Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение молекулярно-механических свойств микротрубочек и развиваемых ими сил

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярно-механических свойств микротрубочек и развиваемых ими сил"

На правах рукописи

□03054305

МОЛОДЦОВ Максим Игоревич

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРОТРУБОЧЕК И РАЗВИВАЕМЫХ ИМИ СИЛ

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003054305

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор И.А. Воробьев

доктор физико-математических наук, профессор В.В. Смолянинов

Ведущее учреждение - институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского.

Защита состоится _Ц._ 2007 г. в / ^ часов

на заседании диссертационного совета в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии медицинских наук (Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН. Автореферат разослан «I® у>_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микротрубочки являются важнейшими компонентами цитоскелета эукариотических клеток. Они участвуют в поддержании клеточной формы, движении, а также перемещении органелл, включая митотические хромосомы. Микротрубочки не только взаимодействуют с моторными белками, выполняющими работу по перемещению, но и сами способны совершать работу.

Хромосомы расходятся по дочерним клеткам во время митоза, взаимодействуя с микротрубочками митотического веретена. Плюс концы микротрубочек связывают кинетохоры - специальные образования на хромосомах, соответствующие центромерному участку. Во время прометафазы хромосомы, связанные с микротрубочками, перемещаются в сторону к полюсу, или от него, а затем, во время метафазы, выстраиваются в метафазную пластинку. Сестринские хроматиды расщепляются во время анафазы и хромосомы движутся к полюсам. Во время всех этих перемещений связанные с кинетохорами микротрубочки изменяют свою длину, добавляя или теряя субъединицы на их плюс конце в месте соединения с кинетохором, в том же самом месте, где кинетохор скользит по поверхности микротрубочки. Хотя в последние годы был достигнут существенный прогресс, и многие белки, входящие в состав кинетохоров теперь известны, молекулярные основы генерации сил в митозе до сих пор не ясны. Каким образом развиваются силы, которые перемещают хромосомы на молекулярном уровне - старейший вопрос исследователей митоза по-прежнему не имеет однозначного ответа. Полимеризующиеся и деполимеризующиеся микротрубочки можно рассматривать как молекулярные машины, которые выполняют работу, толкая или таща за собой объекты, благодаря выделяемой во время полимеризации энергии гидролиза Гуанозин-трифосфата (ГТФ). По сравнению с полимеризацией, где теоретические представление весьма хорошо разработаны, механизм развития тянущей силы при деполимеризации, остается по большей части не ясным. Отчасти это связано с принципиальной трудностью представления устройства, которое бы позволило объекту следовать за концом деполимеризующейся микротрубочки, не теряя механического контакта. Существует две принципиальных модели, описывающие подобное сочленение,

и у обоих отсутствует количественное описание. Что касается величин развиваемых сил, то существующие оценки, основанные на энергии ГТФ шдоролиза или константах скорости полимеризации-деполимеризации тубулина, чрезвычайно грубы. Из-за такой неопределенности вклад динамики микротрубочек в движения хромосом до сих пор был не ясен.

Цель работы. Разработка модели микротрубочки позволяющей рассчитывать силу, развиваемую в процессе деполимеризации микротрубочки и ее экспериментальная проверка.

Задачи исследования.

1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре, кинетики деполимеризации и свойствах составляющих мономеров.

2. С помощью модели определить силу, развиваемую микротрубочкой в процессе деполимеризации.

3. Проанализировать свойства сопрягающего устройства, необходимого для наиболее эффективного развития силы.

4. Экспериментально измерить силу и сравнить результат с теорией.

Научная новизна.

В работе была разработана молекулярно-механическая математическая модель микротрубочки. Согласно расчетам концы стабильных растущих микротрубочек слегка изогнуты. Такого изгиба достаточно, чтобы конец такой микротрубочки могли узнавать специализированные белки, однако не достаточно для того, чтобы это можно было зарегистрировать при помощи электронной микроскопии. Стабильность микротрубочки определяется слоем тубулина на ее конце еще не успевшим гидролизовать ГТФ. Мы показали, что баланс продольных взаимодействий в протофиламентах ответственен за стабильность основной часта микротрубочки, а не наличие латеральных связей, как это было принято считать. Был проанализирован размер ГТФ шапки и было найдено, что двух слоев ГТФ тубулина достаточно, чтобы стабилизировать микротрубочку любой длины в большинстве случаев. Усовершенствованная модель, которая описывает взаимодействие с сопрягающим устройством, позволила рассчитать максимальную силу, которую может развивать микротрубочка. Было показано, что вся энергия, выделяемая в результате

гидролиза молекул ГТФ во время полимеризации, может быть запасена в стенке микротрубочки и использована для генерации сил. Максимальное использование запасенной энергии достигается при развитии силы по механизму удара (power-stroke mechanism). Максимальная сила составляет 75 пН для полной микротрубочки и достигается только при полной диссоциации латеральных связей димеров, развивающих усилие. Для того чтобы эта сила была утилизирована для перемещения хромосом наиболее эффективным образом, необходимо наличие специального устройства, сопрягающего энергию, выделяемую при деполимеризации микротрубочки, с перемещением. Если бы таким сопрягающим устройством, было кольцо, которое может скользить по ее поверхности, то в диаметре оно должно быть на 10 нм больше внешнего диаметра микротрубочки, для того, чтобы развиваемое усилие было максимально.

Была разработана и построена специальная установка для того, чтобы непосредственно измерить величину силы развиваемой микротрубочкой во время деполимеризации. Максимальная развиваемая сила оказалась в точности равной рассчитанной теоретически. Энергия, запасенная в микротрубочке в «напряженном» состоянии тубулина, высвобождаясь в процессе деполимеризации микротрубочки, может развивать значительные силы и совершать работу по движению хромосом, если разбирающийся конец микротрубочки соединен с хромосомой соответствующим устройством сопряжения. Измеренная сила велика и примерно в десять раз больше сил, развиваемых единичным моторным белком кинезином. Из этого следует, что данный механизм может быть основным в движении хромосом во время митоза. В некоторых из наших экспериментов, в результате наличия натяжения, продольные связи в протофиламентах существовали дольше, чем обычно при разборке микротрубочек, т.к. были им стабилизированы. Это может означать наличие специального механизма, который бы позволял сохранять соединение кинетохора с микротрубочкой в то время, когда сила, приложенная к хромосоме в сторону противоположенного полюса, велика.

Научно-практическое значение.

Исследование механизмов деления клеток имеет принципиальное значение для исследования развития раковых заболеваний. Понимание процессов,

протекающих во время митоза, и их механизмов может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание важности и существенности динамики микротрубочек в движении хромосом во время деления.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Построена оригинальная молекулярно-механическая модель микротрубочки.

2. С помощью модели рассчитана сила, развиваемая микротрубочкой в процессе деполимеризации. Рассмотрены различные механизмы сопряжения с передающим устройством.

3. Сила, развиваемая микротрубочкой, измерена экспериментально. Ее величина составила 60 пН, что находится в прекрасном согласии с теорией.

4. Механизм развития силы уникален и являет собой новый тип биомеханического движителя.

Апробация работы состоялась 25-ого апреля 2006 г. на заседании проблемной комиссии «Биохимия, биофизика и реология крови» в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на международной конференции 49th Annual Meeting of the Biophysical Society (Long Beach, California, США, февраль 2005 г.); международной конференции "Biological Motility: Basic Research and Practice" (Пущино, май 2006 г.); 45-ой и 44-ой конференциях annual ASCB meeting (December 10-146 2005. San Francisco, CA. и December 4-8,2004 Washington, DC.);

Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 6-и конференций и 5 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, библиографического указателя, включающего 80 источников, и приложения. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.) и в Университете штата Колорадо (зав лабораторией проф. Ричард Макинтош).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

По вопросам клеточной и молекулярной биологии работу консультировали:

к.б.н. Е.Л. Грищук профессор Р.Дж. Макинтош.

Современные представления.

Микротрубочки - это полые линейные полимеры, образующиеся в результате полимеризации ар -гетеродимеров тубулина. Схематически кончик разбирающейся микротрубочки представлен на Рис 1 (см. также Рис 2). Продольные взаимодействия между молекулами тубулина образуют линейные протофиламенты, которые, в свою очередь, взаимодействуя латерально, образуют стенку микротрубочки.

