Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма функционирования дикарбоксилатного транспортера митохондрий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма функционирования дикарбоксилатного транспортера митохондрий"

На правах рукописи

МАМАЕВ Дмитрий Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ДИКАРБОКСИЛАТНОГО ТРАНСПОРТЕРА МИТОХОНДРИЙ

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА • 2003

Работа выполнена в Лаборатории биологического окисления Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук К.Ф. Шольц

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор JI.C. Ягужинский доктор биологических наук, профессор A.C. Капрельянц

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « V » 2003 г. в часов на заседании диссертационного

совета (К 002.247.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им- А.Н. Баха РАН по адресу: 119071. Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2, конференц-заЛ.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » мая 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

2о<=>з-А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С4-дикарбоксилаты (прежде всего Ь-малат и сукцинат) играют важную роль в метаболизме. Они являются интермедиатами цитратного цикла, локализованного в митохондриях. Окисление дикарбоксилатов необходимо для окислительного фосфорилирования, основного поставщика АТФ в клетке.

Наряду с участием в обмене веществ особую роль играет специфический транспорт этих метаболитов через биологические мембраны. Так, например, транспорт Ь-малата через митохондриальную мембрану связан с так называемым транспортом восстановительных эквивалентов, необходимым для обеспечения взаимодействия между двумя изолированными пулами НАДН - митохондриальным и цитозольным. Транспорт сукцината через митохондриальную мембрану обеспечивает взаимосвязь между обменом в пероксисомах и митохондриях. Особую роль играет транспорт Ь-малата через плазматическую мембрану клетки, поскольку этот дикарбоксилат, благодаря его особой роли в основном обмене может служить источником углерода, необходимого для роста в аэробных условиях клеток эукариотов.

Изучению структуры и особенностей функционирования дикарбоксилатных переносчиков уделяется значительное внимание. В частности, для некоторых из них определена первичная структура. Во внутренней мембране митохондрий выявлены транспортеры дикарбоксилатов, функционирующие только по электронейтральному обменному механизму. Н+/дикарбоксилатные транспортеры плазматической мембраны дрожжей являются симпортерами. По сравнению с другими транспортерами митохондрий дикарбоксилатный мало изучен, а дрожжевые транспортеры слабо изучены по сравнению с другими транспортерами плазматических мембран. Особенно мало известно о молекулярном механизме.функционирования этих транспортеров. В частности, не установлены принципиальные для функции переносчиков особенности структуры их

активного центра, включающего точки связывания дикарбоксилатов и каналы, по которым поступают субстраты к этим точкам связывания. Из обзора видно, что для увязывания значительного количества структурных данных с актом транспорта даже для наиболее изученных митохондриальных транспортеров, необходима новая структурно-функциональная модель и разработка методов проверки ее адекватности.

Цель и задачи исследования. С целью исследования механизма функционирования дикарбоксилатного транспортера в работе решались следующие задачи: '

1. Зондирование активного центра функционирующего дикарбоксилатного транспортера митохондрий печени крыс с высоким разрешением с помощью производные двух его субстратов - маната и малоната - с алкильным заместителем различной длины.

2. Сравнительное исследование активного центра двух типов дикарбоксилатных транспортеров и фермента (сукцинатдегидрогеназы), субстратом которого является дикарбоксилат.

3. Разработка методики определения действующей концентрации амфифильных ингибиторов мембранных ферментов и метода определения доли доступной для этих соединений мембранной фазы клетки.

Научная новизна. Изучение топографии активного центра функционирующего транспортера с помощью набора алкил-производных субстратов позволило получить новые данные в пользу одноцентровой модели транспортера.

Практическая значимость работы. Разработан метод оценки проницаемости клеток дрожжей для амфифильных кислот и методика определения действующей концентрации этого типа ингибиторов на процессы в интактной мембране митохондрий.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: Всесоюзная конференция "Молекулярные механизмы и

регуляция энергетического обмена" (11-13 июня 1986 г., Пущино); Международная конференция "Chemical Physics of Enzyme Catalysis" (Tallinn, Sept., 21-22, 1987); Meeting of the FEBS (30.06.-5.07.2001, Lisbon, Portugal); III съезд биохимического общества (26.06. -01.07.2002, Санкт-Петербург).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Структура и объем работы. Диссертация, изложенная на е., включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, список литературы (139 работ) и содержит 30 рисунков и 12 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследования. Работу проводили на митохондриях печени крыс, субмитохондриальных частицах печени крыс, клетках S. cerevisiae штамма Y-503, выращенных на глюкозе и подвергнутых истощению эндогенных субстратов с помощью холодного анаэробиоза и митохондриях, выделенных из этих дрожжей.

