Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей положения хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах мезенхимных стволовых клеток в зависимости от направления дифференцировки и сроков культивирования

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей положения хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах мезенхимных стволовых клеток в зависимости от направления дифференцировки и сроков культивирования"

На правах рукописи

ВОЛЬДГОРН Яна Иоснфовпа

Изучение особенностей положения хромосом 6,12,18 и X в ядрах мезенхпмных стволовых клеток в зависимости от направления днфференцировки и сроков культивирования

03.02.07-генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

С ДЕК 2012

Москва-2012

005056764

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Лавров Александр Вячеславович Официальные оппоненты:

Рубцов Михаил Александрович кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», биологический факультет МГУ, кафедра молекулярной биологии, старший научный сотрудник

Ревазова Юлия Анатольевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, отдел гигиены, токсикологии пестицидов и химической безопасности, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «17» декабря 2012 г. в 1Г часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Репа Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Проблема хромосомных территорий широко обсуждается в современной научной литературе. Под "хромосомной территорией" (XT) понимается та часть ядра, в которой с помощью гибридизации меченой ДНК и трехмерной микроскопии выявляется хромосомный материал (Рубцов Н.Б., 2007). Многочисленные исследования показывают, что расположение XT в интерфазном ядре не случайно. Позиционирование XT связано с такими процессами, как дифференцировка и старение клеток (Cremer М. et al, 2001). В ряде случаев удается установить взаимосвязь между изменениями в положении XT и развитием заболевания (Kozubek S. et al, 1999; Kuroda M. et al, 2004; Mewborn S. et al, 2010; Taslerova R. et al, 2003).

Особый интерес представляет изучение XT в малодифференцированных клетках, в частности, в мезенхимных стволовых клетках (МСК). МСК способны дифференцироваться в мезенхимные и не мезенхимные клетки, повышают репаративный потенциал и обладают иммуносупрессивной активностью. Важными преимуществами МСК перед прочими стволовыми клетками являются легкость получения и культивирования. В совокупности свойства МСК обеспечили широкое их использование в регенеративной медицине, в области клеточной терапии и тканевой инженерии. При этом необходимость в большинстве случаев культивирования МСК in vitro поднимает вопросы безопасности таких трансплантатов. При оценке биобезопасности МСК важно среди прочих параметров оценивать возможные изменения строения ядер, как ранние проявления процессов фундаментальных изменений в функционировании клеток. Кроме того, МСК являются удобным объектом изучения такого эпигенетического фактора, как XT, т.к. МСК легко подвергаются направленной дифференцировке in vitro. Это позволяет детально изучать изменения положения XT и их роль, как во взрослых стволовых клетках, так и в процессах дифференцировки стволовых клеток в различные терминально дифференцированные специализированные клетки.

Настоящая работа посвящена изучению позиционирования отдельных хромосом в интерфазных ядрах МСК до и после длительного культивирования, а так же до и после дифференцировок в остеогенном и адипогенном направлениях.

Цель исследования

Выявить различия в положении хромосом 6,12, 18, X в интерфазных ядрах МСК в зависимости от направления дифференцировки и сроков культивирования как индикаторы пространственной реорганизации ядра.

Задачи исследования

1. Сформировать выборки препаратов МСК на ранних и поздних пассажах и после дифференцировки в адипогенном и остеогенном направлениях.

2. Провести РКН-анализ ядер МСК на ранних и поздних пассажах с применением центромерных зондов к хромосомам 6, 12, 18, X.

3. Провести ПБН-анализ ядер МСК, дифференцированных в адипогенном и остеогенном направлениях с применением центромерных зондов к хромосомам 6, 12, 18, X.

4. Определить кариологические характеристики положений центромер изучаемых хромосом в полученных ядрах клеток МСК.

5. Сравнить кариологические характеристики положений центромер изучаемых хромосом в МСК на ранних и поздних пассажах, а так же до и после дифференцировки в адипогенном и остеогенном направлениях.

Научная новизна

Впервые получены данные, характеризующие положение центромер хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах МСК. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер хромосом 6, 12, 18 и X до и после длительного культивирования, выявлены различия в положениях центромер хромосом б и X. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер хромосом 6, 12, 18 и X до и после дифференцировки в остеогенном направлении, выявлены различия в положении центромеры хромосомы X. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер хромосом 6, 12, 18 и X до и после дифференцировки в адипогенном направлении, выявлены различия в положении центромер хромосом 12 и 18. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромеры хромосомы X в мужских клетках с положениями центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы X в женских клетках, показано промежуточное положение центромеры хромосомы X в мужских клетках относительно положения центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы X в женских клетках.

Практическая значимость

Данные об архитектуре интерфазного ядра МСК позволяют лучше понять особенности этого вида стволовых клеток, имеющих большой терапевтический потенциал. Получены новые данные об изменениях, наблюдающихся в позиционировании отдельных хромосом в ядрах МСК после длительного культивирования и после их дифференцировки. Данный вопрос представляет особую важность, так как связан с проблемой биобезопасности МСК и возможности медицинского применения данной культуры после длительного культивирования. Также полученные результаты могут быть использованы в дальнейших фундаментальных исследованиях роли пространственной организации интерфазного ядра в клеточной биологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Центромеры хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах МСК занимают различные специфичные для них положения.

2. Длительное культивирование, а так же дифференцировка в остеогенном и адипогенном направлениях приводит к изменению положения изученных хромосом 6, 12,18 и X.

3. Специфичность значений кариологических параметров для разных клеток свидетельствует о важном значении пространственной организации хроматина для функционирования клетки.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 20 Юг), на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-наДону, 2010), на Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011 г), на XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2012, секция "Биология" (Москва, 2012), на European Human Genetics Conference (Nuremberg, 2012) и на рабочих семинарах в ФГБУ "МГНЦ" РАМН, лаборатория мутагенеза (Москва, 2010-2012 гг).

Личный вклад автора в проведении исследования. Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Большая

часть экспериментальных исследований выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации и 5 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 28 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 120 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение и культивирование клеток

МСК из жировой ткани любезно предоставлены Лабораторией стволовой клетки ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Москва). Клеточные культуры готовились по стандартной методике подготовки клеток для трансплантации в клинических целях.

Адипогенная дифференцнровка клеток МСК культивировали до конфлюэнтности 60-70%, после чего в среду добавляли ЮОмкМ индометацина, 1мкМ дексаметазона, 0,5мкМ 1-метил-З-изобутилксантина и 10мкг/мл инсулина и культивировали 20 дней. Среду меняли каждые 3-4 дня. После культивирования клетки зафиксированы в метаноле и для подтверждения дифференцировки окрашены красителем Oil Red О (Змг/мл Oil Red О в 60 % растворе изопропанола) в течение 15 минут. Данная методика обеспечивает дифференцировку не менее 90% клеток в адипогенном направлении, что подтверждено оценкой числа клеток, содержащих жировые включения.

Остеогенная дифференцнровка клеток МСК культивировали до конфлюэнтности 60-70%, после чего в среду добавляли 50мкМ L-аскорбиновой кислоты фосфата, ЮмМ бета-глицерофосфата и ЮОнМ дексаметазона и культивировали 17 дней. Среду меняли каждые 3-4 дня. После культивирования клетки фиксированы в метаноле и для подтверждения дифференцировки окрашены красителем Alizarin Red (2% Alizarin Red в 0,1M

NH40H; рН=5,4) в течение 15 минут. Данная методика обеспечивает дифференцировку не менее 85% клеток в остеогенном направлении, что подтверждено оценкой числа клеток, претерпевших характерные морфологические изменения.

Приготовления цитогенетнческнх препаратов

После удаления среды клетки промывали фосфатным буфером (ФБ) и выдерживали в ледяном 100% метаноле в течение 8 минут, промывали ФБ и дистиллированной водой. Проводили дегидратацию последовательно в этиловом спирте 70%, 85% и 96%, по три минуты в каждом. Высушивали препараты на воздухе.

FISH-анализ

Для проведения интерфазного FISH-анализа использовали зонды фирмы «Vysis, Inc.» СЕР6 (D6Z1), СЕР 12 (D12Z3), СЕР 18 (D18Z1), СЕРХ (DXZ1) альфа-сателлитной ДНК для хромосом 6; 12; 18; X. Подготовку и гибридизацию препаратов проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Для контрастной окраски ядер использовали краситель DAPI.

