Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма распознавания в клетках растений мРНК с преждевременным стоп-кодоном

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма распознавания в клетках растений мРНК с преждевременным стоп-кодоном"

На правах рукописи

ШВАРЦ Антон Маркович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА РАСПОЗНАВАНИЯ В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ МРНК С ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫМ СТОП-КОДОНОМ

03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008 ООЗ168948

003168948

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель

кандидат биологических наук Скулачев Максим Владимирович

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Шатский Иван Николаевич

доктор биологических наук Соловьев Андрей Геннадьевич

Ведущая организация Институт общей генетики РАН

Защита состоится " t-"3t-*- 2008 г в_на заседании совета Д 501 001 76 по

защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им АН Белозерского, лабораторный корпус "А", ауд 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им M В Ломоносова

О

Автореферат разослан "_" апреля 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

(V^

Крашенинников И А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Разрушение РНК, индуцируемое нонсенс-код он ом (nonsense mediated decay, NMD) - это специфический механизм уничтожения аберрантных мРНК (несущих преждевременный стоп-кодон, ПСК), образующихся в результате нарушений в структуре генов или ошибок в процессе созревания мРНК Уничтожение аберрантных мРНК позволяет предотвратить образование укороченных пептидов, которые могут, например, необратимо связывать субстрат, или, напротив, обладают нерегулируемой ферментативной активностью Также было показано важное значение механизма NMD в дестабилизации определённых продуктов альтернативного сплайсинга ряда генов Для человека обнаружен ряд генетических заболеваний, связанных с мутациями, приводящими к образованию предварительных стоп-кодонов

Механизм NMD наиболее подробно изучен на млекопитающих и дрожжах Данный механизм функционирует на первом, так называемом пионерском, раунде трансляции, и требует наличия определённых белков, связавшихся с мРНК в ядре Основной принцип реализации механизма NMD у дрожжей и млекопитающих одинаков определение корректности расположения стоп-кодона при помощи специфических мотивов в мРНК, которые взаимодействуют со специализированными белковыми комплексами Такие области мРНК можно обозначить термином "маркеры естественной кодирующей области" (natural ORF markers, NOMs) Если происходит предварительная терминация синтеза белка, аппарат трансляции оказывается неспособен удалить с матрицы все белковые комплексы, связанные с NOM Такие мРНК распознаются механизмом NMD как аберрантные и подвергаются деградации

Механизм NMD у растений в настоящий момент остается слабо изученным Показано, что возникновение нонсенс-мутаций и сдвиг рамки считывания

приводит к существенному снижению уровня накопления соответствующей мРНК Это было продемонстрировано в экспериментах с генами ингибитора трипсина (Kti3) сои, фитогемагглютинина (РНА) бобов, ферредоксина-1 (Fed-1) табака и геном waxy риса

В настоящей работе проводилось изучение особенностей функционирования NMD в растениях В частности, особое внимание уделено изучению особенностей мРНК, распознаваемых механизмами «контроля качества» растительной клетки

Цели исследования

1 Разработка модели изучения механизмов NMD у растений

2 Исследование механизмов распознавания ПСК, проверка гипотезы о существовании маркеров рамки считывания, распознаваемых механизмом NMD у растений

3 Исследование взаимосвязи механизмов NMD и «умолкания» генов (УГ) у растений

Научная новизна и практическая значимость работы

В клетках растений аберрантные мРНК, синтезированная в ядре, подвергается

NMD Показано, что этот механизм распознает ПСК не зависимо от

нуклеотидной последовательности мРНК Установлено специфическое

разрушение мРНК имеющей 3' некодирующую область (З'НТО) длиной более

300 нт Показано, что распознавание ПСК определяется его удаленностью от

поли-А блока мРНК Введение дополнительной поли-А последовательности

существенно стабилизирует аберрантные мРНК Синтезированные в цитоплазме

субгеномные мРНК вирусов растений не подвергаются NMD Получены данные

о том, что поли-А связывающий белок (poly-A binding protein, РАВР) участвует

в распознавании ПСК Химерный белок, состоящий из РАВР N benthamiana и

белка оболочки фага MS2 стабилизирует аберрантую мРНК Не выявлено

участия УГ в специфической деградации аберрантых мРНК у растений

Практическая значимость работы заключается в оптимизации дизайна мРНК

целевых белков при их экспрессии в растениях

2

Апробация работы Диссертация была апробирована на заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ 25 января 2008 года Материалы работы докладывались на международных конференциях

1 XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», 2005, Москва

2 Международная школа-конференция молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», 2005, Москва

3 Четвертый международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития » , 2007, Москва

4 XV FESPB Congress "Plant, People, Ecosystems and Applications", 2006, Lyon, France

5 EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control (Partnered with Cold Spring Harbor Laboratories), 2007, Heidelberg, Germany

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка работ, опубликованных по теме диссертации

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Чужеродные «нонсенс-РНК» деградируют в растительной клетке по механизму NMD.

На первом этапе работы создана экспериментальная система тестирования NMD в растениях. Для транзиентной (временной) экспрессии модельных мРНК в растениях использовался метод агроинъекций. Были получены три конструкции на основе зеленого флюоресцентного белка (GFP) (рис. 1) -Stop711, Stop360 и Stopl5, где в ген GFP был введен предварительный стоп-кодон за 711, 360 и 15 нуклеотидов до природного стоп-кодона соответственно, т.е. ПСК являлся 3-м, 119-м и 234-м триплетом гена GFP.

В том случае, если и чужеродные, и эндогенные «нонсенс»-РНК (т.е. РНК, несущие ПСК) распознаются растениями по общему механизму, РНК Stop 15 должна накапливаться с той же эффективностью, как и контрольная РНК GFP, в то время как РНК Stop711 и Stop360 будут уничтожены механизмом NMD.

Л

GFP ! 35S Stopl5

GFP

к

Ъ нт

35Sy

GFP

360 нт

Stop360 i 35S

GFP

J\ 6 нт

711 нт

Stop360; 35S )

GFP

Рис.1.Схемы генетических конструкций, используемых в эксперименте. Обозначения 35S и term -соответствуют 35S-np0M0T0py и терминатору CaMV. Показано расстояние (в нт) между IICK и природным стоп-кодоном GFP обозначено для конструкций Stop360, Stopl5, Stop711.

В эксперименте, результаты которого приведены на рис. 2, накопление РНК, несущей ПСК за 300 нт до природного стоп-кодона, было крайне низким, а РНК с ПСК в 15 нт перед природным терминатором накапливалась в той же степени, что контрольная мРНК. Присутствие ПСК в непосредственной близости от стартового кодона (Stop711) приводило к дестабилизации РНК, но в существенно меньшей степени, чем в случае Stop360. Подобная картина наблюдалась и при введении дополнительных стоп-кодонов в растительный ген. Результаты этого эксперимента указывают на то, что растительная клетка использует сходные механизмы для распознавания как собственных, так и чужеродных РНК с ПСК. Эти результаты противоречат предположению о существовании специфических растительных NOM (поскольку присутствие таких NOM в последовательности гена белка медузы маловероятно).

Рис.2. Накопление мРНК, содержащих ПСК, в агроинъецированных листьях. Нозерн-блот анализ РНК, выделенной из листьев N. benthamiana, агроинъецированных конструкциями Рис. 1. мРНК гибридизовали комплементарным к GFP ДНК-зондом, меченным [a-32P]dATP. На нижней панели приведен контроль нанесения - рРНК, окрашенная метиленовым синим.

Для дрожжей и животных было показано, что в некоторых случаях NMD может быть индуцирован лишь удлинением З'-НТО, т.е. в случаях, когда терминация трансляции происходит «вдали» от 3'-конца мРНК. Предполагается, что сигналом к дестабилизации РНК служит сам факт

GFP-PHK

■ ф# Шф ^^

Контроль нанесения

превышения определенного расстояния между сайтом терминации трансляции и поли-А «хвостом» РНК. В этом случае, очевидно, нет надобности в использовании специфических NOM. Можно предположить, что для распознавания ПСК растения используют подобный механизм. Эта гипотеза была проверена в следующем эксперименте.

мРНК с длинными З'-НТО накапливаются с низкой эффективностью и редко встречаются в растительных клетках.