Метод определение доли доступной для амфифильных анионов мембранной фазы клеток. Определяют исходную (Со) и равновесную (С„) концентрацию амфифильных анионов в водной фазе в присутствии интактных (Со' и Cw1) и пермеабилизованных с ДМСО (40%) клеток (Со" и С„"). Концентрацию амфифильных анионов определяют после экстракции их комплекса с метиленовым синим. Долю доступной липофильной фазы (ХДо) рассчитывали по уранению: XJhs = (Co'/Cw' -1)/(Со"/С„" -1).

Измерение скорости дыхания митохондрий и клеток. Скорость восстановления кислорода определяли в полярографической ячейке с закрытыми электродами с рабочим

объемом 1 мл амперометрическим методом на полярографе ОН-105 (Венгрия) или LP-7 (Чехословакия).

Измерение сукцинатдегидрогеназной активности. Измерялась активность сукцинат:феррицианид-редуктазы субмитохондриальных частиц печени крыс фотометрически при 420 им на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония) в среде С1 с добавлением антимицина А (1 мкМ), цианида (1 мМ) и феррицианида калия (1 мМ). Определение коэффициентов распределения амфифильных кислот в системе октанол/вода. Аликвоту раствора ингибитора, например одной из 0-ациляблочных кислот, в диметилсульфоксиде вводят в ЮмМ калий-фосфатный буфер с pH 5,5 или 7,2, перемешивают и добавляют октанол. Объем водной фазы (vw) и октанола (v0) подбирают таким образом, чтобы после установления равновесия концентрация амфифильной кислоты в водной фазе снизилась на 20 - 50%. После добавления октанола проводят осторожное (исключающее значительное пенообразование) перемешивание жидкостей (30 - 120 мин) до установления равновесия, когда концентрация ингибитора в водной фазе перестает изменяться. Исходную (Со) и равновесную (Cw) концентрацию ингибитора в водной фазе определяли с метиленовым синим (см. выше). Коэффициент распределения соответствующей амфифильной кислоты (R) рассчитывают по формуле: R = (C0-C„K/Cwv„ •

Этим методом были получены зависимости коэффициентов распределения О-ацил-Ь-малатов в системе октанол/вода от количества атомов углерода (л) в алифатической цепи этих соединений при pH 5,5 (pH среды инкубации клеток S. cerevisiae) и 7,2 (pH среды инкубации митохондрий).

Как следует из данных, представленных на рис. 1 эти зависимости описываются уравнениями: lgR = 0,41би - 3,46 (для pH 5,5) и lgR = 0,406л - 5,42 (для pH 7,2).

б

Инкременты в данном случае несколько ниже соответствующего инкремента, полученного для жирных кислот в системе гептан/вода [Тапй>гс1, 1973]

Производные маната и малоната. Производные субстратов дикарбоксилатных транспортеров Ь-малата, Э-мапата и малоната (2-апкилмалонаты, 2,2-диалкилмалонаты,

л

Рис. 1. Зависимость коэффициента распределения (Я) в системе октанол/вода от количества атомов С (л) в алифатической цепи О-ацил-Ь-малатов и рН водной фазы. Условия опыта: ЮмМ калий-фосфатный буфер с рН 5,5 и 7,2.

О-ацил-Ь- и О-ацил-О-малаты, а,ш-алкилдималонаты) синтезированы в нашей лаборатории Д.И. Бондаренко. Очистку соединений проводили многократной перекристаллизацией из различных систем органических растворителей. Чистоту препаратов определяли методами газожидкостной (в виде метиловых эфиров на приборе

«Цвет-102»), тонкослойной хроматографией (пластины «Silufol», ЧССР) и элементным анализом.

Определение размеров молекул. Для расчета внутримолекулярных расстояний использовали программу Desktop Molecular Modelling.