Определение карнологическнх характеристик ядра Положение центромер определяли при помощи специально разработанной программы, с помощью которой вычисляли центр ядра и безразмерную величину радиальное расстояние центромеры г по формуле r=rl/R, где rl - расстояние от центра ядра до центра сигнала, R - радиус ядра, проходящий через центр сигнала. Ядра МСК являются уплощенными эллипсоидами с относительно малым вертикальным размером ядра. Поэтому ядра рассматривали как плоские объекты. В плоских ядрах размеры сигналов зондов часто сопоставимы с толщиной ядра (Croft J., 1999), что затрудняет адекватное распознавание центра сигнала при трехмерном FISH-анализе. В ряде статей показано, что распределение гибридизационных сигналов на плоских препаратах адекватно отражает положение хромосомных территорий в относительно плоских и длинных ядрах фибробластоподобных клеток. (Boyle S., 2001; Croft J., 1999; Csink and Henikoff, 1998). Кроме того, показано отсутствие существенных изменений в трехмерном строении ядер после фиксации в ПФА (Cremer et al., 1993; Kurz et al., 1996). Размеры и форма ядер МСК сопоставимы с ядрами фибробластов и сохраняют особенности своей трехмерной структуры как

после фиксации ПФА, так и после фиксации метанолом (размеры ядра фибробласта после фиксации ПФА приблизительно 15x25x6 мкм (Croft J., 1999), размеры ядра МСК после фиксации ПФА 12x20x8 мкм, размеры ядра МСК после фиксации метанолом МСК 10x15x8 мкм). В связи с вышеперечисленными данными, в данной работе использовалась двумерная микроскопия.

Для анализа внутриядерной локализации выбрали хромосому 18, как одну из наиболее хорошо изученных в подобных исследованиях - бедную генами хромосому, расположенную обычно на периферии ядра; хромосомы б и 12, как несущие ряд генов, связанных с недифференцированным статусом стволовых клеток или их дифференцировкой в выбранном направлении (гены, ВМРб, HDAC2, RUNX2, ОСТ4 и NANOG, STELLA и GDF3, соответственно), а так же хромосому X, поскольку один из гомологов этой хромосомы (тельце Барра) заведомо неактивен в ядрах женских культур клеток. Определение различий в положении двух гомологов Х-хромосомы может являться в определенной мере контролем правильности избранного метода оценки положения хромосом в ядре. Также интерес представляет определение положения хромосомы X в мужских клетках. Анализировали положение центромер указанных хромосом. Подобный способ анализа широко известен по литературным данным и хорошо себя зарекомендовал в различных исследованиях положения хромосом в нормальных и аберрантных клетках (Vorsanova S., 2010)

Статистический анализ данных

Статистический анализ проводили с помощью программы STATISTICA 6.0.

Определены медианы и средние для последующего сравнения полученных данных с данными литературы. Распределения радиальных расстояний в изученных культурах отклонялись от нормальных распределений (проверка соответствия нормальности по критериям Лиллиефорса и Колмогорова-Смирнова), что не позволяет в полной мере описать характер распределения радиальных расстояний одним параметром. Поэтому распределение радиальных расстояний центромер анализировали с помощью сравнения числа сигналов, находящихся в пяти интервалах радиальных расстояний: 0-0,2, 02,-0,4, 0,4-0,6, 0,6-0,8, 0,8-1. Значимость результатов подтверждена путем статистического анализа с использованием непараметрических методов (Хи-тест, критерии Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса и

дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса), значимыми считались результаты при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проанализировано более 4000 ядер 19 различных культур МСК на ранних и поздних пассажах. Пассажи до 4 включительно отнесены к ранним, а пассажи, начиная с 7 - к поздним. Также анализировали культуры после дифференцировок в адипогенном и остеогенном направлениях. Наличие дифференцировки подтверждено путем окрашивания препаратов красителем Oil RedO после дифференцировки в адипогенном направлении и красителем Alizarin Red после дифференцировки в остеогенном направлении (Рис 1). О наличии дифференцировки так же свидетельствует изменение формы клеток. В ходе адипогенеза они приобретали округлую или близкую к ней формы. После дифференцировки в адипогенном направлении в клетках появляются жировые включения (Рис. 16), что соответствует фенотипу дифференцирующихся адипобластов (Janderova et al., 2003). Согласно литературным данным, при стандартной методике адипогенной дифференцировки до 95-98% клеток формируют липидные включения, отчетливо заметные после окрашивания жирорастворимым красителем (Романов Ю. и др., 2005). После дифференцировки в остеогенном направлении клетки приобретают характерный внешний вид остеобластов (Рис. 1в) - мелких, вытянутых плотно лежащих клеток, для которых характерны потеря остановки роста при достижении конфлюэнтного монослоя и формирование многослойных узелков. В линии нормальных остеобластов человека 87% клеток экспрессирует щелочную фосфатазу - маркер остеогенных клеток (Гершович Ю.Г., 2007). По данным лаборатории молекулярной биологии ФГБУ "МГНЦ" РАМН, дифференцировка в остеогенном направлении по аналогичному протоколу приводит к дифференцировке не менее 84% клеток. Тем не менее, при проведении FISH-анализа для нанесения пробы выбирали часть препарата, где остеогенные клетки, сформировав монослой, лежали наиболее однотипно и равномерно.

Рис. 1. Дифференцировка МСК в адипогенном и остеогенном направлениях.

а) Культура МСК на раннем пассаже.

б) После дифференцировки в адипогенном направлении в клетках происходит накопление жировых включений, окрашенных красителем Oil Red О. в красный цвет. Клетки приобретают характерную округлую форму.

в) После дифференцировки в остеогенном направлении в клетках и межклеточном матриксе происходит отложение солей кальция, окрашенных красителем Alizarin Red в красный цвет. Клетки становятся мелкими и вытянутыми, лежат плотно.

Радиальное положение центромер на ранних и поздних пассажах, а также до

и после дифференцировок в адипогенном и остеогенном направлениях

Медианы центромер хромосом 6, 12, 18 и X составили 65%, 59%, 46% и 69%, соответственно. Наиболее проксимальное положение среди изученных хромосом занимает хромосома 18, что отличает МСК от других изученных культур, где хромосома 18 обычно расположена на перефирии ядра. Наиболее дистально расположена хромосома X. Ее крайне дистальное положение может объясняться малой активностью одного из гомологов хромосомы X - тельца Барра. Хромосомы 12 и 6 занимают промежуточное положение.

Проведены сравнения кариологических характеристик центромер изучаемых хромосом до и после длительного культивирования, а так же до и после указанных дифференцировок. Ранее показано, что гомологи одной хромосомы лежат на различном радиальном расстоянии и могут вносить независимый вклад в изменение распределения частот сигналов центромер на различном радиальном расстоянии.

Поэтому в данной работе гомологи также рассматривали по отдельности -проксимальный и дистальный. Как видно из рисунка 2, характер распределений для сигналов, учтенных проксимально и дистально разительно отличается, (рис. 2, критерий х2, Р < Ю'7 для всех изучаемых хромосом, независимо от пассажа и направления дифференцировки). В большинстве клеток проксимальный гомолог расположен в интервале 0,4-0,6, а дистальный гомолог - в интервале 0,8-1,0.

а)

50%

00,2 0,2-0,4 0,4-0.6 0,6-0,8 0,8-1 радиальное расстояние

б)

0-0,2 0,2-0,40,4-0,60,6-0,8 0,8-1 радиальное расстояние

0-0,2 0,2-0,4 0,4-0,6 0,6-0,8 0,8-1 радиальное расстояние

г)

60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

-----------1 ......I

У и

0-0,2 0,2-0,40,4-0,60,6-0,8 0,8-1

в)1-----------

Рис. 2. Радиальные положения центромер проксимального (серые прямоугольники) и дистапьного (черные прямоугольники) в МСК на ранних пассажах.

а) Распределения частот радиальных расстояний центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы 6.

б) Распределения частот радиальных расстояний центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы 12.

в) Распределения частот радиальных расстояний центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы 18.

г) Распределения частот радиальных расстояний центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы X.

Положение центромеры хромосомы 6

Не выявлено значимых изменений в распределениях частот радиальных расстояний центромеры хромосомы 6 в целом и центромеры проксимального гомолога на ранних и поздних пассажах. Центромера дистального гомолога хромосомы 6 на ранних пассажах расположена в интервале 0-0,2 с частотой 0%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 1%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 19%, в интервале 0,60,8 с частотой 37% и в интервале 0,8-1 с частотой 43%. (Рис. 3, серые прямоугольники). Центромера дистального гомолога хромосомы 6 на поздних пассажах расположена в интервале 0-0,2 с частотой 0%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 1%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 10%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 35% и в интервале 0,8-1 с частотой 54%. (Рис. 3, черные прямоугольники). Следовательно, частота наблюдения центромеры на поздних пассажах в интервале 0,8-1 повышена (43% и 54% на ранних и поздних пассажах, соответственно) за счет снижения частоты её наблюдения в области 0,4-0,8 (56% и 45% на ранних и поздних пассажах, соответственно) (критерий %2, р=0,01) (Рис. 3). Медиана распределения так же изменяется в сторону увеличения (медианы ± стандартные отклонения составляют 78 ± 15% и 81 ± 15%, на ранних и поздних пассажах, соответственно). Это указывает на увеличение на поздних пассажах частоты встречаемости клеток с более удаленным от центра ядра положением центромеры ША6 и соответствующим снижением доли клеток с более близким к центру положением центромеры. Изменения, наблюдаемые при длительном культивировании, могут быть связаны со старением клеток и/или спонтанной дифференцировкой.

