Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение некоторых цитологических и физиологических характеристик сифонеальной водоросли Vaucheria sessilis в условиях измененной силы тяжести

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение некоторых цитологических и физиологических характеристик сифонеальной водоросли Vaucheria sessilis в условиях измененной силы тяжести"

На правах рукописи

РУДАНОВА Елена Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК СИФОНЕАЛЬНОЙ ВОДОРОСЛИ УАиСНЕПЛ БЕББШБ В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ СИЛЫ ТЯЖЕСТИ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1998

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Б.В.Громов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.M. Безбородое кандидат биологических наук, ст.п.с. И.В. Маркова

Ведущая организация Государственный Научный Центр РФ

Институт медико - биологических проблем

Защита состоится " £." СУу^^ьД- 1998 г. в час на заседании

диссертационного совета Д 063.57.59 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, биолого-почвенный факультет СПбГУ, аудитория-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке имени A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан

"•/g 99% г.

Ученый секретарь кандидат биологических наук

Диссертационного Совета

Е.В. Ермилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Воздействие гравитации на живые организмы привлекает к себе внимание широкого круга исследователей.

К настоящему времени имеется достаточно экспериментальных данных, подтверждающих, что изменение направления и величины силы тяжести оказывает влияние на структурно-функциональные и поведенческие характеристики организмов. Однако конкретные механизмы происходящих процессов до сих пор не ясны: влияет ли гравитация опосредованно через изменение физико-химических параметров внешней среды (Таирбеков, 1994; 1996; 1997) или же мы имеем дело с прямым влиянием силы тяжести на клетку через специализированные рецепторы (СодоП е1 а1„ 1990; Мез1апс1, 1990).

В качестве объектов исследования механизмов рецепции и трансляции гравитационного сигнала в последнее время очень популярны одноклеточные эукариотические организмы, к которым относится и сифонеаль-ная водоросль \/аис1\егш Эксперименты с такими объектами отно-

сительно просты в исполнении и позволяют изучать эффекты на различных уровнях - популяционном, клеточном (организменном) и субклеточном (на уровне отдельных органелл).

Хотя природа первичного гравирецептора в большинстве случаев не установлена, общепризнанно, что универсальным первичным звеном трансляции и усиления гравитационного сигнала, независимо от структуры первичного рецептора и характера гравитационного ответа, являются элементы цитоскелета (НеттегзЬасЬ-Кгаиэе, 1988; Згёуегэ а1., 1993). Но экспериментальных данных относительно функции цитоскелета в условиях измененной силы тяжести не достаточно для окончательного решения данного вопроса. Для организмов, не имеющих специализированных гравирецепторов, экспериментальные данные практически отсутствуют.

Целью настоящей работы было изучение особенностей роста и развития сифонеальной водоросли Каысйег/а хе55г/15 в условиях измененной силы тяжести и исследование роли цитоскелетных элементов в формировании гравитационного ответа.

Поставленная цель достигалась решением следующих основных задач:

1. Изучение основных морфологических и физиологических особенностей V. (цитологического строения, динамики роста и развития).

2. Изучение воздействия измененной силы тяжести (гипергравитации, гипогравитации и микрогравитации) на рост, развитие и некото-

рые клеточные процессы V. sessШs. Описание особенностей ответа водоросли на изменение силы тяжести.

3. Исследование роли микротрубочек и микрофиламентов в реализации гравитационного ответа К^еш'/й с помощью анти-цитоскелегных агентов.

Научная новизна работы. Впервые изучены особенности реакции си-фонеальной водоросли V.sessШs (организма, не имеющего ярко выраженных гравирецепторных структур) на изменение силы тяжести. Показано, что гравитация оказывает непосредственное влияние на рост водоросли и распределение ядер в талломе. Установлено, что микротрубочки и микрофиламенты играют важную роль в реализации гравитационного ответа, но актиновая сеть является наиболее гравитационно-чувствительной.