Вскоре после присоединения димера связанная с р -мономером молекула ГТФ гидролизуется; основная часть микротрубочки состоит из ГДФ-тубулина. При этом гидролиз ГТФ не нужен для полимеризации. Тубулин полимеризуется в присутствии негидролизуемых аналогов ГТФ, самый известный из которых ОМРСРР. Такие микротрубочки являются устойчивыми и не деполимеризуются - гидролиз нужен для того, чтобы дестабилизировать стенку микротрубочки. Гидролиз молекулы ГТФ влияет на конформацию молекулы тубулина: ГДФ-тубулин является более искривленным. Принять естественную конформацию ГДФ-тубулин в стенке микротрубочки не может и находится там под напряжением. Такая микротрубочка является неустойчивой. Ее стабильность определяется наличием на конце небольшого участка молекул еще не гидролизовавших ГТФ. Когда такая «ГТФ-шапка» потеряна, микротрубочка деполимеризуется. При этом, начиная с конца, димеры тубулина принимают свою естественную «искривленную» форму, разрывая связи между протофиламентами. Энергия гидролиза ГТФ, запасенная в стенке микротрубочки в виде механического напряжения, высвобождается.

Деполимеризующиеся микротрубочки могут совершать работу, перемещая объекты. Это было показано экспериментально (Соие е1 а1., 1991; ЬотЬШо е1 а1., 1995). Для того, чтобы высвобовдаемая при деполимеризации энергия была использована для перемещения хромосом в митозе, необходимо наличие подходящего сопрягающего устройства, т.е. такого устройства, которое будет

способно следовать за разбирающимся концом микротрубочки оставаясь псе время с ней связанным и эффективно утилизируя выделяемую энергию. Дизайн такого устройства впервые был предложен в работе (Hill and Kir schlier, 1982). Он представляет собой кольцо, одетое на конец деполимеризующейся микротрубочки (Рис 1),

Рис 1. Депол нмернзую щаяс я

На данный момент существует две основные модели, принципиально объясняющие развитие силы деполимеризующейся микротрубочкой. Модель Хилла (Hill, 1985) получила название модели направленной диффузии (biased ditTusion). Стенки рукава в модели связывают молекулы тубулина в микротрубочке. Движение внутри рукава происходит благодаря термическим флуктуациям энергии и является «направленным» благодаря тому, что энергия взаимодействия микротрубочки с рукавом тем меньше, чем больше сайтов связывания занято. Таким образом, отсоединение туоулинов от конца МТ освободит некоторые сайты в рукаве, которые система будет стремиться занять, передвинув весь рукав. Главным недостатком модели является полное игнорирование изменение кои формации тубулина, связанное с деполимеризацией микротрубочки. Очевидно, что изгибание д та еров в рукаве, узком настолько, чтобы действовали белок-белковые взаимодействия между тубулинами и внутренней поверхностью рукава, не возможно.

Гипотеза, выдвинутая в работе (Koshland et al,, 1988), основана на более поздних данных о структуре разбирающегося конца микротрубочки, ее называют моделью ¡<конформационной волны» (conformational wave model). Согласно этой модели сила развивается благодаря изгибанию протофиламентов, которые при этом давят на внутреннюю кромку кольца, вызывая, таким образом, его скольжение по направлению к противоположенному концу (так называемый "power stroke" механизм). При этом связывание между микротрубочкой и кольцом отсутствует. Величина развиваемой при этом силы

У

?

микротрубочка и кольцо, как устрой CTBOi сопрягающее разборку микротрубочки с движением, lía рисунке Р мономеры изображены более светлыми, чем а.

была оценена нами в данной работе. Мы показали, что если диаметр кольца оптимален, развиваемая сила может составлять 100% от максимально возможной. Таким образом, данный механизм является возможным механизмом, имеющим место в реальности. Стоит, однако, заметить, что согласно нашим расчетам развитие максимальной силы возможно только, если она развивается уже потерявшими латеральные связи тубулинами. Такие димеры остаются слабо связанными с микротрубочкой и возможно, что данный вид соединения будет являться неустойчивым.

Материалы и методы исследований

Подход, используемый для описания микротрубочки. Модель микротрубочки, разработанная в данной работе, основана на механическом описании димеров тубулина, входящих в состав микротрубочки, а также потенциалов взаимодействия между ними. Для простоты мы моделировали димеры как твердые недеформируемые объекты так, что конформационные изменения, сопровождающие гидролиз ГТФ, приводили только к изменению равновесного угла между димерами. Исходя на известных данных о структуре и поведении микротрубочки, для упрощения расчетов, мы ограничили число степеней свободы, которые имеет димер в микротрубочке до одной, соответствующей изгибу димера в плоскости проходящей через центральную ось микротрубочки и ось протофиламента (Рис 2).

Каждый димер имеет 6 точек взаимодействия с другими димерами (Рис 2). Две из них расположены вдоль оси димера и служат для продольного взаимодействия между димерами в протофиламенте. Они выбраны таким образом, что пара димеров в отсутствии других взаимодействий стремится образовать угол %0 в плоскости Р, которая образована осями микротрубочки и данного протофиламента. Предположение, состоящее в том, что димеры одного протофиламента могут изгибаться только в одной плоскости, значительно упрощает расчеты, и отчасти оправдано симметрией микротрубочки. Сумма сил, действующих на димер, находящийся в теле микротрубочки, почти строго лежит в плоскости Р. Латеральные взаимодействия симметричны практически для всех димеров.

Оставшиеся четыре точки служат для описания латеральных взаимодействий между димерами в соседних протофиламентах - по две связи

на мономер. Одна для соседа справа, другая для соседа слева. Соответствующие им силы, действующие между протофиламентами, зависят только от расстояний г, между взаимодействующими точками. Все эти силы совместно удерживают протофиламешы вместе.

Форма и положение /-ого дрота фи дамента полностью определены, когда заданы координаты одного зафиксированного в пространстве димера и углов б}'-1 между осью z и осью каждого димера в протофиламенте (к - 1..N, N-число димсров в протофиламенте /). Продольное взаимодействие между двумя димерами в протофиламенте Описываются при помощи потенциала вида; St Щ • BQfc - ХеМ, где - У'гоп межДУ димерами. Для

описания латеральных взаимодействий мы использовали потенциал, описывающий типичную форму белок-белкового взаимодействия: v(r) = А (г - р)1 ехр(-(г - р) / К), где > - расстояние между точками взаимодействия; р - равновесная длина связи; ft - параметр, характеризующий длину латеральной связи. После того, как полная потенциальная энергия микротрубочки вычислена как сумма вкладов каждого взаимодействия, ее ближайший локальный минимум, соответствующий устойчивой конформации, может быть найден при помощи одной из вариаций метода сопряженных градиентов.

Для того чтобы рассчитать силу, развиваемую одним протофиламентом, МЫ находили минимум потенциальной энергии при дополнительном условии х = w, где х - координата в плоскости Р верхнего края верхнего димера. Т.е. при изгибании протофиламент упирается в упор, не дающий ему изгибаться дальше. Развиваемую силу можно рассчитать по формуле F -AU/Az, где ДU

z

Рис 2. Трехмерный рисунок демонстрирует кусок микротрубочки из 13-ти протофиламентов со сдвигом 3 мономера на виток спирали. Ось Ог - центральная ось микротрубочки. Для выделенного димера показаны точки приложения сил со стороны соседних димеров. Выделенный димер находится а 3-ем протофиламенте, движение которого ограничено плоскостью обозначенной Г™. На рисунке (3 мономеры изображены более светлыми, чем а.

- изменение потенциальной энергии при смещении точки приложения силы по димеру на некоторую небольшую величину вниз. При этом по вертикали ее координата изменяется на Дz.

Экспериментальная установка. Для экспериментального измерения силы, развиваемой деполимеризующейся микротрубочкой, нами была собрана установка «лазерный пинцет». Основными компонентами установки являются: флуоресцентный микроскоп (ZEISS AxioPlan 2), оборудованный также для DIC микроскопии и мощный лазер, дающий непрерывный гауссов пучок (модель BL-106C, Spectra Physics). Сфокусированный объективом микроскопа лазерный луч создает трехмерный градиент света, который работает как ловушка, захватывая объекты микронного размера с диэлектрической проницаемостью, большей, чем проницаемость среды. При отклонении шарика от центра луча возникает сила, направленная к центру, пропорциональная его отклонению. С помощью квадрантного фотодетектора (специально сделанного на физическом факультете Университета штата Колорадо) отклонение шарика от центра луча можно измерить с точностью до нескольких нанометров по изменению интерференционной картины проходящего и преломленного на шарике света.