ч 60% а 50% с 40%

20% ' 10% ! 0%

0-0,2 0,2-0,4 0,4-0,6 0,6-0,8 0,8-1 радиальное расстояние

л\

Рис. 3. Сравнение частот радиальных расстояний центромер дистальных гомологов хромосомы 6 на ранних (серые прямоугольники) и поздних (черные прямоугольники) пассажах, на поздних пассажах центромера гомолога располагается дистапьнее, р=0,01.

Значимых изменений в положении центромеры хромосомы 6 после дифференцировок в адипогенном и остеогенном направлениях не выявлено.

Хромосома 6 содержит ряд генов, связанных с малодифференцированнм статусом клетки, что предполагает понижение активности генов этой хромосомы по мере дифференцировки. Менее активные хромосомы, как правило, расположены ближе к периферии ядра. Из сравнения наших данных с данными литературы следует, что в целом центромера хромосомы 6 в МСК расположена несколько проксимапьнее, по сравнению с фибробластами (средние ± стандартные отклонения распределений составляют 63 ± 21% и 65,73 ± 18,46%, в МСК и в фибробластах, соответственно) (Mora L., 2006), но различия крайне малы.

Положение центромеры хромосомы 12 Центромера хромосомы 12 на ранних пассажах расположена в интервале 0-0,2 с частотой 5%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 18%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 29%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 26% и в интервале 0,8-1 с частотой 22%. (Рис. 4, серые прямоугольники). После дифференцировки в адипогенном направлении центромера хромосомы 12 расположена в интервале 0-0,2 с частотой 2%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 15%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 29%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 32% и в интервале 0,8-1 с частотой 22%. (Рис. 4, черные прямоугольники). Следовательно, центромера хромосомы 12 стала достоверно чаще встречаться в интервале 0,6-0,8 (26% и 32%, до и после дифференцировки, соответственно). Данное увеличение частоты произошло за счет снижения встречаемости в интервале 0-0,4 (23% и 17%, до и после дифференцировки, соответственно) (критерий yl, р=0,008). Медиана распределения так же изменяется в сторону увеличения (медианы ± стандартные отклонения составляют 59 ± 23% и 62 ± 20%, до и после дифференцировки, соответственно). Об изменении в положении центромеры также свидетельствует значимое изменение расстояния между гомологами (среднее ± стандартная ошибка среднего 0,0032 ± 0,00009 и 0,0028 ± 0,00008, до и после дифференцировки, соответственно, критерий Манна-Уитни, р=0,04). Таким образом, после дифференцировки в адипогенном направлении возросла частота встречаемости клеток с более удаленным от центра ядра положением центромеры HSA12 и снизилась доля клеток с более близким к центру положением центромеры.

Наблюдаемые изменения в положении центромеры хромосомы 12 связаны преимущественно с более дистальным положением центромеры проксимального гомолога хромосомы 12 после дифференцировки в адипогенном направлении

(критерий х2, р=0,023). Данное наблюдение подтверждает литературные данные, согласно которым положение одного из гомологов хромосомы 12 изменяется по мере превращения преадипоцитов в адипоциты (Кигоёа М. е1 а1, 2004).

Рис. 4. Радиальное положение центромеры хромосомы 12 на раннем пассаже (серые прямоугольники) и после дифференцировки в адипогенном направлении (черные прямоугольники).

а) Сравнение частот радиальных расстояний центромер хромосомы 12, после дифференцировки в адипогенном направлении центромера хромосомы занимает более дистальное положение, р=0,008.

б) Схематическое изображение положения центромер хромосомы 12 в ядре МСК на раннем пассаже и после дифференцировки в адипогенном направлении. Серыми и черными кругами показана частота встречаемости центромеры в соответствующем интервале на раннем пассаже и после дифференцировки в адипогенном направлении, соответственно.

Согласно литературным данным, хромосома 12 содержит ряд генов, связанных с малодифференцированным статусом клеток (Matin M. et al, 2004; Wiblin A. et al, 2005; Zaehres H. et al, 2005), так же гены, чья экспрессия снижается в процессе дифференцировки (Clark A. et al, 2004; Wiblin A. et al, 2005). Известно, что в ЭСК человека 12р занимает более проксимальное положение, по сравнению с дифференцированными клетками, в частности, с LCL. По нашим данным, в лимфоцитах хромосома 12 расположена дистальнее, по сравнению с МСК (медианы распределений ± стандартные отклонения составляют 59 ± 23% и 71± 22% для МСК и лимфоцитов, соответственно). Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что более дистальное положение хромосомы 12 после дифференцировки связано с уменьшением активности ее генов по мере дифференцировки.

Положение центромеры хромосомы 18

Центромера хромосомы 18 на ранних пассажах расположена в интервале 0-0,2 с частотой 9%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 31%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 34%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 17% и в интервале 0,8-1 с частотой 9%. (Рис. 5, серые прямоугольники). После дифференцировки в адипогенном направлении центромера хромосомы 18 расположена в интервале 0-0,2 с частотой 7%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 23%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 34%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 26% и в интервале 0,8-1 с частотой 10%. (Рис. 5, черные прямоугольники). Следовательно, после дифференцировки в адипогенном направлении отмечается увеличение частоты наблюдения центромеры в областях 0,6-1,0 (17% и 26%, до и после дифференцировки, соответственно) за счет значительного снижения частоты сигналов в областях 0-0,4 (40% и 30%, до и после дифференцировки, соответственно) (критерий у2, р=0,0001).

а)

ч 40%

а 35% 30% С 25% т 20% о 15% т 10% а 5% 0%

0-0,2 0,2-0,4 0,4-0,6 0,6-0,8 0,8-1 радиальное расстояние

б)

Рис. 5. Радиальное положение центромеры хромосомы 18 на раннем пассаже (серые прямоугольники) и после дифференцировки в адипогенном направлении (черные прямоугольники).

а) Сравнение частот радиальных расстояний центромеры хромосомы 18 на раннем пассаже и после дифференцировки в адипогенном направлении, после дифференцировки в адипогенном направлении центромера хромосомы занимает более дистальное положение, р=0,0001.

б) Схематическое изображение положения центромеры хромосомы 18 в ядре МСК на раннем пассаже и после дифференцировки в адипогенном направлении. Серыми и черными кругами показана частота встречаемости центромеры в соответствующем интервале на раннем пассаже и после дифференцировки в адипогенном направлении, соответственно.

Медиана распределения так же изменяется в сторону увеличения (медианы ±

стандартные отклонения 46 ± 21% и 53 ± 21%, до и после дифференцировки, соответственно). Об изменении в положении центромеры также свидетельствует значимое изменение расстояния между гомологами (средние ± стандартные ошибки

среднего 0,0023 ± 0,00005 и 0,0024 ± 0,00008, до и после дифференцировки, соответственно, критерий Колмогорова-Смирнова, р < 0,01). Таким образом, после дифференцировки в адипогенном направлении возросла частота встречаемости клеток с более удаленным от центра ядра положением центромеры Н5А18 и снизилась доля клеток с более близким к центру положением центромеры.

Наблюдаемые изменения в положении центромеры хромосомы 18 связаны с более дистальным положением центромер обоих гомологов хромосомы 18 после дифференцировки в адипогенном направлении (критерий х2, р=0,002 и 0,003 для проксимального и дистального гомолога, соответственно).

Положение центромеры хромосомы X Положение центромеры хромосомы X в женских клетках не отличается на ранних и поздних пассажах, но в мужских клетках центромера на поздних пассажах значительно чаще стала отмечаться в более проксимальных областях ядра по сравнению с ранними пассажами. Центромера хромосомы X в мужских клетках на ранних пассажах расположена в интервале 0-0,2 с частотой 1%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 11%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 25%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 30% и в интервале 0,8-1 с частотой 33%. (Рис. 6, серые прямоугольники). На поздних пассажах центромера хромосомы X в мужских клетках расположена в интервале 0-0,2 с частотой 6%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 10%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 33%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 33% и в интервале 0,8-1 с частотой 18%. (Рис. 6, черные прямоугольники). Следовательно, существенно возросла частота сигнала в области 0-0,2 (1% и 6% на ранних и поздних пассажах, соответственно). Также выросли частоты нахождения центромеры в областях 0,4-0,8 (45% и 66% на ранних и поздних пассажах, соответственно) за счет снижения в области 0,8-1 (33% и 18% на ранних и поздних пассажах, соответственно) (критерий %2, р=0,03). Это указывает на увеличение на поздних пассажах частоты встречаемости клеток с центромерами Н8АХ, удаленными на расстояние 0,4-0,8 и 0-0,2, по сравнению с клетками, в которых центромера занимает другие положения. Можно утверждать, что в целом центромера хромосомы X стала чаще встречаться в более проксимальных областях ядра на поздних пассажах.

ч а с т о

0-0,2 0,2-0,4 0,4-0,6 0,6-0,8 0,8-1 радиальное расстояние

Рис. б. Сравнение частот радиальных расстояний центромер хромосомы X в мужских клетках на раннем (серые прямоугольники) и позднем пассажах (черные прямоугольники), распределение частот радиальных расстояний центромеры значимо изменятеся, р=0,03.