Практическое значение работы заключается в том, что подобран и охарактеризован новый объект для исследований в области гравитационной биологии клетки, который обладает выраженной и достаточно быстрой реакцией на изменение силы тяжести. Результаты исследования могут иметь значение в решении фундаментальных проблем гравирецеп-ции и передачи гравитационного сигнала в клетке, а также в прогнозировании поведения клеточных популяций в условиях космических полетов.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований по теме диссертации доложены на XVII и XVIII Международных конференциях по гравитационной биологии (Варшава, Польша, 1996; Копенгаген, Дания, 1997), VI Европейском симпозиуме "Биологические исследования в космосе" (Трондхейм, Норвегия, 1996), II Международном симпозиуме ученых, работающих в рамках программы "РКА-НАСА" (Москва, 1996), VI Всероссийской конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (С.-Петербург, 1997), Международной конференции по анатомии и морфологии растений, посвященной 150-летию со дня рождения И.П.Бородина (С.-Петербург, 1997), VI Международном фико-логическом конгрессе (Лейден, Голландия), III Российско-американском симпозиуме "Медико-биологические исследования по программе Наука-НАСА" (Хантсвилл, Алабама, США, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из трех разделов, включающих обзор литературы, объект и методы исследований, результаты и их обсуждение; заключение, выводы. Список литературы включает 211 названий. Текст диссертации изложен на 105 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 16 рисунков.

ГЛАВА II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила сифонеальная водоросль Vaucheria sessilis (Vauch.) D.C. CALU 1024, относящаяся к отделу Xanthophyta. Штамм 745-16 Vaucheria sessilis был получен из института Физиологии Геттингенского Университета (Германия). Водоросль выращивали на стандартной минеральной среде №1 (Громов, 1965) с добавлением 1% почвенного экстракта при 20-27°С и непрерывном освещении люминесцентными лампами (1000 лк) в пробирках или конических колбах различного объема. Для экспериментов в условиях измененной силы тяжести водоросль высевали на агаризированную (1,5%-ный агар Difco) питательную среду того же состава на чашки Петри диаметром 3,6 см.

В опытах использовали вегетативные талломы и прорастающие апла-носпоры. Морфометрический анализ производили при непосредственном наблюдении и измерении морфологических параметров материала с использованием бинокуляра Биолам-10 и окуляр-микрометра, а также автоматически в приборе компьютерного анализа изображения VIDS-4. При статистической обработке вычисляли среднее арифметическое значение и ошибку среднего. Соответствие распределения случайных величин нормальному распределению оценивали по критерию^2.

Локализацию ядер в талломе V.sessilis анализировали методом флуоресцентной микроскопии. Материал окрашивали диамидино - фенил -индолом (DAPI, 5 мкг/мл) 1 ч при комнатной температуре или 12 ч при 4°С. Количество и характер распределения ядер оценивали визуально с использованием люминесцентных микроскопов МЛ-2Б и Leica DMRXA.

Подсчет количества ядер производили в стандартном объеме таллома ( длина 50 мкм, диаметр 60 мкм). Поскольку колебание толщины нити было незначительным, им можно было пренебречь. В тексте для простоты изложения везде указывается количество ядер на 50 мкм длины таллома. Статистическую обработку результатов производили выше описанным способом.

Направленное воздействие на цитоскелетные элементы проводили с помощью анти-тубулпнового агента колхицина (Sigma, конечная концентрация 50 мкг/мл) и анти-Г-актиновых агентов фаллоидина (Sigma, конечная концентрация 20 мкг/мл) и цитохалазина D (Sigma, конечная концентрация 10 мкг/мл). Фрагменты нитей и проросшие апланоспоры инкубировали в растворах антицитоскелетных агентов от 30 мин до 1,5 ч.

Для исследования ультраструктуры V. sessilis нити, предварительно зафиксированные 1,2%-ным глутаровым альдегидом, дополнительно обрабатывали 2.5%-ным глутаровым альдегидом в течение 12 ч при 4°С, постфиксировали 1%-ным OsO<t (12 ч), обезвоживали в серии спиртов

возрастающей концентрации и заключали в смесь смол Спура (Spurr, 1969). Ультратонкие срезы, приготовленные на микротоме Reichert, контрастировали 1°/о-ным уранил ацетатом и цитратом свинца и просматривали в микроскопе Tesla.

Условия гипергравитации моделировали в медленно вращающейся центрифуге типа ГМЦ-10 (изготовлена в институте им. М.Н. Богомольца, Киев, Украина). В экспериментах использовали ускорение, равное 3g.

Условия гипогравитации моделировали в медленно вращающемся клиностате с диаметром ротора 18 см и частотой вращения 6-7 об/мин.

