Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных и использование микросимбионтов в биотехнологических целях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных и использование микросимбионтов в биотехнологических целях"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

УШАКОВА Нива Александровна

ИЗУЧЕНИЕ МУТУАЛИСТИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ И ЖИВОТНЫХ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОСИМБИОНТОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Специальность: 03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

Москва, 2006

Работа выполнена в Институте проблем экологии и эволюции им.А.Н.Северцова РАН

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор А.И.Нетрусов

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор Градова Н.Б.

- доктор биологических наук, профессор Азизбскян P.P.

- доктор биологических наук Семенов A.M.

Ведущая организация Российский государственный аграрный университет -МСХА им.К.А.Тимирязева, Москва

Защита диссертации состоится 9 ноября 2006г. в 15-30 часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, кафедра микробиологии, Ученому секретарю Совета Н.Ф.Пискунковой. Факс (495) 9392763

Ученый секретарь диссертационного совета

МГУ.

2006 г.

кандидат биологических наук

Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Животные и населяющие их микробные сообщества представляют собой сложно организованную систему с устойчивой структурой, в которой взаимодействие элементов строго сбалансировано, связано с разграничением функций и их специализацией.

В ходе индивидуального развития особи формируются органы и ткани, где имеются доступные для бактерий органические источники питания, поддерживается тепло, влажность. Микроорганизмы развиваются на поверхности кожного покрова животного, в различных отделах пищеварительного тракта, дыхательного и слухового путей, слизистых выстилках ано-генитальной области. Они принимают участие в Формировании неспепиФической__защиты организма и его иммунного статуса, в пищеварении, химической коммуникации, обеспечивают хозяина необходимыми продуктами микробного метаболизма (Hungate, 1966; Петровская, МаркоД976; Нейчев, 1977; Стейниер и др., 1979; Lee, 19S5; Newman, Nisengaard, 1988; Бабин и др., 1994; Tannock, 1995; Шендеров, 1998 и др.).

Физиолого-биохимические особенности симбиоптных бактерий позволяют использовать их в биотехнологических целях. Одним из активно развивающихся в настоящее время направлений использования симбионтов является разработка пробиотических препаратов для животных - живых микробных пищевых добавок, воздействующих на организм путем улучшения его микробного баланса (Fuller, 1992), стимулирующих обменные и иммунные процессы (Тараканов и др., 2004). Актуальность задачи получения эффективных пробиотиков определяется потребностями современного индустриального животноводства, птицеводства, рыбоводства в стимуляторах роста животных, и связано с ухудшением экологической, санитарно-эпидемиологической обстановки в мире на фоне тенденции общества к ограничению применения в кормах антибиотиков. В странах ЕС с 2006 года вводится запрет на использование антибиотиков в составе кормов для животных; аналогичный вопрос обсуждается и общественностью России (Ли, 2003; Миронов, Малов, 2004). Это ведет к увеличению спроса на пробиотики как альтернативы антибиотиков. Однако научные основы создания таких препаратов (в первую очередь, факторы, помогающие установлению хозяин-микробного симбиоза), источники выделения бактерий с пробиотическими свойствами, обоснованный подбор штаммов, использующихся в препаратах, механизмы их действия, реакции животного на введение пробиотика - разработаны и изучены недостаточно.

К числу перспективных направлений микробной биотехнологии относится создание пробиотических препаратов, в состав которых входят микроорганизмы с целлюлолитическими свойствами в связи с проблемами российского кормопроизводства. В последние годы структура фуражного сырья в стране претерпела значительные изменения, связанные с вынужденным введением в корма трудно перевариваемых и низкокалорийных компонентов (отруби, рожь, овсс,

ячмень, просо), увеличивших долго клетчатки в рационах животных. Это поставило задачу повышения ее переваримости, поскольку клетчатка оказывает существенное влияние на эффективность использования питательных веществ корма. Накопление растительных отходов, обогащенных клетчаткой (пивная дробина, различные типы шротов, жомов и др.), вызвало попытки их утилизации путем скармливания крупному рогатому скоту, свиньям и птице, что также создало необходимость разработки препаратов, стимулирующих пищеварение клетчатки. Поэтому актуально изучите внутренних цепей питания растительноядных животных с высокой степенью переваримости клетчатковых волокон, выделение из них целлюлолитических и иных симбионтных бактерий, участвующих в пищеварении, и разработка биотехнологии промышленного получения и применения таких микроорганизмов.

Теоретический и практический интерес представляют и другие направления использования микросимбионтов, такие, как индикация состояния здоровья хозяина (Клемпарская, 1972), биодеградация токсических органических соединений (Безбородое и др., 1998) и др. В литературе отмечена роль симбионтных бактерий в образовании информативных летучих соединений - половых феромонов, участвующих в химической коммуникации животных (Albone, Perry, 1975; Gorman, 1976; Michael et al., 1976; Brown, Schcllinck, 1992). Это указывает на возможность микробиологического получения препаратов, связанных с решением проблем размножения животных.

Настоящая работа основана на исследовании органов и тканей диких животных, в которых обитают симбионты, исходя из положения, что животные являются природным фондом микроорганизмов с разнообразными и уникальными физиолого-биохимическими свойствами (Заварзин, 1987).

Цель работы: изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных, выделение симбионтных бактерий - продуцентов биологически активных веществ и разработка способов их применения.

Задачи работы:

1) исследовать взаимодействия микроорганизмов и позвоночных животных в отдельных органах и тканях хозяина: кожном покрове, слизистых выстилках репродуктивной системы, пищеварительном тракте;

2) выделить перспективные для практического применения штаммы бактерий, изучить их культуральные и физиолого-биохимические свойства;

3) исследовать воздействие выделенных микроорганизмов и их метаболитов на биохимические и поведенческие реакции животного-реципиента;

4) создать основы технологии получения препарата на основе симбионтного продуцента биологически активных веществ с учетом физико-химических условий места обитания микроорганизма;

5) провести испытания опытных партий препарата в рационе домашних,

сельскохозяйственных животных, пушных зверей и оценить полученный эффект.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В работе исследованы механизмы взаимодействий хозяина и микроорганизмов, развивающихся на поверхности кожного покрова, в специфических кожных железах, в слизистых выстилках репродуктивной системы, в слепой кишке. Полученные данные позволили расширить представления о функциональной роли отдельных симбиотических систем и микросимбионтов. Выявлено новое значение бактерий специфических кожных желез позвоночных, секрет которых попадает в пищеварительную систему: микроорганизмы, входящие в состав сбалансированного в ходе индивидуального развития особи бактериального ценоза, выступают в роли пробиотиков, которые передаются от родителей детенышам. Показано, что симбиотические _взаимодействия между животным и вагинальным микробным ценозом направлены на совместную деятельность по регуляции отношений между полами и обеспечение успешного воспроизводства хозяина. Важное фундаментальное значение имеют исследования симбиотических взаимодействий в кишечном тракте растительноядных млекопитающих и птиц в связи с пищеварением клетчатки при дефиците азота в кормах. Из слепой кишки растительноядной птицы выделен и охарактеризован штамм ВасШш зиЬ[Шз> обладающий пробиотическими свойствами. Сделано предположение о механизме симбиотического влияния бациллы на

метаболитов - продуктов твердбф^!ОГО~сбражйвшшя_растительных компонентов кормов.

На основе изучения физико-химических условий жизнедеятельности симбионтпых бактерий в химусе слепой кишки растительноядных позвоночных разработаны основы твердофазного сбраживания клетчатковых растительных отходов с использованием кишечной бациллы В.зиЫШз. Разработана оригинальная двухстадийная технология получения пробиотического препарата - стимулятора пищеварения животных.

Практическая значимость работы. Создан пробиотический препарат Пробиоцел, имеющий существенное экономическое значение при применении в животноводстве, птицеводстве. Разработана нормативно-техническая документация для производства Пробиоцела (опытный регламент, технические условия, наставления по применению). Препарат испытан в рационах сельскохозяйственных животных: бройлеров, свиней, телят, молочных коров - в хозяйствах Московской, Белгородской областей, Алтайском крае. Получены положительные результаты при использовании Пробиоцела и его модификаций в хозяйствах. Комбинирование разработанного штамма В.зиЬНШ, стимулирующего пищеварение у животных, с клетчатковыми растительными отходами (пивной дробиной) позволяет при введении

данных отходов в рацион сельскохозяйственных животных получить дополнительные привесы живой массы животных, увеличить удои молока повышенной жирности.

Выделение из секрета специфической кожной железы микроорганизма Mlcrobactirium oxydans с пробиотическими свойствами открывает возможность использования специфических желез позвоночных животных в качестве нового источника пробиотиков.

Разработанный методологический подход к созданию в искусственных условиях бактериальных композиций, летучие метаболиты которых имитируют запах эстралыюй самки, аттрактивный для самцов своего вида, может быть применен при микробиологическом получении препаратов, стимулирующих воспроизводство сельскохозяйственных, домашних и содержащихся в неволе животных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплексный подход к изучению мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных, включающий зоологические предпосылки (анатомическое строение органов и тканей, физиолого-биохимические свойства хозяина, особенности поведения), микробиологические исследования, в сочетании с применением достижений современной биотехнологии являются научной основой выделения симбионтных бактерий-продуцентов биологически активных веществ и разработки эффективных препаратов с их использованием.

2. Специфические кожные железы позвоночных животных служат источником пробиотиков, которые передаются от родителей детенышам для обеспечения нормального развития и функционирования животного организма.

3. Участие симбионтных микроорганизмов в химической коммуникации между самцом и самкой проявляется в выделении бактериями летучих метаболитов, которые ыщягатна половое поведение самца, стимулируют процесс воспроизводства животныхГ^-^_______._______—-------------------

4. Бактерии вида Bacillus subtilis, участвующие в начальных этапах анаэробного расщепления клетчатки при дефиците азота, входят в состав нормального кишечного микробиоценоза животных и выполняют важные функции по регуляции углеводного и азотистого обмена веществ хозяина. Общий характер выявленных мутуалистических взаимодействий позволяют животным различной видовой принадлежности (свиньям, курам, крупному рогатому скоту, пушным зверям, собакам) при содержании на рационах, включающих клетчатку, использовать данные бактерии в качестве пробиотических стимуляторов пищеварения.

5. Особенности физико-химических условий жизнедеятельности симбионтных бактерий в химусе слепой кишки являются основой разработки биотехнологии твердофазного сбраживания растительного субстрата.

6. Двухстадийная схема получения пробиотического препарата с использованием выделенного штамма В. subtilis, включающая аэробное глубинное накопление биомассы пробиотика с последующим твердофазным сбраживанием

растительных отходов, позволяет получить стабильный препарат с контролируемыми свойствами, высоким биологическим и экономическим эффектом.

Публикация материалов. По теме диссертации опубликовано 36 научных работ, в том числе 21 - в рецензируемых изданиях, получены 2 патента РФ. Получен Диплом «Concours Lepine» (Paris), 2000; Золотая медаль ВВЦ, 2003; Золотая медаль IV Московского Международного Салона инноваций и инвестиций, 2004.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: 2-е Всесоюзное совещание по химической коммуникации животных. Москва, 1983; 4-й Всесоюзный съезд по териологии, Москва, 1986; 4-е Всесоюзное совещание по проблемам морских гидробионтов, Москва, 1986; Vth Int. Congress of Ecology, Iokohama, Japan, 1990; Chemical signals in vertebrates - VII, Tubingen, 1994; Проблемы эволюционной и экологической морфологии, (Школа-семинар), Москва, 15-16 мая 2001; Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках», С.-Петербург, 14-19 июня 2001; 1-й Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 октября 2002; Научпо-практическая конференция, посвященная 85-летию академика РАСХН А.П.Калашникова «Проблемы кормления сельскохозяйственных животных в современных условиях развития животноводства», Дубровицы, 9-10 февраля 2003; 2-й Московский международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября 2003; Международная конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, ВВЦ, 2-4 июня 2004; Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов», Москва, 2004; 3-й Московский международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 марта 2005.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, списка литературы; содержит 249 страниц текста, в том числе, 54 таблицы, 84 рисунка. Список цитируемой литературы включает 330 источника, из них 119 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

В данном разделе освещены известные фундаментальные представления о мутуалистических связях микроорганизмов и животных - предпосылки для использования микросимбионтов в биотехнологических целях. Отмечены перспективные направления практического применения бактерий.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В литературном обзоре приведены данные о полезных бактериях микробиоты животного - пробиотиках, и участии симбионтных микроорганизмов в химической коммуникации высших позвоночных, поскольку эти направления использованы в настоящей работе для поиска штаммов-продуцентов биологически активных веществ и разработки способов их применения.

При анализе литературных сведений о микросимбионтах животного -продуцентах биологически активных веществ, основное внимание уделено видовому составу бактерий с пробиотическими свойствами, источникам их выделения и механизмам положительного действия. Показано, что пробиотики оказывают разностороннее действие на животный организм, позволяющее применять их как для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, так и для стимуляции роста и повышения продуктивности животных.

Обсужден вопрос о симбиотической роли микроорганизмов, развивающихся в пахучих участках тела животного. Участие бактерий в химической коммуникации млекопитающих обосновывается их присутствием в местах, которые служат источниками химических сигналов, и экспериментальным доказательством способности данных микроорганизмов продуцировать летучие вещества, влияющие на поведение животных-реципиентов. Однако в большинстве работ данные, подтверждающие участие бактерий в образовании феромонов — косвенные, что объясняется сложностью получения в искусственных условиях летучих метаболитов, аналогичных природным. Возможно, это связано также с недостаточным вниманием исследователей к наличию определенных взаимодействий между организмом и его симбионтами, без разработки которых трудно оценить участие микроорганизмов в единой системе с хозяином.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования являлись симбионтные микроорганизмы животных, содержащихся в виварии Института проблем экологи и эволюции им.А.Н.Северцова РАН, на Черноголовской научно-экспериментальной базе и Утришской черноморской морской станции Института, в Московском зоопарке, Приокско-террасном заповеднике, в том числе: большая песчанка Rhombomys opimus (п=15), монгольская песчанка Mariones unguiculatus (п=10), обыкновенная полевка Microíus arvalis (n=10), сирийский хомяк Mesocricetus auraíus (n=65), хомячок Кэмпбелла Phodopus campbelli (n=60), африканская цивета Civettictis civeta (n=2), европейская косуля Capreolus capreoltis (n=2), кабарга Moschus moschiferus (n=4), северный морской котик Callorhinus nrsinus (n=7), дельфины - афалина Tursiops truncatus (n=5), иния Inia geoffrensis (n=2), глухарь Tetrao vrogallus (n=2), полуобезьяна малый толстый лори Nycticebiís pygmaeus coucang (n=10), зубр Bison bonasus (n=l), бизон Bison bison (n=2). Влияние пробиотика исследовали на курах Megapodius reinward (n-120), содержащихся во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом

институте птицеводства, свиньях Sus scrofa (п=95), крупном рогатом скоте Bos taurus L, (п=54) - в экспериментальном хозяйстве «Кленово-Чегодаево» Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства, песце Alopex lagopus (п=34) и американской норке Mustela vison (n=32) - во Всероссийском научно-исследовательском институте пушного звероводства и кролиководства на базе ОАО «Племзавод Родники», служебных собаках Canis familiaris (п=40) пород: немецкая овчарка, Лабрадор, ротвейлер Методико-кинологического центра служебного собаководства ВС РФ.

Изучение роли бактерий в химической коммуникации животных проводили в 1983-1998 г.г. С 1998 г. по 2006 г. исследовали симбиотические связи растительноядных позвоночных в связи с адаптацией животных к кормам, содержащим клетчатку. Одновременно разрабатывали пробиотические препараты и биотехнологию их получения.

В работе анализировали секреты специфических кожных желез животных и слизистых выстилок вагины. Для этого у обездвиженного животного выдавливали секрет железы, влагалище механически обездвиженной самки ежедневно в течение эстрального цикла промывали стерильным физиологическим раствором, или стерильным тампоном отбирали пробу вагинального секрета. Секрет или смыв тонким слоем наносили на предметное стекло; препараты высушивали, фиксировали, окрашивали карболовым генцианвиолетом, микроскопировали при увеличении х400 и хЮОО. Учитывали прямым подсчетом в поле зрения количество эпителиальных клеток различной морфологии, численность лейкоцитов и микроорганизмов (Киршенблат, 1969; Егоров, 1983). Ежедневным подсаживанием тестового самца контролировали наступление рецептивности у хомяков по демонстрации самкой лордоз-реакции. У полуобезьян визуально определяли степень открытости половой щели. Поведение животных изучали с помощью этологических методик наблюдений с автоматической регистрацией элементов поведения инфракрасными датчиками или путем визуального наблюдения и регистрацией по секундомеру.

Определяли зоотехнические показатели животных (массу тела, поедасмость и переваримость компонентов кормов: сухое вещество, органическое вещество, сырой протеин, сырой жир, клетчатку, безазотистые экстрактивные вещества (БЭВ) согласно методам (Томмэ, 1955; Петухова и др., 1981). При биохимическом анализе крови определяли иммуноглобулины методом радиальной иммунодиффузии по Mancini, общий азот по методу Кьельдаля; небелковый азот с реактивом Несслера; аминный азот с нингидрином; мочевину с диацетилмоноксимом; креатинин по Берхену; активность аланинаминотрансферазаы (АлЛТ) по Рейтману и Френкелю.

Бактериологические отпечатки с кожи животных, образцы секретов или химуса кишечника высевали на различные питательные среды: мясо-пептонный бульон, бульон Difco, глюкозо-пептонный бульон, питательный агар с гидролизатом кильки Дагестанского НИИ питательных сред, среду Эндо, среду Ричи для

целлюлолитических бактерий, среду Эшби для азотфиксирующих форм, а также оригинальные селективные среды доя выделения микроорганизмов, обладающих ферментами целлюлолитического комплекса, в условиях дефицита по азоту. Изучали культурально-морфологические и физиологические свойства выделенных бактерий (Методы общей бактериологии, 1984); идентификацию осуществляли согласно определителю бактерий Берджи (Bergey's Manual..., 1984, 1997), и по данным филогенетического анализа на основании секвестрования последовательностей гена 16S рРНК. Продукты сбраживания растительного субстрата выделенным штаммом Bacillus subtilis 8130 изучали с использованием хроматомасс-спектрометрического анализа дихлорметановых экстрактов. Эндоглюканазную активность оценивали вискозиметрически (Синицын и др., 1995). Пробиотаческие свойства бактерий, связанные с их способностью стимулировать развитие лактобактерий в модельных системах, изучали по разработанной оригинальной методике. При этом определяли индекс стимуляции по отношению количества клеток суточной тест-культуры в 1 мл глюкозо-пептонной среды в присутствии B.subtilis 8130 к числу клеток суточной тест-культуры в 1 мл питательной среды аналогичного состава в контроле (без бациллы). Количество клеток бактерий подсчитывали по методу Виноградского-Брида (Егоров, 1983).

Биотехнологические приемы получения пробиотических препаратов включали выращивание посевного материала на жидкой глюкозо-пептонной среде (Методы общей бактериологии, 1984). Глубинное культивирование бактерий осуществляли в колбах на микробиологической термостатированной качалке, 225 об/мин., в ферментерах объемом 30-,100-л на базах: ФГУП ГОСНИИСИНТЕЗ БЕЛОК, г.Москва; НТ1Д «БИО», г.Шебекино, Белгородская обл.; ФГУ Краснодарский биоцентр, г.Краснодар. Сырье для твердофазной ферментации стерилизовали прогреванием в сушильном шкафу при 120°С и высоте слоя субстрата до 5 см в течение 2-х часов, а также с использованием установки сухой УФ-стерилизации типа «Альбатрос ОСП», либо текучим паром в смесителе-стерилизаторе на базе Вышневолоцкого завода ферментных препаратов, г. Вышний Волочок. Твердофазную ферментацию осуществляли в запаянных полиэтиленовых пакетах, мешках, в баках с закрытой крышкой, в смесителе-стерилизаторе. Сушку готового препарата проводили при 60°С с использованием лабораторной сушильной установки фирмы «Аэроматик» (на базе МГУ инженерной экологии), полочных сушилок на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов и заводе «Ректинал», г.Краснодар. В продукте твердофазной ферментации определяли плотность популяции бактерий как число клеток в единице объема, занимаемого популяцией (Печуркин и др., 1990). Общую численность клеток оценивали методом Виноградского-Брида, подсчитывая клетки в окрашенных мазках площадью 1 см2, с нанесенными 20 мкл разведенной в 100-200 раз суспензии, полученной при встряхивании 10 г массы в 100 мл стерильного физраствора с добавлением 10% речной гальки; из этой же суспензии делали высевы последовательных разведений на МПА для определения КОЕ; pH, эндоглюканазную

активность и индекс стимуляции развития лактобацилл определяли в супернатантс после разведения 5 г сырого продукта твердофазной ферментации в 15 мл воды, встряхивании 30 минут и последующим центрифугированием (7000 об/мин, 15 мин).

Расчет ферментативных активностей, построение графиков и статистическая обработка полученных данных (Максимов, Федоров, 1969 и др.) проводились с использованием программ Microsoft Exel, Statistica 6.0, Origin 4, 5, MathCAD. Определяли среднее квадратичное отклонение, среднюю квадратичную ошибку и достоверность отличий показателей. При подсчете числа клеток и определении эндоглюканазной активности ошибка не превышала 15%.

Экспериментальные результаты получены автором лично, а также совместно с коллегами из ИПЭЭ РАН и других институтов. Соискателю принадлежат разработка методологии и проведение основных экспериментов, микробиологические исследования, разработка твердофазного сбраживания субстратов, технологических схем получения препарата Пробиоцел, теоретическое обобщение полученных результатов, участие в проработке и написании нормативно-технической документации, организации испытаний препарата. Общая схема основных этапов работы представлена на рис. 1.

Изучение свойст продуцента биологически активных веществ

Лабораторная разработка технологии получения препарата

Масштабирование лабораторного процесса

Участие в разработке технологических регламентов

Основа работы -изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животного, выделение перспективного симбионтного микроорганизма

Организация производственных испытаний

Разработка наставлений по применению препарата

Рисунок 1. Общая схема основных этапов работы

Глава 3. МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОТДЕЛЬНЫХ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ЖИВОТНОГО КАК СРЕДЫ ОБИТАНИЯ СИМБИОНТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ: РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К НАПРАВЛЕННОМУ ПОИСКУ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ВЕЩЕСТВ

Выявление закономерностей симбиоза животных с бактериями связано с морфо-функциональным анализом органов хозяина, приспособленных для развития микроорганизмов.

3.1. КОЖНЫЙ ПОКРОВ

Наружные покровы животных, и особенно участки, где скапливаются богатые питательными веществами, и в то же время доступные выделения сальных и потовых кожных желез, служат естественной средой обитания бактерий (Ушакова, 1984; Соколов, Ушакова, 1986; Ушакова, Степанова, Абрамова, 1986; Ушакова, 1988; Ушакова, Абрамова, 1989; Соколов, Ушакова и др., 1991; Соколов, Ушакова, Козлова, 1994; Ушакова, 1998). Хозяин и бактерии на поверхности кожно-волосяного покрова — система, находящаяся в динамическом равновесии. Симбиотические связи хозяина с микробиоценозом наружного покрова находятся в зависимости от состояния здоровья особи, которое определяет количественные показатели и видовой состав кожных микроорганизмов (Клемпарская, Шалыгова, 1966). В случае отклонения от нормального состояния животного наблюдается возрастание численности условно патогенных коли-форм и других грамотрицательных бактерий, что рассматривается нами как проявление кожного дисбактериоза, аналогично нарушению баланса микросимбионтов в кишечнике при заболеваниях различной этиологии. В работе были обследованы северные морские котики, дельфины (с помощью отпечатков на агаровые питательные среды бактерий с поверхности неоволосненных участков кожи ласт котиков и отпечатков вокруг спинного плавника дельфинов). Характеристиками микробных ценозов кожи, коррелирующими с состоянием здоровья животных, явились общая численность бактерий в отпечатке, а также количество колоний грамотрицательных лактозосбраживающих и грамположительных пигментированных бактерий. В частности, здоровые северные морские котики, содержавшиеся в неволе более трех лет, имели в среднем 12 колоний в отпечатке (8=3 см2), среди которых практически отсутствовали коли-формы и псевдомонасы, а доля пигментированных микрококков, стафилококков и микобактерий в сумме не превышала 30%. У больных и стрессированных особей эти показатели были достоверно выше (табл. 1).