Наблюдаемые изменения в положении центромеры могут объясняться, активацией хромосомы X при старении культуры МСК в процессе длительного культивирования.

Центромера хромосомы X в женских клетках на ранних пассажах расположена в интервале 0-0,2 с частотой 3%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 9%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 23%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 33% и в интервале 0,8-1 с частотой 32%. (Рис. 7, серые прямоугольники). После дифференцировки в остеогенном направлении центромера хромосомы X в женских клетках расположена в интервале 0-0,2 с частотой 5%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 12%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 17%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 33% и в интервале 0,8-1 с частотой 33%. (Рис. 7, черные прямоугольники). Следовательно, после дифференцировки в остеогенном направлении отмечается увеличение частоты наблюдения центромеры в интервале 0-0,4 (12% и 17%, до и после дифференцировки, соответственно) за счет снижения частоты наблюдения сигналов в области 0,6-0,8 (23% и 17%, до и после дифференцировки, соответственно) (критерий х2, р=0,04). По всей видимости, вклад в изменение распределения дают оба гомолога. После дифференцировки в остеогенном направлении возрастает частота клеток, в которых отмечается более дистальное положение центромеры дистального гомолога (критерий у2, р=0,01). Следует обратить внимание, что частоты проксимального гомолога смещены в сторону ещё большего смещения его положения к центру (критерий %2, р=0,1), что находит отражение в характере распределения центромеры хромосомы в целом - увеличение

частот крайних положений (проксимального и дистального) в интервале 0-0,4 и 0,8' 1,0 за счет уменьшения частоты срединного положения в интервале 0,4-0,6.

0-0,2 0,2-0,4 0,4-0,6 0,6-0,8 0,8-1

радиальное расстояние

Рис. 7. Сравнение частот радиальных расстояний центромер хромосомы X в женских культурах на раннем пассаже и после дифференцировки в остеогенном направлении, р=0,04.

Медиана распределения практически не изменяется (медиана ±

стандартное отклонение 69 ± 21% и 70 ± 23%, до и после дифференцировки,

соответственно). Значимых изменений расстояния между гомологами не

обнаружено.

Положение центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы X в женских клетках и г/ентромеры хромосомы X в мужских клетках

Как показано выше, центромера хромосома X в мужских клетках на ранних пассажах расположена в интервале 0-0,2 с частотой 1%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 11%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 25%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 30% и в интервале 0,8-1 с частотой 33%. (Рис. 8а, черные прямоугольники). Центромера проксимального гомолога хромосомы X на ранних пассажах расположена в интервале 0-0,2 с частотой 6%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 17%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 35%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 32% и в интервале 0,8-1 с частотой 10%. (Рис. 8а, серые прямоугольники). Таким образом, положение центромеры хромосомы X в мужских клетках не совпадает с положением центромеры проксимального гомолога хромосомы X в женских клетках (критерий х2, р < Ю"7) Центромера дистального гомолога хромосомы X на ранних пассажах расположена в интервале 00,2 с частотой 0%, в интервале 0,2-0,4 с частотой 1%, в интервале 0,4-0,6 с частотой 12%, в интервале 0,6-0,8 с частотой 34% и в интервале 0,8-1 с частотой 53%. (Рис. 8а, светло-коричневые прямоугольники). Таким образом, положение центромеры

хромосомы X в мужских клетках не совпадает с положением центромеры дистального гомолога хромосомы X в женских клетках (критерий %2, р < 10~7).

Центромера хромосомы X в мужских клетках занимает примерно промежуточное положение между центромерами проксимального и дистального гомологами хромосомы X в женских культурах (Рис. 86).

а)

0-0,2 0,2-0.40,4-0,60,6-0,8 0,8-: радиальное расстояние

/V

ч \

\

I I I г I ) ■ >• ©I

Ч4--_____■ ' '

б)

X /

Рис. 8. Радиальное положение центромер проксимального (серые прямоугольники) и дистального ШАХ (светло-коричневые прямоугольники) в женских культурах и центромеры ШАХ в мужских клетках (черные прямоугольники).

а) Сравнение частот радиальных расстояний обоих гомологов ШАХ в женских клетках и ШАХ в мужских клетках. ШАХ из мужских клеток занимает примерно промежуточное положение между проксимальным и дистальным гомологами ШАХ в женских клетках, р < 10"7.

б) Схематическое изображение положения центромер гомологов ШАХ в женских клетках и центромеры ШАХ в мужских клетках в ядре МСК на раннем пассаже. Серыми, светло-коричневыми и черными кругами показана частота встречаемости центромеры в соответствующем интервале для проксимального гомолога, дистального гомолога и центромеры ШАХ в мужских клетках, соответственно.

ВЫВОДЫ

1. После длительного культивирования центромера дистального гомолога хромосомы б чаще расположена дистальнее по сравнению с ранним пассажем, а центромера хромосомы X в мужских клетках чаще расположена проксимальнее, по сравнению с ранними пассажами, что может являться признаками старения культуры.

2. После дифференцировки в адипогенном направлении центромеры проксимальных гомологов хромосом 12 и 18 статистически достоверно располагаются дистальнее по сравнению с их положением в МСК на ранних пассажах, что, вероятно, связано со снижением экспрессии расположенных на этих хромосомах генов, ответственных за поддержание стволового статуса МСК.

3. После дифференцировки в остеогенном направлении центромера дистального гомолога хромосомы X в женских клетках чаще располагается дистальнее по сравнению с его расположением в МСК на ранних пассажах, что может быть связано с компактизацией ядра при дифференцировке в высоко специализированную клетку.

4. Центромера хромосомы X в мужских клетках занимает промежуточное положение по сравнению с центромерами проксимального и дистального гомологов хромосомы X в женских клетках, что может быть связано с разной активностью хромосомы X в мужских и женских клетках.

5. Полученные данные могут свидетельствовать о функциональном значении положения хромосом в интерфазном ядре для процессов, происходящих при длительном культивировании и дифференцировке МСК.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Лавров A.B., Вольдгорн Я.И. Расположение хромосом в ядрах мезенхимных стволовых клеток человека. И Клеточные технологии в биологии и медицине.-2011.-№2-С.83-86. Bulletin of Experimental Biology and Medicine - 2011,-Volume 151 - Issue 4-P. 517-520

2. Лавров A.B., Вольдгорн Я.И., Н.П. Бочков Пространственная архитектоника хромосом в интерфазном ядре в норме и при патологии. // Вестник РАМН. - 2011 .-№9.-С.48-54

3. Вольдгорн Я.И., Лавров A.B. Изменение радиальных положений хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах мезенхимных стволовых клеток человека при культивировании и дифференцировке. // Медицинская генетика - 2012. - №10, С. 4347.

Публикации в других изданиях:

4. Вольдгорн Я.И., Лавров A.B. Строение интерфазных ядер в культуре мезенхимных стволовых клеток человека / XVI Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 5-7 октября 2010. //Цитология. 2010. Т.5, №8. С.668.

5. Вольдгорн Я.И., Лавров A.B. Особенности расположения хромосомных территорий в ядрах мезенхимиых стволовых клеток человека. / Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, г. Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. // Медицинская генетика. 2010. С.41

6. Лавров A.B., Вольдгорн Я.И.. Особенности расположения хромосом в ядрах мезенхимных стволовых клеток человека при культивировании in vitro. // Клеточные культуры (Информационный бюллетень). 2011. вып. 27. С. 68-73.

7. Вольдгорн Я.И., Лавров A.B., Н.П. Бочков. Особенности строение интерфазного ядра в мезенхимных стволовых клетках человека (МСК) // Всероссийская научная конференция «Регенеративная биология и медицина», сборник научных трудов, 2011г., С. 42.

8. Вольдгорн Я.И.. Перемещение хромосомных территорий при дифференцировке и старении мезенхимных стволовых клеток. // XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2012, секция "Биология", Москва. 2012. С.138-139.

9. Lavrov A.V., Voldgorn Y.I. Chromatin changes in human mesenchimal stem cells during cultivation and differentiation / European Human Genetics Conference 2012, June 23 - 26 - Nürnberg, Germany // European Journal of Human Genetics. 2012. Vol. 20. suppl. 1. P.263

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ DAPI - флуоресцентный краситель 4, 6-диамино-2-фенилиндол FISH - флюоресцентная гибридизация in situ HSA - хромосомы Homo sapiens LCL - лимфобластная клеточная линия NANOG - транскрипционный фактор ОСТ4 - Octamer-4, транскрипционный фактор МСК - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки ПФА - параформальдегид ТЭС - сыворотка крови телячья ФБ - фосфатный буфер XT - хромосомные территории ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

Подписано в печать:

12.11.2012

Заказ № 7832 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вольдгорн, Яна Иосифовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1.ВВЕДЕНИЕ.

1.1 .Актуальность проблемы.

1.2.Цель и задачи исследования.