Опыты завершали, фиксируя материал непосредственно в центрифуге или сразу после остановки клиностата в чашках Петри 1,2%-ым глута-ровым альдегидом в 0,05 М Na-фосфатном буфере (pH 7,0).

Эксперименты в условиях микрогравитации проводили на борту биоспутника БИОН-11. Биоспутник находился на орбите в течение 14 сут. Температура на протяжении всего времени полета была 20-27°С. В ходе эксперимента зрелые вегетативные талломы и прорастающие апла-носпоры развивались гетеротрофно на агаризованной (1,5%-ый агар) органической среде №3 (Громов, 1965).

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нити вегетативных талломов Vaucheria sessilis покрыты плотной целлюлозной оболочкой и лишены клеточных перегородок. Центральную часть нити занимает вытянутая вдоль ее оси вакуоль. В периферийных зонах цитоплазмы располагаются многочисленные дисковидные хлоро-пласты, митохондрии с трубчатыми кристами, ядра с выраженными ядрышками. Хлоропласты изнутри опоясаны трехтиллакоидными ламел-лами; в строме наблюдаются липидные включения. V. sessilis, как и все представители желто-зеленых водорослей, не синтезирует крахмал запасные питательные вещества накапливаются вне хлоропласта. Особенностью ультраструктурной организации рода Vaucheria является формирование комплекса аппарата Гольджи возле митохондрий, а не у ядерной оболочки. Ядра в талломах располагаются равномерно с плотностью 33+2 на каждые 50 мкм. В апикальной зоне, составляющей около 70 мкм, находится кластер ядер с плотностью 74±6 ядра на 50 мкм. Гравирецеп-торных структур таких, как статолиты или амилопласты, не обнаружено.

Цитоскелет V.sessilis, как и других водорослей, состоит из микротрубочек и микрофиламентов (Seagul, 1989; Derksen et al., 1990). Пучки микрофиламентов проходят в кортикальном слое, ориентируясь параллельно продольной оси клетки. В апикальной зоне актиновые филаменты

формируют ретикулярную структуру. Тонкие актиновые нити звездообразно расходятся от точечных локусов. Микротрубочки обычно располагаются пучками по 10-25 параллельно продольной оси клетки. В апикальной зоне они теряют упорядоченную ориентацию. Микротру-бочковые пучки ассоциированы с центриолями (Blatt et al., 1980; Ott, 1992; Peat, Oliveira, 1994).

Исследование жизненного цикла V. sessilis показало, что при прорастании апланоспор можно выделить ряд этапов, каждый из которых характеризуется определенной скоростью роста и расположением органелл. Для исследований в условиях измененной силы тяжести использовались апланоспоры на стадии формирования вегетативной нити. Эта стадия характеризуется расположением ядер, свойственным вегетативным талломам (74±6 ядер на 50 мкм в апикальной зоне и 33±2 на 50 мкм в остальной части нити).В условиях гипергравитации происходило резкое инги-бирование роста субстратных нитей вегетативного таллома и активное формирование спорангиев с апланоспорами (Табл. I).

Таблица 1

Морфометрические параметры роста вегетативных талломов V. sessUis в условиях гипергравитации (п=35-40 для каждого варианта)

вариант опыта продолжительность опыта, ч

48 96 144

А Б А Б А Б

контроль 400 2 ±0,5 2200 3 ±1 2710 2 ±0,6

гипергравитация 280 2 ±0,2 470 39 ±2 420 25 ±1

Обозначения. А - увеличение длины нити, мкм ( X конечная иачшыш»); Б - количество апланоспор на нить.

Уже в первые часы воздействия гипергравитации наблюдалось перераспределение ядер в талломе. В течение первого часа в условиях гипергравитации количество ядер в апикальной зоне роста значительно увеличивалось, но через 3 сут эксперимента плотность ядер соответствовала контрольным значениям (Табл. 2). Однако расположение ядер несколько изменялось. В базальных частях нитей наблюдались локальные участки скоплений ядер. Дополнительные ядерные кластеры формируются в зонах ветвления и предшествуют образованию спорангиев. Именно через трое суток в условиях гипергравитации регистрировалось увеличение числа спорангиев с апланоспорами.