Реагенты и белки. Большинство реагентов были куплены у Sigma и Molecular Probes. Негидролизуемый аналог ГТФ, GMPCPP, был приобретен у Jena Bioscience. Тубулин был получен из коровьих мозгов путем поэтапной полимеризации - деполимеризации и очистке на фосфоцеллюлозной колонке (Weingarten et al., 1975). Мечение тубулина родамином и биотином было выполнено по стандартному протоколу (Hyman et al., 1991. Preparation of modified tubulins). В качестве центров нуклеации тубулина использовались лизироваиные в стандартном буфере (0.1 M PIPES, lmM EGTA, ImM MgCb, pH 6.9 с КОН) с добавлением 0.5 % детергента (р-40, Sigma) шкурки тетрахимены. Стеклянные микро-шарики были приобретены у Bangs Laboratories, Inc.

Эксперимент по измерению силы. Эксперимент проводился в термостатируемой (32°С) проточной камере, основой которой служили предметное и покровное стекла, разделенные слоем двустороннего скотча. Схема эксперимента представлена на рис ЗА. До начала эксперимента шкурки тетрахимены помещались на покровное стекло, после чего камера заполнялась буфером, собиралась и запечатывалась силаптом (Kwik-cast, WPI, Inc). После этого в камеру в присутствии ГТФ (1мМ) добавлялся тубулин (1.4 мг/мл), 1/10

часть которого бьта мечена биотиком, После этого камера промывалась 4-мя объемами тубулина (0.4 мг/мл), содержащего 1/3 часть меченного родамином в присутствии GMPCPP и без ГТФ. и инкубировалась 2-3 минуты. В результате вырастали нормальные микротрубочки, содержащие 1/10 часть биотинилироваиного тубулина длиной в несколько микрон, кончики которых стабилизированы от деполимеризации небольшой стабильной шапкой родамин меченого тубулина. После промывки в камеру были добавлены стеклянные шарики микронного размера, покрытые стрептавидином (Hurt! and Mcintosh, 1998), которые произвольно приляпали к биотин ил про ванным микротрубочкам. После того, как был выбран шарик для проведения измерения, он был захвачен ловушкой (рис ЗВ). Деполимеризация микротрубочки вызывалась разрушением GMPCPP стабилизированного кончика трубки, светом в полосе поглощения родамина. Нами было показано, что, наряду с сильным фотооб есцвечи вал нем родамина, разрушались и связи между молекулами губулина, связанного с этим родамином. Тем самым, шапочка, стабилизирующая микротрубочку, разрушалась, и микротрубочка начинала делолимеризоваться.

Рнс 3. А, Условная схема эксперимента. Микротрубочки состоят из двух частей. Более темным цветом показаны меченые родамином и стабилизированные кончики. В. 01С изображение шарика, прикрепленного к трубке.

Результаты

Модель описывает изменение стабильности микротрубочки с ГТФ шапкой и без нее. Минимизация энергии для спиральной микротрубочки дает ее устойчивую конформанию В широком диапазоне параметров микротрубочка с ГТФ шапкой является устойчивой (рис 4А). Рисунок ЗВ показывает профиль одного из протофнламеитов в микротрубочке с двумя ГТФ тубулинами на конце. Его конец слегка изогнут, но максимальное отклонения димеров не превышают 2-х ангстрем и очень быстро затухают при удалении от конца прогофиламента.

Конформация микротрубочки, состоящей только из ГДФ тубулина является неустойчивой. Есть только одно равновесное состояние такой микротрубочки, соответствующее полностью закрученным протофиламентам с разорвавшимися латеральными связями. Таким образом, модель описывает основное свойство микротрубочек: быть стабильными при наличии ГТФ шапки и способность быстро разбираться в результате закручивания протофиламентов в ее отсутствии. При нормальных условиях после того, как разрушились связи между протофиламентами, разрушаются и продольные связи в протофиламентах - микротрубочка разбирается на отдельные димеры. Однако продольные связи являются более устойчивыми, и процесс отделения димеров мы в модели не рассматриваем.

п

зоА

В

П

|А

0.83 -0.05 -0.24 0.02 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

Рис 4. Устойчивые состояния микротрубочки. Черные и серые отрезки обозначают ГДФ и ГТФ тубулины соответственно. А. 3-х мерное изображение трубочки из 13-ти протофиламентов с 2Т шапкой. В. Вид сбоку на 8-ой протофиламент из микротрубочки слева. Цифры означают отклонение концов димеров от вертикальной оси в ангстремах. Внутренность трубки показана серым. С. Устойчивое состояние микротрубочки при тех же параметрах, но без ГТФ шапки.

Баланс изгибающих сил и локальность взаимодействий внутри стенки микротрубочки. Для того чтобы димер находился в покое, сумма действующих на него сил должна быть равна нулю. Димеры, находящиеся в стенке микротрубочки не у самого ее конца, практически не отклонены. Это связано с тем, что силы, действующие со стороны нижнего и верхнего димеров, компенсируют друг друга таким образом, что полная сумма сил и моментов сил, приложенных к данному димеру, равны нулю. Основная часть микротрубочки

является выпрямленной благодаря компенсации изгибающих моментов, а не удерживающему характеру латеральных сил.

Кривизна ГТФ и ГДФ димеров различна, поэтому изгибающие силы, которые они прикладывают к своим соседям, тоже различны. Если внутрь стенки ГДФ микротрубочки вставлен ГТФ димер, это приведет к нарушению формы протофиламента, т.к. моменты сил, приложенные к концам димера, отличаются. Анализ сил показывает, что положение данного димера зависит только от ближайших соседей и не сказывается на положениях димеров, отстоящих хоть сколько-нибудь далеко. Это приводит к тому, что неровность формы, вызванная нарушением типа димера, не будет распространяться далеко, а будет локализована в непосредственной его близости. Локальность взаимодействий в стенке микротрубочки сильно облегчает анализ ее свойств. Его непосредственным следствием является то, что структура и стабильность конца микротрубочки не зависят от ее длины и определяются всего 5-6ю последними слоями.

Развитие силы деполгшеризцющейся микротрубочкой. Пусть на некотором расстоянии те от поверхности протофиламента находится внутренняя поверхность кольца, охватывающего микротрубочку. В результате разрушения латеральных связей протофиламеит начинает закручиваться и поверхность одного из его димеров приходит в контакт с внутренней кромкой кольца (рис

точка приложения силы смещается по поверхности димера на с/ - А', и на Дг вниз. Максимальная развиваемая при этом сила равна < ^ >=А1//Дг, где Д17 - изменение потенциальной энергии протофиламента.

5А,В).

Рис 5. А. Во время выгибания протофиламеит может развивать силу приложенную к точке находящейся на расстоянии м> от его поверхности. На данном рисунке сопрягающее устройство в виде кольца, окружающего микротрубочку, сводится к точке в плоскости данного протофиламента. В. В результате изгибания протофиламента

На рис 6С представлена зависимость максимальной развиваемой силы, приложенной со стороны верхней части последнего димера к внутренней кромке кольца, от его диаметра. Когда и» <0.5 нм, составляющая силы, параллельная оси микротрубочки, крайне мала. Отчасти это результат геометрии системы. Когда димер вертикален, большая часть силы приложена в направлении, перпендикулярном оси микротрубочки. Однако более значительным оказывается другое обстоятельство. Когда димер, развивающий силу, наклонен всего немного, его латеральные связи уже натянуты, но еще не порваны. На кривой потенциала латеральных сил мы находимся на возрастающем участке, и сильное латеральное взаимодействие между димерами препятствует развитию больших сил.

Рис 6. Зависимость развиваемой силы от ширины кольца. А. Значения трех последних углов между димерами % как функция п. В. Энергии латеральных связей двух крайних димеров (ЛГг -энергия связи а мономера Л'-ого димера). При увеличении V! связь сначала натягивается, а потом

м (нм)

рвется. С. Равновесная сила, развиваемая единичным протофиламентом на расстоянии к от его поверхности.