1.3.Научная новизна.

1.4.Теоретическая и практическая значимость.

1.5.Положения, выносимые на защиту.

1.6. Апробация работы.

1.7. Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.

1.8.Публикаци и.

1.9.Структура и объем диссертации.

ГЛАВА 2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. История изучения хромосом в интерфазном ядре.

2.2. Понятие о хромосомных территориях (ХТ).

2.3. Возможные механизмы образования хромосомных территорий.

2.4. Расположение ХТ в ядре.

2.5. Роль ХТ в регуляции активности генов.

2.6. Влияние активности генов на положение ХТ.

2.7. ХТ и эволюция.

2.8. Роль ХТ в развитии заболеваний.

2.9. ХТ в стволовых клетках.

2.10. Общая характеристика МСК.

2.11. Дифференцировочный потенциал МСК.

2.12. Применение МСК в медицине.

2.13. Адипогенная дифференцировка.

2.14. Остеогенная дифференцировка.

2.15. Культивирование МСК и проблемы биобезопасности.

ГЛАВА 3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Общая характеристика доноров биопсийного материала из жировой ткани.

3.2. Культивирование и приготовление препаратов клеток из жировой ткани.

3.3. Культивирование клеток на ранних и поздних пассажах.

3.4. Адипогенная дифференцировка клеток.

3.5. Остеогенная дифференцировка клеток.

3.6. Приготовления цитогенетических препаратов.

3.7. БШН-анализ.

3.8. Определение кариологических характеристик ядра.

3.9. Статистический анализ данных.

ГЛАВА 4.РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Анализ положения хромосомных территорий.

4.2. Не случайное расположение хромосом в МСК.

4.3.Сравнение радиального положения центромер проксимальных и дистальных гомологов ША6, ША12, ША18 и НБАХ.

4.4.Радиальное положение цетромеры ШАб и ее гомологов.

А АЛ .Радиальное положение центромеры НБАб.

4.4.2. Радиальное положение центромеры проксималыюго гомолога НБАб.

4.4.3. Радиальное положение центромеры дисталъного гомолога

4.4.4. Сравнение расстояний и углов между гомологами НБАб.

4.4.5. Положение НБАб в МСК и других тканях.

4.5. Радиальное положение центромеры Н8А12 и ее гомологов.

4.5.1. Радиальное положение центромеры

ША12.

4.5.2. Радиальное положение центромеры прокышального гомолога ЖА12.

4.5.3. Радиальное положение центромеры дисталъного гомолога

ЖА12.

4.5.4. Сравнение расстояний иуглов между гомологами ЖА12.

4.5.5. Положение ЖА12 в МСК и других тканях.

4.6. Радиальное положение центромеры Н8А18 и ее гомологов.

4.6.1. Радиальное положение центромеры

ЖА18.

4.6.2. Радиальное положение центромеры проксимального гомолога ЖА18.

4.6.3. Радиальное положение центромеры дистального гомолога

ЖА18.

4.6.4. Сравнение расстояний и углов между гомологами

Н8А18.

4.7. Радиальное положение центромеры ШАХ и ее гомологов в мужских и женских культурах.

4.7.1. Радиальное положение центромеры Н8АХв женских клетках.

4.7.2. Радиальное положение центромеры проксимального гомолога ЖАХ.

4.7.3. Радиальное положение центромеры дисталъного гомолога

4.7.3. Радиальное положение центромеры ЖАХ в мужских клетках.

4.7.4. Сравнение расстояний иуглов между гомологами ЖАХ.

4.7.5. Положение центромеры ЖАХ в МСК и других культурах.

4.7.6. Положение центромеры ЖАХ в МСК и других культурах.

4.8. Сравнение положения центромеры НБАХ в мужских клетках и положения проксимального и дистального гомологов НБАХ в женских клетках.

4.9. Взаимное расположение центромер Н8А12, Н8А18, Н8А6,

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение особенностей положения хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах мезенхимных стволовых клеток в зависимости от направления дифференцировки и сроков культивирования"

1.1. Актуальность проблемы

Проблема хромосомных территорий широко обсуждается в современной научной литературе. Под "хромосомной территорией" (ХТ) понимается та часть ядра, в которой с помощью гибридизации меченой ДНК и трехмерной микроскопии выявляется хромосомный материал [11]. Многочисленные исследования показывают, что расположение ХТ в интерфазном ядре не случайно. Архитектура интерфазного ядра остается консервативной, по крайней мере, от приматов до человека [47], но различается для клеток из разных тканей, а так же для клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла. Положение хромосомы в ядре, по-видимому, зависит от количества и активности ее генов. Хромосомы, содержащие больше активных генов, как правило, расположены, ближе к центру ядра, в то время как бедные активными генами хромосомы обычно расположены ближе к периферии ядра. Расположение ХТ в интерфазном ядре, по-видимому, является одним из важных механизмов эпигенетической регуляции уровня экспрессии генов. Позиционирование ХТ связано с такими процессами, как дифференцировка и старение клеток [32]. В ряде случаев удается установить взаимосвязь между изменениями в положении ХТ и развитием заболевания [62, 64, 77, 85, 102].

Особый интерес представляет изучение ХТ в малодифференцированных клетках, в частности, в мезенхимных стволовых клетках (МСК). МСК способны дифференцироваться в мезенхимные и не мезенхимные клетки.

Возможна дифференцировка МСК в остеоциты, хондроциты и адипоциты.

Важными преимуществами МСК являются иммуносупрессивная активность, легкость в культивировании и доступность - их можно выделять из тканей взрослого человека. Все вышеперечисленные свойства делают возможным использование МСК в регенеративной медицине, в области клеточной терапии и тканевой инженерии. При этом необходимость 8 в большинстве случаев культивирования MCK in vitro поднимает вопросы безопасности таких трансплантатов. При оценке биобезопасности МСК важно среди прочих параметров оценивать возможные изменения строения ядер, как ранние проявления процессов фундаментальных изменений в функционировании клеток. Кроме того, МСК являются удобным объектом изучения такого эпигенетического фактора, как XT, т.к. МСК легко подвергаются направленной дифференцировке in vitro. Это позволяет детально изучать изменения положения XT и их роль, как во взрослых стволовых клетках, так и в процессах дифференцировки стволовых клеток в различные терминально дифференцированные специализированные клетки.

Настоящая работа посвящена изучению позиционирования отдельных хромосом в интерфазных ядрах МСК до и после длительного культивирования, а так же до и после дифференцировок в остеогенном и адипогенном направлениях.

1.2. Цель н задачи исследования

Выявить различия в положении хромосом 6, 12, 18, X в интерфазных ядрах МСК в зависимости от направления дифференцировки и сроков культивирования как индикаторы пространственной реорганизации ядра.

В соответствии с целью исследования поставлены следующие задачи:

1. Сформировать выборки препаратов МСК на ранних и поздних пассажах и после дифференцировки в адипогенном и остеогенном направлениях.

2. Провести FISH-анализ ядер МСК на ранних и поздних пассажах с применением центромерных зондов к хромосомам 6, 12, 18, X.

3. Провести FISH-анализ ядер МСК, дифференцированных в адипогенном и остеогенном направлениях с применением центромерных зондов к хромосомам 6, 12, 18, X.

4. Определить кариологические характеристики положений центромер изучаемых хромосом в полученных ядрах клеток МСК.

5. Сравнить кариологические характеристики положении центромер изучаемых хромосом в МСК на ранних и поздних пассажах, а так же до и после дифференцировки в адипогенном и остеогенном направлениях.

1.3. Научная новизна

Впервые получены данные, характеризующие положение центромер ША6, ША12, ША18 и ШАХ в ядрах МСК, показано необычно дистальное положение ША18, отличающее МСК от ряда других тканей. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер ША6, ША12, ША18 и ШАХ до и после длительного культивирования, выявлены различия в положениях центромер ША6 и ШАХ. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер ША6, ША12, ША18 и ШАХ до и после дифференцировки в остеогенном направлении, выявлены различия в положении центромеры ШАХ. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер ША6, ША12, ША18 и ШАХ до и после дифференцировки в адипогенном направлении, выявлены различия в положении центромер ША12 и ША18. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромеры ШАХ в мужских клетках с положениями центромер проксимального и дистального гомологов ШАХ в женских клетках, показано промежуточное положение ШАХ в мужских клетках относительно положения центромер проксимального и дистального гомологов ШАХ в женских клетках.

1.4.Теоретическая и практическая значимость

Данные об архитектуре интерфазного ядра МСК позволяют лучше понять особенности этого вида стволовых клеток, имеющих большой терапевтический потенциал. Получены новые данные об изменениях, наблюдающихся в позиционировании отдельных хромосом в ядрах МСК после длительного культивирования и после их дифференцировки. Данный вопрос представляет особую важность, так как связан с проблемой биобезопасности МСК и возможности медицинского применения данной культуры после длительного культивирования. Также полученные результаты могут быть использованы в дальнейших фундаментальных исследованиях роли пространственной организации интерфазного ядра в клеточной биологии.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. Центромеры хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах МСК занимают различные специфичные для них положения.