Таблица 2

Количество ядер на 50 мкм апикальной зоны вегетативных талломов _V. яеБзШз в условиях гипергравитации (Х± Бх п=20-30 )_

вариант опыта продолжительность опыта, ч

1 2 4 6 24 72

контроль 74+6 74±6 74±6 74±6 74±6 74±6

гипергравитация 133±10 81+9 77±16 63±6 * 73±17

гипергравитация, колхицин 50±4 55±5 53±4 46±5 42±4 44+4

гипергравитация, фаллоидин 36+3 60+4 40±3 55+4 63+9 65±4

гипергравитация, цитохалазин Б 57±8 54±7 49±5 52±6 58±5 52±8

*-данные не определены

В условиях гипергравитации развитие прорастающих апланоспор ин-гибировалось. Через 4 суток скорость роста сокращалась почти в 25 раз (940 мкм/сут - в контроле; 38 мкм/сут - в опыте). Использование прорастающих апланоспор позволило полнее оценить характер распределения и плотность ядер, чем во фрагментах вегетативных талломов. Подсчет ядер проводили по всей длине нити, не травмируя ее. В течение первых часов экспозиции, как и в случае с вегетативными нитями, отмечалось увеличение числа ядер (Табл. 3).

Таблица 3

Количество ядер на 50 мкм прорастающей апланоспоры V. зеБяШз в условиях гипергравитации (X ± Бх, п=20-30 для каждого значения)

условия опыта продолжительность опыта, ч

1 2 4 6 8 24

контроль А 74 ± 6 74 ± 6 74 ±6 74 ±6 74±6 74 ± 6

Б 33 ±2 33 ± 2 33 ±2 33 ±2 33±2 33 ±2

условия гнпергравнтации А 140±4 136 ±3 81 ±6 74 ±9 79 ±5 72 ±7

Б 60±3 67 ± 3 38 ± 2 40 ± 2 49 ±2 47 ±2

гиперграви таия, колхицин А 59 ±7 80 ±33 51 ±3 60 ±5 41±2 *

Б 38 ±2 39 ±2 37 ±2 40 ±4 48±2 *

гппегравптаиия, цнтохалазнн О А 60 ± 1 68 ±8 56 ±4 59 ±6 61±3 59 ± 7

Б 38 ± 1 43 ± 2 41 ±4 39 ±'2 37±4 34 ± 2

пшеграви танин, фаллоидин А 70 ±5 73 ±7 50 ±3 56 ± I * 69 ±3

Б 49 ±2 54 ± 2 50 ± 1 47 ± 1 * 37 ± 1

ОСютачсния: А - апикальная часть нити; Б - центральная часть нити; * -"Данные не определенгы

Причем их количество возрастало во всем талломе. Через 24 часа количество и расположение ядер в целом соответствовало контролю (Табл. 3).

Таким образом, ответом V. .чемНЬ на воздействие гипергравитации является ингибирование роста, массовый спорогенез и увеличение количества ядер в нитях в первые часы воздействия.

В условиях гипогравитации также наблюдалось ингибирование роста субстратных нитей вегетативного таллома (Табл. 4). Частота спорогенеза была такой же, как в случае нормальной силы тяжести.

Таблица 4

Морфометрические параметры роста вегетативных талломов V. в условиях гипоргравитации (п=30-40 для каждого значения)

условия опыта продолжительность опыта, час

48 96 144

А Б А Б А Б

контроль 700 2 2005 3 2235 2

гипогравитация 415 0 1280 2 1500 2

Обозначения: А - увеличение длины нити в мкм ( конечное " пачллмюс); Б - количество апламоспор на нить.

Увеличение числа ядер в апикальной зоне таллома регистрировалось через 4 часа клиностатирования; через 3 суток число ядер в апикальной зоне таллома примерно вдвое превышало контрольные цифры (Табл. 5). Ядра были распределены по нити равномерно с высокой плотностью.

Таблица 5

Количество ядер на 50 мкм апикальной зоны вегетативных талломов

V. 5<?5в условиях гипогравитации ( X ± Бх, п=20-30 для каждого

значения)

условия опыта продолжительность опыта, ч

1 2 4 6 24 72

Контроль 74+6 74±6 74±6 74+6 74±6 74±6

гипогравитация 72±5 103±9 115±I6 122±20 134+9 155+12

гипогравитация, колхицин 59+5 36±3 36+4 49±П 60±9 73+12

гипогравитация, фаллопднн 64+3 67 ±7 43+6 54±11 99±11 94±7

гипогравитация, цитохалаэин О 57±8 62+7 55±5 62±6 66±8 75± 6

В условиях гипогравитации скорость роста прорастающих аплано-спор была в 10 раз ниже, чем в контроле. При этом полностью ингибиро-вался процесс ветвления нитей. Число ядер в апикальной зоне постепенно возрастало в течение 24 часов экспозиции (Табл. 6).