Для увеличения расстояния между стоп-кодоном и 3'-концом мРНК мы искусственно удлинили З'-НТО в конструкции 358-ОРР. Для этого после стоп-кодона гена ОРР (рис. 3) были клонированы различные фрагменты ДНК в прямой или обратной ориентации.

35S-GFP-X

л

ТАА

35S }

-I/

GFP(

MZilL

ШЙШЙ

Рис.3. Общая схема конструкций на основе GFP, имеющих З'-НТО разной длины

Далее осуществлялась транзиентная экспрессия полученных модельных конструкций в листьях N. ЪепЛштапа при помощи агроинъекции. Уровень накопления мРНК, обеспечиваемый каждой из них, сравнивался с таковым контрольной конструкции 358-ОРР (обозначаемой 358-СРР-40, так как соответствующая мРНК содержит 40-нт З'-НТО) при помощи нозерн-блот гибридизации. Относительные уровни накопления вычислялись как минимум по трем экспериментам при помоши денситометрии нозерн-блотов (в каждом случае количество РНК, продуцируемое конструкцией 358-СРР-40, принималось за 100%). Результаты, приведенные на рис. 4, демонстрируют, что увеличение З'-НТО более чем на 300 нт, приводило к слабому накоплению соответствующих РНК вне зависимости от последовательности участка, удлиняющего З'-НТО.

120.00 -i 35S-GFP-40

100.00 -

« £ 80 00 --в-% "в° i 60.00 -к I g а

£ § 40.00 J

о S ё 2 Я 20 00 ^

......г.

GFP-180a GFP-180b

GFP-34Qa Ч GFP-340b

FP-380

GFP-720

GFP-1010

...............?

/

0 00

0 200 400 600 800 Длина З'-НТО

1000 1200

Рис.4. Зависимость накопления мРНК GFP от длины ее З'-НТО Количество РНК было оценено денситометрией зон на Нозерн-блоте, детектированных гибридизацией с зондом к GFP Количество РНК в случае GFP-40 было принято за 100% Цифры в названиях конструкций обозначают длину участка, расположенного между стоп-кодоном GFP и сигналом полиаденилирования Каждая точка графика соответствует среднему значению по результатам не менее трех независимых экспериментов

Если полученные результаты отражают некий общий принцип жизненного цикла мРНК в растениях, то можно предположить, что растительные РНК с длинной З'-НТО нестабильны В таком случае, РНК с протяженной З'-НТО должны встречаться у растений существенно реже, чем у дрожжей или животных

Чтобы проверить это предположение, мы проанализировали базы данных GeneBank и UTResource (http //bighost area ba cnr it/BIG/UTRHome) Результаты приведены на диаграмме (рис 5)

З'-НТО длина, нт

Рис.5. Анализ базы данных GeneBank Каждая точка на графике соответствует проценту мРНК млекопитающих (треугольники) или растений (точки), имеющих З'-НТО длиннее, чем значение, указанное на оси абсцисс

Компьютерный анализ 78398 мРНК растений и 95173 мРНК млекопитающих однозначно свидетельствует, что растения избегают длинных З'-НТО (каждая точка диаграммы отражает процент мРНК, З'-НТО которых превышает число, приведенное по оси X, рис 5) Те же результаты дал аналогичный анализ, проведенный для РНК с экспериментально определенными З'-НТО (приблизительно по 3000 растительных и животных РНК) (данные не представлены)

Таким образом, и экспериментальные данные, и результаты компьютерного анализа подтверждают, что длина З'-НТО играет значительную роль в определении времени жизни растительных мРНК

РНК с протяженной З'-НТО, возможно, подвержены NMD Приведенные выше результаты показывают, что РНК с длинной З'-НТО нестабильны и редки

в растительной клетке Мы предполагаем, что данный феномен связан с тем, что такие РНК распознаются растительной клеткой как «нонсенс» РНК и подвергаются NMD Однако эти данные могут также объясняться неэффективной транскрипцией модельных конструкций Это предположение было проверено в следующем эксперименте

Действительно, удлинение З'-НТО РНК неизбежно ведет к увеличению общего размера РНК, что, в свою очередь, может уменьшать эффективность транскрипции Конструкция 35S-GFP-720, использованная в предыдущем опыте (рис 3), была получена клонированием гена красного флюоресцентного белка (mRFP) после гена GFP Эта конструкция может быть также обозначена 35S-GFP-RFP (рис 6) Чтобы получить соответствующую контрольную конструкцию (т е мРНК той же длины, но полностью транслируемую), стоп-кодон GFP был удален В результате образовалась единая рамка считывания слитого белка GFPRFP (конструкция 35S-GFPRFPf, рис 6)

ТАА

ТЕ

35S-GFP-RFP 35S > GFP(

it)

RFPr

¡н -.¿..д-..

35S-GFPRFPf

35S > GFP(

■Ш.

it)

'п ,-п.».и-,'

term*

Рис.6 Схема конструкций Зачеркнутые буквы ТАА в конструкции ЗбЗ-СКРЮТГ указывают на то, что стоп-кодон ОРР изменен таким образом, что формируется единая открытая рамка считывания

Нозерн-бяот анализ показал (рис 7), что при агроинъекции в листья N ЬеМкапиапа контрольная РНК ОБРЮ^ экспрессировалась существенно эффективнее, чем ОБР-ЮТ. Этот результат указывает на то, что само по себе удлинение РНК йРР на 680 нт не ведет к существенному подавлению транскрипции, а за слабое накопление РНК ОРР-ИРР ответственен стоп-кодон в середине этой РНК

СРР-РНК

Контроль нанесения

Рис.7. Нозерн-блот анализ РНК. Детещия мРНК осуществлялась комплементарным к вРР ДНК-зондом, меченным [а-32Р]<1АТР. На нижней панели приведен контроль нанесения - рРНК, окрашенная метиленовым синим.

Необходимо отметить важное различие экспериментов с ОРР, несущим ПСК (рис.1,2) и йРР с длинной З'-НТО (рис. 3,4). В то время как в первом случае нестабильные РНК с ПСК могут рассматриваться как «нонсенс» РНК, в последующих опытах удлинение З'НТО приводило к деградации мРНК, несущей естественный терминатор вРР. Поскольку в этом случае формально преждевременной трансляции не происходило, нельзя исключить, что за дестабилизацию РНК, несущих ПСК, и РНК с длиной З'-НТО в растительной клетке отвечают разные механизмы. Наши опыты демонстрируют, что существует зависимость между эффективностью накопления мРНК и расстоянием от стоп-кодона до 3'-конца мРНК. Как в случае ПСК, так и в случае природного стоп-кодона РНК с З'-НТО протяженностью более 300 нт накапливались крайне слабо. Также необходимо отметить, что стоп-кодон гена ОРР в конструкции 358-ОРР-КРР может рассматриваться как ПСК в едином гене СРРЛРРГ.

Деградация РНК с протяженной З'-НТО, как и деградация «нонсенс» РНК, зависит от ее трансляции.

Распознавание «нонсенс» РНК и NMD у всех эукариот (включая растения) строго зависимо от трансляции Мы проверили, может ли быть предотвращена дестабилизация мРНК с длинной З'-НТО блокированием трансляции этой мРНК

Для этого перед геном GFP в GFP-RFP была введена «шпилька», содержащая GC-богатый инвертированный повтор (рис 8) Известно, что такая последовательность на 5'-конце полностью блокирует трансляцию мРНК in vitro

35S-GFP-RFP 35S-hGFP-RFP

35S) GFP( it)

С

35S У GFP(

ТАА

Рис 8. Схема конструкций Показан инвертированный повтор, образующий стабильную вторичную структуру в РНК

Все конструкции вводили в клетки листьев N Ьешкатшпа методом агроинъекции Накопление соответствующих РНК было определено при помощи нозерн-блот анализа (рис 9) Было обнаружено, что нетранслируемая РНК ЬОРР-ЯБР накапливалась с эффективностью, сравнимой с контрольной РНК ОРГШ^, и существенно эффективнее, чем РНК ОРР-ЯРР Таким образом, блокирование трансляции РНК ОРР-КРР (содержащей длинную З'-НТО) предотвратило ее дестабилизацию Следовательно, деградация растительных мРНК с протяженной З'-НТО сопряжена с трансляцией

Контроль нанесения

Нозерн-блот Ahth-GFP-зонд

Рис.9. Нозерн-блот анализ РНК, выделенной из листьев N. ЬепЛат^апа, агроинъецированных ЗбЗ-ЬОРР-ЮТ, 358-ОРР-ЯРР и 358-СРР. Детекция мРНК осуществлялась комплементарным к ОРР ДНК-зондом, меченным [а-32Р]с1АТР. Контроль нанесения приведен на нижней панели. Положение РНК йРР-КРР и йРР обозначено стрелками.