Представленные данные указывают на то, что характеристики кожного микробиоценоза могут использоваться для оценки общего состояния животного в практике их содержания и разведения, однако для поиска штаммов-продуцентов биологически активных веществ в биотехнологических целях следует обследовать только здоровых животных для снижения риска выделения патогенных бактерий.

Таблица 1. Характеристика бактериальных ценозов кожи северных морских котиков в зависимости от их физиологического состояния

Груп Характеристика Чис- Чис- Количество колоний в отпечатке

па состояния ло ло Грам-, Грам+ с Грам+ без

животных осо- отпе- Всего сбражива- пигментом пигмента

бей чат- ющие лактозу

ков х±5 % х±5 % х±5 % х±5 %

I Здоровы, в неволе от 3 мсс. до 3 лет 3 92 12.0± 2.6 100* 0.33± 0.37 2.75** 4.7± 2.5 39.1 * 7.0± 3.6 57.5*

II С изменениями в физиологическом состоянии, без значительной патологии, стрессированные 2 30 46.8± 4.2 100* 8.8± 2.5 18.6** 20.6 ± 1.3 44.0 * 17.4 ± 1.9 37.2*

III Больные с выраженной клинической картиной 2 36 77.3± 5.8 100* 17.б± 5.3 22.8** 47.2 ±9.9 61.1 * 12.5 16.2*

* Разница между всеми группами достоверна (р<0.01); ** разница достоверна р<0.01) между группами I и II и между группами I и III, а между группами II и III - недостоверна (р>0.01)

С кожи здоровых особей выделялись стафилококки, микрококки, пропионовокислые бактерии, дифтероиды, бациллы. Эти группы микроорганизмов обладают выраженными защитными свойствами, часто связанными с образованием антибиотиков. Показано, что продукция антибиотиков кожными бактериями — общее и значительное явление (Selwyn, 1975), которое может быть существенным фактором в естественном иммунитете. Важна также санитарная роль микроорганизмов наружных покровов животных, которая проявляется в разложении загрязняющих кожу веществ. Такие свойства микросимбионтов позволяют рассматривать кожные бактерии как перспективные для использования в установках по биодеградации токсических органических веществ. Так, например, с поверхности кожи северного морского котика был выделен штамм нокардии Nocardia rugosa, растущий на " дизельном топливе, метилэтилкетоне, перспективный для применения в биореакторе по очистке воздуха от техногенных летучих органических соединений (Безбородов и Др., 1998).

3.1.1. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ КОЖНЫЕ ЖЕЛЕЗЫ

В последнее время возросло внимание исследователей к специфическим кожным железам - функционально специализированным органам кожного покрова, в связи с возможным разносторонним влиянием их на физиологию животного организма (Соколов, Степанова, 1987; Бодяк, 1994; Соколов, Чернова, 2001). Специфические кожные железы известны для представителей всех крупных таксонов типа Хордовых, включая Млекопитающих. При классификации по расположению на теле животного выделено около 40 различных видов специфических желез — заушные, предглазничные, подбородочные, тарзальные, среднебрюшные, подхвостовые, паховые, анальные, межпальцевые, и др. (Brown, 1979). Строение специфических кожных желез характеризуется наличием относительно большого по объему резервуара (несколько мл), в котором накапливается секрет сальных, либо смешанный секрет сальных и апокриновых желез, выводные протоки которых открываются в общую полость, куда попадают также отшелушившиеся клетки эпителия. Общий резервуар специфической железы служит своеобразной бродильной камерой, в которой происходит развитие симбионтных микроорганизмов.

Нами проведено микробиологическое обследование секретов среднебрюшной железы большой, монгольской песчанок, препуциального мешка кабарги, перинеального органа африканской циветы, межпальцевых областей зубра, бизона, межпальцевых желез европейской косули, африканского дукера, дополнительных мешочков в устье защечных мешков хомячка Кэмпбелла. Во всех секретах присутствовали микроорганизмы (Соколов, Ушакова, Исаев, 1983; Ушакова, Андреев, 1985, 1986а, б; Ушакова, 1986; Соколов, Ушакова и др., 1990).

Становление микробиоценоза секретов кожных желез начинается в раннем постнатальном онтогенезе и завершается с переходом детеныша на смешанную диету, окончательно формируясь к началу самостоятельного образа жизни. Динамика микробиоценоза специфических кожных желез в процессе индивидуального развития хозяина изучена в секретах дополнительных мешочков (ДМ) в устье защечных мешков хомячка Кэмпбелла (.Phodopus campbelli) (Соколов, Ушакова и др., 1994; Феоктистова, Ушакова, Мещерский, 2004). Эти образования представляют собой карманообразные углубления, расположенные симметрично в углах рта между тканями щеки и защечного мешка, заполненные секретом. Стенки мешочков не содержат железистой ткани; ороговевшие клетки их эпителиальной выстилки слущиваются в полость мешочка, где смешиваются с поступающим секретом сальных желез угла рта. Морфология мешочков указывает на наиболее вероятное назначение данных структур в качестве культиваторов симбионтных бактерий, использующих секрет, поступающий в мешочек, как питательный субстрат.

Установлено, что микробное сообщество в секрете ДМ - специфическая система, характеризующаяся определенным видовым составом и количественным соотношением форм бактерий, зависящем от возраста животного и его репродуктивного статуса. Для этого были проанализированы образцы секрета ДМ,

полученные от взрослых половозрелых хомячков Кэмпбелла, а также секрет ДМ двух групп детенышей этого вида: 1 - детеныши от интактных родителей, 2 - детеныши от родителей, которым за месяц до появления выводков были удалены ДМ. В норме в секрете ДМ в устье защечных мешков у взрослых половозрелых хомячков Ph. campbelli в качестве основных форм присутствовали грамположительные кокки Streptococcus faecium, Streptococcus sp. и палочки, относящиеся к виду Microbacterium охуdarts, а также представители Actinomyces, Lactobacillus. В качестве минорных компонентов высевались Streptococcus salivarius, Lactobacillus sp., представители родов Bacillus, Proteus, Pseudomonas.

Наблюдения за формированием микробного сообщества в секрете ДМ были начаты с 6-суточных детенышей, у которых ДМ видны в виде белых пятнышек диаметром около 1 мм. На поверхности закладывающихся желез концентрировались все доминирующие в будущем формы бактерий, отмеченные в секрете ДМ взрослых особей (рис. 2а). Стабилизация численности основных форм бактерий в секрете ДМ произошла к 20-дневному возрасту с соотношением форм: 47% в сумме S.faecium и Streptococcus sp. и 42% палочек, из которых 33% - Microbacterium oxydans. В период с 20- до 30-дневного возраста у детенышей бактериальная композиция в секрете ДМ оставалось практически неизменной и сходной с таковой у взрослых особей.

0.6 0.4 0.2

5 10 15 20 25 Возраст хомячков, днн

30

10 15 20 25 Возраст хомячков, дни

Рисунок 2. Динамика численности (И в долях от единицы) бактерий секрета ДМ детенышей хомячка Кэмпбелла от интактных родителей (а) и от родителей с удаленными ДМ (б) в онтогенезе. В секретах самок: 1 — кокки, 2 - палочки; в секретах самцов: 3 - кокки, 4 - палочки

Завершение становления бактериального ценоза в секрете ДМ к 20-ти дневному возрасту детенышей согласуется с биологией хомячка Кэмпбелла. В природе в возрасте 18 -20 дней детеныши покидают нору самки накануне рождения ею следующего выводка, и переходят к самостоятельному образу жизни, что возможно только при условии полного развития всех функциональных систем, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность организма:.

В секрете ДМ детенышей, выращенных в группах с родителями, у которых были удалены ДМ, соотношение видов бактерий было иным, чем у детенышей от интактных родителей (рис.2б), за счет существенного уменьшения численности палочек Microbacterium oxydans. Лишение животного возможности получать секрет ДМ ведет к дисбактериозу, нарушениям пищеварения, понижению общей резистентности организма. Очевидно, что микробиоценоз секрета ДМ способен выделять биологически активные вещества. Было предположено, что основной продуцент в данном ценозе - Microbacterium oxydans, поскольку уменьшение численности именно этого микроорганизма характерно для животных с нетипично сформированным микробным сообществом в секрете ДМ. Бактерию выделили в чистом виде и изучили свойства. Идентификацию А/. oxydans проводили на основании культурально-морфологических и физиологических свойств, а также по данным филогенетического анализа гена 16S рРНК и анализа состава клеточной стенки (Ушакова и др., 2004). Штамм M. oxydans обладал пробиотическими свойствами, которые выразились в увеличении массы тела и ряда внутренних органов опытных животных сирийских хомяков Mesocricetus auratus, получавших per os суспензию живых бактерий M. oxydans в течение 20 сут (табл.2), а также в стимуляции у них иммунитета.

Таблица 2. Абсолютная и относительная масса тела и внутренних органов самцов и самок Mesocricetus auratus при введении им per os суспензии живых клеток штамма М. oxydans

Тело или орган Абсолютная масса тела (г) и органов (мг) (относительная масса органов, мг/г)

Контроль, 5 выводков Опыт, 4 выводка

Самцы (п=14) Самки (п=11) Самцы (п=9) Самки (п=9)

Тело 44.4±1.8 44.2±2.6 58.9±1.8 62.2±1.6

Матка 91.0113.2 (2.06+0.002) - 151.3±13.2 (2.43±0.002)

Яичники 8.8±0.7 (0.20±0.001) - 14.0±0.8 (0.23±0.005)

Семенники 303.4±19.5 (6.83±0.003) - 424.3+10.4 (7.20±0.002) -

Эпидидимус 18.4+1.5 (0.41+0.002) - 26.6±1.6 (0.45±0.002) ■

Селезенка 77.6±5.3 (1.75+0.014) 70.4+5.1 (1.59±0.001) 108.8+4.2 (1.85+0.007) 119.0+4.5 (1.91+0.006)

Надпочечники 3.3±0.3 (0.07+0.001) 3.2±0.3 (0.07±0.007) 3.9±0.3 (0.07±0.005) 4.4+0.2 (0.07±0.005)

Тимус 48.2±3.2 (1.09±0.005) 50.7+4.9 (1.15+0.007) 75.7±6.0 (1.29±0.007) 71.7±6.7 (1.15±0.001)

Специальные исследования показали статистически достоверное повышение уровня ^ в (в 5 раз, р<0.05) у опытных особей сирийского хомяка по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе (соответственно, 65.8 г/л и 12.6 г/л). Почти в 2 раза увеличилось содержание А: 16.0 г/л у опытных животных и 8.3 г/л у контрольных.

Полученные данные свидетельствуют о важной физиологической роли формирующегося в ходе индивидуального развития особи микробного ценоза секретов специфических кожных желез животных, и о возможности обнаружения эффективных ауто- и пробиотиков в специальных морфологических образованиях кожного покрова, секрет которых попадает в пищеварительный тракт.

3.2.СЛИЗИСТЫЕ ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ

Слизистые выстилки половой системы животных служат местами обитания микроорганизмов, адаптированных к специфике условий данной экологической ниши,' главными из которых являются гормональные перестройки метаболизма хозяина в зависимости от стадии полового цикла и репродуктивного состояния (Соколов, Ушакова, 1991; Ушакова, 1991, 1996). Функциональное значение микроорганизмов, заселивших слизистые половой системы, практически не изучено. Возможно, бактерии являются защитой от инфекций, превращают гликоген в молочную кислоту и создают определенный рН среды, необходимый для оплодотворения. Предполагается также, что вагинальные микросимбионты участвуют в химической коммуникации животных.

Среди различных химических сигналов, использующихся в коммуникации животных, наиболее важными являются половые феромоны. Они кодируют информацию о виде, поле, физиологическом состоянии особи, непосредственно управляют процессом спаривания. Источниками половых феромонов могут служить продукты жизнедеятельности как самого животного, так и бактерий, развивающихся в слизистых выстилках половой системы.

Гистологическое исследование слизистой вагины ряда видов млекопитающих показало, что компонентами данной системы являются эпителиальные клетки различной морфологии и степени ороговевания, микроорганизмы и лейкоциты. При этом выявляется общая закономерность: количество бактерий, лейкоцитов, ороговевших клеток эпителия — автоколебательный процесс, отражающий циклические гормональные перестройки слизистой.

Изучено участие вагинальных бактерий в химической коммуникации между самцом и самкой (Соколов, Ушакова и др., 1994). В качестве объекта исследования был выбран хомячок Кэмпбелла, т.к. в природе самка в период эструса, прижимая ано-генитальную область к субстрату, метит территоршо, по-видимому, половым аттрактантом (\Vynne-Edwards е1 а1., 1992). Для выяснения влияния на поведение самцов хомячка Кэмпбелла летучих продуктов метаболизма бактерий, выделенных из

вагинального секрета самок, были воссозданы комбинации бактерий, аналогичные композиции симбионтов в секрете на разных стадиях эстрального цикла. Для этого из образцов вагинальной слизи самки в разные фазы полового цикла были выделены бактерии. Одновременно делали мазки слизи, в которых подсчитывали процентное соотношение форм бактерий. Затем на агаризованные питательные среды, разделив чашку Петри на сектора, высевали те формы микроорганизмов и в том соотношении, которые соответствовали качественному составу и количественному соотношению форм в вагинальном секрете эстральной самки, самки в проэструсе и анэструсе. Бактерии выращивали при 30°С в аэробных условиях до 9 сут. Чашки с бактериями разного возраста и контролем (чашка со стерильной питательной средой) предъявляли самцам для обнюхивания. Эстральный цикл самки хомячка Кэмпбелда длился, как правило, 4 сут. Картина слизи вагинальных мазков претерпевала циклические изменения (рис.3). Учитывали прямым подсчетом в поле зрения микроскопа количество эпителиальных клеток различной морфологии при увеличении х400, численность лейкоцитов и бактерий - при увеличении хЮОО. Стадия проэструса характеризовалась повышенным общим количеством микроорганизмов и доминированием кокковых форм бактерий в вагинальном секрете; в эструсе преобладали дифтероиды; в анэструсе количество кокковых и бациллярных форм было одинаковым.

/

1 Эструс 2

4 День цикла

Рисунок 3. Колебания численности компонентов вагинальной слизи самки РЪос1ориз сатрЬеШ в течение эстрального цикла. 1 — количество бактерий, 1 : 10,2 — число лейкоцитов, 3 — количество ороговевших эпителиальных клеток. Кружками отмечены моменты цикла, в которые отбирали пробы бактерий из вагинального секрета. Дни цикла: 1 — проэструс, 2 — эструс, 3 — метэструс, 4 — диэструс

Самцам для обнюхивания были предъявлены препараты бактерий, выращенных в течение 2, 3, 5 - 9 сут. Результаты тестирования представлены на рис.4.

Ш

100

u;

ki

аг

ог

У в?

в«

9 tym

Рисунок 4. Продолжительность исследования самцами хомячка Кэмпбелла (за 10 мин) запаха искусственных комплексов бактерий, соответствующих композиции вагинальных бактерий самки на разных стадиях эстрального цикла: 1 — проэструс, 2 — эструс, 3 — анэструс, 4 — контроль. По оси абсцисс отложено время культивирования бактерий

Различия в продолжительности обнюхивания достоверны для 3-х и 5-ти суточных комплексов, отражающих эстральную композицию, в сравнении со всеми остальными вариантами. Эксперимент показал, что при культивировании микроорганизмов в лабораторных условиях в течение 3-5 суток запах вагинальных бактерий, имитирующих вагинальный микробиоценоз астральной самки, обладал аттрактивным эффектом для самцов. Полученные данные позволили сделать вывод, что на основании изучения бактериального ценоза вагинальной слизи в динамике полового цикла возможно подобрать комбинации бактерий, при культивировании которых на специальных питательных средах образуются летучие вещества, оказывающие воздействие на самцов, сходное с действием запаха эстральной самки своего вида. В работе разработан методологический подход к получению полового аттрактанта для самцов с помощью летучих продуктов метаболизма вагинальных бактерий, выращенных в искусственных условиях. Для подтверждения эффективности данного подхода, была проведена экспериментальная работа на представителе приматов - малом толстом лори (Соколов, Ушакова и др., 1993).

Анализ вагинальных смывов показал, что у всех обследованных самок лори влагалище открывалось на период эструса, о чем свидетельствовало высокое содержание в мазках полностью ороговевших эпителиальных клеток (80—90%). Влагалище закрывалось, когда число чешуек составляло менее 50%. Из вагинального секрета эстральной самки малого толстого лори (количество полностью ороговевших эпителиальных клеток - 98%) в период открытой половой щели были выделены микроорганизмы. Среди них присутствовали представители родов Proteus, Lactobacterium, Brevibacterium (В. epidermidis), Aerococcus, Bacillus, Staphylococcus. Микроорганизмы от эстральной самки, выращенные в различных сочетаниях и на различных питательных средах, были предъявлены самцам для изучения влияния

летучих метаболитов бактерий на поведение животных (табл. 3). Обнаружено, что при предъявлении животным для обнюхивания смеси № 3 на питательном агаре с лактозой все самцы приходили в половое возбуждение; они активно метили ту часть клетки, вблизи которой находилась чашка с данной смесью бактерий, и со специфическими звуковыми сигналами начинали поиск самки. У некоторых самцов запах вызвал эрекцию.

Данный эксперимент продемонстрировал возможность искусственного стимулирования полового поведения самцов лори с помощью симбионтных бактерий.

Таблица 3. Поведенческая реакция самцов малого толстого лори на запах разных комбинаций вагинальных бактерий, выращенных в течение 5 сут на искусственных средах

Номер Питательная среда Регистрация количества Средняя

смеси подходов(в %) на длительность

бактерий расстояние < 0,5 м обнюхивания, с

1 Питательный агар с лактозой 1,9 ±0,3 15,2 ±2,3

2 То же 3,3 ± 0,8 34,3 ± 4,4

3 То же 10,8 ± 1,5 40,1 ±4,5

3 Питательный агар 2,8 ± 0,4 7,3 ±2,7

На двух неродственных видах млекопитающих показано, что вагинальные бактерии способны синтезировать летучие продукты, влияющие на поведение самцов. Для получения биологически активного запаха необходим набор разных видов симбиотических бактерий в определенном количественном соотношении, зависящем от гормональных перестроек организма самки. Взаимодействие вагинальных микросимбионтов с эстралыюй самкой можно рассматривать как проявление мутуализма, когда в определенные периоды гормональной активности создаются специфические условия, обеспечивающие преимущественное развитие определенных форм бактерий. Эти симбионты выделяют биологически активные летучие метаболиты, воздействующие на поведение животных противоположного пола. Конечная цель - осуществление процесса воспроизводства. Эксперименты представляют основу для разработки биотехнологии получения микробиологических препаратов, направленных на стимуляцию полового поведения самцов различной видовой принадлежности.

3.3. ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЙ ТРАКТ

Пищеварительный тракт животных является одной из наиболее изученных морфологических структур в отношении заселения микроорганизмами различных его отделов и функциональной роли симбионтов. Количественный и видовой состав микробиоценозов кишечного тракта здоровых животных специфичен для каждого отдела кишечника. В настоящем исследовании основное внимание обращено на слепую кишку в связи с рассмотрением вопросов переваримости клетчатки - одного из наиболее труднодоступных компонентов в составе рациона диких, домашних и сельскохозяйственных животных.

3.3.1. СЛЕПАЯ КИШКА НЕЖВАЧНЫХ РАСТИТЕЛЬНОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ КАК СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ОРГАН, ПРИСПОСОБЛЕННЫЙ ДЛЯ СИМБИОНТНОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ КЛЕТЧАТКИ

Отличительной особенностью растительноядных нежвачных млекопитающих и некоторых птиц является способность использовать естественные корма с повышенным содержанием клетчатки - сено, ветки, хвою и т.п., которые при низкой калорийности обеспечивают активный образ жизни животных, требующий значительных энергозатрат. Это указывает на высокую эффективность и недостаточную изученность механизмов пищеварения клетчатки у данного типа позвоночных животных.

У нежвачных фитофагов анатомическое строение толстого отдела кишечника характеризуется развитым слепым отростком. Поскольку потребленная растительная пища при прохождении через желудок и тонкий отдел кишечника обедняется белками, легкодоступными углеводами и жирами, в пищевой массе, поступающей в слепую кишку, возрастает относительное содержание клетчатки. По литературным данным в этом отделе желудочно-кишечного тракта наблюдается наибольшая целлюлазная активность, что подтверждает роль слепой кишки как места локализации основных процессов переваривания клетчатки у нежвачных животных.

Эффективное использование клетчатки связано с механизмами ее расщепления, а, следовательно, с наличием активных целлюлолитических микроорганизмов. Кишечные симбионты хорошо изучены у домашних и сельскохозяйственных видов животных, и в меньшей степени — у диких. Количество бактерий в слепой кишке велико, сравнимо с численностью симбионтов в рубце жвачных, и, например, для овцы, мыши составляет Ю10 организмов в 1 мл жидкости. Окислительно-восстановительный потенциал в слепой кишке мыши равен -200 мВ, что свидетельствует об анаэробном характере метаболизма у симбионтов этого отдела кишечника. Дуоденальные железы за счет выделения щелочного секрета обеспечивают нейтрализацию кислой среды поступающего из желудка химуса, что имеет существенное значение для развития микроорганизмов.

Приведенные данные указывают на важную роль слепой кишки в адаптации растительноядных животных к питанию низкопротеиновым клетчатковым кормом.

При этом обращает на себя внимание вопрос обеспечения симбионтов азотом. У жвачных существует механизм реутилизации мочевины, вторично поступающей в желудочно-кишечный тракт для восполнения дефицита азота в растительных кормах. Для нежвачных животных такой путь не выявлен, и в литературе обсуждается возможность симбионтной азотфиксации. Нами (Павлов, Наумова, Ушакова и др., 1999) из химуса слепой кишки диких позвоночных животных, эффективно использующих клетчатку (полевок, песчанок, зайцев, глухаря), были выделены смешанные культуры микроорганизмов, состоящие из представителей рода Bacillus, обладающих эндоглюканазной активностью (способностью деполимеризовать целлюлозу за счет выделения эндо-1,4-р-глюканазы), и азотфиксирующих бактерий рода Klebsiella (Наумова, Ушакова и др., 2000; Наумова, Мещерский, Ушакова, 2001; Ушакова, 2001; Ушакова и др., 2003). Было высказано предположение, что в подобном трофическом комплексе клебсиелла является дополнительным донором азота для бациллы, а продукты метаболизма последней в свою очередь, используются как клебсиеллой, так и другими членами кишечного микробиоценоза.