2. Длительное культивирование, а так же дифференцировка в остеогенном и адипогенном направлениях приводит к изменению положения изученных хромосом 6, 12, 18 и X.

3. Специфичность значений кариологических параметров для разных клеток свидетельствует о важном значении пространственной организации хроматина для функционирования клетки.

1.6. Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы представлены на XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 20 Юг), на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-наДону, 2010), на Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011 г), на XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2012, секция "Биология" (Москва, 2012), на European Human Genetics Conference (Nuremberg, 2012) и на рабочих семинарах в ФГБУ "МГНЦ" РАМН, лаборатория мутагенеза (Москва, 2010-2012 гг).

1.7. Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации

Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Большая часть экспериментальных исследований выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.

1.8. Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации и 5 тезисов.

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Лавров A.B., Вольдгорн Я.И. Расположение хромосом в ядрах мезенхимных стволовых клеток человека. // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2011.-№2-С.83-86.

2. Лавров A.B., Вольдгорн Я.И., Н.П. Бочков. Пространственная архитектоника хромосом в интерфазном ядре в норме и при патологии. // Вестник РАМН. - 2011 ,-№9.-С.48-54

3. Вольдгорн Я.И., Лавров A.B. Изменение радиальных положений хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах мезенхимных стволовых клеток человека при культивировании и дифференцировке. // Медицинская генетика - 2012. - №10, С. 43-47.

Публикации в других изданиях:

4. Вольдгорн Я.И., Лавров A.B. Строение интерфазных ядер в культуре мезенхимных стволовых клеток человека / XVI Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 5-7 октября 2010. //Цитология. 2010. Т.5, №8. С.668.

5. Вольдгорн Я.И., Лавров A.B. Особенности расположения хромосомных территорий в ядрах мезенхимных стволовых клеток человека. /

Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, г. Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. //Медицинская генетика. 2010. С.41

6. Лавров A.B., Вольдгорн Я.И. Особенности расположения хромосом в ядрах мезенхимных стволовых клеток человека при культивировании in vitro. // Клеточные культуры (Информационный бюллетень). 2011. вып. 27. С. 68-73.

7. Вольдгорн Я.И., Лавров A.B., Н.П. Бочков. Особенности строение интерфазного ядра в мезенхимных стволовых клетках человека (МСК) // Всероссийская научная конференция «Регенеративная биология и медицина», сборник научных трудов, 2011г., С. 42.

8. Вольдгорн Я.И. Перемещение хромосомных территорий при дифференцировке и старении мезенхимных стволовых клеток. // XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2012, секция "Биология", Москва. 2012. С.138-139.

9. Lavrov A.V., Voldgorn Y.I. Chromatin changes in human mesenchimal stem cells during cultivation and differentiation / European Human Genetics Conference 2012, June 23 - 26 - Nürnberg, Germany// European Journal of Human Genetics. 2012. Vol. 20. suppl. 1. P.263

1.9. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 28 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 120 ссылок.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Вольдгорн, Яна Иосифовна

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ

1. После длительного культивирования центромера дистального гомолога хромосомы 6 чаще расположена дистальнее по сравнению с ранним пассажем, а центромера хромосомы X в мужских клетках чаще расположена проксимальнее, по сравнению с ранними пассажами, что может являться признаками старения культуры.

2. После дифференцировки в адипогепном направлении центромеры проксимальных гомологов хромосом 12 и 18 статистически достоверно располагаются дистальнее по сравнению с их положением в МСК на ранних пассажах, что, вероятно, связано со снижением экспрессии расположенных на этих хромосомах генов, ответственных за поддержание стволового статуса МСК.

3. После дифференцировки в остеогенном направлении центромера дистального гомолога хромосомы X в женских клетках чаще располагается дистальнее по сравнению с его расположением в МСК на ранних пассажах, что может быть связано с компактизацией ядра при дифференцировке в высоко специализированную клетку.

4. Центромера хромосомы X в мужских клетках занимает промежуточное положение по сравнению с центромерами проксимального и дистального гомологов хромосомы X в женских клетках, что может быть связано с разной активностью хромосомы X в мужских и женских клетках.

5. Полученные данные могут свидетельствовать о функциональном значении положения хромосом в интерфазном ядре для процессов, происходящих при длительном культивировании и дифференцировке МСК.

ГЛАВА 6.

4.10.Закл ючение

В последние годы наблюдается растущий интерес к изучению механизмов эпигенетической регуляции работы ядра, в том числе к изучению архитектуры интерфазного ядра и ХТ. Представляется несомненной важная роль неслучайного расположения хромосом в ядре, что косвенно подтверждается относительной стабильностью и эволюционной консервативностью положения отдельных хромосом в ядре [47]. Тем не менее, роль хромосомных территорий в таких жизненно важных процессах, как дифференцировка и старение клеток на сегодняшний день изучена недостаточно. Также мало известно о положении ХТ в стволовых клетках, в том числе в МСК.

В данном исследовании впервые описано положение отдельных хромосом в недифференцированных МСК на раннем пассаже, а так же изменения в положениях хромосом после длительного культивирования и после дифференцировок в остеогенном и адипогенном направлениях.

Была показана неслучайность положения изученных хромосом. Данное свойство МСК является общим с многочисленными другими тканями, изученными ранее, в частности, с фибробластами человека [6, 78], ЭСК [7, 18,111]

Было показано изменение в положении центромеры Н8А6 после длительного культивирования. На поздних пассажах центромера данной

109 хромосомы расположена дистальннее, по сравнению с ранними пассажами. Изменение в положении центромеры связано с изменением в положении центромеры дистальпого гомолога - на поздних пассажах его центромера расположена дистальннее, по сравнению с ранними пассажами. Изменений в положении радиального расстояния центромеры ША6 после дифференцировок в адипогенном и остеогенном направлениях не выявлено. Тем не менее, можно предположить небольшое изменение угла после дифференцировки в остеогенном направлении.

Не выявлено изменений в положении центромеры Н8А12 после длительного культивирования и дифференцировки в остеогенном направлении. Тем не менее, показаны различия между расстояниями между центромерами гомологов ША12 на раннем и позднем пассаже. Возможно, изменение угла между гомологами так же имеет место. Было показано изменение в положении центромеры ША12 после дифференцировки в адипогенном направлении. После дифференцировки центромера данной хромосомы расположена дистальннее, по сравнению с ранними пассажами. Данное изменение связано с изменением в положении центромеры проксимального гомолога ША12 - после дифференцировки в адипогенном направлении его центромера расположена дистальнее, по сравнению с ранними пассажами. Показано, что центромера ША12 в МСК расположена проксимальнее, по сравнению с ее положением в ЭСК, но дистальнее, по сравнению с ее положением в дифференцированных клетках (лимфоцитах и фибробластах). Данное наблюдение может свидетельствовать о снижении активности Н8А12 по мере дифференцировки клеток.

Не выявлено изменений в положении центромеры Н8А12 после длительного культивирования и дифференцировки в остеогенном направлении. Тем не менее, показаны различия между расстояниями и углами между центромерами гомологов Н8А18 до и после дифференцировки в остеогенном направлении. Было показано изменение в положении центромеры Н8А18 после дифференцировки в адипогенном но направлении. После дифференцировки центромера данной хромосомы расположена дисталышее, по сравнению с ранними пассажами. Данное изменение связано с изменением в положении центромер обоих гомологов ША18 - после дифференцировки в адипогенном направлении центромеры обоих гомологов расположены дистальнее, по сравнению с ранними пассажами. Показано относительно проксимальное расположение центромеры ША18 в ядрах МСК, что отличает МСК от ряда других тканей, где малоактивная ША18 обычно расположена на периферии ядра.

Выявлены различия в положение центромер проксимального гомолога ШАХ в женских клетках и Н8АХ в мужских клетках на ранних и поздних пассажах. В обоих случаях на позднем пассаже наблюдается сужение зоны распределения сигнала центромеры. Данное наблюдение может косвенно свидетельствовать о функциональном сходстве проксимального гомолога ШАХ в женских клетках и ШАХ в мужских клетках. Выявлено изменение в положении центромеры ШАХ в женских клетках после дифференцировки в остеогенном направлении. После дифференцировки центромера данной хромосомы расположена дистальннее, по сравнению с ранними пассажами. Данное изменение связано с изменением в положении центромеры дистального гомолога ШАХ - после дифференцировки в остеогенном направлении его центромера расположена дистальнее, по сравнению с ранними пассажами. Различий в положении центромеры ШАХ до и после дифференцировки в адипогенном направлении не выявлено. В женских клетках показано крайне дистального расположение центромеры дистального гомолога ШАХ, который может являться тельцем Барра. Показано промежуточное положение центромеры ШАХ в мужских клетках, по сравнению с положениями центромер проксимального и дистального гомологов ШАХ. Показано более дистальное положение центромеры ШАХ в МСК, по сравнению с ЭСК и фибробластами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вольдгорн, Яна Иосифовна, Москва

1. Вахрушев И.В., Ярыгин Н.В., Ярыгин К.Н. Тканевая инженерия кости путем трансплантации заселенных мезенхимальными стволовыми клетками скэффолдов. //Хирург. -2011.-№1.-С.48-53.