Вирусные субгеномные мРНК с протяженной З'-НТО не подвержены NMD в растительной клетке.

Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что РНК с длинной З'-НТО (в том числе и полицистронные РНК) накапливаются в растительной клетке с низкой эффективностью. Этому выводу, очевидно, противоречит факт широкого распространения полицистронных мРНК среди вирусов растений. Видимо, РНК вирусов растений (по крайней мере, цитоплазматических РНК-вирусов) не подвержены деградации, несмотря на присутствие длинной З'-НТО.

Для изучения этого явления мы проверили возможность продукции вирусом мРНК GFP-RFP, которая в случае синтеза под контролем 35S промотора накапливается с низкой эффективностью, как было показано выше. На основе генома Х-вируса картофеля (PVX) были сделаны две модельных конструкции. Жизненный цикл PVX проходит исключительно в цитоплазме. Его геном представлен единственной молекулой (+) РНК, содержащей гены РНК-зависимой РНК-плимеразы (RdRp), три гена транспортных белков, имеющих размеры 25 кДа, 12 кДа, 8 кДа, отвечающих за распространение вируса, а также

ген 25 кДа белка оболочки. Белки 25 кДа, 12 кДа и белок оболочки синтезируются при помощи соответствующих субгеномных РНК (сгРНК).

25К сг пром

А. РУХсИ-СЕР-тЮТ

25К сг пром

в. РУХсП-СРТтШ'Р (Лшоп) Ро1утегаве {

А В

I р(А) Р(А)

Рис.10. Эффективная экспрессия бидистройных конструкций при помощи вектора на основе репликона РНК-содержащего вируса. Схемы векторов: 25К сг пром - промотор субгеномной РНК гена белка 25К, стрелками обозначено направление синтеза сгРНК. Получено два варианта вектора: А.РУХШ-СтРР-тКРР, несущий бицистройную «кассету», вставленную под контроль сг промотора, и В. РУХД-ОРРтКРРСйЫоп), содержащий ген слитого белка. Нозерн-блот анализ РНК. Детекция мРНК осуществлялась комплементарным к ОРР ДНК-зондом, меченным [а-32Р]с1АТР. Положение сгРНК ОРР-ЯРР обозначено стрелкой.

Кассеты СтРР-ЙРР и ОРРЮТГ были клонированы в вектор-репликон РУХск на основе РУХ, содержащий ген КсШр и единственный субгеномный промотор, позволяющий синтезировать сгРНК (рис. 10). РНК векторов РУХЛ-ОРР-тКРР и РУХД-ОРРтЮТ^изюп), эффективно реплицировалась в цитоплазме зараженной клетки с образованием сгРНК, практически идентичные РНК вРР-Р!РР и ОРРЯРРГ, синтезируемым в ядре в предыдущих экспериментах по агроинъекции.

Нозерн-блот анализ показал, что эффективность накопления обеих сгРНК была одинаковой (рис. 10). Следовательно, в отличие от РНК, образующихся в

ядре, РНК, с протяженной З'-НТО, синтезированная в цитоплазме, не распознается как аберрантная

Данный эффект можно объяснить допустив, что общая схема реализации NMD у растений и млекопитающих одинакова, т е распознавание РНК с ПСК происходит на особом этапе жизненного цикла РНК - пионерском раунде трансляции и требует наличие белков, связывающихся с мРНК в ядре

В растениях, распознавание ПСК определяется его отдаленностью от поли-А хвоста мРНК.

В этой части работы мы исследовали вопрос, какое расстояние критично для определения ПТС расстояние до поли-А хвоста или расстояние до физического З'-конца молекулы'' Для этого мы сделали 2 конструкции в гене ОБР конструкций ЭЮрЗбО и 81ор15 нуклеотиды с 366 по 426 были заменены на аденины (Рис 11) Таким образом, после ПСК конструкции БЮрЗбО был внесен протяжённый поли-А-участок

360 нт

Stop360 рА

35S

Stopl5 рА 35S

Рис.11. Схемы конструкций Расстояние (в нт) между ПСК и природным стоп-кодоном ОБР обозначено для конструкций БЮрЗбО рА и Б1ор15 рА Зеленым прямоугольником обозначена область, где 60 нуклеотидов гена вРР заменены на аденины

Было показано, что конструкция, содержащая ПСК, после которого располагается поли-А последовательность, накапливается существенно эффективнее аналогичной конструкции, не содержащей внутренней поли-А последовательности

GFP-PHK

Контроль нанесения

Рис.12. Нозерн-блот анализ РНК. выделенной из листьев N. benthamiana, агроинъецированных этими конструкциями. Детекция мРНК осуществлялась комплементарным к GFP ДНК-зондом, меченным [a-32P]dATP. Контроль нанесения приведен на нижней панели.

Уровень накопления РНК с данной конструкции практически неотличим от уровня накопления РНК, не содержащей ПСК (Рис. 12) Таким образом, подтверждается предположение, что детерминация ПСК у растений зависит от его удаленности от поли-А блока.

Поли-А связывающий белок (РАВР) участвует в распознавании ПСК.

В предыдущем эксперименте было показано, что приближение поли-А последовательности к ПСК стабилизирует аберрантую мРНК. В данной работе была произведена попытка определить, вызван ли данный эффект прямым взаимодействием аппарата NMD и поли-А, либо опосредован определёнными белок-белковыми взаимодействиями. Основным белком, связанным с поли-А

последовательностями мРНК является поли-А связывающий белок (poly-A binding protein, РАВР). Для того чтобы выявить роль РАВР, создана следующая экспериментштьная система. Ген белка РАВР из N. benthamiana объединили в одну рамку с геном белка оболочки фага MS2 в конструкции 35S-CP(MS2)PABPf. Известно, что белок оболочки фага MS2 способен связываться с определённой 19-нт шпилечной структурой в РНК фага MS2. Эта структура была поставлена через 6 нт после стоп- кодона в конструкции 35S- GFP-RPP (Рис 13). Поскольку с поли-А последовательностью, как правило, связаны несколько молекул РАВР, была создана конструкция с несколькими шпильками, идущими подряд (Рис 13). Для контроля были созданы аналогичные конструкции, несущие инвертированные последовательности шпилек: такие последовательности способны к образованию вторичной структуры, но не связывают белок оболочки MS2 (Рис 13).

A 35S-GFP-h(MS2)-RFP ; 35S

В 35S-GFP-4Xh(MS2)-RFP 35S ) GFP(.it)

С 35S-GFP-ash(MS2)-RFP j 35S D 35S-GFP-4Xash(MS2)-RFPI 35s) GFP(jit)

Рис 13. Схема конструкций. Показан инвертированный повтор, образующий стабильную вторичную структуру в РНК, способный (на схеме направленный вверх) или не способный (на схеме направленный вниз) связываться с белком оболочки фага MS2.

В листья N'.Ъепгкампапа вводили суспензию агробактерий, содержащих конструкции 358-ОРР-11(М82)-КРР, 358-ОРР-4ХЪ(М82)-11РР, 358-СРР-азЬ(М82)-11РР, и 358-СРР-4Хаз11(М82)-КРР. Каждая из агробактерий, содержащих эти конструкции, инфильтрировалась в 2 вариантах: (а) в сочетании с агробактерией, содержащей конструкцию 358-СР(М82)РАВРГ,

16

несущей 358 промотор, слитый ген белка оболочки фага МБ2 и РАВР, и 35Э терминатор; и (б) в сочетании с агробактерией, содержащей конструкцию 358-СР(М82), которая включает в себя 358 промотор, ген белка оболочки фага МБ2 и 355 терминатор.