Адаптация растительноядных позвоночных к обедненным азотом и обогащенным клетчаткой кормам может быть связана с развитием кишечных симбионтных бактерий, обладающих ферментами целлюлолитического комплекса, и способных переводить азот растительных кормов в доступные для усвоения животным низкомолекулярные азотистые органические соединения. К таким микроорганизмам относится бацилла, выделенная нами на безазотистой среде Эшби с целлюлозой в качестве источника углерода из слепой кишки глухаря в зимний период, когда эта крупная птица питалась хвоей с высоким содержанием лигпоцеллюлозы. Микроорганизм был идентифицирован с помощью методов генной систематики как Bacillus subtilis. Культурально-морфологические особенности соответствовали признакам, характерным для данного вида. Участие штамма в процессах, обеспечивающих расщепление целлюлозы кормов в кишечнике хозяина в условиях затрудненного доступа кислорода, и связи микроорганизма с эффективным использованием животным азота растительных кормов, были подтверждены в дальнейшей работе.

В целом, в данной главе показано, что морфология и физиологические особенности отдельных органов и тканей хозяина определяют присутствие в этих местах адаптированных к специфике конкретной экологической ниши видов симбионтных микроорганизмов, синтез которыми биологически активных веществ зависит от функционального назначения органа/ткани. Выделенные штаммы бактерий могут быть использованы в биотехнологических целях. И хотя все приведенные в главе исследования обладают потенциальной практической значимостью, реальное развитие с выходом в сельское хозяйство получило направление, связанное с изучением механизмов пробиотического действия кишечного симбионта - выделенного штамма Bacillus subtilis.

Глава 4. МУТУАЛИСТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И ЖИВОТНОГО НА ПРИМЕРЕ СВЯЗИ МЕЖДУ СИМБИОНТНЫМ ПИЩЕВАРЕНИЕМ КЛЕТЧАТКИ И АЗОТИСТЫМ ОБМЕНОМ ВЕЩЕСТВ У ХОЗЯИНА

Мутуалистические взаимодействия животного с микроорганизмами, имеющие практическую направленность, изучали на примере связи пищеварения клетчатки симбионтами растительноядных позвоночных с азотистым обменом веществ у хозяина. Исследовали влияние на эти процессы описанного в предыдущей главе штамма Bacillus subtilis с перспективой получения биологически активной (пробиотической) кормовой добавки для сельскохозяйственных и домашних животных.

Выбор штамма определили его физиолого-биохимические свойства, естественная экологическая ниша, из которой выделен микроорганизм, условия питания хозяина, и литературные данные об экологии и пробиотических свойствах бактерий рода Bacillus. Штамм был депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номером Bacillus subtilis В-8130, и в последующем упрощенно назывался Bacillus subtilis 8130.

Определяющее значение для эффективности пробиотического препарата имеют биологические особенности используемого штамма бактерий. Поэтому тучное обоснование выбора микроорганизма, обладающего качествами пробиотика, является основой создания препарата. И если правомерность применения лакто- и бифидобактерий в качестве пробиотиков не вызывает сомнений в силу их резидентного характера, т.е. постоянного присутствия в пищеварительной системе животных, то в отношении пробиотиков - представителей рода Bacillus вопрос сложнее. Если они и обнаруживаются в кишечном тракте, то в небольшом количестве. Так почему многие современные пробиотические препараты содержат бактерии нескольких видов Bacillus? Каковы фундаментальные основы, объясняющие наличие пробиотических свойств у этих бактерий? Поскольку микроорганизмы, относящиеся к пробиотикам, должны вступать в мутуалистические отношения с животным организмом, то ответ на поставленный вопрос связан с признанием факта, что бактерии некоторых видов Bacillus не просто транзитом проходят сквозь организм хозяина, но, входя в состав нормального кишечного микробиоценоза животного, играют в нем важную роль.

4.1. ПРОБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS

Споровые палочки встречаются в составе различных микробиоценозов диких, домашних животных и человека. Широкое распространение бактерий рода Bacillus в природе (в почве, воде, на растениях и в гниющих растительных остатках) приводит к естественному контакту с животным организмом, и с пищей они могут попадать в пищеварительный тракт. Известно, что бациллы продуцируют различные биологически активные вещества: ферменты, аминокислоты, витамины, антибиотики,

обладают выраженным иммуномодулирующим действием. В полости желудочно-кишечного тракта антагонистическое действие бацилл носит избирательный характер в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, характеризуясь одновременно слабым действием или полным отсутствием антагонизма к представителям индигенного микробиоценоза. Отмеченные свойства бацилл позволяют с успехом использовать их в составе лечебно-профилактических пробиотических препаратов.

4.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММА В. SUB TILTS 8130

Одним из перспективных направлений исследований мутуалистических связей животного с бактериями вида Bacillus subtilis является изучение роли отдельных штаммов в процессах пищеварения клетчатки в условиях дефицита азота и затрудненного доступа кислорода, поскольку богатые метаболические возможности и адаптационная пластичность представителей данного вида позволяют обнаруживать новые эффекты.

Штамм В.subtilis 8130 получен в результате направленного поиска бактерий-продуцентов биологически активных веществ на основе симбиотических предпосылок. Он выбран из числа микроорганизмов рода Bacillus, выделенных из слепой кишки растительноядных с естественной высокой степенью переваримости клетчатки (различных видов грызунов, кроликов, ленивца, глухаря), и обладал наибольшей эццоглюканазной активностью, т.е. способностью деполимеризовать молекулы целлюлозы (Ушакова, 2005).

Специфика сезонного рациона хозяина и места обитания штамма позволили предполагать наличие у микроорганизма пробиотических качеств в сочетании с функциональной связью с переваримостью клетчатки в условиях пониженного содержания протеина в кормах хозяина.

В модельных экспериментах установлено, что штамм B.subtilis 8130 выделял водорастворимые метаболиты, стимулирующие развитие руминококка, лактобацилл, молочнокислых стрептококков, т.е. демонстрировал пробиотические свойства (рис.5, 6). Паста клеток бациллы, обедненная метаболитами, вызывала меньший эффект (Ушакова и др., 2004; Ushakova et all., 2006).

Стимулирующие лактобактерии метаболиты присутствовали в культуральной жидкости при развитии B.subtilis 8130 на глюкозо-пептонной среде (ГПС), мясо-пептонном бульоне (МПБ), в кукурузно-соевой среде с 0.75% подсолнечного шрота, кукурузно-соевой среде с 0.75% свекловичного жома и др. Индекс стимуляции развития лахтобазегерий составлял в среднем 2.0±0.25 на всех указанных средах.

Участие штамма B.subtilis 8130 в деструкции целлюлозы обосновывали наличием у него эндоглюканазной активности. Данная активность зависела от состава питательной среды и возраста культуры (табл. 4). Эндоглюканаза выявлялась при аэробном культивировании бациллы на ГПС, МПБ — средах, не содержащих

клетчатку, что указывало на возможный конституционный характер синтеза данного фермента.

Таблица 4. Активность эндоглюканазы (А, ед.) в культуральной жидкости ВлиЬНШ 8130 в динамике при аэробном глубинном культивировании бациллы на различных питательных средах

Вид пробы Возраст Число Споры, % А, ед

(питательная среда) культуры, ч клеток/мл, х 109

М11Б 48 1.9 7.6±1.7 3.8

ГПС 24 1.5 0.1±0.07 2.9

48 2.2 2.5±0.8 12.5

Среда глютеново- 24 1.9 0.3±0.05 5.2

мелассная с 0.75% 48 2.0 83.0±5.4 13.7

свекловичного жома

Среда с глютеном и 48 2.7 0 14.0

крахмальной патокой

1

2

3

4

Рисунок 5. Влияние фильтрата суточной культуры В.зиЫШэ 8130, выросшей на ГПС (1), культуральной жидкости с клетками бациллы (2) и пасты клеток бациллы (3) на рост культуры Ь.савег. Контроль (4) — рост 1,.са$е1 без добавок

Число клеток N х 106

Рисунок б. Изменение численности клеток при совместном развитии тест-культур

с B.subtilis 8130: 1» Lactobacillus acidophilus В-4625,2-Streptococcus lactis, 3-B.subtilis 8130. Контроля (раздельное культивирование): 4- L.acidophilus В-4625, 5-S.iactis, 6- B.subtilis 8130 на ГПС.

Выделение эндоглюкалазы и биологически активных метаболитов клетками В.яиЬШк 8130 в динамике роста культуры на кукурузно-соевой среде с 0.75% подсолнечного шрота представлено на рис.7.

Рисунок 7. Показатели развития культуры В.$иЫШ$ 8130 на кукурузно-соевой среде с 0.75% подсолнечного шрота. 1- число клеток/мл, х 108,2- эндоглюканазная активность (А, ед.), 3- рН среды, 4- индекс стимуляции роста Ь.саБв!

Штамм В.хиЫг'Иэ 8130 при развитии в жидких питательных средах в аэробных условиях способен одновременно выделять ферменты целлюлолитического комплекса и метаболиты — стимуляторы роста представителей нормального кишечного микробиоценоза.

Учитывая, что в слепой кишке мало кислорода, влажность массы химуса составляет 75-80%, поддерживается нейтральное значение кислотности среды, размеры твердых частиц - не более 1 мм, был разработан микроаэробный твердофазный способ культивирования бациллы, до некоторой степени имитирующий природные условия ее жизнедеятельности в кишечнике животного, и изучены особенности метаболизма бациллы в таких условиях. Культуральную жидкость выращенной аэробно в жидкой питательной среде В.яиЫШя 8130 смешивали со стерильным растительным субстратом (различными типами шротов, сухой пивной дробиной и др.) до получения однородной массы 50-60% влажности. Влажную массу помещали в условия затрудненного доступа кислорода (например, в полностью заполненные субстратом и запаянные полиэтиленовые пакеты) и проводили твердофазное сбраживание субстрата. В продукте ферментации определяли рН, плотность популяции клеток бациллы, активность эндоглюканазы, показатели стимуляции лактобацилл, изучали биохимический состав.

Процесс твердофазного сбраживания исследовали на примере ферментации подсолнечного, облепихового шротов, пивной дробины, свекловичного жома. При глубинном аэробном культивировании В.тЬйШ 8130 на ГПС численность клеток (плотность популяции) в двухсуточной культуре составила 2.25x10® клеток/мл. До начала твердофазного культивирования сразу после смешения культуральной жидкости с сухим подсолнечным шротом в соотношении 1:1 вес/объем, при насыпной плотности шрота, равной 0.67, объем сырой массы увеличился в 1.25 раза. Плотность популяции клеток составила 0.5 хЮ9 клеток/мл. Кажущееся уменьшение почти в 3.5 раза плотности популяции бациллы после введения шрота мы связываем с прочной сорбцией клеток на субстрате. Спустя 48 часов твердофазной ферментации в полученной массе плотность популяции бациллы возросла с 0.5 хЮ9 до 6.1х109 клеток/мл. Следовательно, внесение в жидкую среду клетчаткового субстрата с последующим его сбраживанием позволило повысить накопление клеток в единице объема сырой массы не менее, чем в 3 раза по сравнению с плотностью клеток в жидкой питательной среде.

Значение рН среды изменялось характерно для двухфазного процесса развития бактериальных культур: на первые сутки развития наблюдалось подкисление среды до рН 5.4-5.5, затем ко вторым суткам происходило подщелачивание до рН 6.8-6.9. И именно последний интервал рН являлся оптимальным для активности эндоглюканазы (рис.8). Температура реакционной смеси повышалась незначительно, не более, чем на 2°С на вторые сутки ферментации (рис. 9).

Рисунок 8. Зависимость эндоглюканазной активности (А, ед.) от рН

Т°С 44 42 40 38363432 3028; 26

10

20

50

60

30 40 час

Рисунок 9. Изменение температуры реакционной смеси при твердофазном сбраживании подсолнечного шрота

Анализ химического состава продуктов твердофазного сбраживания на примере пивной дробины (по сравнению с составом необработанного бактериями субстрата) показал, что бактериальная трансформация растительного субстрата вела к увеличению в продукте ферментации содержания аминокислот, в наибольшей степени - глутаминовой кислоты и гистидина. Доля глутаминовой кислоты в сумме аминокислот составила 3.26% в контроле и 5.21% в опыте, гистидина - 0.57% в контроле и 0.84% в опыте; увеличение, соответственно, в 1.6 и 1.5 раз).

Способность бациллы обогащать продукты твердофазного сбраживания растительного субстрата глутаминовой кислотой — одной из основных доноров-переносчиков МН2-группы, указывала на возможность влияния В.яиЫПЬ 8130 па азотистый обмен веществ у хозяина. Не противоречили данному предположению и результаты хромато-масс-спектрометрического изучения некоторых продуктов твердофазной ферментации облепихового, подсолнечного шротов и свекловичного

жома. Контролем служили аналогичные анализы смеси стерильной жидкой питательной среды с соответствующим стерильным растительным сырьем. Сложный состав субстрата отразился на общем профиле масс-хроматоурамм. Вид масс-хроматограмм препаратов из облепихового шрота и соответствующего контроля представлен на рис.10. По разнице компонентов в спектрах судили о появлении продуктов, связанных с метаболизмом бациллы.

Рисунок 10. Масс-хроматограммы препарата из облепихового шрота (о) и контроля (к). Идентифицированные компоненты бактериального происхождения: ЯТ:5.40 - З-метил-2-бутеновая кислота; 11Т:5.60 - 2-гидроксиэтиламин; ЯТ:9.06 -бензойная кислота; Л,Т:9.78 - ацетобензойная кислота; ЯТ: 10.73 - щавелевая кислота; ИХ: 12.75 -1-(2-гидроксиметилпирролидин-1-ил)этанон; КТ:13.34 - фенил-2-гидроксипропионовая кислота; ЮГ: 16.95 - 2-оксоглутаровая кислота

Обнаружено, что культура В.зиЪМШ 8130 способна при деструкции различных растительных субстратов образовывать производные масляной кислоты: 2-метил-, 3-метилмасляную кислоту, ненасыщенные производные. На спектрах идентифицированы эфиры органических кислот, ароматические кислоты, спирты, альдегиды, кетоны, а также пизкомолекулярные азотсодержащие органические соединения, производное Б-фруктозы, которое может придавать пребиотические свойства продуктам сбраживания растительного субстрата, 2-оксоглутаровая кислота - одно из ключевых веществ, регулирующих взаимодействие процессов углеводного, белкового (аминокислотного), липидного обмена, 5-гептил-2-дигидрофуранон -вещество, имеющее структуру, схожую с А-факторами некоторых актиномицетов, содержащих у-бутиролактонный цикл. Полученные данные сочетаются с представлениями, что В.ьиЪйШ осуществляет бутандиоловое брожение (Роуз, 1971).

Разнообразные ароматические соединения - производные бензойной кислоты и фенил-содержащие соединения, наличие метил-производной кротоновой кислоты могут свидетельствовать об анаэробном пути расщепения лигнина, фитостеринов и ароматических соединений, ненасыщенные органические кислоты - о расщеплении растительных липидов, органические азотсодержащие соединения - о разложении гетероциклических азотсодержащих веществ, пептидов и аминокислот. Принципиальное значение для понимания симбиотического взаимодействия бациллы с животным имеют азотсодержащие вещества, образующиеся при микробиологической трансформации растительных кормов. В.яиЫШх 8130 в условиях затрудненного доступа кислорода расщепляет азотсодержащие компоненты растительных субстратов с образованием таких низкомолекулярных фрагментов, как этиламин, 2-гидроксиэтиламин, которые могут легко усваиваться животным организмом. Из представленных данных можно предположить, что при микроаэробной твердофазной ферментации с помощью В.аиЫЯи 8130 получаются продукты неполного сбраживания субстрата по смешанному типу (Современная микробиология. Прокариоты, 2005), и при этом образуются соединения, которые могут иметь регуляторное и сигнальное значение.

Симбиотические функции В.зиЬШк 8130 могут проявляться как в стимуляции развития отдельных видов представителей кишечного микробиоценоза, увеличении эффективности пищеварения, в том числе, клетчатки, так и во влиянии на усвоение азотистых компонентов кормов и регуляцию аминокислотного обмена у хозяина. Для доказательства последнего положения были изучены физиолого-биохимические реакции животных, получавших с кормом живые клетки бациллы с метаболитами — продуктами твердофазного сбраживания растительных отходов.

4.3. РЕАКЦИЯ ЖИВОТНОГО ОРГАНИЗМА НА ВВЕДЕНИЕ С КОРМАМИ В. ЪиВТШХ 8130

Как было отмечено, механизмы взаимосвязи и взаимодействия анаэробного расщепления и усвоения целлюлозы растительных кормов с азотным балансом организма животного изучены недостаточно. Также мало данных по механизмам влияния пробиотиков на пищеварение и его отдельные стадии. Между тем это фундаментальные вопросы, связанные с максимальным использованием потенциала системы макроорганизм-микробиоценоз кишечного тракта. Степень усвоения белков и аминокислот корма зависит от характера питания, и в частности, от количественного и качественного состава белков кормов. Большое значение имеет содержание клетчатки в рационе, которая имеет тссную, но противоположную связь с уровнем протеина: с увеличением клетчатки в рационе (особенно при низком содержании протеина) отложение азота в теле животных снижается (Макарцев, 1999).

Для понимания симбиотических взаимодействий между животным и бактериями, оценки масштаба пользы, приносимой симбионтами, принципиальное

значение имеет изучение влияния выделенного микроорганизма В.зиЫШэ 8130, участвующего в расщеплении целлюлозы, на азотистый обмен веществ хозяина.

Симбиотические взаимодействия бациллы В, $иЫШз 8130 с животным, в рационе которого присутствует клетчатка, изучали на примере организма молодой, интенсивно растущей свиньи (Яхин и др., 2003). В экспериментах на поросятах исследовали эффективность применения опытного комбикорма с добавлением 5% продукта твердофазного сбраживания бациллой пивной дробины с пшеничными отрубями. Животные были распределены по принципу аналогов (возрасту, полу, живой массе) в две группы (контрольная и опытная) по 11 голов. Опытная группа получала пробиотик с кормом, контрольная пробиотик не получала. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Изменение зоотехнических показателей поросят на рационе с пробиотиком В. зиЬИШ 8130

Показатели Контрольная группа Опытная группа

Общий прирост, кг 58,2 67,4

Среднесуточный прирост, г 576+31,2 667±12,6'>

в % к контрольной группе 100,0 115,8

Среднесуточное потребление комбикорма, кг 2,18 2,18

Затрачено комбикорма на 1 кг прироста, кг 3,78 3,27

в % к контрольной группе 100,0 86,5

Различия статистически достоверны по сравнению с контролем при значении Р: *) < 0,02.

Исследования показали, что штамм В. зиЫШз 8130 оказывал положительное влияние на интенсивность роста поросят, т.к. у животных опытной группы масса тела и среднесуточный прирост увеличился на 15,8% (Р< 0,02). При этом у животных контрольной группы на 1 кг прироста массы тела было затрачено 3,78 кг комбикорма, а свиней опытной группы - 3,27 кг или на 13,5% меньше. Эксперимент свидетельствовал о том, что более высокие приросты живой массы у поросят опытной группы, получавшие пробиотик, были результатом лучшего использования ими комбикорма, что было показано при анализе переваримости отдельных компонентов кормов (табл.6). У поросят опытной группы по сравнению с контрольными повысилась переваримость всех питательных веществ: органического вещества

комбикормов, протеина, жира, БЭВ - на 3.5-4.5%, в то время как клетчатки - почти на 14%.

Таблица 6. Переваримость питательных веществ комбикормов поросятами, получавшими пробиотик В. виЬНШ 8130, %

Питательные вещества Контрольная группа Опытная 1руппа

Сухое вещество 78,2± 1,8 7 81,8±1,33

Органическое вещество 80,6± 1,73 83,8±1,15

Сырой протеин 75,1±2,08 79,5± 1,27

Сырой жир 40,0±3,55 43,2±6,39

Сырая клетчатка 31,5±6,39 45,3±3,83

БЭВ 87,7±1,24 89,б±0,87

Обмен азота, усвоение животными его переваримой части, характеризует биологическую ценность кормов и, в первую очередь, содержащегося в них протеина. Данные об использовании азота корма контрольными и опытными животными приведены в табл.7. Баланс азота в обеих группах был положительный, однако в теле контрольных животных отложилось 22,97 г азота, а опытных - 25,16 г. Свиньи опытной группы не только больше откладывали азота, но лучше, чем контрольные животные, использовали его. Результаты балансового опыта по использованию азота корма животными контрольной и опытной группы согласуются с данными опыта по приросту живой массы.

Таблица 7. Среднесуточный баланс и использование азота корма поросятами,

получавшими пробиотик В. зиЫНк 8130 (в среднем на 1 голову)

Показатели Контрольная группа Опытная группа

Принято с кормом, г 66,72 67,50

Выделено в кале, г в% 16,67±1,37 25,0 13,84±0,62 20,5

Переварено, г в % 50,05±1,37 75,0 53,66±0,30" 79,5

Выделено в моче, г в% 27,08±0,51 40,6 28,50±1,09 42,2

Отложилось в теле, г 22,97±1,54 25,16±1,15

Использовано, в %: от принятого от переваренного 34,43 45,89 37,27 46,89

Различия статистически достоверны по сравнению с контролем при

значении Р< 0,05

Таким образом, показано, что при ведении в корма животных штамма В^иЬИНз 8130, его пробиотическая активность связана со стимуляцией пищеварения, в наибольшей степени выраженной в увеличении переваримости клетчатки. Одновременно штамм оказал положительное влияние на количество отложенного в теле животного азота (в теле животного оставалось больше азота, чем выводилось), что проявилось в увеличении мышечной массы.

Результаты биохимических исследований крови поросят (табл.8) выявили тенденцию к снижению содержания в крови опытных животных мочевины -основного конечного продукта распада белков в организме, более высокому по сравнению с контрольными животными содержанию аминного азота, креатинина, отражающего степень развития мышечной массы, увеличению активности аланинаминотрансферазы (АлАТ). Последняя связана с вовлечением аминокислот, поступающих с кормом, в процессы синтеза новых белков организма, и повышение показателя АлАТ может быть объяснено увеличением содержания аминного азота.

Таблица 8. Результаты определения биохимических показателей крови подопытных свиней

Показатели Контроль, М ± т Опыт, М ± т

Азот: общий, мг% 2688,00±92,40 2716,00±131,33

небелковый, мг% 38,90±1,53 38,60±0,69

белковый, мг% 2649,10±138,38 2677,40±138,03

аминный, мг% 9,28±0,30 10,0±0,21

ммоль/л 6,б2±0,21 7,14±0,15

Мочевина, мг% 18,38±4,83 15,76±1,97

ммоль/л 3,06±0,80 2,62±0,33

Креатинин, мг% 1,24±0,07 1,38±0,14

ммоль/л 0,109±0,006 0,121±0,012

АлАТ, ИЕ/л 41,75±3,21 52,50±5,17

Таким образом, в результате применения пробиотика В.тЬИНя 8130 произошло изменение в соотношении азотистых веществ крови, позволяющее сделать предположение о смещении использования азота в сторону синтеза новых, в том числе, структурных белков тканей, преобладанием анаболических процессов над катаболическими. Этот вывод подтверждается значительно более высокими показателями живой массы и ее прироста у животных опытных групп.

Ключевую роль во взаимодействии углеводного и азотистого обмена веществ в организме, регуляции обмена веществ играют 2-оксоглутарат, глутаминовая кислота (Грачева, 2003). И именно эти продукты обнаруживаются при твердофазном

сбраживании растительного сырья, осуществляемым симбионтом слепой кишки растительноядного животного - В. subtilis 8130.

Известен путь расщепления микроорганизмами пектина, лигнина, целлюлозы (Шлегель, 1987; Роуз, 1971; Прокариоты, 2005) с образованием через 2-оксоглутарат глутамата, который, в свою очередь, является предшественником гистидина и других аминокислот. Возможно, сходные реакции осуществляет В. subtilis 8130 в естественной среде обитания в кишечнике хозяина, сдвигая направленность биосинтетических процессов в сторону синтеза:

2-оксоглутарат —► глутаминовая кислота —► гистидин и другие аминокислоты, что может приводить к увеличению пула аминокислот и дополнительному синтезу белков тканей.