Вся энергия уходит на то, чтобы преодолеть барьер латеральных связей. После того, как это барьер преодолен, возникает дополнительное отталкивание между димерами, наоборот, способствующее развитию сил. Но это происходит только при больших диаметрах кольца. Далее в игру вступают нижележащие связи, и общее поведение дает сложную нелинейную зависимость развиваемой силы от величины кольца. Максимум силы достигается, когда обе латеральные связи работающего димера разорваны и отчасти работают силы отталкивания. При дальнейшем увеличении у/ сила начинает падать, т.к. энергия расходуется на растяжение связей нижележащего димера. Эти небольшие модуляции силы происходят регулярно с ростом диаметра кольца, но, чем больше кольцо, тем

меньше эти изменения, потому что более отдаленные от точки приложения силы димеры дают в нее меньший вклад. При \\'> 10 пм сила начинает падать из-за значительного удаления димеров, развивающих силу, от точки ее приложения. Таким образом, максимальное развитие силы возможно на расстоянии 5-7 им от поверхности протофиламентов. Именно настолько должно отстоять кольцо от стенки микротрубочки, чтобы энергия изгибающихся протофиламентов могла быть эффективно использована для развития механического усилия.

Максимальная ста, развиваемая микротрубочкой. Оказывается, что точные расчеты силы зависят от конкретной формы димера. Во всех вышеприведенных расчетах предполагалось, что сила развивается верхним краем димера. Если димеры моделировать как жесткие цилиндры, то при попадании кромки кольца, где приложена сила, па место стыка между димерами возникает сингулярность. Для того чтобы оценить среднюю силу, развиваемую микротрубочкой при скольжении по ней кольца, мы упростили задачу и рассмотрели ее аналитически.

Рассмотрим кольцо, которое скользит вдоль оси Ог микротрубочки при постоянном и1, и рассмотрим два состояния. Первое, когда Ы-ый димер касается кромки кольца какой-то своей точкой, и второе, когда И-1-ый димер касается кромки кольца точкой, расположенной так же, как и на И-ом димере в состоянии 1. Поскольку конформация крайних димеров не зависит от длины всего протофиламента, в состоянии 2 (М-1)-ый димер и димеры, лежащие под ним, будут иметь точно такую же конформацию, как и Кт-ый димер и лежащие под ним в состоянии 1. Следовательно:

<?,(1) = в™ для всех I = (1)

Верхние индексы при углах обозначают состояния 1 или 2. Максимальная работа, которая может быть произведена протофиламентом по перемещению кольца из состояния 1 в состояние 2, есть:

ДРГ = ит-ит = ¿с/<2) -¿и?> (2)

ы

Здесть {//"' - потенциальная энергия всех взаимодействий ¡-ого димера.

В силу (1) AW = - Uf ', или AW = -[/,(,,s т.к. вклад в потенциальную энергию N-oro димера в состоянии 2 равен нулю - все его латеральные связи разорваны, а угол равен равновесному. Т.к. -Ои г, = 0, самый

нижний димер стоит вертикально, то, при условии, что глубина потенциальной ямы равна нулю, имеем:

&W = -£/<" =-l/25Uf)J (3)

Максимальная сила, развиваемая протофиламентом, есть F = -(У1(1) /1, где I - длина димера. Ровно настолько сместится кольцо вдоль оси Oz при переходе из состояния 1 в состояние 2. Уравнение (3) показывает, что вся энергия, запасенная в продольной связи испрямленного димера, может быть, в принципе, использована для совершения работы.

Используя экспериментальные данные по скоростям деполимеризации микротрубочек (Walker et al., 1988; Fygenson et al., 1994), мы оценили энергию активации разрыва латеральной связи. Она составила 4.8 ± 0.6 ккал/моль. Для того чтобы ГДФ димер, изгибаясь, мог преодолеть этот барьер, минимальная энергия, запасенная в испрямленной конформации ГДФ-тубулина, должна составить С/,(1)= 6.7 ккал/моль (основано на расчетах по нашей модели). Максимальная сила, развиваемая протофиламентом при этом, - 5.8 пН.

Таким образом, для МТ, состоящей из 13-ти протофиламентов, максимально возможная развиваемая при деполимеризации сила составит 75 пН. Оценка максимальной силы на основе гидролиза молекулы ГТФ при условии, что вся энергия пошла на работу, дает 82 пН на микротрубочку (если считать энергию гидролиза ГТФ = 7.3 ккал/моль). Для сравнения сила, развиваемая по механизму Хила, составляет 15 пН (Joglekar and Hunt, 2002). Это значительно меньше, чем развиваемые по механизму изгибания протофиламента.

Наша оценка в 75 пН составляет значительную часть 700 пН, необходимых, чтобы остановить анафазное движение хромосомы (Nicklas, 1983). Это означает, что порядка десяти микротрубочек участвуют в перемещении хромосомы для данного вида организма, в то время как по сделанным оценкам их должно быть около 40-ка. Однако не известно, как много из этих сорока доходят до полюса или развивают силу. Анафазное движение

может был. зависимо только от нескольких микротрубочек в данный конкретный момент времени. Возможно, некоторые другие феномены, такие, как прецессивность (способность совершать несколько шагов, непрерывно развивая силу, без отрыва от субстрата) играют важную роль. Большее число микротрубочек может увеличить шансы успешного завершения анафазвого движения.

Экспериментальное измерение силы, Шарики, прилипшие к микротрубочкам (см- «Материалы и методы»), не являются жестко закрепленными, а по-прежнему участвуют в броуновском движении (рис 7В), После того, как запущена деполимеризация трубок, через некоторое время (как правило, 0.5 - 2 мин) наблюдаемый шарик, бывший прикрепленным к микротрубочкам, становится свободным.

А 1(1 20 30 40 К) М 0 15 21 30 40 Я

время (сек)

Рис 7. Примеры сигналов - необработанные данные квадрантного детектора, По оси абсцисс отложено время, А - захваченный ловушкой свободный шарик, с которым проделаны разные операции. Стрелки - открытие и закрытие освещения, разрушающего родамииовые концы микротрубочек, вытянутые треугольнички -перемещения подставки - держателя объекта, вместе с объектом. Ни освещение, ни движения объекта не влияют на регистрируемое, чисто броуновское движение. В -Броуновское движение уменьшено для шарика под натяжением, прикрепленного к нескольким микротрубочкам. Несколько событий отрыва от разных микротрубочек произошло после открытия иллюминации и до полного освобождения шарика. С - Г -примеры сигналов. Сплошная кривая - аппроксимация гладкой функцией. С, I) -типичные сигналы силы: Р - сигнал без силы, релаксация; Е - сложный сигнал.

Наблюдавшиеся нами движения шарика, вызванные деполимеризацией микротрубочки, варьировали от эксперимента к эксперименту очень сильно: некоторые шарики отрывались быстро, с характерным временем в сотые доли секунды, тогда как другие совершали довольно сложные движения, длившиеся 5-40 сек. Но, в конце концов, шарик всегда оказывался в центре ловушки, освободожденным от трубки. Об этом можно было судить по увеличению броуновского движения шарика после серии событий, что хорошо видно на рис 7В. Сложное поведения шарика мы объясняем тем, что в этих экспериментах шарик был исходно связан сразу с несколькими трубочками, и отсоединение его от разных трубочек происходило в разные моменты времени. Дошедшая до шарика волна деполимеризации каждой из этих трубок вызывала некоторое движение. Поскольку мы никогда не знаем наверняка, сколько трубок было изначально прикреплено к тому или иному шарику, мы анализировали только последнее событие на полученных данных. Это гарантировало нам анализ отсоединения одной, последней микротрубочки. В том, что шарик свободен, мы убеждались, перемещая подставку и следя за положением шарика: он должен все время оставаться в центре ловушки, если шарик действительно свободен (рис 7В).

В б 1-ом из 144-х экспериментов перед последним отрывом шарик немного двинулся от центра, прежде чем в него перейти (рис 7 С-Е). Смещение в перпендикулярном направлении, как правило, составляло не более 20% от смещения вдоль микротрубочки.

Средняя величина развиваемой силы в наших экспериментах составила 0.24 ± 0.02 пН. Чтобы проверить, не зависит ли развиваемая сила от способа прикрепления к шарикам, в качестве альтернативного линкера между шариком и микротрубочкой мы использовали MAP белки. При этом средняя развиваемая сила не изменилась и составила 0.22 ± 0.04 пН. Величины развиваемых сил не зависят ни от длины микротрубочки, ни от изначально приложенного натяжения. Распределение сил резко падает практически до нуля на значении 0.45 пН (рис 8), предполагая тем самым, что это есть максимальная сила, которая может быть развита в нашей экспериментальной системе.