Мы получили результаты, свидетельствующие о том, что связывание РАВР после ПСК повышает стабильность конструкций 358-ОРР-Ь(М82)-КРР и 358-ОРР-4ХЬ(М82)-КР'Р (Рис 14). С другой стороны присоединение белка оболочки фага МБ2 к мРНК конструкций 358-ОРР-Ь(М82)-КРР и 358-ОРР-4ХЬ(М52)-ЯРР не повлияли на стабильность этих матриц (Рис 14). Наличие в клетке белка СР(М82)-РАВР также не повышало стабильность мРНК 358-ОРР-азЬ(М82)-ЯРР, сходной по строению с мРНК 358-СРР-И(М32)-КРР, но не способной связывать этот химерный белок вблизи стоп-кодона (Рис 14).

353-СР(М Э2)Р АВ Р ^изе) 358-СР(М32) 35$-СР(М32)-РАВР(Ги5е)

Рис 14. Нозерн-блот анализ РНК, выделенной из листьев N. ЬепЛатгапа, агроинъецированных конструкциями А 358-ОРР-11(М82)-КРР, В 358-ОРР-4ХЬ(М82> ЮТ, С 358-ОРР-аз11(М82)-КРР и Б 358-ОРР-4ХазЬ(М82)-ЯРР в сочетании с конструкциями 358-СР(М82)-РАВР(йд5е) и 358-СР(М82). Детекция мРНК осуществлялась комплементарным к ОРР ДНК-зондом, меченньм [а-32Р](1АТР. Контроль нанесения приведен на нижней панели. Под ней приведено соотношение количества РНК, содержащей последовательность вРР к рРРГК, нормированное на соотношение, рассчитанное для конструкции 358-ОРР-аз11(М82)-КРР.

Стабильность всех 4 РНК, в отсутствии белка СР(М82)-РАВР была примерно одинакова и сходна со стабильностью конструкции 358-ОРР-ЯРР (данные не представлены).

А ВС А ВС д В С О

«й «¡р СгР-РНК

Таким образом, можно утверждать, что связывание РАВР после стоп-кодона повышает стабильность мРНК, содержащих ПСК Этот эксперимент подтверждает предположение о том, что детерминация ПСК зависит от его удаленности от поли-А блока мРНК По всей видимости, такой механизм является общим для растений и грибов На это указывают недавние данные на дрожжах, где связывание аналогичного химерного белка после ПСК приводило к стабилизации мРНК

Не выявлено участия УГ в специфической деградации аберрантных мРНК у растений.

Белок томбусвирусов р19, связывающий siPHK не влияет на процесс специфической деградации аберрантных мРНК в растениях

Наиболее хорошо описанным механизмом деградации мРНК у растений -является механизм РНК-интерференции и связанный с ней механизм умолкания генов - gene silencing (УГ) Ранее были получены данные, свидетельствующие о взаимодействии механизмов NMD и РНК-интерференции у растений Кроме того, были получены данные, свидетельствующие об участии механизмов УГ в специфической деградации аберрантных мРНК у круглых червей

Для проверки участия механизма РНК-интерференции в деградации аберрантных мРНК в растениях мы произвели коинфильтрацию агробактерий содержащих конструкции 35S-GFP и 35S-GFP-RFP с агробактерией, содержащей ген белка р19 томбусвируса, под контролем 35S промотора Данный белок является сильным ингибитором УГ Его основное действие заключается в связывании коротких интерферирующих РНК (siPHK), играющих ключевую роль в активации деградации мРНК по механизму РНК-интерференции

врр

вРР+рЧЭ

вРР+р19

вРР-КРР

СРР^РР+рТЭ

СРР-ЯРР

ерр-ирр+ртэ

Рис 15. Свечение ОРР в УФ свете. Слева фотография без использования фильтра, справа с использование фильтра, позволяющего регистрировать слабое свечение. Лист N. Ьеп1кат1апа, агроинъецированных конструкциями 355-ОРР и 358-ОРР-КРР с «пустым» бинарным вектором и с вектором, несущим ген белка р19 томбусвируса.

На рисунке 15 видно, что р19 усиливает экспрессию обоих конструкций, однако не изменяет соотношения экспрессии межу конструкцией, обладающей коротким З'НТО (около 40 нг) и конструкцией, обладающей длиной З'НТО (около 720нт), то есть несущей ПСК. Таким образом, белок р 19 не оказывает влияния на специфическую дискриминацию мРНК, которые распознаются как аберрантные.

Деградация аберрантных мРНК не связана с образованием $1РНК.

Отсутствие влияния р19 на процесс деградации аберрантных матриц ещё не доказывает, что данный процесс не связан с механизмом РНК-интерференции. Возможно, деградация в данном случае осуществляется через короткие молекулы РНК, не связываемые белком р19.

Листья Ы.ЬепШагшапа были инфильтрированы суспензиями агробактерий, содержащими конструкции 358-ОРР, 358-ОРР-11РР и 358-ОРРЯРРГ.

Из зон инфильтрации были выделены фракции коротких РНК. Количество коротких РНК, содержащих участки трансгеных матриц было определенно с помощью Нозерн-блота, с использованием зонда на ген ОБР.

Контроль нанесения —►

19-25 нт РНК

Рис.16. Нозерн-блот анализ коротких РНК, выделенной из листьев N.benthamiana, агроинъецированных этими конструкциями. Детекцию мРНК проводили гибридизацией комплементарным к GFP ДНК-зондом, меченным [a-32P]dATP. Контроль нанесения приведен на нижней панели.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что деградация мРНК, обладающая стоп-код оном, отдалённым от 3'-конца матрицы, не приводит к увеличению количества коротких РНК (Рис 16). Механизм деградации аберрантных мРНК в растениях не связан с образованием малых интерферирующих РНК.

ВЫВОДЫ

1. Аберрантные мРНК, синтезированные в ядре клеток растений, подвергаются NMD. Этот механизм распознает ПСК не зависимо от нуклеотидной последовательности мРНК. Установлено специфическое разрушение мРНК имеющей З'НТО длиной более 300 нт.

2. Распознавание ПСК определяется его удаленностью от поли-А блока мРНК. Введение дополнительной яоли-А последовательности существенно стабилизирует аберрантные мРНК.

3. Синтезированные в цитоплазме субгеномные мРНК вирусов растений не подвергаются NMD.

4 Поли-А связывающий белок (РАВР) участвует в распознавании ПСК Химерный белок, состоящий из РАВР Nbenthamiana и белка оболочки фага MS2 может стабилизировать аберрантную мРНК

5 Не выявлено участия УГ в специфической деградации аберрантных мРНК у растений

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Комарова ТВ, Скулачев MB, Зверева АС, Шварц AM, Дорохов ЮЛ, Атабеков ИГ (2006) Новый вирус-вектор для эффективной продукции целевых белков в растениях Биохимия 71,1043 -1049

2 Шварц А М , Комарова Т В , Скулачев М В, Зверева А С , Дорохов Ю Л и Атабеков ИГ (2006) Стабильность мРНК в растениях зависит от длины 3'-нетранслируемойобласти БиохимияН, 1377-1384

3 Шварц AM, Скулачев MB (2006) Проблемы экспрессии бицистронных конструкций в растениях XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», Москва, 253

4 Шварц AM, Комарова ТВ Дестабилизация мРНК, обладающих длинной З'нетранслируемой областью, в растения Значение в фитобиотехнолопш Четвертый международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развитая », 2007, Москва, 237-238

5 Komarova Т V, Skulachev М V, Zvereva A S, Schwartz А М, Dorokhov Yu L, Atabekov J G (2006) New virus-vector for efficient production of target proteins in plants International symposium "Biosafety Issues m Implementation of GMOs New Research Approaches, Regulation and Public Perception", Yalta, May 10-14, p 21

6 Komarova T V, Schwartz A M, Zvereva A S, Dorokhov Yu L, Atabekov J G, Skulachev M V (2006) Recognition of nonsense RNA m plants XV FESPB Congress "Plant, People, Ecosystems and Applications", Lyon, France, July 17-21, p 108

7 Skulachev M V, Komarova T V, Schwartz A M, Zvereva A.S , Skulachev К V, Dorokhov YuL, Atabekov JG. (2006) Internal termination of translation causes nonsense-mediated decay of mRNA m plants The 8th International Engelhardt

Conference on Molecular Biology "RNA-Protem Interactions", Moscow Region, Russia, August 19-24, p 32

8 Komarova T V, Schwartz A M, Dorokhov Yu L, Atabekov J G, Skulachev M V (2007) mRNA poly(A)-tail is involved in recognition of nonsense RNAs m plants EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control (Partnered with Cold Spnng Harbor Laboratories), Heidelberg, Germany, September 12-16, p 172

Подписано в печать 11 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 264 Тираж ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шварц, Антон Маркович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

11.1. Деградация мРНК с преждевременным стоп-кодоном.