Положительное влияние пробиотика B.subtilis 8130 на животных выявлено в отношении систематически различных видов: бройлеров, поросят, собак, пушных зверей (американской норки, песца). Это указывает на общий характер действия бациллы на животный организм.

Пробиотические свойства выделенного микроорганизма определяются физиолого-биохимической специализацией штамма, что обеспечивает направленное влияние на животных, в рационе которых используется клетчатка. При этом действие пробиотика проявляется в нескольких направлениях:

- предобработка клетчатки бациллярной эндоглюканазой увеличивает доступность целлюлозы кишечным целлюлолитическим симбионтам и повышает переваримость и усвоение клетчатки;

стимуляция развития лактобацилл, стрептококков, руминококков способствует нормализации и активизации кишечного микробиоценоза, повышает эффективность пищеварения;

- повышение переваримости азота кормов за счет биотрансформации растительных компонентов корма с образованием низкомолекулярных азотсодержащих молекул положительно влияет на азотистый баланс организма хозяина;

- выделение сигнальных и регуляторных метаболитов - продуктов анаэробного расщепления клетчатки, сдвигает направленность использования азота кормов в сторону синтеза белков тканей, ведущих к увеличению мышечной массы и дополнительным приростам животных.

Глава 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ К КОРМАМ ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В. SUBTILIS 8130

Проведенные исследования особенностей симбиотических связей животного со штаммом В. subtilis 8130 позволили разработать пробиотическую добавку к кормам животных Пробиоцел. Биотехнология включала создание технологической схемы

получения препарата, определение дозы и способов введения его в рацион животных (Ушакова, 2005; Ushakova, 2004; Ushakova et all., 2006).

Выделение микроорганизма-продуцента биологически активных веществ является важным, по не единственным критерием для получения эффективного пробиотического препарата. Исходя из того, что некоторые физиолого-биохимические свойства штамма проявляются в определенных условиях, при разработке технологии получения препарата мы стремились приблизиться к особенностям естественного места обитания микроорганизма в теле хозяина, направляя метаболизм бациллы в искусственной среде по пути, сходному с природным. Способ получения препарата Пробиоцсл основан на способности бациллы В. subtilis 8130 использовать клетчатку растительного сырья в качестве источника питательных веществ в условиях затрудненного доступа кислорода при содержании азота, ограниченном азотом применяемого для сбраживания сырья. Эти данные явились предпосылкой для разработки биотехнологии получения пробиотического препарата путем твердофазного выращивания бациллы на растительном субстрате в микроаэробных условиях без дополнительного внесения азота, что до некоторой степени имитирует процессы в химусе слепой кишки (Ушакова и др., патент RU 2202224, от 20.04.2003).

5.1. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОБИОДЕЛ

Технология получения пробиотической добавки к кормам животных Пробиоцел основана на комбинации накопления биомассы бактерий В. subtilis 8130 в аэробных условиях с последующим получением биологически активных метаболитов - продуктов брожения, и включала две стадии: аэробное глубинное культивирование бациллы и твердофазное сбраживание растительного субстрата.

Препарат Пробиоцел ■ получали по разработанному совместно с ФГУП ГОСНИИСИНТЕЗ БЕЛОК лабораторному регламенту путем твердофазного сбраживания увлажненного субстрата при введении 10% посевного материала -культуральной жидкости бациллы, выращенной глубинным способом. Аэробное глубинное культивирование микроорганизма осуществляли в жидких питательных средах, традициошю применяющихся для выращивания сапрофитных гетеротрофных бактерий. Культуральную жидкость, содержащую не менее 1х10ш клеток бациллы (соответствующий регламент разработан с участием ФГУП ГОСНИИСИНТЕЗ БЕЛОК) смешивали со смесью сырой пивной дробины с пшеничными отрубями. Полученную массу 55-60% влажности помещали в емкости в условия затрудненного доступа кислорода и проводили твердофазную ферментацию. После окончания ферментации продукт высушивали при температуре сушильного агента до 60°С. Каждую стадию контролировали микроскопированием, определяли плотность популяции клеток, рН, показатели эндоглюканазной активности и индекс стимуляции развития лактобактерий.

Твердофазную ферментацию вели в высоком слое. Для создания микроаэробных условий и поддержания температурного режима сбраживаемая масса помещалась в заполненные до верха и плотно завязанные полиэтиленовые мешки, полностью заполненные бочки, закрытые крышками, и помещенные в термокамеру, или специальное оборудование типа смесителя с регулируемым подогревом. Выбор типа аппарата определялся объемом производимого препарата. Продукт ферментации представлял собой биотрансформированное растительное сырье, содержал жизнеспособные клетки бациллы (не менее 108 КОЕ/г), эндоглюканазу, низкомолекулярные метаболиты.

Небольшое содержание клеток пробиотика в единице массы препарата определило дозу его введения в корма, которая составила 5% от массы комбикорма (50 кг на тонну). Это вызвало необходимость получения относительно больших объемов препарата. Возникли проблемы с сушкой продукта, связанные с применением мягкого высушивания большого объема сырого препарата при низкой температуре сушильного агента для сохранения жизнеспособности клеток. Низкая температура сушки вела к увеличению ее продолжительности. Поскольку процесс сушки вели в нестерильных условиях, это создавало предпосылки для развития сопутствующих форм бактерий и появления грибного заражения. Данное явление вносило элемент нестабильности в микробиологические показатели качества препарата.

В целях оптимизации технологии без потери биологической активности препарата было предложено модифицировать способ получения препарата Пробиоцел, и разработать его концентрированную форму (ПРО-Л). Модифицированная технология включала две стадии: глубинное аэробное культивирование пробиотика для накопления биомассы клеток и твердофазное сбраживание растительного сырья. Лабораторные исследования показали преимущества такого способа, позволившего решить вопросы стерилизации сырья, сушки продукта.

Плотность популяции клеток при применении двухстадийного процесса увеличивалась более, чем в 10 раз по сравнению с одностадийным процессом (табл.9), что указывало на возможность уменьшения дозы ввода концентрированного продукта двухстадийной ферментации в корма животных до 1-2 кг ПРО-А на тонну комбикорма.

Таблица 9. Показатели качества сырого продукта развития В.яиЫШз 8130 при разных способах твердофазной ферментации подсолнечного шрота

Показатель Способ твердофазной ферментации

Одностадийный Двухстадийный

Плотность популяции клеток, хЮ' кл/мл Не менее 0,1 Не менее 1,5

Для установления, какая из технологических схем предпочтительнее для рекомендации в производство, исследовали влияние скармливания ПРО-А на продуктивность и состояние азотистого обмена веществ у животных в сравнении с Пробиоцелом.

Были проведены опыты по введению в корма поросят, распределенных по принципу аналогов (возрасту, полу, живой массе) в группы по 10 голов, двух препаратов. Опытная группа 1 получала корм, в котором 5% полнорационного комбикорма заменили на такое же количество препарата Пробиоцел. Опытная группа 2 получала комбикорм и препарат ПРО-А в дозе 0.1% от массы корма. Результаты, представленные в табл. 10, показали, что между животными групп Опытная 1 и Опытная 2 значительной разницы не наблюдалось по всем исследованным показателям: живой массе, среднесуточному приросту, потреблению кормов и кормозатратам.

Таблица 10. Изменение живой массы и среднесуточных приростов поросят, и затраты комбикорма на 1 кг прироста

Показатели Группы поросят

Контроль Опытная 1 Опытная 2

Общий прирост, кг 56,3 69,9 68,7

Среднесуточный прирост, г 52б±90,3 653*56,6 642*63,7

в % к контрольной группе 100,0 124,1 122,0

Среднесуточное потребление комбикорма, кг 2,71 2,71 2,71

Затрачено комбикорма на 1 кг прироста, кг 5,15 4,15 4,22

в % к контрольной группе 100,0 80,6 81,9

Хотя Пробиоцел дал несколько лучшие результаты, возможно, вследствие заниженной дозы ввода ПРО-А, учитывая, что двухстадийный процесс более технологичен, именно данная схема рекомендована для получения препарата в промышленных условиях при увеличении дозы применения ПРО-А до 2 кг на тонну комбикорма.

Дальнейшая разработка биотехнологии получения препарата пробиотического действия с эффектом стимуляции пищеварения связана с изучением технологических параметров отдельных стадий процесса, ведущегося по схеме для ПРО-Л (рис. 11).

Рисунок II. Схема получения концентрированного Пробиоцела (ПРО-А)

Принципиальная технологическая схема получения препарата включала

стадии:

1 - поддержание коллекционного штамма Bacillus subtilis 8130

2 - получение посевного материала бациллы

3 - глубинное аэробное культивирование бациллы

4 - твердофазное сбраживание растительного субстрата

5 - высушивание препарата и складирование

На стадиях с 1 по 5 осуществляли микробиологический контроль, на стадиях 3,4 - контролировали pH, дополнительно осуществляли учет количества клеток бациллы, активность фермента эндоглюканазы, индекс стимуляции развития лактобактерий. На стадии 5 определяли количество клеток бациллы, проверяли отсутствие бактерий кишечной группы, золотистого стафилококка, контролировали безвредность препарата.

Была разработана питательная среда для глубинного культивирования бациллы, определена оптимальная влажность для накопления максимального количества клеток пробиотика при твердофазной ферментации, продолжительность брожения, отработаны способы стерилизации сыпучего субстрата, подобрано оборудование для твердофазного процесса. Опытные партии препаратов получали на заводе Ректинал, Вышневолоцком заводе ферментных препаратов, НТЦ «БИО», г.Шебекино.

Энергозатратная термическая обработка растительного сырья существенно сказывалась на стоимости готового препарата. Предложено решение проблемы

стерилизации твердого субстрата с помощью установки для обеззараживания сыпучих продуктов с использованием УФ-излучения на установке типа Альбатрос ОСП (фирма Консит-А, Россия). Эффект стерилизации достигается за счет постоянного перемешивания сыпучего материала в движущемся под УФ-лампами псевдокипящем слое, и разрушении структур ДНК и РНК микроорганизмов при воздействии излучения в области 240-280 нм. Испытания стерилизации облепихового шрота на установке показали, что сырье стерильно, а продукт твердофазного сбраживания шрота содержал монокультуру В.зиЬНШ 8130.

Для проведения твердофазного процесса в реакционной смеси до 0,5 т, удобным аппаратом явился смеситель-стерилизатор на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов. Для малых объемов на заводе Ректинал использовали бетономешалку на 75 л с крышкой, или полностью заполненные и завязанные полиэтиленовые мешки на 15-20 кг, перенесенные в термальное помещение; в НТЦ «БИО» применяли наполненные и запаянные полиэтиленовые пакеты на 3-5 кг, помещенные в термостат.

Специальные исследования проводили по оптимизации параметров сушки препарата. Определяли термическую устойчивость микробов в процессе сушки методом прямого количественного учета бактерий высевом на чашки Петри с МПА. По полученным данным составлен график (рис.12) снижения количества жизнеспособных клеток бациллы, и сделан вывод, что оптимальный температурный режим технологического процесса сушки - 60 °С.

Рисунок 12. Изменение жизнеспособности клеток Bacillus subtilis 8130 при разных температурах сушки

С учетом свойств продукта, наиболее подходящими признаны сушилки с активными гидродинамическими режимами: сушилки с псевдоожиженным слоем и вращающиеся барабанные сушилки; для среднетоннажного производства можно также использовать сушилки в виброкипящем слое или ленточные сушилки. Применение полочных сушилок возможно только для малотоннажного производства при условии обязательного периодического ручного ворошения продукта.

1.5-ю'

5.2. ОТРАБОТКА ДОЗЫ И СПОСОБОВ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОБИОЦЕЛ В РАЦИОН ЖИВОТНЫХ

На различных видах животных были отработаны дозы и способы ввода препарата Пробиоцел.

На американской норке клеточного содержания было исследовано влияние на рост и развитие животных препарата при введении в корма 0.5, 2.0, 3.5, 5.0 и 7.0 % сухого Пробиоцела. Контрольная группа норок получала такой же корм, но без добавки. В каждой группе было взято по 16 самцов 1.5-2 месячного возраста. На начало эксперимента звери контрольной и опытных групп были уравнены по живой массе тела. Эксперименты длились 2 месяца. По данным учета корма была рассчитана его поедаемость (количество заданного корма по отношению к количеству съеденного корма, выраженное в процентах). Выявлено, что по привесу живой массы самцов американской норки и экономии кормов лучшие результаты были у групп, получавших 3,5 и 5,0% препарата. Для песцов более эффективной оказалась доза в 7% Пробиоцела от массы корма. Были составлены две опытные 1руппы по 8 трехмесячных самцов в каждой. В контрольную группу вошло 18 самцов того же возраста. Животные всех групп были уравнены по живой массе тела. Опыт длился 1 месяц. Сравнивали влияние 5,0% (1 опытная группа) и 7,0% (2 опытная группа) ввода препарата в корм песцов. Результаты (табл. 11), статистически достоверны: разница между 1 опытной группой и контрольной Р>0,90, между 2 опытной группой и контрольной Р>0,95. В подопытных группах за время опыта было съедено корма на 1 голову на 3,3 кг (15,5%), меньше, чем в контрольной, а живая масса тела на конец опыта в опытных группах была на 10-13% выше контрольных животных.

Таблица 11. Влияние различных доз Пробиоцела на живую массу и поедаемость

корма песцом

Доза ввода Живая масса, г (M ±т) Экономия корма

Пробиоцела, В начале В конце опыта Привес, г (%) на 1 гол., кг

% опыта

Контроль 3244±38.5 4927±89.4 1683 (100) -

5,0 3281±63.6 5145±84.4 1864(110) 3,3

7,0 3327±131.7 5237±1007 1910(113) 3,3

На бройлерах кросса В^ исследовали эффективность различных схем введения Пробиоцела в рацион птицы и его доз. Были сформированы 3 группы по 40 голов в каждой. Опыт проводили с суточного до 7-ми недельного возраста цыплят. Контрольную группу и две опытных содержали на сухих полнорационных комбикормах. 1-я опытная группа бройлеров получала 3% Пробиоцела с первого дня до 49-дневного возраста. В рацион цыплят 2-й опытной группы вводили 5% препарата во втором периоде развития (с 29-го дня до 49-дневнош возраста). Результаты представлены в табл. 12.

Таблица 12. Результаты зоотехнических показателей цыплят-бройлеров в эксперименте по различным схемам введения в корм препарата Пробиоцел

Зоотехнические показатели Контроль 1 опытная 2 опытная

группа группа

Сохранность поголовья, % 92,5 95,0 95,0

Живая масса, г: 28-дневных цыплят Е98,8±14 971±21 924±18

% к коггтролю 100.0 108.1 102.9

49-дневных цыплят 2070±29 2161±38 2153±40

% к контролю 100,0 104,4 104,0

Потребление корма на 1 гол., г 4551 4327 4342

% к контролю 100,0 95,1 95,4

Расход корма на 1 кг привеса, кг 2,24 2,04 2,05

% к контролю 100,0 91,1 91,5

Среднесуточный прирост живой 41,4 43,3 43,1

массы, г

% к контролю 100,0 104,6 104,1

Несколько лучший эффект дало введение препарата в корма на протяжении всего периода выращивания бройлеров (опытная группа 1), связанное, по-видимому, с более ранним потреблением биологически активной добавки. При этом наблюдалось увеличение живой массы цыплят, и экономия расхода корма на 1 кг привеса.

Полученные результаты были учтены при составлении Временных наставлений по применению препарата Пробиоцел.

5.3. ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИКА НА ПРОДУКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ КОМБИКОРМОВ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ КЛЕТЧАТКИ

Использование кормовых отходов мукомольной, сахарной, ливоварешюй промышленности, производства растительных масел решает не только вопросы расширения кормовой базы животноводства, но также экологические проблемы частичной утилизации отходов. К числу субстратов, имеющих некоторую питательную ценность, и которые могут применяться в кормовых целях, можно отнести сухую пивную дробину, подсолнечный, облепиховый шрот, отруби.

Высокий уровень клетчатки ограничивает возможность широкого использования пивной дробины в кормах. Было предположено, что добавление к дробине пробиотика В.зиЫШя 8130, положительно влияющего на пищеварение, стимулирующего переваримость клетчатки, может повысить продуктивное действие сухой пивной дробиггы. Была разработана технология обогащения сухой пивной дробины концентрированной модификацией препарата Пробиоцел (ПРО-А), и проведены эксперименты по изучению биологического эффекта при введении дробины с пробиотиком в рационы поросят, телят, молочных коров.

В опыте были использованы группы поросят по 8 голов в каждой, уравненные по принципу аналогов. Животные контрольной группы получали полнорационный комбикорм с 11% отрубей. Опытная группа 1 получала комбикорм, аналогичный комбикорму для контрольной группы, но в котором 6% отрубей заменили на соответствующее количество сухой пивной дробины. Опытная группа 2 получала комбикорм с 6% сухой пивной дробины, обогащенной препаратом ПРО-А. Полученные данные по поросятам представлены в табл. 13.

Таблица 13. Результаты кормления поросят комбикормом с сухой пивной дробиной с

ПРО-А

Показатели Группа

Контрольная 1 опытная 2 опытная

Живая масса в конце опыта, га- 45,3±0,99 45,4±0,99 47,бл=1,12

Прирост живой массы: общий, кг 24,3±1,12 24,7±0,99 26,7±1,36

среднесуточный, г 506±12 515±14 55б±20*

Тоже в % к контролю 100,0 101,8 109,9

Среднесуточное потребление комбикорма, кг 1,25 1,25 1,25

Затраты комбикорма на 1 кг прироста, кг 2,47 2,43 2,25

В % к контролю 100,0 98,4 91,0

♦Различия статистически достоверны по сравнению с контролем при значении Р< 0,05

Состав комбикормов не повлиял на их потребление: поросята всех групп съели одинаковое количество комбикормов, остатков не было. Тем не менее, эксперимент показал эффективность обогащения сухой пивной дробиной препаратом ПРО-А: в конце опыта животные 2 опытной группы статистически достоверно превосходили своих сверстников как контрольной группы, так и 1 опытной группы по живой массе и по ее общему приросту. При этом во 2 опытной группе было израсходовано на 9% меньше комбикорма по сравнению с контрольной группой.

Проводили также экспериментальное кормление телят пивной дробиной с ПРО-А и без него. Было сформировано три группы телят-аналогов по 8 голов. Животные контрольной группы получали стартовый комбикорм, включающий 6% пшеничных отрубей и 25% подсолнечного шрота. В составе стартового комбикорма для телят опытной группы 1 уменьшили количество отрубей до 4%, а подсолнечного шрота - до 21%, и ввели 6% сухой пивной дробины. Телята опытной группы 2 получали комбикорм того же состава, что и для 1 опытной группы, но пивная дробина была обогащена ПРО-А из расчета 0,2% пробиотика на тонну конечной кормосмеси. Эксперимент проводили 3 месяца. В результате у телят 2 опытной группы (табл. 14) выявлена тенденция к повышению переваримости органических веществ кормов, увеличению количества общего белка сыворотки крови и отложенного в теле животных азота. В целом получено 12% дополнительного прироста живой массы, и экономия кормозатрат на 5,5% на 1 кг прироста.

Таблица 14. Результаты исследований по экспериментальному кормлению телят комбикормом с пивной дробиной, обогащенной пробиотиком В.тЫШз 8130

Показатели Группа

Контрольная 1 опытная 2 опытная

Живая масса, кг: в начале опыта в конце опыта 53,5±2,78 124,5±8,11 53,7±3,10 126,1±3,33 53,6± 1,43 133,1±4,37

Прирост живой массы: общий, кг среднесуточный, г в % к контролю 71,0±7,7 771±84 100,0 72,4±3,5 787±38 102,1 79,0±4,3 864±47 112,1

Затраты на 1 кг прироста:

Обменной энергии, МДж 33,9 34,4 31,8

Комбикорма, кг в % к контролю 2,20 100,0 2,16 98,2 2,08 94,5

Переваримость, %

Сухое вещество 73,3±2,4 73,7±1.4 75,3±0,б

Органическое вещество 74,б±2,3 75,1±1.4 76,8±0,7

Протеин 70,5±2,3 71,3±2.5 71,8±0,9

Жир 70,9±1,5 73,8±3.2 75,9±0,4

Клетчатка 65,4±2,7 66,7±1.9 69,0±1,7

БЭВ 78,2±2,3 79,4±0.9 80,6±0,5

Баланс и использование азота

Принято с кормом, г 79,5±0,6 83,6±0,6 84,9±0,3

Выделено с калом, г 23,4±1,8 23,9±2,0 24,0±0,8

Переварено, г 56,1 59,7 60,9

Выделено с мочой, г 32,9±1,1 33,9±3,1 34,1±3,4

Отложено в теле, г 23,2±0,91 25,8±1,43 26,8±2,14

Использовано в % от принятого 29,1 30,8 31,5

Общий белок сыворотки, г/л 63,4±1,4 65,1±2,1 67,4±1,6

Примечание: различия статистически достоверны по сравнению с контролем при значении Р< 0,1.

Влияние Пробиоцела на кормовую эффективность сухой пивной дробины исследовали на высокопродуктивных коровах. Было сформировано 3 группы по 10 голов новотельных коров с одинаковым удоем в предыдущей лактации и жирностью молока 4,3%. Животных распределяли по труппам по принципу аналогов. Кормление осуществляли по схеме: контрольная группа не получала сухой пивной дробины, 1

опытная группа получала комбикорм, в состав которого было введено 15% сухой пивной дробины, комбикорм 2 опытной группы содержал 15% сухой пивной дробины, обогащенной ПРО-А из расчета 0,2% на тонну кормосмеси. Продолжительность опыта - 120 дней. Из табл. 15 видно, что введение в корма для молочных коров 15% сухой пивной дробины не сказалось положительно на удое молока и его жирности. В то же время обогащение пивной дробины препаратом ПРО-А существенно повысило эти показатели: разница между контрольной и 2 опытной группой по удою натурального молока составила 5,2%, разница по удою молока 4% жирности - 6,9%.

Таблица 15. Молочная продуктивность коров в опыте по влиянию препарата ПРО-А в составе сухой пивной дробины, введенной в рацион животных

Показатели Группы

Контрольная 1 опытная 2 опытная

Удой натурального молока, кг 3139±191 3159±265 3301±216

Содержание жира, % 4,19±0,12 4,20±0,20 4,26±0,13

Удой молока 4% жирности, кг 3288±214 3317±296 3516±186

Среднесуточный удой молока 4% жирности, кг 27,4± 1,69 27,6±2,01 29,3± 1,14

Продукция молочного жира, кг 131,5 132,7 140,6

Затраты комбикорма на 1 кг молока 4% жирности, г 411 406 402

Изучение переваримости и использования питательных веществ в организме подопытных животных показало общую тенденцию к увеличению переваримости всех рассматриваемых питательных веществ. При этом наиболее значительное различие между группами наблюдалось в отношении переваримости протеина и клетчатки (табл.16).

Молочная продуктивность коров во многом определяется биологической полноценностью протеина кормов, критерием которого являются показатели усвоения и использования азота. Было выявлено, что при практически одинаковом среднесуточном потреблении азота всеми группами животных, составившем 509,1513,5 г, у коров 2 опытной группы количество азота, выделенного с калом и мочой, ниже, чем у животных других групп, а, следовательно, переваримость азота - выше. В то же время выделение азота в виде белка молока, т.е. использование азота на образование молока, в этой группе превосходило контрольных животных на 11,5%. Также больше по сравнению с контрольными отложено азота в теле коров 2 опытной группы: 12,3 г у животных данной группы и 5,6 г у контрольных.