Перемещение шарика вызвано изгибанием протофиламентов. Радиус шарика составляет 500 нм, в то время как размер области прикрепления 20 - 60 нм. Это означает, что сила, приложенная к центру шарика, уменьшена в — 10

раз, поскольку таково отношение плеч рычагов в нашей постановке эксперимента. Следовательно, максимальная сила, развиваемая вблизи поверхности микротрубочки, составляет 4.5-5.0 пИ, что по величине равно силе, развиваемой моторным белком. Если бы энергия всех 13-ти протофиламсцтом могла утилизироваться подходящим устройством для совершения работы по перемещению, можно было бы ожидать, что развиваемая при этом сила составит 30 - 60 пН.

15

tS f—

I 10

О О

СО t-

0 с oj Э

S

1

Рис 8. Гистограмма амплитуд, измеренных, в эксперименте сил.

V» ^ £ # сила(пн)

Время нарастания силы, скорее всего, определяется скоростью деполимеризации. Распределение времен нарастания является довольно широким (рис 9А), времена колеблются от 0.03 до 9.5 сек, что отчасти может быть объяснено различными скоростями деполимеризации микротрубочек. Эту гипотезу мы проверили, лроварьировав концентрацию ионов Mg2+ в растворе. Известно, что с ростом концентрации скорость деполимеризации расчет

(O'Brien et al„ 1990). На рис 9В видно, что уменьшение концентрации этих ионов приводит к увеличенным временам релаксации, что указывает па хорошую обратную корреляцию этих времен со скоростью деполимеризации. Для физиологических значений концентрации Mgb (1-4 мМ) среднее время развития силы в наших экс пери ментах составляет 1.3 сек.

Для анализа событий в эксперименте мы использовали модель, аналогичную описанной н разделе «развитие силы де полимеризцющейся микротру бочкой», в которую было включено взаимодействие с шариком радиуса 1мкм. Модель позволяла количественно рассчитать силу, приложенную к центру масс шарика, основываясь на оценках энергий связей приведенных выше, а также понять природ)' возникновения разных амплитуд сил и сигналов типа медленных релаксаций (рис 6C.D.F).

А 3

-О

§ 12-М

И 1

с

Рис 9. Характеристики развиваемые сия. А. Гистограмма длительностей развиваемых сип; В. Характеристики сил для различных значений концентрации М»!т (физиологические значения 1 - 4мМ), Длительности сил и релаксаций больше для медленнее деполимеризующихся микротрубочек, в то время как амплитуды сил неизменны.

Из полученных зависимостей и анализа модели был сделан вывод, что причиной возникновения различных величин развиваемых сил и различных времен релаксации является стохастический характер разрушения связей между протофи лам ентам и. По мере того, как латеральные связи рвутся, прикрепленный к микротрубочке шарик будет двигаться различно в зависимости от того, какие протофиламенты на уровне закрепления отщепятся первыми: те, за которые закреплен шарик, или протофиламенты, находящиеся с другой стороны закрепления. Наша модель показывает, что если первыми отщепятся протофиламенты, за которые закреплен шарик, то в этом случае будет развита наибольшая сила (рис 10В). Величина силы, полученная в расчетах, составила 0,4 пН - это прекрасно согласуется с максимальной силой измеренной экспериментально.

Если же первыми на уровне закрепления шарика отщепятся протофиламенты, не связанные с шариком, то возникнет ситуация, в которой шарйк связан со связкой из более, чем 2-х гтротоф алиментов (рис ЮС). Чем больше протофиламеитов в этой связке, тем меньше они могут изогнуться как целое из-за того, что им мешают по-прежнему существующие между ними латеральные связи. Их общая кривизна меньше, чем кривизна одного протофиламента, и поэтому развиваемая сила меньше.

среднее $3± 0,3 сек п = 54

11м !■■ I ■

12 3-1567 Длительность силы (сек)

в 8

Длительность силы Врем релаксации Амплитуде силы

0.25 1-4 10 Концентрация Мд2* (ыМ)

Рис 10. Модели развития силы. Димер ту булиня показан двумя маленькими шариками. Более светлый - р тубулин. Стеклянный шарик, использованный для измерения силы, прикреплен к микротрубочке 6-ю димерами в 2-х соседних протофиламеитах (Для наглядности шарик показан в 10 раз меньше реального размера). Крест обозначает центр ловушки. А. Условно изображена микротрубочка с шапкой из ОМТО№ тубулина (более темная); В. Сценарий 1. Протофиламенты, закрепленные за шарик отваливаются раньше других. Они толкают шарик дальше от центра ловушки, развивая максимальную силу, С. Сценарий 2. Протофкламенты, закрепленные за шарик отваливаются самыми последними. При этом шарик долгое время закреплен за структуру из многих Гфотофиламектов, гораздо менее жесткую, чем вся микротрубочка. Приложенное к шарику натяжение вьгнужлэет ее изгибаться, приводя шарик ближе к центру ловушки.

Если их в связке более 6-ти, то сила вообще не будет развиваться, а будет иметь место другой эффект. Жесткость такой связки из нескольких протофиламентом намного меньше, чем все микротрубочки целиком. Если шарик находится под натяжением, то поскольку жесткость закрепления уменьшилась по сравнению с той, которая была до полимеризации, шарик начнет медленно смещаться к центру ловушки. Именно это и есть причина наблюдаемых нами медленных релаксаций (Рис ?Р).

Медленные релаксации к центру ловушки являются довольно неожиданными - согласно полученным цифрам шарик может оставаться связанным с частично разобранной микротрубочкой в течение нескольких секунд, в то время как за одну секунду латеральные связи должны потерять от 8 до 65 димеров. В течение всего этого времени продольные связи в протофидаментах остаются не разорвавшимися, поскольку шарик не является свободным. Более того, согласно нашим данным большие времена релаксации

соответствовали большим натяжениям. Таким образом, время жизни продольной связи в протофиламенте увеличено приложенным натяжением, которое противодействует выгибанию протофиламеитов. Этот результат может оказаться ключом к пониманию важного свойства кинетохоров. Если натяжение присоединенных к кинетохору микротрубочек велико из-за сил, действующих с другой стороны хромосомы, они не отрываются, а наоборот переходят в состояние полимеризации. В наших экспериментах приложенное к микротрубочкам натяжение замедлило изгибание протофиламеитов, тем самым, затормозив их разборку.

ВЫВОДЫ

1. Разработана молекулярно-механическая модель микротрубочки, которая позволила проанализировать стабильность и форму микротрубочки и понять, какие механические силы могут развиваться при ее деполимеризации.

2. Рассчитана максимальная сила, развиваемая микротрубочкой. Она составила 75 пН. Показано, что вся запасенная в стенке микротрубочки энергия гидролиза ГТФ может быть использована для генерации сил, т.е. микротрубочка может действовать, как молекулярная машина с КПД близким к 100%.

3. Экспериментально измерена сила, развиваемая при деполимеризации одиночной микротрубочки. Ее величина составляет 30 - 60 пН, что в 10 раз больше силы, развиваемой моторным белком кинезином, и, следовательно, деполимеризация микротрубочек может служить основной силой, движущей хромосомы в митозе.

4. Обнаружено, что приложенное к микротрубочке натяжение стабилизирует ее от деполимеризации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Efremov А.К., Mcintosh J.R., and Ataullakhanov F.I. Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study, Proc Natl Acad Sci USA. 2005, v.102, n. 12, p. 4353-4358.

2. Molodtsov M.I., Ermakova E.A., Shnol E.E., Grishchuk E.L., Mcintosh J.R., and Ataullakhanov F.I. A molecular-mecanical model of the microtubule. Biophys J. 2005, v. 88, n. 5, p. 3167 - 3179.

3. Grishchuk E.L., Molodtsov M.I., Mcintosh J.R., and Ataullakhanov F.I. Force production by disassembling microtubules. Nature. 2005, v. 438(7066), p. 384-8

4. М.И. Молодцов, E.JI. Гршцук, Д.Р. Макинтош, Ф.И. Атауллаханов. Измерение силы, развиваемой разбирающейся микротрубочкой в ходе деполимеризации, вызванной ионами Са. Доклады Академии Наук. 2007. том 412, №2, с. 1-4.