II. 1.1. Биологическое значение механизма NMD.

II. 1.2. Механизм распознавания преждевременного стоп-кодна.

II. 1.3. Уничтожение мРНК, в которой аппарат NMD обнаружил преждевременный стоп-кодон.

11.2. ПОСТТРАНСКРИПЦИОННОЕ УМОЛКАНИЕ ГЕНОВ (Posttranscriptional genes silencing, PTGS).

II.2.2. Индуцируемый РНК комплексумолкания генов.

II. 2.3. Системное умолкание генов.

II. 2.4 РНК-зависимое подавление транскрипции.

II.2.5 Вирусные супрессоры УГ.

11.3.Взаимодействие механизмов NMD и PTGS.

III. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ.

111.1. Реактивы.

111.2. Ферменты и наборы.

111.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

111.4. Выделение и анализ плазмидной ДНК.

III.4.1. Выделение плазмидной ДНК.

III. 4.2. Электрофорез в агарозе.

III.4.3. Рестрикция. Достраивание выступающих концов ДНК.

Дефосфорилирование вектора.

III. 4.4. Лигирование ДНК.

111.5. Количественный анализ РНК из высечек листьев N. bentamiana.

III.5.1. Агроинфилътрация листьев N. bentamiana.

III. 5.2. Выделение РНК.

III. 5.3. Нозерн-блот гибридизация.

III. 5.4. Изготовление одноцепочечного ДНК зонда.

III. 5.5. Получение кДНК из РНК.

111.6. Получение генноинженерных конструкций.

III.6.1. Клонирование конструкций GFP, Stop711, Stop360 и Stop 15.

III. 6.2. Клонирование конструкций GFP-mRFP, GFPmRFPf.

III. 6.3. Клонирование конструкций GFP-X.

III. 6.4. Создание конструкции 35S-hGFP-RFP и 35S-GFP-IRES-RFP.

111.6.5. Создание конструкции PVX.GFP-RFP и PVX.GFPRFPf.

111.6.6. Клонирование конструкций Stop360рА и Stopl5рА.

III. 6.7. Создание конструкции 35S-GFP-h(MS2)-RFP, 35S-GFP-ash(MS2)~

RFP, 35S-GFP-4Xh(MS2)-RFP и 35S-GFP-4Xash(MS2)-RFP.

III.6.8. Создание конструкции 35S-CP(MS2) и 35S-CP(MS2)PABPf.

VI. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

VI. 1. Чужеродные «нонсенс-РНК» деградируют в растительной клетке по механизму NMD. мРНК с длинными З'-НТО накапливаются с низкой эффективностью и редко встречаются в растительных клетках.

VI.2. Деградация РНК с протяжённой З'-НТО, как и деградация «нонсенс»

РНК, зависит от её трансляции.

VI.3. Вирусные субгеномные мРНК с протяженной З'-НТО не подвержены

NMD в растительной клетке.

VI.4. В растениях, распознавание преждевременного стоп-кодона определяется его отдаленностью от поли-А хвоста мРНК.

VI.5. Связывание РАВР с аберрантой мРНК вблизи ПСК стабилизирует матрицу.

VI.6. Белок томбусвирусов р19, связывающий siPHK не влияет на процесс специфической деградации аберрантных мРНК в растениях.

VI.7. Деградация аберрантных мРНК не связана с образованием siPHK. .76 VI.8. Деградация мРНК, обладающих длинной З'-НТО не вызывает разрушение РНК сходной последовательности.

V. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизма распознавания в клетках растений мРНК с преждевременным стоп-кодоном"

Центральная догма молекулярной биологии декларирует, что последовательность нуклеотидов ДНК определяет последовательность нуклеотидов мРНК, которая, в свою очередь определяет последовательность аминокислот белка.Однако в процессе передачи информации по данной цепочке могут возникать ошибки. Такие ошибки приводят к образованию полипептидов, нередко вредных для клетки. Поэтому в клетке существует ряд механизмов, предотвращающих появление таких "ошибочных" молекул полипептидов.Если причиной образования такого полипептида явилась случайная ошибка трансляции, появление нескольких таких молекул не является существенным событием для клетки. Скорее всего, такая молекула будет неспособна адекватно свернуться и образовать ядро из гидрофобных участков. Такие молекулы могут обладать нестабильной третичной структурой и нести на своей поверхности гидрофобные участки, которые способствуют слипанию таких молекул. Несвернувшиеся молекулы полипептида подвергаются протеолизу в протеосомах (Gelman and Kopito, 2002).Если же ошибка произошла в процессе транскрипции или созревания мРНК, это может повлечь за собой образование значительного количества аномальных полипептидов. Для эукариот показано существование специфического механизма "контроля качества" мРНК. Прежде всего, отбор ведётся на уровне экспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Матрицы, не обладающие кэп-структурой, поли-А-терминальной последовательностью или обладающие нитронами не экспортируются в цитоплазму.После выхода из ядра, происходит своеобразная "проверка качества матрицы", которая заключается в проверке соответствия открытой рамки считывания данной мРНК определённым требованиям.Прежде всего, рамка считывания мРНК должна иметь эффективно распознаваемый аппаратом трансляции стоп-кодон. В случае отсутствия стоп-кодона, или в случае наличия в рамке только слабо распознаваемого стоп-кодона, такие мРНК подвергаются деградации (Akimitsu, 2008).В случае наличия распознаваемого рибосомой стоп-кодона, этот кодон должен занимать строго определённое место: должен находиться в конце нативной открытой рамки считывания (то есть области, кодирующей требуемый белок). Если стоп-кодон находиться в середине нативной рамки, он носит название преждевременного стоп-кодона (ПСК). Наличие ПСК свидетельствует либо о возникновении нонсенс-мутации, либо о сбое рамки трансляции. В обоих этих случаях, трансляция матрицы приводит к образованию "ошибочного" полипептида. Для предотвращения трансляции этих мРНК, существует механизм, обнаружения и элиминирования таких матриц. Он получил название нонсенс обусловленного распада (nonsensemediated decay, NMD) (Maquat et al, 1981; Peltz et al., 1993).Этот механизм хорошо изучен в животных и дрожжевых клетках.Однако мало что известно о механизме NMD у растений. Показано, что возникновение нонсенс-мутаций и сдвиг рамки считывания приводит к существенному снижению уровня накопления соответствующей мРНК. Это было продемонстрировано в экспериментах с генами ингибитора трипсина (Kti3) сои (Dickey et al., 2004) фитогемагглютинина (РНА) бобов (van Hoof and Green, 1996), ферредоксина-l (Fed-1) табака (Petracek et al., 2005) и геном waxy риса (Isshiki et al., 1996).Основной принцип реализации механизма NMD у дрожжей и млекопитающих одинаков: определение корректности расположения стопкодона связано со специфическими мотивами в мРНК, которые взаимодействуют со специализированными белковыми комплексами. Такие области мРНК можно обозначить термином "маркеры естественной кодирующей области" (natural ORF markers, NOMs). Если происходит преждевременная терминация синтеза белка, аппарат трансляции оказывается неспособен удалить с матрицы все белковые комплексы, связанные с NOM. Такие мРНК распознаются механизмом NMD как аберрантные и подвергаются деградации.В данной работе исследовался вопрос: каким образом механизм NMD растений распознаёт мРНК, содержащие ПСК и насколько от сходен с механизмом, описанным для дрожжей и млекопитающих.В последнее время появились данные о том, что механизм NMD тесно связан с механизмом умолкания генов (Gazzani et al., 2004). Поскольку механизм умолкания генов хорошо изучен для растений, установление взаимосвязи этих процессов в растениях дало бы возможность приблизиться к пониманию реализации NMD у растений. Поэтому одним из аспектов данной работы было произведено изучение роли РНК- интерференции в специфической деградации мРНК, содержащих ПТС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шварц, Антон Маркович, Москва

1. Akimitsu N./ Messenger RNA surveillance systems monitoring propertranslation termination // J Biochem. - 2008. - 1: Vol. 143. - P. 1-8.

2. Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A. M., and Carrington, J. C. / microRNAdirected phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants // Cell. - 2005. - 2: Vol. 121.-P. 207-221.