Таблица 6

Количество ядер на 50 мкм прорастающей апланоспоры V. sessilis в

условиях гипогравитации (X ± 8х, п= 20-30 для каждого варианта)

условия опыта продолжительность опыта, ч

1 2 4 6 24

контроль А 74 ±6 74 ± 6 74 ±6 74 ±6 74 ±6

Б 33 ±2 33 ±2 33 ±2 33 ±2 33 ¿2

условия гипогравитации А 70 ±7 78 ¿5 63 ±4 66 ±4 100 ±4

Б 30 ±5 28 ± 1 32 ± 1 41 ± 1 33 ±2

гипогравитаия, колхицин А 55 ±4 53 ±5 40 ±2 50 ±2 60 ±4

Б 31 ± 2 27 ± 1 27 ± 1 30 ±2 34 ±2

гипогравитация, цитохалазин А 74 ±7 57 ± 2 67 ±3 64 ± 2 70 ±2

Б 33 ± 1 29 ± 1 28 ± 1 31± 1 32 ± 1

гипогравитация, фаллондин А 65 ±4 47 ±7 44 ±2 46 ±6 98 ±5

Б 33 ± 1 34 ± 1 36 ± 1 31± 1 36 ± 1

Обозначения. А - апикальная часть нити; Б - центральная часть нити.

Таким образом, в ответ на условия гипер- и гипогравитации у водоросли V. ет/ц снижается скорость роста и увеличивается число ядер. В условиях гипергравитации гравитационный ответ включает также активизацию процессов апланоспорогенеза.

Увеличение числа ядер было также зарегестрировано в нитях талломов через 14 дней космического полета. Количество ядер наземного контроля на 50 мкм нити составило 24±6, а у талломов, побывавших в условиях микрогравитации 41±3.

У V. зеБвШв отсутствуют гравирецепторные органеллы, описанные для клеток водорослей и растений (статолиты и амилопласты). Вместе с тем, водоросль демонстрирует гравитационно-зависимый рост и морфогенез. Природа первичного рецептора гравитации у автотрофных эукариот практически не исследована, но имеется ряд данных, свидетельствующих, что в ходе эволюции могли быть выработаны системы рецепции, чувствительные одновременно к нескольким внешним сигналам.

Взаимодействие светового и гравитацноннного сигналов было обнаружено у плазмодия миксомицета Physarum policephalum (Block et al., 1993).Свет определенной длины волны изменяет характер гравитропизма у протонемы мха и водоросли Chara (Hodick, 1993;Demkiv, et al. 1997). У высших растений предполагают наличие рецептора, одновременно чувствительного к красному свету и гравитационному сигналу (Halstead, Dutcher, 1984/Следует отметить, что спорогенез у водоросли V.sessilis является светозависимым процессом, количество сформировавшихся апланоспор зависит от длины светового периода и спектрального состава света. Активизация апланоспорогенеза в условиях гипергравитации может косвенно указывать на существование комплексного свето-гравитационного рецептора у исследованного организма.

Независимо от природы первичного гравирецептора предполагается, что универсальным звеном в цепи передачи и усиления гравитационного сигнала является цитоскелет (Sievers et al., 1993).

Для изучения роли цитоскелетных структур в гравитационном ответе V.sessilis были использованы анти-цитоскелетные агенты. Анти-тубулиновый агент колхицин в использованных концентрациях вызывает разрушение микротрубочковых пучков, но не влияет на скорость тока цитоплазмы (Peat, Oliveira, 1994). Колхицин также является эффективным анти-митотическим агентом у водорослей (Васильев, 1996).

Действие колхицина на V. sessilis препятствовало увеличению числа ядер в ходе гравитационного ответа. После воздействия ингибитора на вегетативные талломы и прорастающие апланоспоры в условиях гипергравитации скорость роста уменьшалась и полностью блокировался спорогенез. Число ядер в первые часы центрифугирования в апикальной зоне вегетативных талломов и прорастающих апланоспор не только не увеличивалось, а напротив уменьшалось в сравнении с контролем (Табл. 2, 3). В центральной части прорастающих апланоспор количество ядер несколько увеличивалось.