5. М.И. Молодцов, Е.Л. Гршцук, Д.Р. Макинтош, Ф.И. Атауллаханов. Новый тип биомеханического движителя. Российский химический журнал. В печати.

6. Molodtsov МЛ., Grishchuk E.L., Mcintosh J.R., and Ataullakhanov F.I. 2005. Force Production by Depolymerizing Microtubules. Abstract book of the 49th Biophysical Society Meeting, February 12-16, 2005, Long Beach, California, p. 644a

7. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Mcintosh J.R., and Ataullakhanov F.I. 2006. New type of biomechanical motor. International symposium: "Biological motility: research and practice". Pushchino, May 11-15, 2006, Moscow region, Russia

8. E.L. Grishchuk, M.I. Molodtsov, F.I. Ataullakhanov, J.R. Mcintosh. Force production by disassembling microtubules. 2005. 45th annual ASCB meeting. December 10-14. San Francisco, CA. p. 476a.

9. E.L. Grishchuk, M.I. Molodtsov, F.I. Ataullakhanov, J.R. Mcintosh. The Force Produced by Depolymerizing Microtubules. 2004. 44th annual ASCB meeting. December 4-8. Washington, DC.

10. E.L. Grishchuk, M.I. Molodtsov, A.K.Yefremov, I.S. Spiridonov, F.I. Ataullakhanov and J.R. Mcintosh. 2006. Mechanisms of poleward chromosome movement. Biophysical society discussion group. Molecular motors: Point Counterpoint. October 19-22. California.

11. K.V. Zhudenkov, M.I.Molodtsov, F.I. Ataullakhanov. Mathematical modeling of the mitotic spindle formation and mechanics of the microtubule end. 2006. Is1 International Conference on Mathematical Biology and Bioinformatics. October 9-15. Pushchino region, Russia.

Принято к исполнению 09/01/2007 Исполнено 10/01/2007

Заказ № 2 Тираж: 150 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoieferat.rn

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Молодцов, Максим Игоревич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Деление клетки и движение хромосом.

1.2 Современные представления о структуре и динамике микротрубочек.

1.2.1 Структура микротрубочки.

1.2.2 Динамика микротрубочки.

1.2.3 Структурная основа динамической нестабильности.

1.3 Математические модели динамики и механики микротрубочек.

1.3.1 Кинетические модели.

1.3.2 Ста, развиваемая микротрубочкой.

1.3.3 Термодинамические оценки.

1.3.4 Модели сопряжения микротрубочки с кинетохором.

1.4 Экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочками.

1.5 Измерение малых сил с помощью оптической ловушки.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ.

2.1 Описание модели.

2.2 Описание потенциалов продольных взаимодействий.

2.3 Описание латеральных взаимодействий.

2.4 Полная потенциальная энергия МТ.

2.6 Расчет равновесной силы, развиваемой микротрубочкой.

2.7 Оценка жесткостей продольных и поперечных связей.

2.8 Модель, используемая в эксперименте.

ГЛАВА 3. МЕТОДЫ.

3.1 Численный метод.

3.2 Линеаризация уравнений основной модели.

3.2.1 Микротрубочка без спиральности.

3.2.2 Переход к другим переменным.

3.2.3 Модель одного протофиламента.

3.2.4 Линеаризация уравнений равновесия.

3.3 Экспериментальные методы и материалы исследования.

3.3.1 Описание установки.

3.3.2 Схема эксперимента.

3.3.3 Приготовление тубулина и нуклиирующих ifeumpoe.

3.3.4 Проточная камера.

3.3.5 Подготовка камеры к эксперименту.

3.3.6 Обработка экспериментальных данных.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Стабильность МТ с Т-шапкой и без.

4.2 Баланс изгибающих сил в стенке микротрубочки.

4.3 Локальность взаимодействий внутри стенки МТ.

4.4 Форма кончика микротрубочки.

4.5 Характеристика стабильности МТ.

4.6 Параметры, влияющие на стабильность.

4.7 Разница между плюс и минус концами.

4.8 Микротрубочка 133 немного менее стабильна, чем 130.

4.9 Независимость главных выводов от параметров, описывающих силы

4.10 Катастрофа при наличии удерживающего кольца.

4.11 Развитие силы протофиламентом.

4.12 Влияние латеральных потенциалов на развитие сил.

4.13 Оценка максимальной силы, развиваемой микротрубочкой.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1 Обсуждение теоретической части работы.

5.2 Обсуждение экспериментальной части работы.

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение молекулярно-механических свойств микротрубочек и развиваемых ими сил"

Микротрубочки являются важнейшими компонентами цитоскелета эукариотических клеток. Они участвуют в поддержании клеточной формы, движении, а так же перемещении органелл, включая митотические хромосомы. Микротрубочки не только взаимодействуют с моторными белками, выполняющими работу по перемещению, но и сами способны совершать работу. Хромосомы расходятся по дочерним клеткам во время митоза, взаимодействуя с микротрубочками митотического веретена. Плюс концы микротрубочек связывают кинетохоры - специальные образования на хромосомах, соответствующие центромерному участку. Во время прометафазы хромосомы связанные с микротрубочками перемещаются в сторону к полюсу или прочь, а затем во время метафазы выстраиваются в метафазную пластинку. Сестринские хроматиды расщепляются во время анафазы и хромосомы движутся к полюсам. Во время всех этих перемещений связанные с кинетохорами микротрубочки изменяют свою длину, добавляя или теряя субъединицы на их плюс конце, в месте соединения с кинетохором, в том же самом месте, где кинетохор скользит по поверхности микротрубочки. Хотя в последние годы был сделан существенный прогресс, и многие белки входящие в состав кинетохоров известны, понимание молекулярных основ генерации сил в митозе по-прежнему отсутствует. Каким образом развиваются силы, которые перемещают хромосомы на молекулярном уровне - старейший вопрос исследователей митоза по-прежнему не имеет однозначного ответа. Полимеризующиеся и деполимеризующиеся микротрубочки можно рассматривать как молекулярные машины, которые выполняют работу, толкая или таща за собой объекты, благодаря энергии гидролиза ГТФ выделяемой во время полимеризации. По сравнению с полимеризацией, где теоретические представление весьма хорошо разработаны, механизм, в результате которого развивается тянущая сила при деполимеризации остается по большей части не ясным. Отчасти это связано с принципиальной трудностью представления устройства, которое бы позволило объекту следовать за концом деполимеризующейся микротрубочки, не теряя механического контакта. Существует две принципиальных модели описывающих подобное сочленение, но у обоих отсутствует количественное описание. Что касается величин развиваемых сил, то существующие оценки, основанные на энергии ГТФ гидоролиза или константах скорости полимеризации-деполимеризации тубулина, чрезвычайно грубы. Из-за такой неопределенности вклад динамики микротрубочек в движения хромосом до сих пор был не ясен.

Целью данной работы было теоретическое и экспериментальное исследование сил, развиваемых микротрубочкой во время деполимеризации. Мы хотели создать наиболее полную модель, которая бы позволила количественно определять силы, которые микротрубочки могут развивать, основываясь на описаниях потенциалов взаимодействия между молекулами тубулина, а так же рассчитывать уже существующие не количественные модели. Второй целью работы явилось сравнение теории и эксперимента -прямое измерение развиваемой силы.

Цель работы: Разработка модели микротрубочки позволяющей рассчитывать силу, развиваемую в процессе деполимеризации микротрубочки и ее экспериментальная проверка.

Задачи исследования:

1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре, кинетики деполимеризации и свойствах составляющих мономеров.

2. С помощью модели определить силу, развиваемую микротрубочкой в процессе деполимеризации

3. Проанализировать свойства сопрягающего устройства, необходимого для наиболее эффективного развития силы

4. Экспериментально измерить силу, и сравнить с теорией

Научная новизна:

Мы разработали молекулярно-механическую математическую модель микротрубочки. Мы показали, что концы микротрубочек слегка изогнуты, не достаточно, чтобы это можно было увидеть при помощи электронной микроскопии, но достаточно для того, чтобы их могли узнавать специализированные белки. Мы показали, что баланс продольных взаимодействий в протофиламентах ответственен за стабильность основной части микротрубочки, а не наличие поперечных связей. Мы проанализировали размер ГТФ шапки и нашли, что двух слоев ГТФ тубулина достаточно, чтобы стабилизировать микротрубочку любой длины в большинстве случаев.