3. Amrani, N., Dong, S., He, F., Ganesan, R., Ghosh, S., Kervestin, S., Li, C,Mangus, D. A., Spatrick, P., and Jacobson, A. / Aberrant termination triggers nonsense-mediated mRNA decay // Biochem Soc Trans. - 2006. - Pt 1: Vol. 34. P. 39-42.

4. Amrani, N., Ganesan, R., Kervestin, S., Mangus, D. A., Ghosh, S., andJacobson, A. /A faux З'-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsensemediated mRNA decay // Nature. - 2004. - 7013: Vol. 432. - P. 112-118.

5. Atkin, A. L., Schenkman, L. R., Eastham, M., Dahlseid, J. N., Lelivelt, M.J., and Culbertson, M. R. / Relationship between yeast polyribosomes and Upf proteins required for nonsense mRNA decay // J Biol Chem. - 1997. - 35: Vol. 272. -P. 22163-22172.

6. Baumberger, N., and Baulcombe, D. C. / Arabidopsis ARGONAUTE1 is anRNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs // Pro с Natl Acad Sci U S A . - 2005. - 33: Vol. 102. - P. 11928-11933.

7. Belostotsky, D. / mRNA turnover meets RNA interference // Mol Cell.2004. - 4: Vol. 16. - P. 498-500.

8. Berget, S. M. / Exon recognition in vertebrate splicing // J Biol Chem.1995. - 6: Vol. 270. - P. 2411-244.

9. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. / Role fora bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature. 2001. - 6818: Vol. 409. - P. 363-366.

10. Blencowe, B. J., Issner, R., Nickerson, J. A., and Sharp, P. A. / A coactivatorof pre-mRNA splicing // Genes Dev. - 1998. - 7: Vol. 12. - P. 996-1009.

11. Borsani, O., Zhu, J., Verslues, P. E., Sunkar, R., and Zhu, J. K. /Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis // Cell. - 2005. - 7: Vol. 123. - P. 1279-1291.

12. Bouche, N., Lauressergues, D., Gasciolli, V., and Vaucheret, H. / Anantagonistic function for Arabidopsis DCL2 in development and a new function for DCL4 in generating viral siRNAs // Embo J. - 2006. - 14: Vol. 25. - P. 3347-3356.

13. Bremer, K. A., Stevens, A., and Schoenberg, D. R. / An endonucleaseactivity similar to Xenopus PMR1 catalyzes the degradation of normal and nonsense-containing human beta-globin mRNA in erythroid cells // Rna. - 2003. 9: Vol. 9.-P. 1157-1167.

14. Brodersen, P., and Voinnet, O.I The diversity of RNA silencing pathways inplants // Trends Genet. - 2006. - 5: Vol. 22. - P. 268-280.

15. Buhler, M., Paillusson, A., and Muhlemann, O. / Efficient downregulationof immunoglobulin mu mRNA with premature translation-termination codons requires the 5'-half of the VDJ exon // Nucleic Acids Res. - 2004. - 1 1 : Vol. 32. P. 3304-3315.

16. Carter, M. S., Li, S., and Wilkinson, M. F. / A splicing-dependent regulatorymechanism that detects translation signals // Embo J. - 1996. - 21: Vol. 15. - P. 5965-5975.

17. Cheng, J., Belgrader, P., Zhou, X., and Maquat, L. E. / Introns are ciseffectors of the nonsense-codon-mediated reduction in nuclear mRNA abundance // Mol Cell Biol. -1994. - 9: Vol. 14. - P. 6317-6325.

18. Cohen, Y., Gisel, A., and Zambryski, P. C. / Cell-to-cell and systemicmovement of recombinant green fluorescent protein-tagged turnip crinkle viruses // Virology. - 2000. - 2: Vol. 273. - P. 258-266.

19. Cohen, Y., Qu, F., Gisel, A., Morris, T. J., and Zambryski, P. C / Nuclearlocalization of turnip crinkle virus movement protein p8 // Virology. - 2000. - 2: Vol. 273.-P. 276-285.

20. Conti, E., and Izaurralde, E./ Nonsense-mediated mRNA decay: molecularinsights and mechanistic variations across species // Curr Opin Cell Biol. - 2005. 3:Vol. 17.-P. 316-325.

21. Dernburg, A. F., Zalevsky, J., Colaiacovo, M. P., and Villeneuve, A. M./Transgene-mediated cosuppression in the С elegans germ line // Genes Dev. 2000. - 13: Vol. 14. - P. 1578-1583.

22. Dickey, L. F., Nguyen, Т. Т., Allen, G. C , and Thompson, W. F. / Lightmodulation of ferredoxin mRNA abundance requires an open reading frame // Plant Cell. - 1994. - 8: Vol. 6. - P. 1171-1176.

23. Dorokhov, Y. L., Skulachev, M. V., Ivanov, P. A., Zvereva, S. D., Tjulkina,

24. G., Merits, A., Gleba, Y. Y., Hohn, Т., and Atabekov, J. G. / Polypurine (A)rich sequences promote cross-kingdom conservation of internal ribosome entry // Proc Natl Acad Sci U S A . - 2002. - 8: Vol. 99. - P. 5301-5306.

25. Dunoyer, P., Himber, C , and Voinnet, O.l DICER-LIKE 4 is required forRNA interference and produces the 21-nucleotide small interfering RNA component of the plant cell-to-cell silencing signal // Nat Genet. - 2005. - 12: Vol. 37.-P. 1356-1360.

26. Dunoyer, P., and Voinnet, O. / The complex interplay between plant virusesand host RNA-silencing pathways // Curr Opin Plant Biol. - 2005. - 4: Vol. 8. - P. 415-423.

27. Ebhardt, H. A., Thi, E. P., Wang, M. В., and Unrau, P. J. / Extensive 3'modification of plant small RNAs is modulated by helper component-proteinase expression // Proc Natl Acad Sci U S A . - 2005. - 38: Vol. 102. - P. 13398-13403.

28. Engdahl, H. M., Hjalt, T. A., and Wagner, E. G. / A two unit antisense RNAcassette test system for silencing of target genes // Nucleic Acids Res. - 1997. - 16: Vol.25.-P. 3218-3227.

29. Fagard, M., and Vaucheret, H. / (TRANS)GENE SILENCING IN PLANTS:How Many Mechanisms? // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. - 2000: Vol. 51.-P. 167-194.

30. Fortes, P., Inada, Т., Preiss, Т., Hentze, M. W., Mattaj, I. W., and Sachs, A.В./ The yeast nuclear cap binding complex can interact with translation factor eIF4G and mediate translation initiation // Mol Cell. - 2000. - 1: Vol. 6. - P. 191196.

31. Gaba, A., Jacobson, A., and Sachs, M. S. / Ribosome occupancy of the yeastCPA1 upstream open reading frame termination codon modulates nonsensemediated mRNA decay // Mol Cell. - 2005. - 3: Vol. 20. - P. 449-460.

32. Gadjieva, R., Axelsson, E., Olsson, U., Vallon-Christersson, J., andHansson, M. / Nonsense-mediated mRNA decay in barley mutants allows the cloning of mutated genes by a microarray approach // Plant Physiol Biochem. 2004. - 7-8: Vol. 42. - P. 681-685.

33. Gasciolli, V., Mallory, A. C, Bartel, D. P., and Vaucheret, H. / Partiallyredundant functions of Arabidopsis DICER-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-acting siRNAs // Curr Biol. - 2005. - 16: Vol. 15. - P. 1494-1500.

34. Gatfield, D., and Izaurralde, E. / Nonsense-mediated messenger RNA decayis initiated by endonucleolytic cleavage in Drosophila // Nature. - 2004. - 6991: Vol. 429. - P. 575-578.

35. Gazzani, S., Lawrenson, Т., Woodward, C , Headon, D., and Sablowski, R. /A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis // Science. 2004. - 5698: Vol. 306. - P. 1046-1048.

36. Gehring, N. H., Neu-Yilik, G., Schell, Т., Hentze, M. W., and Kulozik, A. E./ Y14 and hUpBb form an NMD-activating complex // Mol Cell. - 2003. - 4: Vol. 11.-P. 939-949.