В условиях гипогравитации количество ядер в вегетативных талломах и прорастающих апланоспорах не увеличивалось, располагались ядра более или менее равномерно по нити (Табл. 5, 6).

Отсутствие увеличения количества ядер в нитях V. sessilis в условиях измененной силы тяжести после обработки колхицином дает основание считать, что одним из первых этапов гравитационного ответа является активизация митотических процессов.

Для различных эукариотических одноклеточных организмов показано увеличение темпов деления на начальных стадиях воздействия измененной силы тяжести (Ирлина и др., 1989; Гаврилова и др., 1995; Таир-беков и др., 1995). В условиях микрогравитации на синхронизирован-

ных культурах хламидомонады было показано, что происходит сдвиг в продолжительности стадий жизненного цикла клетки, следствием этого является увеличение числа митозов (van den Ende, van den Briell, 1996). Можно предположить, что стимуляция деления является универсальной реакцией одноклеточных организмов на изменение силы тя-жести.Увеличение числа ядер у V.sessilis в первые часы гипергравитации, через трое суток клиностатирования и в условиях космического полета возможно указывает на участие силы тяжести в регуляции клеточного цикла.

Цитохалазин D в использованных концентрациях немедленно вызывает остановку тока цитоплазмы, разрушает кортикальные пучки мик-рофиламентов, не влияя существенно на организацию актиновой сети в зоне роста (Peat, Oliveira, 1994). При добавлении цитохалазина D в гипер- и гипогравитации скорость роста нитей V. sessilis оказывалась в 1,5 раза выше, чем в варианте без добавления ингибиторов. Ветвление отсутствовало. Число ядер в апикальной зоне таллома в первые часы центрифугирования несколько уменьшалось и поддерживалось приблизительно на том же уровне до конца опыта (Табл. 2), одновременно наблюдалось увеличение числа ядер в субапикальных зонах. Отток ядер из апикальной зоны таллома осуществляется за счет сохраняющейся системы микротрубочек.

В случае с прорастающими апланоспорами количество ядер в апикальной зоне несколько сокращалось, а в центральной соответствовало контролю (Табл. 3). В центре нити наблюдались локальные скопления ядер. Через трое суток регистрировалось активное формирование спорангиев в местах локальных скоплений ядер. После воздействия цитохалазина прекращается движение цитоплазмы, в результате чего, становится невозможным равномерное распределение ядер по таллому. В результате этого споры формируются не равномерно по всей нити, а лишь в определенных участках.

В условиях гипогравитации число ядер в вегетативном талломе и прорастающих апланоспорах оставалось в пределах нормы (Табл. 5,6).

Разрушение сети кортикальных актиновых фибрилл приводит к быстрой адаптации V. sessilis к условиям измененной силы тяжести и восстановлению скорости роста. Можно предположить, что наиболее грави-тационно-чувствительгымп элементами цитоскелета являются актиновые микроф'иламенты.

Фаллоидин соединяется с субъединицами F-актина приблизительно в соотношении 1:1. Фаллоидин-связанный актин не тяряет способности взаимодействия с миозином (Wieland, 1976, 1977). Предполагается, что фаллоидин препятствует ретикулизации актиновых фибрилл и измене-

нию их пространственной архитектуры (Blatt, Briggs, 1980; Blatt et al., 1980). Фаллоидин ингибирует рост, ветвление и спорогенез в условиях гипо- и гипергравитации и приводит к морфологическим аномалиям вне зависимости от условий роста.

Морфологические аномалии нитей V. sessilis, вызванные обработкой фаллоидина, возможно, вызваны нарушениями в формировании оболочки. Новая оболочка формируется в зоне роста за счет материала, поступающего в секреторных везикулах диктиосом.Возможно, направленный транспорт этих пузырьков и их количество обеспечивается за счет рети-кулизации актиновых фибрилл в зонах ветвления и роста.

В условиях гипогравитации обработка фаллоидином вегетативных талломов и прорастающих апланоспор в целом не приводила к изменению характера реакции на изменение силы тяжести (Табл.5, 6). Шло постепенное увеличение количества ядер в апикальной зоне нити в течение 24 часов; в центре нити число ядер на каждые 50 мкм оставалось постоянным и соответствовало контрольным значениям.