Усовершенствованная модель, которая описывает взаимодействие с сопрягающим устройством, позволила рассчитать максимальную силу, которую может развивать микротрубочка. Мы показали, что вся энергия, выделяемая в результате гидролиза молекул ГТФ во время полимеризации, может быть запасена в стенке микротрубочки и использована для генерации сил. Максимальное использование запасенной энергии достигается при развитии силы по механизму удара (power-stroke mechanism). Максимальная сила составляет 75 пН для полной микротрубочки. Эта сила достигается только при полной диссоциации латеральных связей димеров развивающих усилие. Если сопряжение достигается посредством кольца, то в диаметре оно должно быть на 10 нм больше внешнего диаметра микротрубочки, для того, чтобы развиваемое усилие было максимально.

Мы разработали и построили оптическую ловушку для того, чтобы непосредственно впервые измерить величину силы развиваемой микротрубочкой во время деполимеризации. Мы получили спектр развиваемых сил, разной величины. Максимальная развиваемая сила оказалась в точности равной рассчитанной теоретически. Механо-химический механизм развития силы оказался уникальным: молекулы тубулина, из которых состоят стенки микротрубочек, при полимеризации присоединяются к растущей трубочке в «выпрямленной» конформации, и в связанном с ГТФ состоянии. После полимеризации происходит расщепление ГТФ и выделившаяся энергия запасается в «напряженном» состоянии тубулина. При этом каждая молекула тубулина стремиться выгнуться наружу из стенки трубочки. Это напряжение, высвобождаясь в процессе деполимеризации микротрубочки, может развивать значительные силы и совершать работу по движению хромосом, если разбирающийся конец микротрубочки соединен с хромосомой соответствующим устройством сопряжения. Измеренная нами сила велика и составляет примерно десять сил, развиваемых единичным моторным белком. Из этого следует, что данный механизм может быть основным в движении хромосом во время митоза. Мы промоделировали эксперимент, модернизировав разработанную нами модель и нашли, что спектр различных амплитуд сил, наблюдаемых в эксперименте соответствует различным сценариям разрушения связей между протофиламентами во время деполимеризации. Трещины между протофиламентами могут распространяться, оставляя 2 или 3 или другое число протофиламентов в отдельной связке, которая развалится позже, определяя амплитуду развиваемой силы. Этот результат означает, что развитие силы на не симметричном устройстве, как это было у нас в эксперименте, может быть случайным образом снижено из-за асинхронности разборки микротрубочки. В некоторых из наших экспериментов в результате наличия натяжения продольные связи в протофиламентах существую дольше, чем обычно при разборке микротрубочек, стабилизируемые натяжением. Это может означать наличие специального механизма, который бы позволял сохранять соединение кинетохора с микротрубочкой в то время, когда сила, приложенная к хромосоме в стороны противоположенного полюса велика.

Научно-практическое значение:

Исследование механизмов деления клеток имеет принципиально важное значение для исследования развития раковых заболеваний. Понимание процессов протекающих во время митоза и их механизмов может помочь в создании анти-раковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание важности и существенности динамики микротрубочек в движение хромосом во время деления.

Положения, выносимые на защиту:

1. Построена оригинальная молекулярно-механическая модель микротрубочки.

2. С помощью модели рассчитана сила, развиваемая микротрубочкой в процессе деполимеризации. Рассмотрены различные механизмы сопряжения с передающим устройством.

3. Сила, развиваемая микротрубочкой, измерена экспериментально. Ее величина составила 60 пН, что находится в прекрасном согласии с теорией.

4. Механизм развития силы уникален и являет собой новый тип биомеханического движителя.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Молодцов, Максим Игоревич

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ

1. Разработана молекулярно-механическая модель микротрубочки, которая позволила проанализировать стабильность и форму микротрубочки и понять, какие механические силы могут развиваться при ее деполимеризации.

2. Рассчитана максимальная сила, развиваемая микротрубочкой. Она составила 75 пН. Показано, что вся запасенная в стенке микротрубочки энергия гидролиза ГТФ может быть использована для генерации сил, т.е. микротрубочка может действовать, как молекулярная машина с КПД близким к 100%.

3. Экспериментально измерена сила, развиваемая при деполимеризации одиночной микротрубочки. Ее величина составляет 30 - 60 пН, что в 10 раз больше силы, развиваемой моторным белком кинезином, и, следовательно, деполимеризация микротрубочек может служить основной силой, движущей хромосомы в митозе.

4. Обнаружено, что приложенное к микротрубочке натяжение стабилизирует ее от деполимеризации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Молодцов, Максим Игоревич, Москва

1. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. 1972. «Медицина». Москва.

2. Abbondanzieri, Е.А., Greenleaf W.J., Shaevitz J.W., Landick R., and S.M. Block. 2004. Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase. Nature. 438(7067):460-465.

3. Alberts, В., A. Johnson, J. Lewis, M. Ra, K. Roberts, and P. Walter. 2002. Molecular Biology of The Cell. Garland Publishing, New York, 4th edition.

4. Ashkin, A. 1970. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys.Rev. Lett. 24:156-159.

5. Bayley, P., M. Schilstra, and S. Martin. 1989. A lateral cap model of microtubule dynamic instability. FEBS Lett. 259:181-184.

6. Caplow M., and J. Shanks. 1990. Mechanism of the microtubule GTPase reaction. J Biol Chem, 265:8935-8941.

7. Caplow, M., and J. Shanks. 1996. Evidence that a single monolayer tubulin-GTP cap is both necessary and sufficient to stabilize microtubules. Mol. Biol. Cell 7:663-675.

8. Chen, Y.D., and T.L. Hill. 1985. Monte Carlo study of the GTP cap in a five-start helix model of a microtubule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:1131-1135.

9. Chretien, D., H. Flyvbjerg, and S.D. Fuller. 1998. Limited flexibility of the inter-protofilament bonds in microtubules assembled from pure tubulin. Eur. Biophys. J. 27:490-500.

10. Chretien, D., S.D. Fuller, and E. Karsenti. 1995. Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. J. Cell Biol. 129:1311-1328.

11. Coue, M., Lombillo, V. A. & Mcintosh, J. R. 1991. Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro. J Cell Biol 112,1165-75.

12. Desai, A., and T.J. Mitchison. 1997. Microtubule polymerization dynamics. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13:83-117.

13. Dogterom M., and Yurke B. 1997. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278:856-860.

14. Erickson, H.P., and E.T. O'Brien. 1992. Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:145-166.

15. Fygenson, D.K., E. Braun, and A. Libchaber. 1994. Phase diagram of microtubules. Phys Rev E. 50:1579-1588.

16. Gelles, J., B.J. Schnapp, and M.P. Sheetz. 1988. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331(6155):450-453.

17. Gildersleeve, R.F., A.R. Cross, K.E. Cullen, A.P. Fagen, and R.C. Williams Jr. 1992. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. J. Biol. Chem. 267:7995-8006.

18. Grishchuk E.L., Molodtsov M.I., Mcintosh J.R., and Ataullakhanov F.I. Force production by disassembling microtubules. 2005. Nature. 438:384-388.

19. Hirose, K., J. Fan, and L.A. Amos. 1995. Re-examination of the polarity of microtubules and sheets decorated with kinesin motor domain. J Mol Biol. 251:329-333.

20. Hill, T. 1985. Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. Proc. Natl. Acad. Sci. 82,4404-4408.

21. Hill, T.L., and M.W. Kirschner. 1982. Bioenergetics and kinetics of microtubule and actin filament assembly-disassembly. Int. Rev. Cytol. 78:1125.

22. Hill, T.L., and Y. Chen. 1984. Phase changes at the end of a microtubule with a GTP cap. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:5772-5776.

23. Horio Т., and Hotani H. 1986. Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy. Nature. 321:605-607.

24. Howard, J. 2001. Mechanics of motor proteins and the cytoskeleton. Sinauer Associates.

25. Hunt, A.J. and J.R. Mcintosh. 1998. The dynamic behavior of individual microtubules associated with chromosomes in vitro. Mol. Biol. Cell. 9:28572871.

26. Hyman A.A., and Mitchison T.J. , 1991. Two different microtubule-based motor activities with opposite polarities in kinetochores. Nature. 351(6323):206-211.