Таблица 16. Показатели переваримости питательных веществ кормов рациона у

молочных коров, %

Показатели Группы

Контрольная 1 опытная 2 опытная

Сухое вещество 60,5± 1,3 5 62,0± 1,47 64,2±0,96

Органическое вещество 63,б± 1,54 64,9± 1,22 66,8± 1,60

Протеин 64,9±3,46 65,6±2,02 68,8±1,26

Жир 53,4±2,49 55,9±2,06 57,6±0,79

Клетчатка 50,1±4,02 55,6±3,62 57,7±2,62

БЭВ 67,6± 1,07 69,4± 1,87 70,4± 1,64

Использование азота кормов

Принято с кормом, г 509,2±1,07 512,3±1,03 513,5±2,03

Выделено с калом, г 178,7±1,11 176,2±1,22 170,4±1,62

Переварено, г 330,5±2,81 336,1±2,14 343,1±2,35

Выделено с мочой, г 194,4±2,81 192,2±2,18 185,8^1,56

Использовано на образование молока, г 130,5±2,68 133,8±2,10 145,0±2,48

Отложено в теле, г 5,6±0,91 10,1±1,43 12,3±2,14

Полученные результаты свидетельствовали о положительном влиянии В.зиЫ>'Ш 8130 на пищеварение и обмен веществ у всех изученных видов животных, и возможности эффективного ввода в их рацион сухой пивной дробины в сочетании с бациллой.

5.4. ОЦЕНКА ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА

Оценка экономического эффекта от применения пробиотичсского препарата Пробиоцел на основе В.зиЬНШ 8130 в комбикормах для откармливаемых свиней, цыплят-бройлеров показала экономическую оправданность препарата. Расчетное превышение реализационной стоимости дополнительного прироста живой массы над разницей в стоимости кормов составило для свиней на откорме 344,54 рубля на голову в сравнении с контролем в случае применения Пробиоцела и 338,50 рубля на голову при использовании ПРО-А. Расчетная экономическая эффективность применения Пробиоцела в рационе цыплят-бройлеров с первого дня развития птиц составила 2,58 руб. на голову.

Не менее выгодно введение ПРО-А в составе сухой пивной дробины в рацион откармливаемых поросят, телят и молочных коров. Более высокий прирост живой массы у животных обеспечивает превышение стоимости дополнительного прироста над разницей в стоимости кормов. Для поросят эта величина составила 115,2 руб. на голову. Себестоимость 1 ц прироста у телят ниже контроля на 249 руб. Расчеты

показали, что включение в комбикорма-концентраты для коров с продуктивностью около 7000 кг молока в год 15% сухой пивной дробины с пробиотиком позволит получить себестоимость 1 ц молока ниже, чем в контроле на 1,97 руб. От каждой коровы из опытной группы была получена дополнительная прибыль в размере 899,01 руб.

Результаты дали основание для организации и проведения испытаний Пробиоцела в хозяйствах страны - первого этапа внедрения разработанного препарата в практику.

5.5. ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ ПРОВЕРКА ПРОБИОЦЕЛА

На основании разносторонних исследований препарата Пробиоцел: анализа непатогенности штамма В.зиЫШв 8130, безвредности препарата - продукта бактериальной ферментации растительного сырья, изучения свойств Пробиоцела и положительного влияния препарата на животных, испытанного в хозяйстве Кленово-Чегодаево, ОАО «Племзавод Родники», ВНИТИПе Московская обл., было получено разрешение Минсельхоза РФ на проведение производственной проверки Пробиоцела в рационах сельскохозяйственных животных (Временное наставление по применению препарата Пробиоцел №13-4-03/0668). При участии НТЦ «БИО» (г.Шебекино, Белгородская обл.) и ЗАО «Алтайвитамины» (г.Бийск, Алтайский край) получены опытные партии препарата.

В настоящее время препарат успешно проходит испытания, что является практическим подтверждением правильности теоретических предпосылок работы. Получены положительные результаты при использовании Пробиоцела и его модификаций в рационах свиней в ЗАО «Возрождение», Белгородская область, бройлеров кроссов Сибиряк в ООО «Новоеловская птицефабрика», Алтайский край. Было получено 11,6% прироста живой массы поросят, и 7% дополнительного прироста живой массы цыплят при экономии кормозатрат на 3,1 %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа основывается на представлениях о ведущей роли симбиоза в прогрессивной эволюции органического мира, позволяющих рассматривать современное состояние наружных покровов, пищеварительного, респираторного, родового трактов животных как результат длительного развития их симбиоза с микроорганизмами. Разветвленная сеть участков организма животного, в которых присутствуют микросимбионты, оказывает существенное воздействие на функционирование хозяина. Полученные нами результаты показывают, что взаимоотношения между микросимбионтами и позвоночным животным подчиняются закономерностям, понимание которых позволяет направленно влиять на особь: оценивать и корректировать состояние здоровья, воздействовать на рост и развитие, на поведение и размножение.

Одним из важных элементов взаимодействия между животным и микросимбионтами репродуктивных систем, связанным с гормональными перестройками организма, является участие бактерий в химической коммуникации между полами в процессе воспроизводства популяции вида хозяина.

Существование у позвоночных животных системы специфических кожных желез является малоизученным с позиций симбиоза приспособлением для культивирования пробиотиков ш vivo. Поскольку в пищеварительном тракте находится значительная микробная масса, требующая постоянного контроля со стороны животного, к числу регуляторных механизмов можно отнести, и нормализацию микробного баланса путем периодического внесения аутопробиотиков. Локализация источника их получения в обособленных культиваторах - специфических кожных железах - может иметь значение для сохранения культуры пробиотика и возможности передачи его потомству.

Симбиотические связи животных с микроорганизмами желудочно-кишечного тракта позволяют хозяину повысить эффективность пищеварения, адаптироваться к специфике биохимического состава кормов. Большое значение имеет взаимосвязь симбиотического пищеварения клетчатки кормов с обеспечением азотом и биосинтезом белков тела животного. Кишечные симбионты, осуществляющие начальные этапы расщепления целлюлозы и повышающие переваримость растительных протеинов, помогают животному расширить кормовую базу. Выделяя биологически активные метаболиты в условиях твердофазного брожения, такие симбионты принимают участие в регуляции углеводного и азотистого обмена веществ животного.

Предложенная технология получения пробиотического препарата путем твердофазного сбраживания растительного субстрата открывает перспективы эффективного способа накопления биомассы микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ. Применение созданного препарата, стимулирующего пищеварение, имеет важное хозяйственное значение не только для интенсификации животноводства и птицеводства, но также позволяет получить дополнительный экономический эффект и повысить дозу ввода клетчатковых отходов

в корма сельскохозяйственных "животных с целью частичной утилизации отходов посредством скармливания ихжйвотным.

1. Исследования тонких механизмов симбиотических взаимосвязей между микроорганизмами и животным позволяют на основе анализа анатомии, физиологии и функциональных особенностей конкретных участков обитания микросимбионтов осуществить направленный поиск и выделение бактерий - эффективных продуцентов биологически активных веществ и пробиотиков, разработать соответствующую условиям их жизнедеятельности технологию получения препаратов.

2. В ходе индивидуального развития животного в секретах специфических

ВЫВОДЫ

кожных желез происходит становление микробного ценоза, сбалансированного по численности и видовому составу. Кожные железы, секреты которых могут попадать в пищеварительный тракт, выступают в качестве природных культиваторов бактерий с пробиотическими свойствами, нормализующими кишечный микробиоценоз взрослой особи и детенышей.

3. Функциональное значение микроорганизмов, заселивших слизистые половой системы, связано с их участием в химической коммуникации животных для стимуляции воспроизводства. Зацахэстральной самки имитируют вторичные метаболиты вапшальных бактерий" при условииТШГбйнирВЙа'ния микроорганизмовв определенном видовом и количественном соотношении, характерном для композиции симбионтов в слизистой рецептивной самки.

4. В слепой кишке растительноядных нежвачных животных развиваются бактерии рода Bacillus, участвующие в пищеварении целлюлозы, образующие метаболиты-стимуляторы роста лактобактерий, целлюлолитичсских микроорганизмов и повышающие усвояемость протеина растительных субстратов, что, по-видимому, служит механизмом адаптации фитофагов к специфике кормовой базы.

5. Выделен штамм Bacillus subtiüs 8130 - симбионт кишечника растительноядного глухаря, принимающий участие в пищеварении клетчатки. Микроорганизм оказывает пробиотическое действие на животных других видов и типов питания: кур, коров, свиней, домашних собак, норки, песца. Это свидетельствует об общем принципе организации симбиотических связей животных с бактериями, расщепляющими клетчатку.

6. Создана технология получения пробиотического препарата путем твердофазного сбраживания Bacillus subtilis 8130 растительных субстратов. Технология основана на способности бациллы при развитии в условиях затрудненного доступа кислорода без дополнительного внесения азота использовать питательные компоненты растительных отходов и образовывать биологически активные метаболиты. Технология позволяет вести управляемый процесс и получать препарат, соответствующий разработанному регламенту.

7. Твердофазное сбраживание субстрата при 50-60% влажности массы позволяет увеличить плотность популяции микроорганизма-продуцента биологически активных метаболитов, что ведет к возможности уменьшения дозы ввода препарата в корма животных.

8. Применение разработанного пробиотика в рационе животных увеличивает переваримость всех компонентов кормов, и в наибольшей степени - клетчатки, повышает поступление в организм азота кормов и его использование, стимулирует рост сельскохозяйственных животных, дает экономию затрат кормов на единицу прироста живой массы тела и экономически оправдано.

9. Препарат Пробиоцел в сочетании с сухой пивной дробиной позволяет при введении в рацион поросят и телят 6% сухой пивной дробины, а в рацион молочных

коров 15% данного растительного отхода с повышенным содержанием клетчатки,

пол^ить^ополнительный прирост живой массы тела и увеличить удои молока

повышенной жирности;-~~~ ............

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ушакова H.A. Роль симбионтной микрофлоры в химической коммуникации млекопитающих // В кн. Сигнализация и экология млекопитающих и птиц. М.: Наука. 1984. С. 44-64.

2. Соколов В.Е., Ушакова H.A. Микрофлора и химическая коммуникация животных: некоторые экологические аспекты // В кн. Химическая коммуникация животных. Теория и практика. М.:Наука. 1986. С. 262-270.

3. Ушакова H.A., Андреев Л.В. Спорообразующие бактерии и другие микроорганизмы в секрете среднебрюшной железы самцов большой песчанки // В кн. Химическая коммуникация животных. Теория и практика. М.: Наука. 1986 а. С. 271-286.

4. Ушакова H.A., Андреев Л.В. Аэробная микрофлора секрета среднебрюшной железы самцов большой песчанки // Доклады АН СССР. 1986 б. Т. 286. № 4. С. 988.

5. Ушакова H.A. Особенности микробных ассоциаций на коже и с5 производных в связи с жизнедеятельностью млекопитающих // В кн. Актуальные проблемы морфологии и экологии высших позвоночных. М.:ВАСХНИЛ. 1988. Т. 2. С. 598630.

6. Ушакова H.A., Абрамова О.Ю. Количество и состав бактерий кожи морских млекопитающих — индикатор физиологического состояния животных //Микробиология. 1989. Т. 58. № 5. с. 864-870.

7. Соколов В.Е., Ушакова H.A., Приходько В.И., Неклюдова Т.И, Громов B.C., Белоусова И.П. Особенности микробных ассоциаций в секретах некоторых кожных желез млекопитающих // Микробиология. 1990. Т.59. № 3. С. 472-481.

8. Соколов В.Е., Ушакова H.A., Шубкина A.B. Реакция микробных ассоциаций па поверхности кожи млекопитающих на изменения физиологического состояния животных // Известия АН СССР. Серия биологическая. 1990. Т. 5. С. 694-700.

9. Ushakova N.A., Shubkina A.Y. Stress as a factor which cause a disturbance of the stability of communities of macroorganisms and skin bacteria, associated with them // Abstr. Plenary, Symposium Papers and Posters presented at the V Int. Congress of ecology. Iokohama/ Japan. 1990. P. 346.

Ю.Соколов B.E., Ушакова H.A., Шубкина A.B., Неклюдова Т.И. Стресс - как фактор, нарушающий стабильность кожных микробных ассоциаций // Доклады АН СССР. 1991. Т. 317. №3. С. 764-768.

П.Ушакова H.A. Микробиологическое обследование кожи и слизистых амазонских речных дельфинов иний в связи с оценкой физиологического состояния животных //Известия АН СССР. Серия биологическая. 1991. № 6. С. 943-949.

12. Соколов В.Е., Ушакова H.A., Суров A.B., Телицина А.Ю. Динамика бактериальных ассоциаций в вагинальных смывах самок сирийского хомячка в течение их полового цикла // Известия АН СССР. Серия биологическая. 1991. № 5. С. 675-683.

13. Ушакова H.A., Шубкина A.B. Участие бактерий на коже млекопитающих в химической коммуникации животных // В кн. Проблемы химической коммуникации животных. М.: Наука. 1991. С.323-330.

14.Шубкина A.B., Ушакова H.A. К вопросу о возможных механизмах выбора жертвы // В кн. Проблемы химической коммуникации животных. М.: Наука, 1991. С.393-404.

15.Соколов В.Е., Ушакова H.A. Автоколебания компонентов вагинальной слизи в течение овуляторного цикла у млекопитающих // Доклады АН СССР. 1991. Т. 319. № 5. С. 1263-1267.

16. Соколов В.Е., Ушакова H.A., Чернова О.Ф., Перфилова Т.В. Взаимодействие между поверхностью волоса и бактериями при изменении физиологического состояния млекопитающего // Доклады АН СССР. 1992. Т. 323. К» 5. С. 980-988.

17. Соколов В.Е., Ушакова H.A., Телицина А.Ю., Мешик В.А. Некоторые особенности размножения малого толстого лори Nycticebus pygmaeus coucang в Московском зоопарке // Известия АН СССР. Серия биологическая. 1993. № 2. С. 219-226.

18. Соколов В.Е., Ушакова H.A., Суров A.B., Телицина А.Ю. Участие вагинальных бактерий хомячка Кэмпбелла в химической коммуникации между самкой и самцом // Известия РАН. Серия биологическая. 1994. № 5. С. 810-817.

19.Соколов В.Е., Ушакова H.A., Феоктистова Н.Ю., Васильева Н.Ю. Бактерии в секрете дополнительных мешочков в устье защечных мешков у хомячка Phodopus campbelli // Микробиология. 1995. Т.64. №2. С.216-221.

20.Соколов В.Е., Ушакова H.A., Козлова A.A. Изучение физиологического состояния детенышей Беломорского стада гренландского тюленя Padophilus groenlandica с помощью микробиологических характеристик кожно-волосяного покрова животных //Известия РАН, Серия биологическая. 1994. № 3. С. 375-386.

21. Соколов В.Е., Ушакова H.A., Чернова О.Ф., Шубкина A.B., Алимбарова JI.M., Баринский И.Ф. Об антиинфекционных свойствах ушной серы млекопитающих //Известия РАН. Серия биологическая. 1995. №5. С.579-585.

22. Ушакова H.A. Эстральный цикл самки амазонского дельфина при содержании в неволе // В кн. Амазонский дельфин. М.: Наука. 1996. С.266-270.

23. Соколов В.Е., Ушакова H.A., Чернова О.Ф., Алимбарова Л.М., Баринский И.Ф. Строение кожи наружного слухового прохода и антивирусная активность

церумена у хищных млекопитающих // Известия РАН. Серия биологическая. 1996. №4. С.430-436.

24. Ушакова H.A. Микробиологические показатели состояния здоровья у северного морского котика //В кн. Северный морской котик. Систематика. Морфология. Экология. Поведение. М.: МАБ. 1998. Часть 2. С.893-900.

25.Безбородов A.M., Рогожин И.С., Ушакова H.A., Жуков В.Г., Курлович А.Е., Попов В.О. Взаимодействие бактерий Pseudomonas oleovorans и Nocardia rugosa в модельной системе по очистке воздуха от смеси толуола и метилэтилкетона // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т.34. №5. С. 513-516.

26.Наумова Е.И., Ушакова H.A., Мещерский И.Г., Костина Н.В., Умаров М.М. Азотфиксация - новый феномен в питании грызунов // Зоологический журнал. 2000. №3. С.329-331.

27. Наумова Е.И., Мещерский И.Г., Ушакова H.A. Потребность в азоте у восточноевропейской полевки Microtus rossiaemeridionalis // Известия АН. Серия биологическая. 2001. №5. С.573-578.

28.Яхин А., Кирилов М., Боголюбов А., Суменкова Н., Абдрафиков А., Чернуха Б., Ушакова Н., Бабурина М.Кормовая добавка для откорма свиней // Комбикорма. 2003. №2. С.59-60.

29.Яхин АЛ., Соковых О.В., Абдрафиков А.Р., Чернуха Б.А., Ушакова H.A., Бабурина М.И. Комплексная кормовая добавка «Пробиоцел» // Мясная индустрия.

2003. №1. С. 44-45.

30. Ушакова H.A., Белов Л.П., Варшавский A.A., Козлова A.A., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П. Расщепление целлюлозы при дефиците азота бактериями, выделенными из кишечника растительноядных позвоночных // Микробиология. 2003. Т.72. №3. C.I-7.

31. Ушакова H.A., Феоктистова Н.Ю., Колганова Т.В., Турова Т.П. Microbacterium oxydans — симбионт хомячка Кэмпбелла, обладающий пробиотическими свойствами Н Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 50. №6. С. 639-644.

32. Феоктистова Н.Ю., Ушакова H.A., Мещерский И.Г. Участие симбиотических бактерий, обитающих в специфических комплексах в углах рта, в процессах регуляции нормальной жизнедеятельности у хомячка Кэмпбелла // Доклады АН.

2004. Т.398. №3. С. 1-4.

33.Ushakova N.A. Two- Stage Process of Cultivation of Probiotic Bacillus Subtilis 8130 for Reception Biologically Active Feed Additives for Animals // in: Biotechnology and Industry. Ed. G.E.Zaikov. Nova Science Publishers, Inc. New York. 2004. P.75-79.

34. Ушакова H.A. Дикие животные и населяющие их микроорганизмы: теоретические предпосылки разработки биологически активных препаратов // Сборник научных статей Фундаметальные основы управления биологическими ресурсами. М. КМК. 2005. С.473-479.

35.Ushakova N.A., Kozlova A.A., Nifatov A.V. Strain Bacillus subtilis 8130 - the natural stimulator of digestion // in: Biotechnology, Agriculture and the Food Industry. Ed. G.E.Zaikov. Nova Science Publishers, Inc. New York. 2006. P. 111-118.

36. Ушакова НА., Котенкова E.B., Козлова A.A., Нифатов A.B. Изучение

^ механизмов пробиотической активности штамма Bacillus subtilis 8130 II

Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 52. №3. С.285-291.

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

37. Соколов В.Е., Ушакова Н.А., Исаев С.И. Симбионтные бактерии в секрете среднебрюшной железы самцов большой песчанки // II Всесоюзное совещание по химической коммуникации животных. Тез. докл ., М., 1983, с. 11-13.

38. Ушакова Н.А., Степанова Л.В., Абрамова О.Ю. Изменения в составе аутофлоры поверхности кожи черноморской афалины и в структуре кожи при развитии дерматоза // 4 Всесоюзное совещание по проблемам морских гидробионтов. 1986, с. 77.

39.Ushakova N.A., Shubkina A.V. Stress as a factor which cause a disturbance of the stability of communities of macroorganisms and skin bacteria, associated with them // Abstr. Plenary, Symposium Papers and Posters presented at the V Int. Congress of ecology. Iokohama/ Japan, 1990, p. 346.

40. Nina A. Ushakova. About the role of bacteria in chemical communication of animals //Chemical signals in vertebrates YII Tubingen, 1994. P. 382-385.

41.Ушакова H.A. Особенности усвоения клетчатки растительноядными млекопитающими // Проблемы эволюционной и экологической морфологии. Школа-семинар Москва, 15-16 мая 2001 г., Биоинформсервис, М., 2001, с.135-139.

42. Ушакова Н.А., Наумова Е.И., Павлов Д.С., Чернуха Б.А. Пробиоцел -перспективная добавка к кормам животных // Сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках Всероссийская конференция. 14-19 июня 2001 г. Тезисы докладов, с. 110,

43.Поляков А.Н., Ушакова Н.А., Стифеев Е.А. Процесс сушки в технологии переработки твердых целлюлозосодержащих растительных отходов с получением кормовых добавок // Инженерная защита окружающей среды. Международная конференция и V международный симпозиум молодых ученых, аспирантов и студентов. 16-18 мая 2001 г. Тезисы докладов. М., 2001, с.200-202.

44. Ушакова Н.А., Павлов Д.С., Чернуха Б.А., Бирюков В.В., Поляков А.Н., Козлова А.А., Нифатов А.В. Биотрансформированная пивная дробина как кормовая добавка для сельскохозяйственных животных // 1-й Международный Конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития». Москва, Россия, 14-18 октября 2002. Материалы Конгресса, с,202-203.

45.Абдрафиков А.Р., Яхин А.Я., Боголюбов А.В., Соковых O.B., Ушакова Н.А. Использование питательных веществ комбикормов с кормовой добавкой «Пробиоцел» откармливаемыми свиньями // Проблемы кормления

сельскохозяйственных животных в современных условиях развития животноводства. Материалы научно-практической конференции, посвященной 85-летию академика РАСХН Л.П.Калашникова. 9-10 февраля 2003 г. Дубровицы. С. 141-142

46. Ушакова H.A. Двухстадийный процесс аэробно-анаэробного культивирования пробиотика Bacilus subtilis 8130 для получения биологически активных добавок к кормам животных // II Московский международный Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы конгресса. Москва, Россия, 10-14 ноября 2003г. Часть 1. С.285-286.

47. Ушакова H.A., Павлов Д.С., Чернуха Б.А., Кириллов М.П., Яхин А .Я., Соковых О.В., Козлова A.A., Нифатов A.B., Абдрафиков А.Р. Изучение механизмов биологической активности штамма Bacillus subtilis 8130, входящего в препарат Пробиоцел, в лабораторных экспериментах, научно-хозяйственных опытах и при производственной проверке в рационе свиней // Тез.докл. Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» Москва, Россия, 2-4 июня 2004 г., с. 162-163.

48. Ушакова H.A. Факторы, определяющие пробиотические свойства бактерий вида Bacillus subtilis // Тез.докл. Всероссийского симпозиума Биотехнология микробов, Москва, МАКС Пресс, 2004. с.90.

49. Ушакова H.A., Павлов Д.С., Чернуха Б.А., Козлова A.A., Нифатов A.B., Кириллов М.П., Яхин А.Я., Перепелкин Н.В., Хабаров А.Б., Некрасов Р. Пробиотик Bacillus subtilis 8130 кормового назначения — природный стимулятор пищеварения // Третий Московский международный Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы конгресса. Москва, Россия, 14-18 марта 2005г. Часть 1. С.303.

ПАТЕНТЫ

50. Пат. Российской Федерации. Способ приготовления корма для животных из растительного сырья /Павлов Д.С., Наумова Е.И., Ушакова H.A., Нестерова Н.Г., Жарова Г.К., Чернуха Б.А. - № 2153813; 26.11.1999.

51. Пат. Российской Федерации. Способ получения биологически активной кормовой добавки из растительного сырья /Ушакова H.A., Наумова Е.И., Павлов Д.С., Чернуха Б.А. - № 2202224; 20.04.2003.