В условиях гипергравитации для вегетативных талломов были характерны большие колебания в численности ядер в апикальной зоне (Табл. 2). В случае прорастающих апланоспор в первые часы воздействия в апикальной зоне ядер становилось меньше, но росло их число в центральных частях нити (Табл. 3). Через 24 часа характер распределения и количество ядер соответствовали контролю.

Фаллоидин не блокирует деление ядер. Можно предположить, что сокращение числа ядер в апикальной зоне в первые часы в условиях гипергравитации при их увеличении в прилегающих зонах было обусловлено отсутствием структур, стабилизирующих положение ядер в кончике нити. Очевидно, в нормальных условиях постоянство числа ядер в апикальной зоне роста в значительной степени определяется особой организацией актиновой сети в ней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что сифонеальная водоросль Vaucheria sessilis, не демонстрируя гравитро-пизм, не имея гравирецепторных органелл, тем не менее проявляет гравитационно-зависимые рост и морфогенез.

В ходе исследования показано, что важным моментом при изучении гравитационного ответа является правильный выбор стадии жизненного цикла водоросли. Наиболее удачной моделью для исследования гравитационного ответа V. sessilis признана синхронная культура, представленная апланоспорами на стадии формирования вегететивной нити. Данная

стадия характеризуется значительным по длине отростком и расположением органелл,типичным для вегетативных талломов.

Показано, что гравитационный ответ V. sessilis заключается в инги-биронанки роста нитей и увеличении числа ядер, вследствии активизации митотических процессов. Гравитационный ответ, регистрируемый по числу ядер на 50 мкм нити, и спорогенез в условиях гипергравитации блокируются колхицином. Эти этапы гравитационного ответа, по-видимому, являются следствием активизации митотических процессов в условиях измененной силы тяжести. Сравнение результатов наших исследований с имеющимися в литературе данными позволяет заключить, что гравитация оказывает влияние на регуляцию клеточных циклов одноклеточных эукариот.

Эти результаты позволяют сделать вывод о непосредственном влиянии силы тяжести на клеточные процессы. Данная гипотеза впервые экспериментально подтверждена для одноклеточных эукариотических организмов.

Использованные анти-цитоскелетные агенты колхицин и цитохалазин изменяют распределение ядер в ходе гравитационного ответа V. sessilis. Это свидетельствует об участии и микротрубочек, и микрофиламентов в клеточных процессах, зависимых от силы тяжести.

Разрушение актиновых микрофиламентов под действием цитохалази-на D в условиях измененной силы тяжести нивелирует гравитационный ответ, регистрируемый по скорости роста. Можно считать, что актино-вые микрофиламенты и ток цитоплазмы, обусловленный ими, наиболее чувствительны к гравитации. Ведущая роль актомиозиновой системы в гравирецепции показана также у водоросли Chara (Sievers et al., 1996)

Воздействие фаллоидина, стабилизирующего ретикулярную структуру актиновых филаментов, приводит к морфологическим аномалиям роста вне зависимости от условий культивирования, которые связаны с нарушениями в процессе формирования оболочки. Обработка V. sessilis фал-лоидином ведет к значительному колебанию численности ядер в апикальной зоне таллома и увеличению протяженности зоны апикального скопления ядер. Это свидетельствует о том, что постоянное количество ядер в апикальной зоне поддерживается за счет особой динамичной организации актиновой сети в ней.

В настоящее время в гравитационной биологии используется очень ограниченный круг объектов. В основном это организмы, содержащие специализированные гравирецепторные структуры. Сифонеальная водоросль V. sessilis, обладающая гравитационно-зависимым ростом и морфогенезом, может стать перспективным объектом исследований не только в области гравитационной биологии, но и в области исследований

фундаментальных проблем регуляции клеточных процессов внешними факторами.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучены морфометрические параметры и динамика роста сифонеальной водоросли Vaucheria sessilis в условиях измененной гравитации. Гравитационный ответ заключается в ингибировании роста и активизации митотических процессов.

2. В присутствии анти-цитоскелетных агентов колхицина и цитохала-зина D характер гравитационного ответа изменяется, что свидетельствует о роли микротрубочек и актиновых микрофиламентов в реализации последнего.

3. Разрушение актиновых микрофиламентов под действием цитохала-зина D в условиях измененной силы тяжести нивелирует гравитационный ответ, регистрируемый по скорости роста. Можно считать, что актино-вые микрофиламенты и ток цитоплазмы, обусловленный ими, наиболее чувствительны к гравитации.