27. Hyman, A.A., S. Salser, D.N. Drechsel, N. Unwin, and T.J. Mitchison. 1992. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell 3:1155-1167.

28. Hyman, A.A., D. Chretien, I. Arnal, R.H. Wade. 1995. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate.J Cell Biol. 128:117-125.

29. Inoue S., Fuseler J., Salmon E.D., and Ellis G.W. 1975. Functional organization of mitotic microtubules. Physical chemistry of the in vivo equilibrium system. Biophys J. 15:725-744.

30. Inoue S., and Salmon E.D. 1995. Force generation by microtubule assembly/disassembly in mitosis and related movements. Mol Biol Cell. 6:1619-1640.

31. Janosi, I.M., D. Chretien, and H. Flyvbjerg. 1998. Modeling elastic properties of microtubule tips and walls. Eur. Biophys. J. 27:501-513.

32. Janosi, I.M., D. Chretien, and H. Flyvbjerg. 2002. Structural microtubule cap: stability, catastrophe, rescue, and third state. Biophys. J. 83:1317-1330.

33. Janson M.E, and Dogterom M. 2004a. Scaling of microtubule force-velocity curves obtained at different tubulin concentrations. Phys Rev Lett. 92:248101.

34. Janson M.E, and Dogterom M. 2004b. A bending mode analysis for growing microtubules: evidence for velocity-dependent rigidity. Biophys. J. 87:27232736.

35. Jiang, L., Y. Gao, F. Mao, Z. Liu, and L. Lai. 2002. Potential of mean force for protein-protein interaction studies. Proteins. 46:190-196.

36. Joglekar, A.P. and A.J. Hunt. 2002. A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements. Biophys. J. 83:42-58.

37. Johnson, K.A., and G.G. Borisy. 1979. Thermodynamic analysis of microtubule self-assembly in vitro. J. Mol. Biol. 133:199-216.

38. Kikkawa M., Ishikawa Т., Nakata Т., Wakabayashi Т., and Hirokawa N. 1994. Direct visualization of the microtubule lattice seam both in vitro and in vivo. J Cell Biol. 127:1965-1971.

39. Koshland D. E., Mitchison, T. J. and Kirschner M. W. 1988. Polewards chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro. Nature. 331:499-504.

40. Lehninger, A. L., Nelson, D. L. and Cox, M. M. 1993. Principles of Biochemistry (NY:Worth. 2nd ed.), p.377.

41. Li, H., D.J. DeRosier, W.V. Nicholson, E. Nogales, and K.H. Downing. 2002. Microtubule structure at 8 A resolution. Structure (Camb). 10:1317-1328 .

42. Lombillo, V. A., Stewart, R. J. and Mcintosh, J. R. 1995. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature 373,161-164.

43. Mandelkow, E.M., and E. Mandelkow. 1985. Unstained microtubules studied by cryo-electron microscopy. Substructure, supertwist and disassembly. J. Mol. Biol. 181:123-135.

44. Mandelkow, E.M., E. Mandelkow, and R.A. Milligan. 1991. Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo-electron microscopy study. J. Cell Biol. 114:977-991.

45. Martin, S.R., M.J. Schilstra, and P.M. Bayley. 1993. Dynamic instability of microtubules: Monte Carlo simulation and application to different types of microtubule lattice. Biophys. J. 65:578-596.

46. Mcintosh J.R., Grishchuk E.L., and West R.R. 2002. Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Annu Rev Cell Dev Biol.l8:193-219.

47. Mehta A.D., Pullen K.A., and J.A. Spudich. 1998. Single molecule biochemistry using optical tweezers. FEBS Lett. 430:23-27.

48. Meurer-Grob, P., J. Kasparian, and R.H. Wade. 2001. Microtubule structure at improved resolution. Biochemistry. 40:8000-8008.

49. Mitchison T.J., Evans L., Schulze E., and Kirschner M. 1986. Sites of microtubule assembly and disassembly in the mitotic spindle. Cell. 45:515527.

50. Mitchison T.J. 1989. Polewards microtubule flux in the mitotic spindle: evidence from photoactivation of fluorescence. J. Cell Biol. 109:637-652.

51. Mitchison T.J. 1993. Localization of an exchangeable GTP binding site at the plus end of microtubules. Science. 261:1044-1047.

52. Mitchison, Т., and M. Kirschner. 1984. Dynamic instability of microtubule growth Nature. 312:237-242.

53. Mogilner, A. and Oster, G. 2003. Polymer motors: pushing out the front and pulling up the back. Curr. Biol. 13:R721-R733.

54. Nicklas, B. 1983. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. J. Cell. Biol. 97:542-548.

55. Nogales, E., M. Whittaker, R.A. Milligan, and K.H. Downing. 1999. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96:79-88.

56. O'Brien, E. Т., E.D. Salmon, R.A. Walker, and H.P. Erickson. 1990. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry 29:6648-6656.

57. Odde, D.J., L. Cassimeris, and H.M. Buettner. 1995. Kinetics of microtubule catastrophe assessed by probabilistic analysis. Biophys. J. 69:796-802.

58. Panda, D., H.P. Miller, and L. Wilson. 2002. Determination of the size and chemical nature of the stabilizing "cap" at microtubule ends using modulators of polymerization dynamics. Biochemistry. 41(5):1609-1617.

59. Pedigo, S., and R.C. Williams Jr. 2002. Concentration dependence of variability in growth rates of microtubules. Biophys. J. 83:1809-1819.

60. Pfarr C.M., Coue M., Grissom P.M., Hays T.S., Porter M.E., and Mcintosh J.R. 1990. Cytoplasmic dynein is localized to kinetochores during mitosis. Nature. 345(6272):263-265.

61. Press, W.H., S.A. Teukolsky, W.T. Vetterling, and B.P. Flannery. 1992. Numerical recipes in C. 2nd edition Cambridge University Press, Cambridge

62. Sept, D., N.A. Baker, and J.A. McCammon. 2003. The physical basis of microtubule structure and stability. Protein Sci. 12:2257-2261.

63. Simon, J.R., and E.D. Salmon. 1990. The structure of microtubule ends during the elongation and shortening phases of dynamic instability examined by negative-stain electron microscopy. J. Cell Sci. 96:571-582.

64. Sheetz, M. 1998. Laser tweezers in cell biology. Vol. 55. San Diego: Academic Press.

65. Svoboda, K. and S.M. Block. 1994. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77:773-784.

66. Tao, Y. C. and Peskin, C. S. 1998. Simulating the role of microtubules in depolymerization-driven transport: a Monte Carlo approach. Biophys J. 75:1529-1540.

67. Tran, P.T., P. Joshi, and E.D. Salmon. 1997a. How tubulin subunits are lost from the shortening ends of microtubules. J. Struct. Biol. 118:107-118.

68. Tran, P.T., R.A. Walker, and E.D. Salmon. 1997b. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138:105-117.

69. VanBuren, V., D.J. Odde, and L. Cassimeris. 2002. Estimates of lateral and longitudinal bond energies within the microtubule lattice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:6035-6040.

70. VanBuren, V., L. Cassimeris, and D.J. Odde. 2005. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89(5):2911-2926.

71. Visscher, K., and S.M. Block. 1998. Versatile optical traps with feedback control. Methods Enzymol. 298:460-89.

72. Voter, W.A., E.T. O'Brien, and H.P. Erickson. 1991. Dilution-induced disassembly of microtubules: relation to dynamic instability and the GTP cap. Cell Motil. Cytoskeleton. 18:55-62.

73. Walker, R.A., S. Inoue, and E.D. Salmon. 1989. Asymmetric behavior of severed microtubule ends after ultraviolet-microbeam irradiation of individual microtubules in vitro. J Cell Biol. 108(3):931-937.

74. Walker, R.A., N.K. Pryer, and E.D. Salmon. 1991. Dilution of individual microtubules observed in real time in vitro: evidence that cap size is small and independent of elongation rate. J. Cell Biol. 114:73-81.

75. Wang, M.D., Yin H., Landick R., Gelles J., and S.M. Block. 1997. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72(3):1335-1346.

76. Weingarten M.D., Lockwood A.H., Hwo S.Y., and M.W. Kirschner. 1975. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 72:1858-1862.

77. Weisenberg, R.C. 1972. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177:1104-1105.