37. Gelman, M. S., and Kopito, R. R. / Rescuing protein conformation:prospects for pharmacological therapy in cystic fibrosis // J Clin Invest. - 2002. 11: Vol. 110.-P. 1591-1597.

38. Gonzalez, С I., Ruiz-Echevarria, M. J., Vasudevan, S., Henry, M. F., andPeltz, S. W./ The yeast hnRNP-like protein Hrpl/Nab4 marks a transcript for nonsense-mediated mRNA decay //Mol Cell. - 2000. - 3: Vol. 5. - P. 489-499.

39. Graber, J. H., Cantor, С R, Mohr, S. C , and Smith, T. F./ Genomicdetection of new yeast pre-mRNA 3'-end-processing signals // Nucleic Acids Res. 1999.-3: Vol. 27. - P . 888-894.

40. Grishok, A., Tabara, H., and Mello, / Genetic requirements forinheritance of RNAi in С elegans // Science. - 2000. - 5462: Vol. 287. - P. 24942497.

41. Guo, H. S., Fei, J. F., Xie, Q., and Chua, N. H. / A chemical-regulatedinducible RNAi system in plants // Plant J. - 2003. - 3: Vol. 34. - P. 383-392.

42. Hilleren, P., and Parker, R./ Mechanisms of mRNA surveillance ineukaryotes // Annu Rev Genet. - 1999: Vol. 33. - P. 229-260.

43. Himber, C , Dunoyer, P., Moissiard, G., Ritzenthaler, C , and Voinnet, O. /Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing // Embo J. - 2003. -17: Vol. 22. - P. 4523-4533.

44. Hoibrook, J. A., Neu-Yilik, G., Gehring, N. H., Kulozik, A. E., and Hentze,M. W. / Internal ribosome entry sequence-mediated translation initiation triggers nonsense-mediated decay // EMBO Rep. - 2006. - 7: Vol. 7. - P. 722-726.

45. Hori, K., and Watanabe, Y.I Context analysis of termination codons inmRNA that are recognized by plant NMD // Plant Cell Physiol. - 2007. - 7: Vol. 48.-P. 1072-1078.

46. Huettel, В., Kanno, Т., Daxinger, L., Aufsatz, W., Matzke, A. J., andMatzke, M./ Endogenous targets of RNA-directed DNA methylation and Pol IV in Arabidopsis // Embo J. - 2006. - 12: Vol. 25. - P. 2828-2836.

47. Ingelfinger, D., Arndt-Jovin, D. J., Luhrmann, R., and Achsel, Т./ The human1.ml-7 proteins colocalize with the mRNA-degrading enzymes Dcpl/2 and Xrnl in distinct cytoplasmic foci // RNA. - 2002. - 12: Vol. 8. - P. 1489-1501.

48. Ishigaki, Y., Li, X., Serin, G., and Maquat, L. E./ Evidence for a pioneerround of mRNA translation: mRNAs subject to nonsense-mediated decay in mammalian cells are bound by CBP80 and CBP20 // Cell. -2001.-5: Vol. 106. P. 607-617.

49. Isshiki, M., Yamamoto, Y., Satoh, H., and Shimamoto, K. /Nonsensemediated decay of mutant waxy mRNA in rice // Plant Physiol. - 2001. - 3: Vol. 125.-P. 1388-1395.

50. Janowski, B. A., Huffman, K. E., Schwartz, J. C , Ram, R., Nordsell, R.,Shames, D. S., Minna, J. D., and Corey, D. R./ Involvement of AGO 1 and AG02 in mammalian transcriptional silencing // Nat Struct Mol Biol. - 2006. - 9: Vol. 13. - P. 787-792.

51. Jofiiku, K. D., and Goldberg, R. В./ Kunitz trypsin inhibitor genes aredifferentially expressed during the soybean life cycle and in transformed tobacco plants //Plant Cell. - 1989. - 11: Vol. 1. - P. 1079-1093.

52. Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas, A.,Jr., Zhu, J. K., Staskawicz, B. J., and Jin, H./ A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity // Proc Natl Acad Sci U S A . - 2006.

53. Ketting, R. F., and Plasterk, R. H./ A genetic link between co-suppressionand RNA interference in C. elegans //Nature. - 2000. - 6775: Vol. 404. - P. 296298.

54. Kurihara, Y., and Watanabe, Y./ Arabidopsis micro-RNA biogenesisthrough Dicer-like 1 protein functions // Proc Natl Acad Sci U S A . - 2004. - 34: Vol. 101.-P. 12753-12758.

55. Le Hir, H., Izaurralde, E., Maquat, L. E., and Moore, M. J./ The spliceosomedeposits multiple proteins 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions // Embo J. - 2000. - 24: Vol. 19. - P. 6860-6869.

56. Le Hir, H., Moore, M. J., and Maquat, L. E./ Pre-mRNA splicing altersmRNP composition: evidence for stable association of proteins at exon-exon junctions // Genes Dev. - 2000. - 9: Vol. 14. - P. 1098-1108.

57. Lecellier, C. H., Dunoyer, P., Arar, K., Lehmann-Che, J., Eyquem, S.,Himber, C, Saib, A., and Voinnet, O.I A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells // Science. - 2005. - 5721: Vol. 308. - P. 557-560.

58. Lejeune, F., Ishigaki, Y., Li, X., and Maquat, L. E./ The exon junctioncomplex is detected on CBP80-bound but not eIF4E-bound mRNA in mammalian cells: dynamics of mRNP remodeling // Embo J. - 2002. - 13: Vol. 21. - P. 35363545.

59. Lejeune, F., Li, X., and Maquat, L. E./ Nonsense-mediated mRNA decay inmammalian cells involves decapping, deadenylating, and exonucleolytic activities // Mol Cell. - 2003. - 3: Vol. 12. - P. 675-687.

60. Lewis, B. P., Green, R. E., and Brenner, S. E./ Evidence for the widespreadcoupling of alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans // ProcNatl Acad Sci U S A . - 2003. - 1: Vol. 100. - P. 189-192.

61. Li, J., Yang, Z., Yu, В., Liu, J., and Chen, X./ Methylation protects miRNAsand siRNAs from a З'-end uridylation activity in Arabidopsis // Curr Biol. - 2005. 16: Vol. 15.-P. 1501-1507.

62. Lingel, A., Simon, В., Izaurralde, E., and Sattler, M./ Structure and nucleicacid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain //Nature. - 2003. - 6965: Vol. 426. - P. 465-469.

63. Lykke-Andersen, J. / Identification of a human decapping complexassociated with hUpf proteins in nonsense-mediated decay // Mol Cell Biol. - 2002. -23: Vol. 22.-P. 8114-8121.

64. Macrae, I. J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A. N., Cande, W. Z.,Adams, P. D., and Doudna, J. A. / Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer // Science. - 2006. - 5758: Vol. 311. - P. 195-198.

65. Mallory, A. C , and Vaucheret, H./ MicroRNAs: something importantbetween the genes // Curr Opin Plant Biol. - 2004. - 2: Vol. 7. - P. 120-125.

66. Maquat, L. E./ Nonsense-mediated mRNA decay: splicing, translation andmRNP dynamics // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2004. - 2: Vol. 5. - P. 89-99.

67. Maquat, L. E., Kinniburgh, A. J., Rachmilewitz, E. A., and Ross, J. /Unstable beta-globin mRNA in mRNA-deficient beta о thalassemia // Cell. - 1981. - 3 P t 2 : Vol. 27.-P. 543-553.

68. Margis, R., Fusaro, A. F., Smith, N. A., Curtin, S. J., Watson, J. M.,Finnegan, E. J., and Waterhouse, P. M./ The evolution and diversification of Dicers in plants // FEBS Lett. - 2006. - 10: Vol. 580. - P. 2442-2450.

69. Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., andTuschl, T. / Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs //Mol Cell. - 2004. - 2: Vol. 15. - P. 185-197.

70. Meister, G., Landthaler, M., Peters, L., Chen, P. Y., Urlaub, H., Luhrmann,R., and Tuschl, Т./ Identification of novel argonaute-associated proteins // Curr Biol. - 2005. - 23: Vol. 15. - P. 2149-2155.

71. Minvielle-Sebastia, L., Preker, P. J., and Keller, W./ RNA14 and RNA15proteins as components of a yeast pre-mRNA З'-end processing factor // Science. 1994. - 5191: Vol. 266. - P. 1702-1705.