ПРОФЕССИОНАЛЬНЫЕ НАГРАДЫ Премия Правительства Российской Федерации за создание технологии

биологической очистки воздуха от техногенных выбросов летучих органических

соединений. Диплом № 1307, 06 апреля 1998 года.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12,99 г. Подписано к печати 18.09.2006 г. Формат 60x90 1/16, Усл.печл. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ 615. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ушакова, Нина Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ПОЛЕЗНЫЕ БАКТЕРИИ МИКРОБИОТЫ ЖИВОТНОГО

- ПРОДУЦЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ.

1.2. УЧАСТИЕ БАКТЕРИЙ В ХИМИЧЕСКОЙ КОММУНИКАЦИИ ЖИВОТНЫХ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОТДЕЛЬНЫХ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ЖИВОТНОГО КАК СРЕДЫ ОБИТАНИЯ СИМБИОНТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ: РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К НАПРАВЛЕННОМУ ПОИСКУ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ВЕЩЕСТВ.

3.1. КОЖНЫЙ ПОКРОВ.

3.1.1. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ КОЖНЫЕ ЖЕЛЕЗЫ.

3.2. СЛИЗИСТЫЕ ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ.

3.3. ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЙ ТРАКТ.

3.3.1. СЛЕПАЯ КИШКА НЕЖВАЧНЫХ РАСТИТЕЛЬНОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ

КАК СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ОРГАН, ПРИСПОСОБЛЕННЫЙ ДЛЯ

СИМБИОНТНОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ КЛЕТЧАТКИ.

ГЛАВА 4. МУТУАЛИСТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ И ЖИВОТНОГО НА ПРИМЕРЕ СВЯЗИ МЕЖДУ СИМБИОНТНЫМ ПИЩЕВАРЕНИЕМ КЛЕТЧАТКИ И АЗОТИСТЫМ ОБМЕНОМ ВЕЩЕСТВ У ХОЗЯИНА.

4.1. ПРОБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS.

4.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММА В. SUBTILIS 8130.

4.3. РЕАКЦИЯ ЖИВОТНОГО ОРГАНИЗМА НА ВВЕДЕНИЕ С КОРМАМИ

В. SUBTILIS 8130.

4.4. СЕЛЕКЦИЯ ШТАММА В. SUBTILIS 8130 В УСЛОВИЯХ СИМБИОЗА

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ К КОРМАМ ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В. SUBTILIS

8130.

5.1. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОБИОЦЕЛ.

5.2. ОТРАБОТКА ДОЗЫ И СПОСОБОВ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОБИОЦЕЛ В РАЦИОН ЖИВОТНЫХ.

5.3. ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИКА НА ПРОДУКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ КОМБИКОРМОВ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ

КЛЕТЧАТКИ.

5.4. ОЦЕНКА ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА.

5.5. ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ ПРОВЕРКА ПРОБИОЦЕЛА.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных и использование микросимбионтов в биотехнологических целях"

Симбиоз (от греческого symbiosis - совместная жизнь) - форма совместного существования двух и более организмов разных видов. Часто симбиоз взаимовыгоден для обоих симбионтов (мутуалистический симбиоз), то есть сожительство обоих организмов (симбионтов) взаимовыгодно и возникает в процессе эволюции как одна из форм приспособления к условиям существования. К данному типу симбиоза относится симбиоз между животными (человеком) и непатогенными микроорганизмами, обитающими в отдельных участках тела хозяина (Мошковский, 1946; Догель, 1981).

Животные и населяющие их микробные сообщества представляют собой сложно организованную систему с устойчивой структурой, в которой взаимодействие элементов строго сбалансировано и связано с разграничением функций и их специализацией. В ходе индивидуального развития особи формируются органы и ткани, где имеются доступные для бактерий органические источники питания, поддерживается тепло, влажность. Новорожденные детеныши млекопитающих инфицируются бактериями матери при прохождении через родовые пути (Зинченко, Панин, 2000). У птиц внутри яиц содержится специфический микробиоценоз, включающий лактобактерии, коли-формы (Moats, 1980). А такие формы поведения животных, как облизывание малышей, потирание частями тела в области специфических кожных желез, копрофагия, вылизывание детенышами оральной области родителей и т.п. (Соколов, 2002), обеспечивают передачу потомству кожных бактерий, бактерий ротовой полости, ано-генитальной области и пищеварительного тракта. Таким образом, из поколения в поколение животными передаются друг другу определенные виды микроорганизмов, что служит показателем неразрывного единства организма хозяина и симбионтов.

Общие представления о структурной организации и функционировании позвоночного животного и совокупности микробиоценозов, рассмотренные в данной работе, сводятся к следующему. Современное животное является результатом длительной коэволюции хозяина и прокариот, в результате которой сложились отношения дополнительности компонентов единой системы, сопровождающиеся развитием специализированных органов хозяина, физиолого-биохимической адаптацией микроорганизмов к организму животного к конкретным местам обитания), и совершенствованием механизмов взаимодействия всех элементов системы.

Специализированные морфологические структуры хозяина, в которых развиваются приспособленные к таким местам микроорганизмы, представляют собой образования, по сути являющиеся естественными культиваторами -бродильными камерами (Современная микробиология. Прокариоты, 2005). К подобным структурам относятся различные отделы пищеварительной системы (рубец жвачных, преджелудки грызунов и зайцеобразных (Наумова, 1981), толстый отдел кишечника, а также малоизученные с позиций симбиотических взаимодействий протоки и резервуары кожных желез (Ушакова, 1984). Микроорганизмы развиваются на поверхности кожно-волосяного покрова, включая наружный слуховой проход, верхние дыхательные пути, в слизистых выстилках ротовой полости, ано-генитальных областей. Макроорганизм создает необходимые условия для жизнедеятельности микроорганизмов, однако контролирует и ограничивает степень их развития.

Роль микробного сообщества связана с его топографическим расположением, функциональными особенностями мест обитания микроорганизмов, и в общих чертах может быть подразделена на: 1) непосредственное участие в процессах пищеварения, 2) обеспечение хозяина необходимыми продуктами микробного метаболизма, включая витамины, антибиотики, сигнальные молекулы бактериального происхождения, в том числе, летучие вещества, нейропептиды и др., 3) участие в формировании неспецифической защиты организма и его иммунного статуса с момента рождения (Hungate, 1966; Петровская, Марко, 1976; Нейчев, 1977; Стейниер и др., 1979; Lee et all., 1980; Lee, 1985; Brown, Schellinck, 1992; Бабин и др., 1994; Tannock, 1995; Шендеров, 1998; Ковальзон и др., 1994; Крюгер, Ковальзон, 1994; Янковский, 2003).

Известные данные о функциональных взаимодействиях животного и его микробиоты позволяют сделать вывод, что симбиотические связи направлены на поддержание целостности всего организма и обеспечение его нормального функционирования и воспроизводства. Микросимбионты вносят вклад в биотрансформацию компонентов кормов в доступные для хозяина формы источников энергии, углерода, макро- и микроэлементов, синтезируют используемые животным метаболиты, принимают участие в химической коммуникации животных, в том числе, в синтезе половых феромонов. Открытость системы, создающая возможность развития патогенов, вызывает комплексную защиту, включающую иммунные процессы хозяина и антагонистические свойства симбионтных микроорганизмов.

Несмотря на большой интерес многих исследователей к роли симбионтов, и, казалось бы, многостороннюю изученность данного вопроса, ряд принципиальных моментов, касающихся взаимоотношений микробиота — организм-хозяин, до сих пор остается неясным. Среди них основными являются оценка масштаба той пользы, которую получает макроорганизм от симбиоза, а также выяснение механизмов, управляющих связью хозяина с микроорганизмами (Бабин и др., 1994).

Физиолого-биохимические особенности симбионтных микроорганизмов позволяют использовать их в биотехнологических целях. Исследование мутуалистических взаимодействий хозяина с микроорганизмами может обеспечить целенаправленное выделение штаммов-продуцентов биологически активных веществ, разработку технологии их получения и применения. Таким образом, понимание механизмов симбиотических связей является основой для научного подхода к выделению и практическому применению микросимбионтов.

Настоящая работа основана на исследовании диких животных, обладающих системой органов и тканей, доступных для развития симбионтов, и исходит из положения, что животные являются природным фондом микроорганизмов с разнообразными и уникальными физиолого-биохимическими свойствами (Заварзин, 1987). Эффективное использование таких микроорганизмов зависит от комплексного подхода к изучению симбиотических взаимосвязей животного и бактерий, включающего микробиологические и зоологические (морфологические, этологические, экологические и физиолого-биохимические) исследования хозяина в сочетании с применением достижений современной биотехнологии.

Симбиотические взаимосвязи являются предпосылками для создания с помощью микроорганизмов препаратов, влияющих на животное-реципиент. К таким препаратам можно отнести антибиотики, ферменты, витамины. В число активно развивающихся в последнее время направлений использования симбионтов животных входит разработка пробиотических препаратов.

Пробиотики - живая микробная пищевая добавка, воздействующая на животное путем улучшения его микробного баланса (Fuller, 1992), обменные и иммунные процессы (Тараканов, и др., 2004). Актуальность задачи получения эффективных пробиотиков определяется как потребностями современного индустриального животноводства в стимуляторах роста сельскохозяйственных животных, так и ухудшением экологической, санитарно-эпидемиологической обстановки в мире на фоне тенденции общества к ограничению применения в кормах антибиотиков. В странах ЕС с 2006 года вводится запрет на использование антибиотиков в составе кормов для животных; аналогичный вопрос обсуждается и общественностью России (Ли В., 2003; Миронов А., Малов А., 2004), что ведет к увеличению спроса на пробиотики в качестве альтернативы антибиотиков. Однако теоретические основы создания таких препаратов: источники выделения микроорганизмов с пробиотическими свойствами, обоснованный подбор штаммов, использующихся в препаратах, механизмы их действия, реакция организма на введение пробиотика разработаны в недостаточной степени (Янковский и др., 2004).

Перспективным направлением микробной биотехнологии является разработка пробиотических препаратов кормового назначения. При этом большое внимание уделяется пробиотикам с целлюлолитическими свойствами в связи с проблемами российского кормопроизводства. В последние годы структура фуражного сырья в стране претерпела значительные изменения, которые привели к вынужденному введению в корма трудно перевариваемых и низкокалорийных компонентов (отруби, рожь, овес, ячмень, просо). Большое значение имеет отказ от применения в кормах сельскохозяйственных животных мясо-костной муки и замене ее на белок растительного происхождения (соевую муку, кукурузный глютен), продажные формы которого содержат примеси клетчатки. Это приводит к увеличению доли трудно перевариваемой клетчатки в кормах и ставит задачу повышения ее усвоения, поскольку клетчатка оказывает существенное влияние на использование животными питательных веществ рациона. Накопление растительных отходов, обогащенных клетчаткой (пивная дробина, различные типы шротов, жомов и др.), вызывает попытки их утилизации введением в корма сельскохозяйственных животных, что также вызывает необходимость разработки препаратов, стимулирующих пищеварение клетчатки. Поэтому актуально изучение внутренних цепей питания растительноядных животных с высокой степенью переваримости клетчатковых волокон, выделение из них целлюлолитических и иных симбионтных бактерий, участвующих в пищеварении, и разработка биотехнологии промышленного получения и применения таких микроорганизмов.

К числу важнейших теоретических и практических вопросов относится обеспечение животных азотом, незаменимыми аминокислотами, витаминами -и соответствующий поиск симбионтов, продуцирующих аминокислоты и витамины, создание генноинженерных модификаций бактерий-продуцентов, например, лизина, разработка способов увеличения переваримости и усвоения белков существующих рационов путем введения ферментов, в том числе, микробного происхождения.

Не меньший интерес представляет химическая коммуникация животных и участие бактерий в этом процессе, с перспективой создания микробных препаратов - стимуляторов размножения животных.

Разрабатываются и другие направления применения микросимбионтов в практических целях, такие, как индикация состояния здоровья хозяина, создание противоопухолевых вакцин, гормональных препаратов - стимуляторов или ингибиторов ряда гормонов.

Микроорганизмы, обладающие специфическими ферментами, расщепляющими различные углеводороды, ароматические вещества и иные токсины, могут использоваться для биодеградации токсических органических соединений в практических целях.

Общий методологический подход к разработке способа применения отдельного симбионтного микроорганизма или микробного ценоза, примененный в настоящей работе, заключается в следующем. Основой является морфо-функциональный анализ отдельных органов и тканей животного как среды обитания симбионтных микроорганизмов, что в сочетании с особенностями физиологии, поведения и экологии хозяина определяет возможное направление использования микросимбионтов. Технология культивирования микросимбионта и целенаправленное получение биологически активных метаболитов основывается на специфике природной экологической ниши данного микроорганизма и возможной его роли в конкретном микробиоценозе и в симбиотической системе. В качестве примера поиска штамма-продуцента биологически активных веществ и разработки способа его применения в биотехнологических целях использовано направление исследований мутуалистических взаимодействий между микроорганизмами и животным, связанное с изучением полезных бактерий микробиоты с пробиотическими свойствами. Другие направления - индикация состояния здоровья особи, использование для биодеградации токсических веществ и участие симбионтных микроорганизмов в химической коммуникации высших позвоночных - обозначены как перспективные.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ушакова, Нина Александровна

выводы

1. Исследования тонких механизмов симбиотических взаимосвязей между микроорганизмами и животным позволяют на основе анализа анатомии, физиологии и функциональных особенностей конкретных участков обитания микросимбионтов осуществить направленный поиск и выделение бактерий -эффективных продуцентов биологически активных веществ и пробиотиков, разработать соответствующую условиям их жизнедеятельности технологию получения препаратов.

2. В ходе индивидуального развития животного в секретах специфических кожных желез происходит становление микробного ценоза, сбалансированного по численности и видовому составу. Кожные железы, секреты которых могут попадать в пищеварительный тракт, выступают в качестве природных культиваторов бактерий с пробиотическими свойствами, нормализующими кишечный микробиоценоз взрослой особи и детенышей.

3. Функциональное значение микроорганизмов, заселивших слизистые половой системы, связано с их участием в химической коммуникации животных для стимуляции воспроизводства. Запах астральной самки имитируют вторичные метаболиты вагинальных бактерий при условии комбинирования микроорганизмов в определенном видовом и количественном соотношении, характерном для композиции симбионтов в слизистой рецептивной самки.

4. В слепой кишке растительноядных нежвачных животных развиваются бактерии рода Bacillus, участвующие в пищеварении целлюлозы, образующие метаболиты-стимуляторы роста лактобактерий, целлюлолитических микроорганизмов и повышающие усвояемость протеина растительных субстратов, что, по-видимому, служит механизмом адаптации фитофагов к специфике кормовой базы.

5. Выделен штамм Bacillus subtilis 8130 - симбионт кишечника растительноядного глухаря, принимающий участие в пищеварении клетчатки. Микроорганизм оказывает пробиотическое действие на животных других видов и типов питания: кур, коров, свиней, домашних собак, норки, песца. Это свидетельствует об общем принципе организации симбиотических связей животных с бактериями, расщепляющими клетчатку.

6. Создана технология получения пробиотического препарата путем твердофазного сбраживания Bacillus subtilis 8130 растительных субстратов. Технология основана на способности бациллы при развитии в условиях затрудненного доступа кислорода без дополнительного внесения азота использовать питательные компоненты растительных отходов и образовывать биологически активные метаболиты. Технология позволяет вести управляемый процесс и получать препарат, соответствующий разработанному регламенту.

7. Твердофазное сбраживание субстрата при 50-60% влажности массы позволяет увеличить плотность популяции микроорганизма-продуцента биологически активных метаболитов, что ведет к возможности уменьшения дозы ввода препарата в корма животных.

8. Применение разработанного пробиотика в рационе животных увеличивает переваримость всех компонентов кормов, и в наибольшей степени - клетчатки, повышает поступление в организм азота кормов и его использование, стимулирует рост сельскохозяйственных животных, дает экономию затрат кормов на единицу прироста живой массы тела и экономически оправдано.

9. Препарат Пробиоцел в сочетании с сухой пивной дробиной позволяет при введении в рацион поросят и телят 6% сухой пивной дробины, а в рацион молочных коров 15% данного растительного отхода с повышенным содержанием клетчатки, получить дополнительный прирост живой массы тела и увеличить удои молока повышенной жирности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа основывается на представлениях о ведущей роли симбиоза в прогрессивной эволюции органического мира, позволяющих рассматривать современное состояние наружных покровов, пищеварительного, респираторного, родового трактов животных как результат длительного развития их симбиоза с микроорганизмами. Разветвленная сеть участков организма животного, в которых присутствуют микросимбионты, оказывает существенное воздействие на функционирование хозяина. Полученные нами результаты показывают, что взаимоотношения между микросимбионтами и позвоночным животным подчиняются закономерностям, понимание которых позволяет направленно влиять на особь: оценивать и корректировать состояние здоровья, воздействовать на рост и развитие, на поведение и размножение.

Одним из важных элементов взаимодействия между животным и микросимбионтами репродуктивных систем, связанным с гормональными перестройками организма, является участие бактерий в химической коммуникации между полами в процессе воспроизводства популяции вида хозяина.

Существование у позвоночных животных системы специфических кожных желез является малоизученным с позиций симбиоза приспособлением для культивирования пробиотиков in vivo. Поскольку в пищеварительном тракте находится значительная микробная масса, требующая постоянного контроля со стороны животного, к числу регуляторных механизмов можно отнести и нормализацию микробного баланса путем периодического внесения аутопробиотиков. Локализация источника их получения в обособленных культиваторах - специфических кожных железах - может иметь значение для сохранения культуры пробиотика и возможности передачи его потомству.

Симбиотические связи животных с микроорганизмами желудочно-кишечного тракта позволяют хозяину повысить эффективность пищеварения, адаптироваться к специфике биохимического состава кормов. Большое значение имеет взаимосвязь симбиотического пищеварения клетчатки кормов с обеспечением азотом и биосинтезом белков тела животного. Кишечные симбионты, осуществляющие начальные этапы расщепления целлюлозы и повышающие переваримость растительных протеинов, помогают животному расширить кормовую базу. Выделяя биологически активные метаболиты в условиях твердофазного брожения, такие симбионты принимают участие в регуляции углеводного и азотистого обмена веществ животного.

Предложенная технология получения пробиотического препарата путем твердофазного сбраживания растительного субстрата открывает перспективы эффективного способа накопления биомассы микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ. Применение созданного препарата, стимулирующего пищеварение, имеет важное хозяйственное значение не только для интенсификации животноводства и птицеводства, но также позволяет получить дополнительный экономический эффект и повысить дозу ввода клетчатковых отходов в корма сельскохозяйственных животных с целью частичной утилизации отходов посредством скармливания их животным.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ушакова, Нина Александровна, Москва

1. Алексеева Л. Б. Полицикличность размножения у приматов и антропогенез. М.: Наука, 1977. 196 с.

2. Алимов A.M., Алиев М.Ш. Лечебно-профилактическое значение пробиотиков при желудочно-кишечных инфекциях поросят и цыплят // Актуальные проблемы биологии в животноводстве. Тез. докл. Боровск. 2000. С.382-383.

3. Антипов В.А. Биологические препараты симбионтных микроорганизмов и их применение в ветеринарии // Сельское хозяйство за рубежом. 1981. №2. С.43-47.

4. Антипов В.А., Ермакова Т.И. Перспективы использования пробиотиков // Фармакология и токсикология новых лекарственных средств и кормовых добавок в ветеринарии. Л. 1989. С.173-175.

5. Антипов В.А., Мартынов Г.Н. Отечественные пробиотики для животноводства // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных. Тез. докл. междунар. конф. Боровск. 1990. 4.2. С.109 -110.

6. Антипов В.А. Использование пробиотиков в животноводстве // Ветеринария. 1991. №4. С.55-56.

7. Бабин В.Н, Домарадский И.В, Дубинин А.В., Кондракова О. А. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры // Российский химический журнал. М. 1994. №6. С.66-78.

8. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г. и др. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии // Биотехнология. 2001. №2. С.48-56.

9. Башкиров О.Г. Применение препарата Биоплюс 2Б в современном свиноводстве IIБИО. 2003. №2. С.22-27.

10. Бергнер X., Кейтц Х.А. Научные основы питания сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1973. 597 с.

11. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. Учебник. 3-е изд М.: Медицина, 1998. 704 с.

12. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. М.:«КолосС» «Химия», 2004. 296 с.

13. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы. Ленинград: Медицина, 1979. С. 175.

14. Бодяк Н.Д. Морфофункциональные особенности гардеровой железы некоторых видов млекопитающих. Автореф. дис.канд.биол.наук. М. МЭМЭЖ РАН, 1994. 24 с.

15. Булеза В. В., Васильева В. С. Влияние отдельных компонентов полового феромона озимой совки Agrotis segetum на его аттрактивность и видоспецифичность // Проблемы химической коммуникации животных. М.: Наука. 1991. С. 115.

16. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нукпеотидных последовательностей генов nifH некоторых метанотрофных бактерий // Микробиология. 2002. Т.71. №4. С.500-509.

17. Вальдман А.Р. Питание животных и микрофлора II Биохимия и физиология питания животных. Рига:«3инатне», 1972. С.47-66.

18. Варшавский А.А., Наумова Е.И., Тихонов И.А. Особенности функционирования целлюлолитических симбионтов в преджелудке и слепой кишке серых полевок // Зоологический журнал. 2004. Т.83. №11. С. 1299-1304.

19. Васильева Н.Ю. Функция специфических кожных желез. Автореф. дис. .канд. биол. наук. М. ИЭМЭЖ, 1990. 26 с.

20. Васильева Н.Ю., Феоктистова Н.Ю. Функция дополнительных мешочков в устье защечных мешков у хомячка Кэмпбелла (Phodopus campbelli) // Зоол.журн. 1993. Т.72. №6. С.103-113.

21. Ветом-1.1 эффективное средство лечения и профилактики болезней органов пищеварения у телят // Рекламации: НГАУ Новосибирск. 1996. С. 15.

22. Вилли К.Биология. М.: Иностранная Литература, 1959. С.328-329.

23. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства, защитные функции // Микробиологический журнал. 1999. №6. С.102-105.

24. Ганина В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии. М.: МГУПБ, 2001. 169 с.

25. Грачева М.М. (ред.) Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. М.: «Элевар», 2003. 553 с

26. Гриценко И.Н. Микрофлора мелких млекопитающих Западной Сибири. Новосибирск: Наука. СО, 1971. 263 с.

27. Грязнева Т. Н. Технология производства пробиотика «Биод-5» и его применение в ветеринарии // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Покров. 2003. ч. 2. С. 609 614.

28. Гущин Н.Н. Протеолитические бактерии, выделенные из рубца и слепой кишки овец // Бюл. ВНИИфизиологии и биохимии с.-х. животных.1968. №6. Вып.2. С. 65-68.

29. Догель В.А. Зоология беспозвоночных. М.: Высшая школа, 1981. 606с.

30. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М.: ГРАНТЪ, 2002. 296 с.

31. Дьюсбери Д. Поведение животных. Сравнительные аспекты. М.:Мир, 1981. С.214-217.

32. Егоров Н. С. (Ред.) Практикум по микробиологии. М.: МГУ, 1976. С. 92.

33. Жданов П.И. Применение споробактерина для повышения сохранности и продуктивности свиней // Ветеринария. 1994. №11. С.36-40.

34. Жмакин К.И. (ред.) Гинекологическая эндокринология. М.: Медицина, 1980. 527 с.

35. Заварзин Г.А. Особенности эволюции прокариот. Эволюция и биоценотические кризисы. М.:Наука, 1987. С.144-156.

36. Зинченко Е. В., Панин А. Н. Иммунобиотики в ветеринарной практике. Пущино.: ОНТИ ПНЦ РАН, 2000. 164 с.