4. Нарушение фаллоидином процесса ретикулизации актиновых микрофибрилл вызывает морфологические аномалии роста вне зависимости от характера гравитационного воздействия, что свидетельствует об опосредованном влиянии ингибитора на формирование клеточной оболочки.

5. Характер распределения ядер в талломе при действии фаллоидина свидетельствует о том, что постоянство кластера ядер в апикальной зоне поддерживается динамичной структурой ее актиновой сети.

6. Проведенные исследования свидетельствуют о непосредственном воздействии гравитации на клеточные процессы V. sessilis - организма, не содержащего ярко выраженных гравирецепторных структур.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gavrilova О. V., Rudanova Е-.Е., Voloshko L.N. & A.V.Gabova. The influence of hypo- and hypergravity on growth and structure of the siphonaceuos alga Vaucheria sessilis (Vauch.) D.C. // Abstr. 6th Eur. Symp. on Life Sri. Res. in Space (ESA SP-390). Trondheim, Norvvay. 1996. P.13.

2. Gavrilova O.V., Rudanova E.E., Voloshko L.N. & A.V.Gabova. Some pecularities of the graviresponse in Vaucheria II Proc. 6th Eur. Symp. on Life Sci.Res. in Space. ESA SP-390. 1996. P.55-60.

3. Gavrilova O.V., Rudanova E.E., Voloshko L.N. & A.V.Gabova. Peculiarities of Graviperception and Graviresponces in some Unicellular Eukaryotic Organisms //J. Gravitational Physiology. 1996. V.3. № 2. P. 71-72.

4. Gavrilova O.V., Rudanova E.E., Voloshko L.N. & A.V.Gabova. Directed movement of organells and functions of the cytoskeleton in conditions of modificated gravity (Vaucheria) II Absrt. II Int. Symposium"Biomedical Research on the Science- NASA Project". Korolev, Russia, 1996. P. 28.

5. Rudanova E.E., Gavrilova O.V., Voloshko L.N. & A.V.Gabova. Some peculiarites of graviperception and graviresponces in unicellular eukaryotic organisms // Abstr. 17th Ann. Int. Gravitational Physiology Meeting. Warsaw, Poland. 1996. P.44.

6. Гаврилова O.B., А.В. Габова, Руданова E.E. и Л.Н.Волошко. Особенности распределения ядер у водоросли Vaucheria sessilis в условиях измененной силы тяжести II Цитология. 1997. Т.39. № 7. С.629-633.

7. Гаврилова О.В., Руданова Е.Е. и Л.Н.Волошко. Некоторые особенности ответа водоросли Vaucheria sessilis на измение силы тяжести. Возможные функции цитоскелета II Тезисы VI молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург. 1997. С. 21-22.

8. Gavrilova O.V., Voloshko L.N., Rudanova Е.Е. & N.N.Petrova. Germination of aplanospore of Vaucheria sessilis II Proc. Int. Conf. Plant Anatomy and Morphology (dedicated to I.P.Borodins 150 Anniversary).Sant-Petersburg. 1997. P.240.

9. Gavrilova O.V., Voloshko L.N., Rudanova E.E. & A.V.Gabova. The growth and srtucture of geminating aplanospores of algae Vaucheria sessilis under condition of hyper-, hypo-, and microgravity // Abstr. 3th Int. Symposium "Biomedical Research on the Science-NASA Project". Huntsville, Al, USA. 1997. P.107.

10. Gavrilova O.V., Rudanova E.E., Gabova A.V. & L.N.Voloshko. The position of nuclei and the role of cytoskeleton in graviresponse of siphonaceous algae Vaucheria sessilis II Abstr. 18th Ann. Int. Gravitational Physiology Meeting. Copenhagen,Denmark. 1997. P. 39.

11. Gavrilova O.V., Rudanova E.E., Gabova A.V. & L.N.VoIoshko. Position of nuclei and the role of cytoskeleton in Vaucheria sessilis graviresponse // Abstr. 6th Int. Phycological Congress. Leiden, The Netherlands. 1997. P.34.

ЛР№ 040815 от 22.05.97. Подписано к печати 6.02.98 г Усл.-печ. л 1. Тираж 100 экз. Заказ 198. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИ химии СПбГУ 198904, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр. 2.