72. Mitchell, P., and Tollervey, D. / An NMD pathway in yeast involvingaccelerated deadenylation and exosome-mediated 3'>5' degradation // Mol Cell. 2003.-5: Vol. 11.-P. 1405-1413.

73. Modrek, В., and Lee, С J./ Alternative splicing in the human, mouse and ratgenomes is associated with an increased frequency of exon creation and/or loss // Nat Genet. - 2003. - 2: Vol. 34. - P. 177-180.

74. Molnar, A., Csorba, Т., Lakatos, L., Varallyay, E., Lacomme, C , andBurgyan, J./ Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly from highly structured single-stranded viral RNAs // J Virol. - 2005. - 12: Vol. 79. -P. 7812-7818.

75. Muhlrad, D., and Parker, R./ Aberrant mRNAs with extended 3' UTRs aresubstrates for rapid degradation by mRNA surveillance // Rna. - 1999. - 10: Vol. 5. -P. 1299-1307.

76. Nagy, E., and Maquat, L. E./ A rule for termination-codon position withinintron-containing genes: when nonsense affects RNA abundance // Trends Biochem Sci. - 1998. - 6: Vol. 23. - P. 198-199.

77. Nakayashiki, H. / RNA silencing in fungi: mechanisms and applications //FEBS Lett. - 2005. - 26: Vol. 579. - P. 5950-5957.

79. Peltz, S. W., Brown, A. H., and Jacobson, A./ mRNA destabilizationtriggered by premature translational termination depends on at least three cisacting sequence elements and one trans-acting factor // Genes Dev. - 1993. - 9: Vol. 7.-P. 1737-1754.

80. Petracek, M. E., Nuygen, Т., Thompson, W. F., and Dickey, L. F./Premature termination codons destabilize ferredoxin-1 mRNA when ferredoxin-1 is translated // Plant J. - 2000. - 6: Vol. 21. - P. 563-569.

81. Pillai, R. S., Artus, C. G., and Filipowicz, W./Tethering of human Agoproteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis // Rna. - 2004. - 10: Vol. 10. - P. 1518-25.

82. Pirrotta, V., and Gross, D. S. / Epigenetic silencing mechanisms in buddingyeast and fruit fly: different paths, same destinations // Mol Cell. - 2005. - 4: Vol. 18.-P. 395-398.

83. Qu, F., and Morris, T. J./ Suppressors of RNA silencing encoded by plantviruses and their role iriviral infections // FEBS Lett. - 2005. - 26: Vol. 579. - P. 5958-5964.

84. Reddy, M. S., Dinkins, R. D., and Collins, G. В./ Gene silencing intransgenic soybean plants transformed via particle bombardment // Plant Cell Rep. - 2003. - 7: Vol. 21. - P. 676-683.

85. Roth, В. M., Pruss, G. J., and Vance, V. В./ Plant viral suppressors of RNAsilencing //Virus Res. - 2004. - 1: Vol. 102. - P . 97-108.

86. Ruiz-Echevarria, M. J., Gonzalez, С I., and Peltz, S. W. / Identifying theright stop: determining how the surveillance complex recognizes and degrades an aberrant mRNA // Embo J. - 1998. - 2: Vol. 17. - P. 575-589.

87. Ruiz-Echevarria, M. J., and Peltz, S. W./ The RNA binding protein Publmodulates the stability of transcripts containing upstream open reading frames // Cell. - 2000. - 7: Vol. 101. - P. 741-751.

88. Schauer, S. E., Jacobsen, S. E., Метке, D. W., and Ray, A./ DICER-LIKEl:blind men and elephants in Arabidopsis development // Trends Plant Sci. - 2002. 11: Vol. 7.-P. 487-491.

89. Sheth, U., and Parker, R. / Targeting of aberrant rnRNAs to cytoplasmicprocessing bodies // Cell. - 2006. - 6: Vol. 125. - P. 1095-1109.

90. Solier, S., Logette, E., Desoche, L., Solary, E., and Corcos, L. / Nonsensemediated mRNA decay among human caspases: the caspase-2S putative protein is encoded by an extremely short-lived mRNA // Cell Death Differ. - 2005.

91. Tyulkina, L. G., Skurat, E. V., Zvereva, A. S., Dorokhov, Y. L., andAtabekov, J. G./ Movement protein stimulates tobacco mosaic virus reproduction in infected cells // Dokl Biochem Biophys. - 2006: Vol. 409. - P. 253-256.

92. Vaucheret, H., Mallory, A. C , and Bartel, D. P./ AGOl homeostasis entailscoexpression of MIR168 and AGOl and preferential stabilization of miR168 by AGOl // Mol Cell. - 2006. - 1: Vol. 22. - P. 129-136.

93. Vaucheret, H., Vazquez, F., Crete, P., and Bartel, D. P./ The action ofARGONAUTEl in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development // Genes Dev. - 2004. - 10: Vol. 18. - P. 11871197.

94. Vilela, C , Velasco, C , Ptushkina, M., and McCarthy, J. E./ The eukaryoticmRNA decapping protein Dcpl interacts physically and functionally with the eIF4F translation initiation complex // Embo J. - 2000. - 16: Vol. 19. - P. 43724382.

95. Voelker, T. A., Moreno, J., and Chrispeels, M. J./ Expression analysis of apseudogene in transgenic tobacco: a frameshift mutation prevents mRNA accumulation // Plant Cell. - 1990. - 3: Vol. 2. - P. 255-261.

96. Voinnet, O.I RNA silencing as a plant immune system against viruses //Trends Genet. -2001.-8: Vol. 17. - P. 449-459.

97. Voinnet, O.I RNA silencing bridging the gaps in wheat extracts // TrendsPlant Sci. - 2003. - 7: Vol. 8. - P. 307-309.

98. Wang, W., Czaplinski, K., Rao, Y., and Peltz, S. W.I The role of Upfproteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts // Embo J. - 2001. - 4: Vol. 20. - P. 880-890.

99. Waring, D. A., and Kenyon, C/ Selective silencing of cell communicationinfluences anteroposterior pattern formation in C. elegans // Cell. - 1990. - 1: Vol. 60.-P. 123-131.

100. Wright, S. L, and Gaut, B. S./ Molecular population genetics and the searchfor adaptive evolution in plants // Mol Biol Evol. - 2005. - 3: Vol. 22. - P. 506-519.

101. Xie, Z., Allen, E., Fahlgren, N., Calamar, A., Givan, S. A., and Carrington,J. С / Expression of Arabidopsis MIRNA genes // Plant Physiol. - 2005a. - 4: Vol. 138.-P. 2145-2154.

102. Xie, Z., Allen, E., Wilken, A., and Carrington, J. C/ DICER-LIKE 4functions in trans-acting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase <l change in Arabidopsis thaliana // Proc Natl Acad Sci U S A . - 2005b. - 36: Vol. 102.-P. 12984-12989.

103. Xie, Z., Kasschau, K. D., and Carrington, J. C. / Negative feedbackregulation of Dicer-Like 1 in Arabidopsis by microRNA-guided mRNA degradation // Curr Biol. - 2003. - 9: Vol. 13. - P. 784-789.

104. Yan, K. S., Yan, S., Farooq, A., Han, A., Zeng, L., and Zhou, M. M./Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain // Nature. - 2003. 6965: Vol. 426. - P. 468-474.

105. Yu, В., Chapman, E. J., Yang, Z., Carrington, J. C , and Chen, X./Transgenically expressed viral RNA silencing suppressors interfere with microRNA methylation in Arabidopsis //FEBS Lett. - 2006. - 13: Vol. 580. - P. 3117-3120.

106. Zandueta-Criado, A., and Bock, R./ Surprising features of plastid ndhDtranscripts: addition of non-encoded nucleotides and polysome association of mRNAs with an unedited start codon //Nucleic Acids Res. - 2004. - 2: Vol. 32. P. 542-550.

107. Zhang, S., Ruiz-Echevarria, M. J., Quan, Y., and Peltz, S. W./ Identificationand characterization of a sequence motif involved in nonsense-mediated mRNA decay // Mol Cell Biol. - 1995. - 4: Vol. 15. - P. 2231-2244.

108. Zilbennan, D., Cao, X., and Jacobsen, S. E. / ARGONAUTE4 control oflocus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation // Science. 2003. - 5607: Vol. 299. - P. 716-719.