37. Зинкевич Э.П., Васильева B.C. Химическая коммуникация млекопитающих: молекулярные подходы // Зоол. журн. 1998. Т. 77. № 1. с.10-19.

38. Имшенецкий А.А., Солнцева Л.И. Симбиоз целлюлозных и азотфиксирующих бактерий // Микробиология. 1940. Т. IX, вып.9-10. С.699-803.

39. Иноземцев В.П., Балковой И.И., Батракова Е.А. Лечение атоний преджелудков крупного рогатого скота лазерным лучом // Актуал.пробл.вет.хирургии. Воронеж. 1997. С.83.

40. Казаков А.В. Эуфлорины истоки жидких форм БАД микробного происхождения // Пробиотики, пребиотики, синбиотики ифункциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: Сб. мат. междунар. конф. М.:ВВЦ, 2004. С.102-103.

41. Калугин Ю.А. Физиология питания кроликов. М.Колос, 1980. 175 с.

42. Канбеков Р.Г. Влияние цеолитов, биотрина, пробиотика Лактобифид на микробиоценоз, естественную резистентность, минеральный обмен и продуктивные свойства поросят. Автореф. дис.канд. биол. наук. Уфа,2003. 21 с.

43. Карпов A.M., Саруханов А.В. Теплофизические и физико-химические характеристики продуктов микробиологического синтеза. Справочник. М.: Агропромиздат, 1987. 224 с.

44. Каширская Н. Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры // Российский медицинский журнал. 2000. Т.8. №13-14. С.572-575.

45. Киршенблат Я. Д. Практикум по эндокринологии. М.: Высш. шк., 1969. 256 с.

46. Клемпарская Н.Н., Шальнова Г.А. Аутофлора как индикатор радиационного поражения организма. М.: Медицина, 1966. 207 с.

47. Клименко В.В. Применение пробиотиков в ветеринарии // Биотехнология, экология, медицина. Материалы III-IV Международных научных семинаров 2001-2002гг. под редакцией д.т.н. А.Ф.Труфанова. Москва-Киров: ЭКСПРЕСС. 2002. С. 32 -34.

48. Князева Н.Ю., Гаврилова Н.Н., Тараканов Б.В. Технологические приемы получения микробного препарата целлобактерина // Биологические основы высокой продуктивности с.-х. животных. Боровск. 1990. 4.2. С.121-122.

49. Ковальзон В.М., Обал Ф.(мл.), Йохансен Л., Крюгер Дж., Андронова Т.М. Мурамил-пептиды и сон // Физиологический журнал им.И.М.Сеченова. 1994. Т.80. №11. С.44-50.

50. Коломбет Л.В. Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней. Автореф. дис.докт. биол. наук. Москва. 2006. 47 с.

51. Крюгер Дж., Ковальзон В.М. Вещества сна: иллюзии и реальность // Наука и человечество. Международный ежегодник. ЮНЕСКО. 1992-1994. с. 50-57.

52. Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А., Осадчая А.И. и др. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма // Микробиологический журнал. 1996. №2. С.46-55.

53. Кузнецов В.Б. О функции секрета среднебрюшной железы большой песчанки // Песчанки важнейшие грызуны арид.зоны СССР. Матер. 3 Всес.совещ. Ташкент. 19-23 сент. 1989. Ташкент. 1989. С. 12-14.

54. Курилов Н.В., Грызлова О.Н., Лищенко В.Ф. Роль микроорганизмов в питании жвачных: Обзор литературы. М.: Колос, 1968. 132 с.

55. Курилов Н. В., Кроткова А. П., Харитонова Л. В. Физиология сельскохозяйственных животных. Л.:Наука, 1978. С. 6—45.

56. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш.шк., 1980. 293 с.

57. Лактионов К.С. Целлолитическая активность микроорганизмов и особенности переваривания клетчатки у кроликов в зависимости от возраста и условий кормления. Автореф. дисс. канд. биол.наук. Орел.Орловский госуниверситет, 1999. 24 с.

58. Лаптев Г.Ю. Нитрогеназная активность содержимого рубца жвачных животных // 9-й Баховский Коллоквиум по азотфиксации памяти чл.-корр. РАН В.Л.Кретовича. Тез.докл. ОНТИ ПНЦ РАН. Пущино. 1995. С.91.

59. Ли В. Имагро естественная защита здоровья животных // Животноводство России. 2003. №2. С. 36-37.

60. Макарцев Н.Г. Кормление сельскохозяйственных животных. Калуга: ГУП «Облиздат», 1999. 646 с.

61. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М.:МГУ. 1969. 128 с.

62. Малик Н.И. Новые пробиотические препараты ветеринарного назначения. Автореф. дис. .доктора биол. наук. Москва, 2002. 51 с.

63. Малик Н.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты // Ветеринария. 2001. №1. С.46-51.

64. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nifH различных таксономических групп прокариот // Микробиология. 2001. Т.70. С. 86-91.

65. Меркурьева Е.К. Биометрия в селекции и генетике сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1970. 423 с.

66. Методы общей бактериологии. Под ред.Ф.Герхарда и др. М.: Мир, 1983. Т.1. 536 с.

67. Мир микробов. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. (ред.). М. Мир, 1979. Т.1-3. 486 с.

68. Миронов А., Малов С. Использование ферментативного пробиотика целлобактерина // Свиноводство. 2004. №2. С.30.

69. Моргунова B.C., Алтухов Н.М., Моргунов В.И. и др. Профилактика колибактериоза у новорожденных поросят // Ветеринария. 2003. №1. С. 18-21.

70. Мошковский Ш.Д. Аллергия и иммунинет. М.:Медгиз. 1947. 91 с.

71. Мошкутелло И.И., Егорова О.Г., Городецкая А.А. и др. Положительное воздействие препарата Фродо на развитие поросят-сосунов // Вестник РАСХН. 1997. №1. С.74-75.

72. Наумова Е.И. Пути специализации пищеварительной системы потребляющих клетчатку млекопитающих к обеспечению организма пищевым белком // Общая биология. 1976. Т.37. №2. С. 276-285.

73. Наумова Е.И. Функциональная морфология пищеварительной системы грызунов и зайцеобразных. М.:Наука, 1981. 263 с.

74. Наумова Е.И., Ушакова Н.А., Мещерский И.Г., Костина Н.В., Умаров М.М. Азотфиксация новый феномен в питании грызунов // Известия АН серия биологическая. 2000. №3. С. 329-331.

75. Наумова Е.И., Мещерский И.Г., Ушакова Н.А. Потребность в азоте у восточноевропейской полевки Microtus rossiameridionalis // Известия АН серия биологическая. 2001. №5. С.573-578.

76. Нейчев С. Клиническая микробиология. София: Медицина и физкультура, 1977. 317 с.

77. Никитенко В.И. 1990. Взаимоотношения макроорганизма и бактерий в ране и тканях человека и животных // Хирургия. №9. С.94-99.

78. Никитенко В.И. Вместо лекарств бактерии // Наука в СССР. 1991. №4. С.116-121

79. Нобл У.К. Микробиология кожи человека. М.: Медицина, 1986.492 с.

80. Олескин А.В., Кировская Т.А., Ботвинко И.В., Лысак Л.В. Действие серотонина (5-окситриптамина) на рост и дифференциацию микроорганизмов // Микробиология. 1998. Т.67. № 3. С.305-312.

81. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уилльямса. М.:Мир, Т.1-2. 1997. 800 с.

82. Определитель гельминтов грызунов фауны СССР. Отв. ред. Рыжиков К.М. М.: Наука, 1979. 279 с.

83. Остин К., Шорт Р. (ред.). Гормональная регуляция размножения у млекопитающих. М.: Мир,1987. 304 с.

84. Павлов Д.С., Наумова Е.И., Ушакова НА, Нестерова Н.Г., Жарова Г.К., Чернуха Б.А. Способ приготовления корма для животных из растительного сырья. RU 2153813 С1 от 26.11.1999.

85. Панин А.Н., Малик Н.И., Степаненко И.П. Влияние пробиотика стрептобифида форте на клеточный иммунитет//Аграрная наука. 2000. №5. С.20-21

86. Парникова С.И. Изучение биологических свойств бактерий рода Bacillus и разработка пробиотического препарата для профилактики и лечения диареи новорожденных телят. Автореф. дис. . канд. вет. наук: Якут. НИИСХ, 2002. 18 с.

87. Петровская В. Г., Марко О. П. Микрофлора человека в норме и патологии. М.: Медицина, 1976. 328 с.

88. ЮО.Петухова Е.А., Бессарабова Р.Ф., Халенева Л.Д., Антонова О.А. Зоотехнический анализ кормов. М.:Колос, 1981. 256 с.101 .Пивняк И.Г., Тараканов Б.В. Микробиология пищеварения жвачных. М.: Колос, 1982.248 с.

89. Пивняк И.Г. Биологически активные вещества микробного синтеза в рационах сельскохозяйственных животных // Оптимизация кормления с,-х. животных. М. 1991. С. 28-33.

90. ЮЗ.Плохинский Н.А. (ред.) Математические методы в биологии. М.МГУ. 1972. 135 с.

91. Понд У.Дж., Хаупт К.А. Биология свиньи. М.:Колос, 1983. 334 с.

92. Полонская М.С., Поперекова Т.М. Выделение азотобактера из кишечника цыплят и поросят. Сообщение 1 // Бюлл. Научно-технической информации по сельскохозяйственной микробиологии. Ленинград. 1958. №5. С.48-50.

93. Попов Ж.П., Никонорова А.К. Новый пробиотик для животноводства // Зоотехния. 1995. №11. С.21-22.

94. Потребня Г.П., Хуторной С.В., Диденко Г.В. Оценка эффективности противоопухолевых вакцин, полученных при помощи продуктов метаболизма Bacillus subtilis АВ-56 // Экспериментальная онкология. 2002. Т.24. № 3.

95. ЮЭ.Приходько В.И. Поведение и внутрипопуляционная структура кабарги (Moschus moschiferus). Автореф. дис.канд. биол. наук. М.:ИЭМЭЖ. 1984. 28 с.

96. Роуз Э. Химическая микробиология. М.: Мир, 1971. 371с.

97. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: практическое пособие. Ред. Н.С. Егоров. М.: МГУ, 1983. 215 с.

98. ИЗ.Сажин Б.С., Сажин В.Б. Научные основы техники сушки. М.: Наука, 1997. 448 с.

99. Саркисова С.С., Панин А.Н., Гараев И.М. Биологические свойства бактерий рода Бациллюс, выделенных из кишечника поросят // Сб. науч. тр. ВГНКИ. 1994. Т.55. С.76-81.

100. Сафонов Г.А., Калинина Т.А., Романова В.А. Пробиотики как фактор, стабилизирующий здоровье животных//Ветеринария. 1992. №7-8. С.3-4.

101. Сидоров М.А., Субботин В.В., Данилевская Н.В. Нормальная микрофлора животных и ее коррекция пробиотиками // Ветеринария. 2000. №11. С.17-22.

102. Сидорчук И.И., Павлюк И.М., Тищенко Е.И. Микроорганизмы кишечника и естественная резистентность поросят // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных: Мат. междунар. конф. Боровск. 1990. С. 118-125.

103. Сизова А.В. Значение микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных и использование бактерий-симбионтов в животноводстве // М. Вестник сельскохозяйственной науки. 1974. №1. С.39-74.

104. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазое В.М. Биоконверсия лигно-целлюлозных материалов. М.: МГУ, 1995. С.146-148.

105. Смирнов В.В. Антибиотики и/или пробиотики: размышления и факты // «ГНкування та fliaгностика». 1998. №2. С.8-13.

106. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Слорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. Киев.: Наукова думка, 1982. 280 с.

107. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.В. Высокоэффективный биологический препарат Биоспорин // Врачебное дело. 1994. №5-6. С.133-137.

108. Смирнова И.Э., Саубенова М.Г. Целлюлозолитические азотфиксирующие бактерии для обогащения белком грубых кормов // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. №1. С. 86-89.

109. Современная микробиология. Прокариоты. Под ред. Й.Ленгелера, Г.Древса и Г.Шлегеля. М.:Мир, 2005. Т.1. 654 с. и Т.2. 493 с.

110. Соколов В.Е. Кожный покров млекопитающих. М.: Наука, 1973. 486 с.

111. Соколов В.Е. Избранные труды. Отв.ред. Д.С.Павлов. М.:Наука, 2002. Т.1.295 с.

112. Соколов В.Е., Зинкевич Э.П. Основные принципы химической коммуникации млекопитающих // Первый Междунар. конгресс по млекопитающим. М. 6-12 июня 1974. М. 1974.1.2. С. 209.

113. Соколов В.Е., Зинкевич Э.П. Химическая коммуникация млекопитающих // Биология. (Новое в жизни, науке, технике. Сер.№8.). М.: Знание, 1978. 136 с.

114. Соколов В.Е., Зинкевич Э.П. Химическая коммуникация млекопитающих // Наука и человечество. М. 1979. С. 129-137.

115. Соколов В.Е., Исаев С.И. Роль химических сигналов в системе коммуникации большой песчанки (Rhombomys opimus Licht.) // Феромоны и поведение. М.:Наука, 1982. С.127-144.

116. Соколов В.Е., Скурат Л.Н. Специфическая среднебрюшная железа песчанок//Зоол.журн. 1966. Т.45. вып.11. С. 1739-1741.

117. Соколов В.Е., Скурат Л.Н. Рост и развитие большой песчанки (Rhombomys opimus) // Зоол.журн. 1969. Т.48. вып.12. С.1860-1869.

118. Соколов В.Е., Степанова Л.В. Лимфоидная ткань, ассоциированная с межпальцевыми железами копытных//Докл. АН СССР. 1987. Т.294. №3. С.691-695.

119. Соколов В.Е., Ушакова Н.А. Микрофлора и химическая коммуникация животных: некоторые экологические аспекты // Химическая коммуникация животных. Теория и практика. М.: Наука, 1986. С. 262-270.

120. Соколов В.Е., Хорлина И.М., Феромоны млекопитающих: Исследование состава летучих кислот вагинальных выделений норок Mustela vison Briss // ДАН СССР. 1976 Т.228. №1. С.225-227.

121. Соколов В.Е., Чернова О.Ф. Эволюционно-экологические исследования кожных желез млекопитающих // Современные проблемы эволюционной морфологии: Тез. докл. Междунар.симпоз. М. Наука. 1981. С.96-98.

122. Соколов В.Е., Чернова О.Ф. Кожные железы млекопитающих. Отв.ред.В.Н.Большаков. М.:ГЕОС, 2001. 648 с.

123. Соколов В.Е., Исаев С.И., Ратникова О.А. Размножение и маркировочное поведение больших песчанок (Rhombomys opimus Licht) при содержании в неволе // Зоол. журн. 1981. Т. 10. Вып.З. С.432-437.

124. Соколов В.Е., Ушакова Н.А., Исаев С.И. Симбионтные бактерии в секрете среднебрюшной железы самцов большой песчанки // II Всесоюзное совещание по химической коммуникации животных. Тез. докл. М. 1983. С. 11-13.

125. Соколов В.Е., Ушакова Н.А., Шубкина А.В. Реакция микробных ассоциаций на поверхности кожи млекопитающих на изменения физиологического состояния животных. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1990. № 5. С. 694-700.

126. Соколов В.Е., Феоктистова Н.Ю., Васильева Н.Ю. Онтогенез дополнительных мешочков в устье защечных мешков хомячка

127. Кэмпбелла (Phodopus campbelli Thomas, 1905) и джунгарского хомячка (Phodopus sungorus Pallas, 1773): морфометрический анализ // Изв. АН СССР. Сер.биол. 1993. № 6. С. 852-887.

128. Соколов В.Е., Феоктистова Н.Ю., Мещерский И. Г. Влияние специфических образований в углах рта на физиолого-морфомектрические параметры взрослого организма хомячка Кэмпбелла (Phodopus campbelli Thomas, 1905) // Докл. РАН. 1993.Т.330. № 5, С. 667-669.

129. Соколов В.Е., Васильева Н.Ю., Демина Н.И., Феоктистова Н.Ю. Дополнительные мешочки в устье защечных мешков хомячка Кэмпбелла (Phodopus campbelli Thomas, 1905)// Доклады РАН. 1991. Т.316. №2. С.479-483.

130. Соколов В. Е., Суров А. В.Васильева Я. Ю., Зинкевич Э.П. Стимулирование полового поведения у самцов сирийского хомяка (Mesocricetus auratus) искусственными обонятельными стимулами // Докл. АН СССР. 1985. Т. 282. № 3. С. 765.

131. Соколов В. Е., Ушакова Н. А., Суров А. В., Телицына А. Ю. Динамика бактериальных ассоциаций в вагинальной слизи самок сирийского хомяка в течение полового цикла // Изв. АН СССР. Сер.биол. 1991. № 5. С. 675-682.

132. Соколов В.Е., Ушакова Н.А., Суров А.В., Телицина А.Ю. Участие вагинальных бактерий хомячка Кэмпбелла в химической коммуникации между самкой и самцом. // Изв. РАН. Сер. биол. 1994. № 5, С.810-817.

133. Соколов В.Е., Ушакова Н.А., Феоктистова Н.Ю., Васильева Н.Ю. Бактерии в секрете дополнительных мешочков в устье защечных мешков у хомячка Phodopus campbelli // Микробиология. 1995. Т.64. №2. с.216-221.

134. Соколов В.Е., Ушакова Н.А., Шубкина А.В., Неклюдова Т.И. Стресс как фактор, нарушающий стабильность кожных микробных ассоциаций // Докл. АН СССР. 1991. Т. 317. № 3. С. 764-768.

135. Соколов В.Е.(отв. ред.), Скурат Л.Н., Степанова Л.В., Сумина Е.Б., Шабадаш С. А. Руководство по изучению кожного покрова млекопитающих. М.: Наука, 1988. 279 с.

136. Соколов В.Е., Ушакова Н.А., Приходько В.И., Неклюдова Т.И., Громов B.C., Белоусова И.П. Особенности микробных ассоциаций в секретах некоторых кожных желёз млекопитающих // Микробиология. 1990. Т. 59. № 3. С. 472-481.

137. Смирнова И.Э., Саубенова М.Г. Целлюлолитические азотфиксирующие бактерии для протеинизации грубых кормов // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. №1. С.19-23.

138. Субботин В.В., Данилевская Н.В. Микрофлора кишечника собак: физиологическое значение, возрастная динамика, дисбактериозы, коррекция. Часть 1. Нормальная микрофлора кишечника собак // Ветеринар. 2002. №1.

139. Субботин В.В., Сидоров М.А. Биотехнология пробиотиков ветеринарного назначения//Аграрная наука. 1998 а. №3. С.20-21.

140. Суров А. В. Влияние обонятельных сигналов на поведение сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterhouse, 1839). Автореф. . канд. биол. наук. ИЭМЭЖ им.А.Н.Северцова РАН, 1986. 24 с.

141. Тараканов Б.В. Использование пробиотиков в животноводстве / ВНИИ ФБ и П с/х животных, г.Калуга, 1998. С.5-6.

142. Тараканов Б.В. Биологические эффекты пробиотиков // Современные проблемы биотехнологии и биологии продуктивных животных. Сб. науч. тр. Боровск. 1999 а. Т. XXXVIII. С.78-86.

143. Тараканов Б.В. Микрофлора пищеварительного тракта, неспецифическая резистентность и продуктивность поросят при применении лактоамиловирина // Ветеринария. 1999 б. №8. С.51-54.

144. Тараканов Б.В. Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животного // Ветеринария. 2000. С.47-54.

145. Тараканов Б.В., Николичева Т.Д., Алешин В.В. и др. Пробиотики. Достижения и перспективы использования в животноводстве // Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки: Тр. ВИЖа. Вып. 62. Т.З. 2004. С. 69-73.

146. Тимошко М.А. Микрофлора пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных. Кишинев: Штиинца, 1990. 190 с.

147. Тимошенко Т.А., Щенников Г.Н. Микрофлора анальных и ее связь с химической коммуникацией у европейского бобра Castor fiber L. // Проблемы химической коммуникации животных. М.: Наука, 1991. С. 330334.

148. Томмэ М.Ф. Методика определения переваримости кормов и рационов. М.: Колос, 1955. 23 с.

149. Томмэ М.Ф. Корма СССР состав и питательность. М.: Колос, 1964. 448с.

150. Топчий М.П. Применение препаратов из живых культур сенной палочки при дисбактериозе у телят. Автореф. дис. .канд. биол. наук. Минск, 1979.21 с.

151. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: МГУ, 1986. 135 с.

152. Ушакова Н.А. Роль симбионтной микрофлоры в химической коммуникации млекопитающих // Сигнализация и экология млекопитающих и птиц. М.: Наука, 1984. С. 44-64.

153. Ушакова Н.А. Большая песчанка переносчик и естественный резервуар сапрофитной микрофлоры, воздействующей на растения и их вредителей II 4 Всесоюзный съезд по териологии. Тез. докл. 1986. Т.1. С. 383.

154. Ушакова Н.А. Особенности микробных ассоциаций на коже и ее производных в связи с жизнедеятельностью млекопитающих // Актуальные проблемы морфологии и экологии высших позвоночных. М.: ВАСХНИЛ, 1988. Т. 2. С. 598-630.

155. Ушакова Н.А. Микробиологическое обследование кожи и слизистых амазонских речных дельфинов иний в связи с оценкой физиологического состояния животных// Изв. АН СССР. Сер. биол. 1991. № 6. С. 943-949.

156. Ушакова Н.А. Эстральный цикл самки амазонского дельфина при содержании в неволе // Амазонский дельфин. М.: Наука, 1996. С.266-270.

157. Ушакова Н.А. Микробиологические показатели состояния здоровья у северного морского котика // Северный морской котик. Систематика. Морфология. Экология. Поведение. М.: ЮНЕСКО, 1998. Часть 2. С.893-900.

158. Ушакова Н.А. Особенности усвоения клетчатки растительноядными млекопитающими // Проблемы эволюционной и экологической морфологии. Школа-семинар Москва, 15-16 мая 2001 г. М. Биоинформсервис. 2001. С.135-139.

159. Ушакова Н.А. Дикие животные и населяющие их микроорганизмы: теоретические предпосылки разработки биологически активных препаратов // Сборник научных статей Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами. М.: КМК, 2005. С.473-479.

160. Ушакова Н.А., Абрамова О.Ю. Количество и состав бактерий на коже морских млекопитающих индикатор физиологического состояния животных// Микробиология. 1989. Т. 58. № 5. С. 864-870.

161. Ушакова Н.А., Андреев Л.В. Способность большой песчанки распространять в почве спорообразующие бактерии и другиемикроорганизмы // IX Международный коллоквиум по почвенной зоологии. Москва. СССР, Тез. докл. Вильнюс. 1985. С. 297.

162. Ушакова НА, Андреев Л.В. Аэробная микрофлора секрета среднебрюшной железы самцов большой песчанки // Докл. АН СССР. 1986а. Т. 286. №4. С. 988-992.

163. Ушакова Н.А., Андреев Л.В. Спорообразующие бактерии и другие микроорганизмы в секрете среднебрюшной железы самцов большой песчанки // Химическая коммуникация животных. Теория и практика. М.: Наука, 19866. С. 271-286.

164. Ушакова Н.А., Степанова Л.В., Абрамова О.Ю. Изменения в составе автофлоры поверхности кожи черноморской афалины и в структуре кожи при развитии дерматоза // 4 Всесоюзное совещание по проблемам морских гидробионтов. М. 1986. С. 77.

165. Ушакова Н.А., Наумова Е.И., Павлов Д.С., Чернуха Б.А. Пробиоцел -перспективная добавка к кормам животных // Сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках Всероссийская конференция. 14-19 июня 2001 г. Тезисы докладов. С. 110.