2. Владимирская Е.Б. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в клеточной терапии. // Онкогематология.- 2007.- №1.- С.4-15.

3. Гвоздев В.А. Пространственное расположение хромосом в клеточном ядре определяет активность генов. // Соровский образовательный журнал.- БИОЛОГИЯ,- 2001.-том. 7-№2-С.4-10.

4. Лавров A.B., Вольдгорн Я.И. Расположение хромосом в ядрах мезенхимных стволовых клеток человека. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2011.- №2 - С. 83-86.

5. Петрова Н. В. Пространственная организация хромосомных территорий в ядрах нормальных и анеуплоидных клеток. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. -2007г.

6. Прохорович М.А. Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESM01-04. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Место защиты: Институт цитологии и генетики СО РАН.- Новосибирск.- 2009.

7. Пыко И.В., Корень С.В., Квачева З.Б., Федулов A.C.

8. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга: свойства, функции,возможность использования в регенеративной и восстановительнойтерапии. // Медицинский журнал. 2007. - № 4,- С. 18 - 22.из

9. Рубцов Н.Б. Хромосома человека в четырех измерениях. // Природа. -2007 r.-N.8.- С. 3-11.

10. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Ладыкина К.С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворных тканей морских свинок. //Цитология. 1970.- №12,- С.1147-55.

11. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию: Учебник для вузов. // -2004г.-4-е изд. М.: ИКЦ "Академкнига".

12. Aust L., Devlin В., Foster S.J., Halvorsen YD, Hicok K, du Laney T, Sen A, Willingmyre GD, Gimble JM. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. // Cytotherapy. 2004. - V. 6(1).-P.7-14.

13. Baksh D., Song L.,Tuan J. R.S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. // Cell. Mol. Med. 2004. - V. 8(3).-P. 301-316.

14. Barda-Saad M., Rozenszajn L.A., Ashush H., Shav-Tal Y, Ben Nun A,

15. Zipori D. Adhesion molecules involved in the interactions between early T114cells and mesenchymal bone marrow stromal cells. // Exp Hematol. 1999. -V.27 (5). -P.834-844.

16. Bártová E, Galiová G, Krejcí J, Harnicarová A, Strasák L, Kozubek S. Epigenome and chromatin structure in human embryonic stem cells undergoing differentiation. // Dev. Dyn. 2008. - Dec;237(12). - P.3690-702

17. Bernard-Beaubois K., Hecquet C., Houcine O., Hay em G., Adolphe M. Culture and characterization of juvenile rabbit tenocytes. // Cell Biol Toxicol. -1997. V. 13 (2).-P. 103-113.

18. Bernlohr DA, Bolanowski MA, Kelly TJ Jr, Lane MD. Evidence for an increase in transcription of specific mRNAs during differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. // J. Biol Chem. 1985. - Mayl0;260(9) - P. 5563-7.

19. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P. G. Bone Marrow Stromal Stem Cells: Nature, Biology, and Potential Applications. // Stem Cells. -2001.-V.19 (3).P.180-192.

20. Boyle S., Gilchrist S., Bridger J.M., Mahy N.L., Ellis J.A., Bickmore W.A. The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells. // Hum. Mol. Genet. 2001.- t. 10. - № 3 - C. 211219.

21. Casolari J.M., Brown C.R., Komili S., West J., Hieronymus H., Silver P.A.

22. Genome-wide localization of the nuclear transport machinery couples115transcriptional status and nuclear organization. // Cell. 2004.- t. 117 - № 4 - C. 427-439.

23. Chi N.H., Yang M.C, Chung T.W., Chen J.Y., Chou N.K., Wang S.S. Cardiac repair achieved by bone marrow mesenchymal stem cells/silk fibroin/hyaluronic acid patches in a rat of myocardial infarction model. // Biomaterials. -2012. Aug;33(22). - P.5541-51.

24. Cook P.R., Marenduzzo D. Entropie organization of interphase chromosomes. // J. Cell Biol. 2009,- t. 186 - № 6 - P. 825-834.

25. Cremer C., Cremer T., Fukuda M., Nakanishi K. Detection of laser—UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. // Hum. Genet. 1980. - t. 54 - № 1 - P. 107-110.

26. Cremer M., von Hase J., Volm T., Brero A., Kreth G., Walter J., Fischer C., Solovei I., Cremer C., Cremer T. Non-random radial higher-order chromatin arrangements in nuclei of diploid human cells. // Chromosome Res. 2001. -t. 9-№7-C. 541-567.

27. Cremer T, Cremer M, Dietzel S, Müller S, Solovei I, Fakan S. Chromosome territories-a functional nuclear landscape. // Curr. Opin. Cell Biol. -2006. -Jun;18(3). -P.307-16.

28. Croft J. A., Bridger J.M., Boyle S., Perry P., Teague P., Bickmore W.A. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.//J. Cell Biol.- 1999.-t.145 № 6 -P.l 119-1131.

29. Csink A., Henikoff S. Large-scale chromosomal movements during interphase progression in Drosophila. // J. Cell Biol. 1998. - Oct 5;143(1). -P. 13-22.

30. Dani C., Amri E.Z., Bertrand B., Enerback S., Bjursell G., Grimaldi P., Ailhaud G. Expression and regulation of pOb24 and lipoprotein lipase genes during adipose conversion. // J. Cell Biochem. 1990. - Jun;43(2). - P. 10310.

31. De Bari C., Dell'Accio F., Tylzanowski P., Luyten FP. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. // Arthritis Rheum. -2001.- V.44 (8). P. 1928-42.

32. Dezawa M., Ishikawa H., Hoshino M., Itokazu Y., Nabeshima Y. Potential of bone marrow stromal cells in applications for neuro-degenerative, neurotraumatic and muscle degenerative diseases. // Curr. neuropharmacol. -2005.-V.3 (4). P.257 - 66.

33. Dillen K., Annaert W. A two decade contribution of molecular cell biology to the centennial of Alzheimer's disease: are we progressing toward therapy? // Int. Rev. Cytol. 2006. - t. 254 - P. 215-300.

34. Dillon N. The impact of gene location in the nucleus on transcriptional regulation. // Dev. Cell. 2008.- t. 15 - № 2 - P. 182-186.

35. Ducy P, Schinke T, Karsenty G. The osteoblast: a sophisticated fibroblast under central surveillance. // Science. 2000. - Sep 1;289(5484). - P. 15014.

36. Erices A., Conget P., Minguell JJ. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.//Br J. Haematol. 2000. - 109(1 ).-P.235-42.

37. Fisher AG, Merkenschlager M. Gene silencing, cell fate and nuclear organisation. // Curr Opin Genet Dev. 2002. - Apr; 12(2). - P. 193-7

38. Foster H. A., Bridger J.M. The genome and the nucleus: a marriage made by evolution. //Chromosoma. 2005.-114. - P. 212-229.

39. Foster H.A., Abeydeera L.R., Griffin D.K., Bridger J.M. Non-random chromosome positioning in mammalian sperm nuclei, with migration of the sex chromosomes during late spermatogenesis. // J. Cell Sci. 2005. - t. 118 - № Pt 9 - P. 1811-1820.

40. Freytag S.O., Paielli D.L., Gilbert J.D. Ectopic expression of the CCAAT/enhancer-binding protein alpha promotes the adipogenic program in a variety of mouse fibroblastic cells. // Genes Dev. 1994. - Jul. 15;8(14). -P. 1654-63.

41. Gage F. Mammalian CNS. // Science.-2000. V.287 (5457). -P. 1433-8

42. Galiova G., Bartova E., Kozubek S. Nuclear topography of beta-like globin gene cluster in IL-3-stimulated human leukemic K-562 cells. // Blood Cells Mol. Dis. 2004. - t. 33 - № 1 - P. 4-14.

43. Gieseke F., Bohringer J., Bussolari R., Dominici M., Handgretinger R., Miiller I. Human multipotent mesenchymal stromal cells use galectin-1 to inhibit immune effector cells. // Blood. 2010. - Nov. 11;116(19). - P.3770-9.

44. Gilchrist S., Gilbert N., Perry P., Bickmore W.A. Nuclear organization of centromeric domains is not perturbed by inhibition of histone deacetylases. // Chromosome Res. 2004. - t. 12 - № 5 - P. 505-516.

45. Hu Y., Kireev I., Plutz M., Ashourian N., Belmont A.S. Large-scale chromatin structure of inducible genes: transcription on a condensed, linear template. //J. Cell Biol. 2009.- t. 185 - № 1 - P. 87-100.

46. Janderova L., McNeil M., Murrell A., Mynatt R., Smith S. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. // Obes. Res. 2003. - Jan;l 1(1) - P.65-74.