166. Ушакова Н.А., Белов Л.П., Варшавский А.А., Козлова А.А., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П. Расщепление целлюлозы при дефиците азота бактериями, выделенными из кишечника растительноядных позвоночных //Микробиология. 2003. Т.72. №3. с.1-7.

167. Ушакова Н.А., Наумова Е.И., Павлов Д.С., Чернуха Б.А. Способ получения биологически активной кормовой добавки из растительного сырья. RU 2202224, С1 от 20.04.2003.

168. Ушакова Н.А., Н.Ю.Феоктистова, Т.В.Колганова, Т.П.Турова Microbacterium oxydans симбионт хомячка Кэмпбелла, обладающий пробиотическими свойствами // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 50. №6. С. 639-644.

169. Ушакова Н.А., Котенкова Е.В., Козлова А.А., Нифатов А.В. Изучение механизмов пробиотической активности штамма Bacillus subtilis 8130 // Прикладная биохимия и микробиология, 2006, Т. 52. №3. С.285-291.

170. Феоктистова Н.Ю. Строение и функции специфических комплексов в углах рта у двух видов хомячков рода Phodopus. Автореф. дисс. . карнд.биол.наук. М. Институт проблем экологии и эволюции им.А.Н.Северцова РАН, 1994. 24 с.

171. Хахина Л.Н. Проблема симбиогенеза: историко-критический очерк исследования отечественных ботаников. Л.:Наука. 1979. 153 с.

172. Хэм А., Кормак Д. Гистология. М.: Мир, 1983. Т. 5. С. 169.

173. Чичерин И.Ю., Кулемин Л.М. «Рекицен-РД» гастроэнтерологический препарат нового поколения // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: Сб. мат. междунар. конф. М. 2004. С.125-126.

174. Шайдуллина Т.В. Влияние токоферолсинтезирующего пробиотика на микрофлору желудочно-кишечного тракта и организм телят: Дис. .канд. биол. наук. Дубровицы, 2004. 108 с.

175. Шахназаров В.Ю. Пробиотики препараты молочнокислых бактерий // Кролиководство и звероводство. 1990. №6. С.10-11.

176. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора кишечника и некоторые вопросы микроэкологической экологии // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. №3. С.164-170.

177. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.1. Микрофлора человека и животных и ее функции. М.:Трантъ", 1998. 358 с.

178. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. Сб. мат. междунар. конф. М.:ВВЦ, 2004. С.12-14.

179. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. 515 с.

180. Шубкина А.В., Ушакова Н.А. К вопросу о возможных механизмах выбора жертвы // Проблемы химической коммуникации животных. М.: Наука, 1991. С. 393-404.

181. Щепеткина С.В. Влияние пробиотика мультибактерин ветеринарный ОМЕГА-Ю на продуктивность и естественную резистентность поросят при инфекционных желудочно-кишечных болезнях: Автореф. дис.канд. вет. наук. СПб., 2002. 25 с.

182. Щербакова Э.Г. К механизмам действия пробиотиков, пребиотиков и их сочетаний // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. Сб. мат. междунар. конф. М.:ВВЦ, 2004. С.14-15.

183. Эрнст Л.К., Кирилов М.П., Крохина В.А., Михайлов П.А., Лаптев Ю.Г., Солдатова В.В. Использование лизинсинтезирующего препарата в комбикормах для поросят-отъемы шей // Докл. Российской академии сельскохозяйственных наук. 2002. №5. С. 40-41.

184. Янковский Д.С. Состав и функции микробиоценозов различных биотопов человека // Здоровье женщины. 2003. Т.4. №16. С.146.

185. Янковский Д.С., Бережной В.В., Шунько Е.Е., Крамарев С.А., Дымент Г.С. Настоящее и будущее пробиотиков как биокорректоров микроэкологических нарушений // Современная педиатрия. 2004. Т.1. №2. С.111-118.

186. Achouak W., Normand P., Heulin Т. Comparative phylogeny of rrs and nifH genes in the Bacillaceae // Int. J. Sist. Bacteriol. 1999. V.49. P. 961-967.

187. Adams M.G. Odour-producting organs of mammals // Symp.Zool.Soc. London. 1980. V.45. P.57-86.

188. Albone E.S. Mammalian Semiochemistry. John Wiley & Sons, Limited, Chichester. 1984. P.226-234.

189. Albone E.S., Eglinton G. The anal sac secretion of the red fox (Vulpes vulpes): Its chemistry and microbiology. A comparison with the anal sac secretion of the lion (Pantera leo) // Life Sci. 1974. V.14. P.387-400.

190. Albone E.S., Robins S.P., Patel D. 5-aminovaleric acid, a major free aminoacid component of the anal sac secretion of the red fox, Vulpes vulpes// Comp.Biochem. and Physiol. 1976. V.55. P.483-486.

191. Albone E.S., Gosden P.E., Ware G.C. Bacteria as a source of chemical signals in mammals// in Muller-Schwarze and Mozel (eds.). Chemical Signals in Vertebrates. Plenum Press, New York. 1977. P.35-43.

192. Albone E.S., Gosden P.E., Ware G.C. et al. Bacterial action and chemical signaling in the red fox (Vulpes vulpes) and other mammals // Flavor Chem.Anim.Foods. ACS Symp. Ser. 1978. V.67. P.78-91.

193. Albone E.S., Gronneberg Т.О. Lipids of the anal sac secretions of the red fox, Vulpes vulpes and of the lion, Pantera leo// J. Lipid Res. 1977. V.18. P.474-479.

194. Albone E.S., Perry G.C. Anal sac secretion of the red fox, Vulpes vulpes, volative fatty acids and diamines: Implications for a fermentation hypothesis of chemical recognition// J.Chem.Ecol. 1975. V.2. N1. P.101-111.

195. Barnett S.A., Standford M.H.R. Decrements in "social stress" among wild Ruttus rattus treated with antibiotic // Physiol. Behav. 1982. V.28. p.483-487.

196. Bennet J.W., Bentley R. What is the name? Microbial secondary metabolism //Adv.Appl.Microbiol. 1989. V.34. P.1-28.

197. Bergersen FJ, Hipsley E.H. The presence of N2-fixing bacteria in the intestines of man and animals//J Gen Microbiol. 1970. V.60. N1. P.61-65.

198. Bergey's manual of determinative bacteriology / Eds. Buchanan R. E., Gibbons N. E. 8th ed. Baltimore:Williams and Wilkins Co. 1984, 1986. V.1,2. 1152 p.

199. Bibel D.T., Lovell D.J., Smiljanic R.T. Survival of Bacillus licheniformis on Human Skin //Appl. Environ.Microb. 1978. V.35. N.6. P.1128-1135.

200. Bonn D. Probiotics reduce risk of gut infections // The Lancet Infectious Diseases. 2002. N 2. P 716.

201. Booth W. Endocrine and exocrine factors in the reproductive behaviour of the pig // Symp. Zool. Soc.London.1980. V.45. P.289-311.

202. Botta G. A., Pedulla D., Madoff S. Adherence of urogenital tract pathogens to estrogen and progesterone-stimulated epithelial cells as detected by Papanicolaou staining // FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 16. P. 353.

203. Brown R.E. Mammalian social odors//Adv. Study Behav.1979. V.10. P.103

204. Brown R.E., Schellinck H.M. Interactions among the MHC, diet and bacteria in the production of the social odors in Rodents // In: Chemical Signals in Vertebrates VI. Ed. by R.L.Doty and D.Muller-Schwarze. Plenum Press, New York. 1992. P.175-181.

205. Celesk R.A., Asano Т., Wagner M. The size, pH and redox potential of the cecum in mice associated with various microbial floras (39187) // Pros.Soc.Exp.Biol. and Med. 1976. V.151. P.260-263.

206. Cen P.L., Xia L.M. Production of Cellulase by Solid-state Fermentation// Adv.Biochem.Eng.Biotechnol. 1999. V.65. P.68-92.

207. Collins M.D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut // Am. J. Clin. Nutr. 1999. V.69. (Suppi): 1052S-7S.

208. Comfort A. Likelihood of human pheromones // Nature. 1971. V.230. P.432-433.

209. Curtis R. F., Ballanthina J. A., Keverne E. В., Bonsall R., Michael R. P. Identification of primate sexual pheromones and the properties of synthetic attractants // Nature. 1971. V. 232. P. 396.

210. Curtis R. F., Ballantnine J. A., Keverne E. В., Bonsall R. W., Michael R. P. Identification of primate sexual pheromones and the properties of synthetic attractants // Nature. 1971. V. 6. P. 396.

211. Edwards U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M. D., Boeettge E. C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA. // Nucl. Acids Res 1989. V. 17. P. 78437853.

212. Estrada A., Drew M.D. Van Kissel. A. Effect of the dietary supplementation of fructooligosaccharides and Bifidobacterium longum to early weaned pigs on performance and fecal bacterial populations// Canad. J. Anim. Sc. 2001. Vol.81. №1. P.141-148.

213. Fox G. J. Potentials for pheromones in chimpazee uaginal fatty acids // Folia Primatol. 1982. V. 37. P. 255.

214. Fox S.M. Probiotics: Intestinal inoculants for production animals// Veter. Med. 1988. T.83. №8. P.806-810.

215. Fuller R. Probiotics in man and animals// J. Appl. Bacteriol. 1989. V. 66. P. 365-378.

216. Fuller Ray (Ed.) Probiotics. The scientific basis. Chapman & Hall. London. N.Y. Tokyo. 1992. 397 p.

217. Fuller R., Gibson G.R. Probiotics and prebiotics: microtlora management for improved gut health // Clin. Microbiol. Infect. 1998. V.4 P. 477-480.

218. Gibson G.R., Fuller R. Aspects of in vitro and In vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use // J. Nutr. 2000. V.130. N 2. Suppi: 391S-395S.

219. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic micro-biota: introducing the concept of prebiotics // J. Nutr. 1995. V.125, P. 14011412.

220. Gorbach SL, Plaut AG, Nahas L, et al. Studies of intestinal microflora. II. Microorganisms of the small intestine and their relations to oral and fecal flora // Gastroenterology. 1967. V.3 P.856-867.

221. Goldin BR, Lichtenstein Ah, Gorbach S.L. The role of the intestinal Flora. In: Shils Me, Young VR ( Eds): Modern Nutrition in Health and Disease. Lea & Febriger, Philadelphia, 1994. 500 P.

222. Goodrich B.S. Studies of the chemical composition of secretions from skin glands of the rabbit Oryctolagus cuniculus // in: Chemical signals in vertebrates. Ed. Muller-Scwarze & Silverstein. Plenum Press. N.-Y.,L. 1983. V.3. P.275-290.

223. Gordon R.E. //In: CRC Handbook of Microbiology. Bacteria. Eds.by A.I.Laskin, H.A.Lechevalier. CRC Press. 1977. V.1. P.319.

224. Gorman M.L. A mechanism for individual recognition by odour in Herpestes auropunctatus (Carnivora: Viveridae) // Animal Behav. 1976. V.24. P. 141145.

225. Gorman M.L., Nedwell D.B., Smith R.M. An analysis of the contents of the anal scent pocket of Herpestes auropunctatus (Carnivora: Viveridae) // J.Zool. 1974. V.172. P. 389-399.

226. Gosden P.E., Ware G.C. The aerobic bacterial flora in the anal sac of the red fox//J.Appl.Bacteriol. 1976. V.41. P. 271-275.

227. Gosden P.E., Ware G.C. A method for the production of pre-reduced anaerobically sterilized culture media // J.Appl.Bacteriol. 1977. V.42. p.77-79.

228. Gonzalez S., De Ambrosini V.M., De Nadra M.M., De Holgado A.P., Oliver G. Acetaldehyde production by strains used as probiotics in fermented milk // J.Food Prot. 1994. V.57. P.436-440.

229. Goodrich B.S. Studies of the chemical composition of secretions from skin glands of the rabbit Oryctolagus cuniculus// Chemical signals in Vertebrates. Ed. D.Muller-Schwarze a. R.M. Silverstein. New York; London. Plenum Press. 1983. V.3. P.275-290.

230. Hungate R.E. Anaerobic biotransformations of organic matter// in: Leadbetter E.R., Pointedexter J.S. (eds).New York. Plenum Press. Bacteria in nature. 1985. V.1. P.39-95.

231. Hurley H.S., Shelley W.B. The human apocrine sweat gland in the health and disease/ Ed.Ch.C.Thomas. Springfield (III). 1960. 281 p.259.lben B. Ferkel fruh an festes Futter gewohnen // DIL Agrarmag. Agro Bonus. 1999. Jg.50. №3. S.148-152.

232. Izard M. K, Weisenseel K. A., Ange R. L. Reproduction in slow loris (Nycticebus coucar>g)/IAmerJ.Primatol. 1988. V. 16. P. 331-343.

233. Jadamus A., Vahjen W., Simon 0. Influence of the probiotic. bacterial strain, Bacillus cereus var. Toyoi on the development of selected microbial groups adhering to instestinal mucosal fissues of piglets// J.Anim.Feed. Sc. 2000. V.9. №2. P.347-362.

234. Johnston R. E. Sexual attraction function of golden hamster vaginal secretion // Behav. Biol. 1974. V. 12. P. 111.

235. Johnston R. E. Responses of male hamsters to odours of female in different reproductive states // J. Compar. Physiol. Psychol. 1980. V. 93. P. 894.

236. Kailaspathy K.A., Chin J. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. // Immunol. Cell Biol. 2000. V.78. P. 80-88.

237. Kilpatrick S.J., Bolt M., Moltz H. Induction of the maternal pheromone by cholicacid in the virgin rat//Physiol, and Behav. 1980. V.25. N1. P.31-34.

238. Kloos W.E., Musselwhite M.S. //Appl.Microb. 1975. V.30. N3. P. 381-395.

239. Krischke N. // Saugetierkundliche'Mittelungen. 1986. T.33. N 2+3. S. 195.

240. Lancaster I., Lee R. The annual reproductive cycle in monkey and apes // Primate Behaviour (Ed. de Vore l).N. Y. 1965. P. 486.

241. Lee A. II Adv. Microbiol. Ecol. 1985. V. 8. N 3. P.115—162.

242. Lee T.M., Molts H. How Ret Young Govern the Release of Maternal Pheromone // Physiology and Behavior. 1980. V.24. P.983-989

243. Leon M. Maternal Pheromone // Physiology and behavior. 1974. V.13. P.441-453.

244. Lilly D.M., Stilwell R.H. Probiotics growth promoting factors produced by microorganisms//Science. 1965. P.747-748.

245. Lisk R. D., Ciaccio L., Catanzaro C. Mating behaviour of the golden hamster under seminatural conditions // Anim. Behav. 1983. V. 31. P. 659.

246. Marples R.R., Kligman A.M., Lantis L.R., D.T.Downing The role of the aerobic microflora in the genesis of fatty acids in human surface lipids // J.lnvest.Dermatol. 1970. V.55. N3. P.173-178.

247. Micak P. Moznosti vynsiti probiotik ve vyzive nospodars kuckrvirat. Brno.1990. S.19.

248. Michael R. P. Determinants of primate reproductive behaviour // Acta Endocrinol. 1972. V. 71. P. 322.

249. Michael R. P., Bonsall R. W., Zumpe D. Evidence for chemical communication in primates //Vitamins and Hormones. 1976. V. 34. P. 137.

250. Minami M., Oowada Т., Ozaki A., Jamamoto Т., Saito K., Adachi ., Fujisawa Т., Mit-zuoka T. Estrous cycle and vaginal flora in conventionalized and gnotobiotic BALB/c mice / /Bifidus flores et fructus. 1987. V. 1. P. 25-37.

251. Mitchell D.A., Krieger N., Stuart D.M., et all. New developments in solid state fermentation II. Rational approaches to the design, operation and scale-up of bioreactors // Process Biochem. 2000. V.35. P.1211-1225.

252. Moats W.A. Classification of bacteria from commercial egg washers and washed and unwashed eggs // Appl.Environ.Microb. 1980. V.40. P.710-714.

253. Moltz H., Kilpatrick S.J. Response to the maternal pheromone in the rat as protection against necrotizing enterocolits // Neurosci. Biobehav. Rev. 1978. V.2. N4. P.277-280.

254. Mykytowycz R. The role of skin glands in mammalian communication // Adv. Chemorecept. 1970. V. 1. P. 327-360.

255. Mykytowycz R. The behavioral role of the mammalian skin glands // Naturwissenschaften. 1972. Bd. 59. S. 133-139.

256. Mykytowycz R, Goodrich B.S. Skin glands as organs of communication in mammals//J.lnvest.Dermatol. 1974. V.62. P.124-131.

257. Parker R. B. 1974. Probiotics, the other half of the antibiotics story // Anim. Nutrition and health, v. 29, №12, p. 4-8

258. Patterson R.L.S. Identification of 3-a-hydroxy-5 a-androst-16-ene as the musk odour component of boar submaxillary salivary gland and its relationship to the sex odour taint in pork meat // J.Sci.Food and Agr. 1968. V.19. N8. P.434-438.

259. Porter R.H., Doane H.M. Maternal pheromone in the spine mouse (Acomys cahirinus) // Physiol. And Behav. 1976. V.16. P.75-78.

260. Potrikus C. J., Breznak, J. A. Nitrogen-fixing Enterobacter agglomerans isolated from guts of wood-eating termites //Appl. Environ. Microbiol. 1977. V. 33 N 2. P. 392-399.

261. Preti G., Muetterties E.L., Furman J.M., et all. Volatile constituents of dog (Canis familiaris) and coyote (Canis latrans), and sacs // J.Chem.Ecol. 1976. V.2. P.177-186.

262. Puhvel S.M., Ph.D. Reisner R.M., Sakamoto M.A. Analysis of lipid composition of isolated human sebaceous gland homogenates after incubation with cutaneous bacteria. Thin layer chromatography // J.lnvest.Dermatol. 1975. V.64. P.406-411.

263. Ralls K. Mammalian scent marking//Science. 1971. V.171. P.443-449.

264. Reid G. The Scientific Basis for Probiotic Strains of Lactobacillus 11 Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65. No. 9. P. 3763-3766.

265. Roberfroid M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? //Am. J. Clin Nutr. 2000. V.71. N6. Suppi. P. 1682-1687.

266. Robinson Т., Singh D., Nigam P. Solid-state fermentation: a promising microbial technology for secondary metabolite production // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.55. P.284-289.

267. Rocchietta J. The use of Вас. subtilis in the treatment of the diseases // Minerva Med. 1969.V60. N3/4. P.117-123.

268. Rowland I.R., Tanaka R. The effects of transgalactosylated oligosaccharides on gut flora metabolism in rats associated with a human faecal microflora // J. Appl. Bacteriol. 1993. V.74. P. 667-674.

269. Savage D.C. 1986. Mechanisms by which indigenous microorganisms colonize gastrointestinal epithelial surfaces // Prog. Fd. Nutr. Sc. v. 7, p. 6574.

270. Scharmann W., Nagel P., Helier D. Oestrus phases of the Syrian hamster // Z. Versuch-stierkd. 1988. V. 31. P. 276-283.

271. Scott T. G., Curran В., Smyth С J. Electron microscopy of adhesive interactions between Gardnerella vaginalis and vaginal epithelian cells, McCoy cells and human red blood cells //J. Gen. Microbiol. 1989. V. 135. P. 475-479.

272. Selwyn S. Natural antibiosis among skin bacteria as a primary defense against infection // Br.J.Darmatol.1975. V.93. P.487-493.

273. Sharpe M. E., Law B. A, Phillips B. A., Pitcher D. G. Methanethiol production by coryneform bacteria: strains from dairy and human skin sources and Brevibacterium lines//}. Gen. Microbiol. 1977. V.101. P. 345.

274. Singer A. G., Agosta W. C, O'Connell R. J., Pfaffmann C., Bowen D.V., Field F.N. Dimethyl disulfide: an attractant pheromone in hamster vaginal secretion // Science. 1976. V. 191. P. 948-950.

275. Schumann P., Rainey F.A., Burghardt J., Stackebrandt E., Weiss N. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P.175-177.

276. Skinner J. P. The effect of season on spermatogenesis in some ungulates // Reprod. Fertil. 1971. Suppl.13. P. 29.

277. Smits J.P., Rinzema A., Tramper J. et all. The influence of temperature on kinetics in solid-state fermentation // Enzyme & Microb.Technol. 1998. V.22. P.50-57.

278. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present speciesdefinition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. N 4. P.846-849.

279. I.Stevens C.E., Hume I.D. Contributions of microbes in vertebrate gastrointestinal tract to production and conservation of nutrients // Phisiol.Rev. 1998. V.78. N2. 393-427 p.

280. Sumawong U., Gregoire A.T., Johnson W.D., Rakoff A.B. Identification of carbohydrates in the vaginal fluid of normal females // Fertil. Steril. 1962. V.13. P.270-273.

281. Tannock G.W. The normal microflora: new concepts in health promotion // Microbiol. Sc. V. 5. №1. 1988. P. 4-8.

282. Tannock G.W. Normal microflora: an introduction to microbes inhabitating the human body И London. Chapman and Hall. 1995. 278 p.

283. Tornut J. Applications of probiotics to animal husbandryn // Rev.Sci.Tech. Off. Inf. Epiz. 1987. V.4. P.263-266.

284. Tsygankova S.V., Ignatov A.N., Boulygina E.S., Kuznetsov B.B., Korotkov E.V. Genetic Relationships among strains of Xanthomonas campestris pv. Campestris revealed by Novel rep-PCR Primers // Eur. J. Plant Pathology. 2004. V.110. N8. P.845-853.

285. Ushakova N.A. Two- Stage Process of Cultivation of Probiotic Bacillus Subtilis 8130 for Reception Biologically Active Feed Additives for Animals // in: Biotechnology and Industry. Ed. G.E.Zaikov. Nova Science Publishers, Inc. New York. 2004. P.75-79.

286. Ushakova N.A., Kozlova A.A., Nifatov A.V. Strain Bacillus subtilis 8130 the natural stimulator of digestion // in: Biotechnology, Agriculture and the Food Industry. Ed. G.E.Zaikov. Nova Science Publishers, Inc. New York. 2006. P. 111-118.

287. Van de Peer, Y. & De Wachter, R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

288. Van Soest P.J. Nutritional Ecology of the Ruminant. (2nd end). Ithaca, NY:Cornell Univ. Press, 1994. 367 p.

289. Wachtel E. G., M. D. Exfoliative cytology in ginaecological practice. L.: Butterworths, 1969. 245 p.

290. Walro J.M., Svendsen G.E. //J.Chem.Ecol. 1982. V.8. P.809.

291. Weber A., Knapp W. Uber die jahreszeitliche abhangigkeit des Nachweises von Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis in tonsillen genus der Schlachtschweine // Zentr. Bl. Bakteriol. Abt. IA. 1981. Bd. 250. N 1-2.

292. Weidong M.A., Clement B.A., Klemm W.R. Cyclic changes in volatile constituents of bovine vaginal secretions // J.Chem.Ecol. 1995. V.21. N.12. P. 1895-1906.

293. Wellington J.L., Byrne K.J., Preti G. et all. Perineal scent gland of wild and domestic guinea-pigs: A comparative chemical and behavioral study // J. Chem. Ecol. 1979. V.1. P.737-751.

294. Zechmann J.M., Martin I.G., Wellington J.I. et all. // Physiol. Behav. 1984. V.32. P.269

295. Zimmermann В., Bauer E., Mozenthin R. Pro- and prebiotics in pig nutrition potential modulators of gut health// J. Anim. Feed. Sc. 2001. V. 10. №1. P.47-56.

296. Zlamala C., Schumann P., Kampfer P., Valens M., Rossello-More R., Eubitz W., Busse H.-J. // Int.Syst.Evol.Microbiol. 2002. V.52. P. 1229-1234.