47. Kim S.H., McQueen P.G., Lichtman M.K., Shevach E.M., Parada L.A., Misteli T. Spatial genome organization during T-cell differentiation. // Cytogenet. Genome Res. 2004.- t. 105 - № 2-4 - P. 292-301.

48. K09 O.N., Day J., Nieder M., Gerson S.L., Lazarus H.M., Krivit W. Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatment of metachromatic leukodystrophy (MLD) and Hurler syndrome (MPS-IH). // Bone Marrow Transplant.- 2002.-V.30(4).-P.215-22

49. Kopen G. C., Prockop D.J., Phinney D.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. // Proc. Natl. Acad. Science.-1999.- V.96(19).- P.10711-6

50. Kuroda M., Tanabe H., Yoshida K., Oikawa K., Saito A., Kiyuna T., Mizusawa H., Mukai K. Alteration of chromosome positioning during adipocyte differentiation. // J. Cell Sci. 2004. - t. 117 - № Pt 24 - P. 58975903.

51. Kurz A., Lampel S., Nickolenko J., Bradl J, Benner A., Zirbel R., Cremer T., Lichter P. Active and inactive genes localize preferentially in the periphery of chromosome territories. // J Cell Biol. -1996. Dec; 135(5) - P. 1195-205.

52. Lavin M.F. Ataxia-telangiectasia: from a rare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008.- t. 9 - № 10 - P. 759-769.

53. Lin F.T, Lane M.D. CCAAT/enhancer binding protein alpha is sufficient to initiate the 3T3-L1 adipocyte differentiation program. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Sep 13;91(19). -P.8757-61.

54. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S., Konishi F., Kodama H., Pan J., Sano M., Takahashi T., Hori S., Abe H., Hata J., Umezawa A., Ogawa S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. // J. Clin Invest.- 1999.-V. 103(5).-P.697-705.

55. Mathieu P.S., Loboa E. Cytoskeletal and focal adhesion influences on mesenchymal stem cell shape, mechanical properties, and differentiation down osteogenic, adipogenic and chondrogenic pathways. // Tissue Eng Part BRev. -2012.- Jun 28.

56. Matin MM, Walsh JR, Gokhale PJ, Draper JS, Bahrami AR, Morton I,

57. Moore HD, Andrews PW. Specific knockdown of Oct4 and beta2microglobulin expression by RNA interference in human embryonic stem121cells and embryonic carcinoma cells. // Stem Cells. 2004. - 22(5). — P.659-68

58. McKeon C., Pham T. Transactivation of the human insulin receptor gene by the CAAT/enhancer binding protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1991. Jan. 31; 174(2). - P.721 -8.

59. Meaburn K.J., Tom Misteli. Chromosome territories. //Nature. Vol. 2007. -January - 445125.

60. Mora L., Sánchez I., Garcia M., Ponsá M. Chromosome territory positioning of conserved homologous chromosomes in different primate species. // Chromosoma. 2006. - Oct; 115(5). - P.367-75

61. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. // Cell Science. 2000.-V.113.-P.1161-1166.

62. Nathanson M.A. Bone matrix-directed chondrogenesis of muscle in vitro. // Clin. Orthop. Relat. Res. 1985.-V.200.-P. 142-58.

63. Orlic D, Kajstura J., Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson S.M, Li B, Pickel J., McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine D.M, Leri A, Anversa P. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. // Nature. 2001. - t.410. - P. 701705.

64. Reyes M., Lund T., Lenvik T., Aguiar D., Koodie L., Verfaillie C.M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. // Blood.-2001.-V.98.-P. 2615-2625.

65. Sabatini F., Petecchia L., Tavian M., Jodon de Villeroche V., Rossi G.A., Brouty-Boye D. Human bronchial fibroblasts exhibit a mesenchymal stem cell phenotype and multilineage differentiating potentialities. // Lab Invest.-2005.-V.85(8).-P.962-71

66. Salingcarnboriboon R., Yoshitake H., Tsuji K., Obinata M., Amagasa T., Nifuji A., Noda M. Establishment of tendon-derived cell lines exhibiting pluripotent mesenchymal stem cell-like property. // Experimental Cell Research. 2003.-V.287(2).-P. 289-300.

67. Schimming R., Schmelzeisen R. Tissue-engineered bone for maxillary sinus augmentation. // J. Oral Maxillofac Surg. 2004.-V. 62 (6).-P. 724-729.123

68. Shapiro F., Koide S., Glimcher M.J. Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage. // J. Bone Joint Surg. Am. 1993- V.75 (4). - P.532-53.

69. Shoham T., Parameswaran R., Shav-Tal Y., Barda-Saad M., Zipori D. The mesenchymal stroma negatively regulates B cell lymphopoiesis through the expression of activin A. // Ann. N Y Acad. Sci. 2003.-V.996. - P.-245-60

70. Sohur U.S., Emsley J.G., Mitchell B.D., Macklis J.D. Adult neurogenesis and cellular brain repair with neural progenitors, precursors and stem cells. // Philos. Trans. R Soc. Lond. B. Biol. Sci. -2006. -V.361 (1473).-P.1477-1497.

71. Spilianakis C.G., Lalioti M.D., Town T., Lee G.R., Flavell R.A. Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. // Nature 2005. - t. 435 - № 7042 - P. 637-645.

72. Swerdlow R.H. Pathogenesis of Alzheimer's disease. // Clin. Interv. Aging. -2007. T. 2 - № 3 - P. 347-359.

73. Taddei A., Van Houwe G., Hediger F., Kalck V., Cubizolles F., Schober H., Gasser S.M. Nuclear pore association confers optimal expression levels for an inducible yeast gene. //Nature. 2006.- t. 441 - № 7094 - P. 774-778.

74. Tanaka N. Studies of chromosomfe arrangement in some higher plants. 1. Interphase chromosomes in three Liliaceous plants. // Cytologia. 1981.- t. 46-№ - P. 343-357.

75. Taupin P. Therapeutic potential of adult neural stem cells. // Recent Pat CNS DrugDiscov. 2006. - V.l (3). - P.299-303.

76. Temple S., Alvares-Buylla A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. //Curr Opin Neurobiol. -1999.-V.9 (l).-P. 135-141.

77. Toma J.G., Akhavan M., Fernandes K.J., Barnabe-Heider F., Sadikot A., Kaplan D.R., Miller F.D. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. //Nat. Cell. Biol. -2001.-V. 3.-P.778-784.

78. Tumbar T., Belmont A.S. Interphase movements of a DNA chromosome region modulated by VP16 transcriptional activator. Nat. Cell. Biol. 2001.-t. 3 - № 2 - P. 134-139.

79. Umek RM, Friedman AD, McKnight SL. CCAAT-enhancer binding protein: a component of a differentiation switch. // Science. 1991. - Jan 18;251(4991). -P. 288-92.108. van Os J., Kapur S. Schizophrenia. // Lancet. 2009.- t. 374 - № 9690 - P. 635-645.

80. Verfaillie C.M., Schwarts R., Reyes M., Jiang Y. Unexpected potential of adult stem cells. // Ann. N Y Acad. Sci. 2003.-V.996.-P.231-234.

81. Vorsanova S., Yurov Y., Iourov I. Human interphase chromosomes: a review of available molecular cytogenetic technologies. // Mol Cytogenet. 2010; 3: 1. Published online, doi: 10.1186/1755-8166-3-1.

82. Wiblin A.E., Cui W., Clark A.J., Bickmore W.A. Distinctive nuclear organisation of centromeres and regions involved in pluripotency in human embryonic stem cells. // J. Cell. Sci.- 2005.- Sep 1; 118(Pt 17)-P.3861-8.

83. Williams J.T., Southerland S.S., Souza J., Calcutt A.F., Cartledge R.G. Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes. // Am. Surg.-1999. V 65. - P.22-26.

84. Xu M., Cook P.R. 2008. The role of specialized transcription factories in chromosome pairing. Biochim Biophys Acta t. 1783 - № 11 - C. 21552160.

85. Zaehres H, Lensch MW, Daheron L, Stewart SA, Itskovitz-Eldor J., Daley GQ. High-efficiency RNA interference in human embryonic stem cells. Stem Cells. 2005. - Mar;23(3). - P.299-305

86. Zeitz M.J., Mukherjee L., Bhattacharya S., Xu J., Berezney R. A probabilistic model for the arrangement of a subset of human chromosome territories in WI38 human fibroblasts. // J. Cell. Physiol. 2009. - t. 221 - № 1 - C. 120-129.

87. Zizelmann C., Schoen R., Metzger M.C., Schmelzeisen R., Schramm A.,

88. Dott B., Bormann K.H., Gellrich N.C. Bone formation after sinus126augmentation with engineered bone. // Clin Oral Implants Res. 2007.-V.18. - P.69-73.

89. Zuccotti M, Garagna S, Merico V, Monti M, Alberto Redi C. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. // Mol. Cell. Endocrinol. -2005. Apr 29;234(l-2).-P.l 1-7

90. Zuk P.A., M. Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. // Mol. Bio. Cell.-2002.-V.13.-P. 42794295.