Определение кинетических параметров. Наблюдаемые константы ингибирования (К,) рассчитывали по формулам: К, = 1Км/(Км' - Км) или К, = ЬоКм/(Км + S), где Км и Км' - константы Михаэлиса для субстрата, найденные в координатах Лайнуивера-Берка, в отсутствие и в присутствии ингибитора, I - концентрация ингибитора, I50 - найденная в координатах Диксона концентрация ингибитора, вызывающая 50% эффект, S -концентрация субстрата.

При определении истинной константы ингибирования (К,) амфифильных ингибиторов исходили из зависимости наблюдаемой К, (К,°) от концентрации доступной ингибитору липидной фазы в системе в соответствии с уравнением: К," = К, + (K,Rla)B, где В концентрация митохондрий или клеток. Поскольку выражение в скобках, включающее коэффициент распределения вещества между липофильной и водной фазами системы (R), удельный объем доступной ингибитору липидной фазы (Ха) и истинную константу ингибирования данного ингибитора (К,), является постоянной величиной,, истинная К, находится в точке пересечения прямой с осью К, в зависимости К,°от В.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Чтобы исключить возможные артефакты, связанные с выделением переносчиков и их реконструкцией в искусственных мембранах, в настоящей работе активности дикарбоксилатных транспортеров измерялись в интактных мембранах с помощью эндогенных сопряженных систем окисления сукцината.

Использованный в данной работе набор ингибиторов дикарбоксилатных транспортеров представляет собой субстраты, химически модифицированные липофильными апкильными или ацильными заместителями с различной длиной алифатической цепи. Эти соединения не влияют на убихиноноксидазный участок дыхательной цепи, поскольку они не ингнбируют 2-оксибутиратоксидазную систему митохондрий (данные не приведены).

0-Лауроил-1_-малат, мкМ

Рис. 2. Зависимость скорости дыхания митохондрий печени крыс (0,2 мг белка в 1 мл) с сукцинатом (3 мМ) и концентрации О-лауроил-Ь-малата в присутствии в отсутствие грамицидина Б.

В среде: протонофор 3,5-ди-тре/и-бутил-4-оксибензилиденмалононитрил (20 мкМ) и цитохром с (4 мкМ).

СИ-ТиёисЬ

Поскольку пермеабилизация митохондрий грамицидином Б цжс. 2) значительно снижает степень ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий О-лауроил-Ь-малатом, дикарбоксилатный транспортер этих органелл лимитирует сукцинатоксидазу этих органелл. Несмотря на то, что некоторые ингибиторы сукцинатоксидаз (алкилмалонаты) являются также ингибиторами сукцинатдегидрогеназы, (см. ниже), их ингибирующий эффект на сукцинатоксидазах отражает их действие на дикарбоксилатный транспортер. Это обусловлено тем, что сродство этих соединений к сукцинатдегидрогеназе значительно ниже, чем к переносчику, а также тем, что они не проникают в матрикс митохондрий. Это следует, в частности из того, что на зависимостях Диксона не выявляется вторая составляющая: кривые Диксона для всех изученных соединений были линейны.

Таблица 1. Определение доли доступной для ингибитора О-пальмитоил-Ъ-малата (40 мкМ) и протонофора SF6847 (10 мкМ) липофильной фазы клеток S. cerevisiae в ЮмМ калий-фосфатном буфере с pH 5,5.

Соединение Дрожжи, мг/мл Do" Do' Dw" D»1 ХДо

О-Пальмитоил-Ь-малат 50,0 0,607 0,607 0,192 0,333 0,380

25,0 0,654 ' 0,654 0,133 0,289 0,323

25,0 0,557 0,557 0,129 0,242 0,392

Среднее: 0,365

SF6847 25,0 0,496 0,389 0,039 0,030 1,021

12,5 0,396 0,396 0,024 0,021 1,152

Среднее: 1,087

Из данных табл. 1 следует, что примерно 2/3 липофильной фазы интактной клетки дрожжей недоступны для одного из наиболее липофильных производных малата,

О-пальмитоил-Ь-малата (Х,До = 0,364). В то время как для слабой кислоты протонофора БИ 6847 эта фаза полностью доступна (Ха/9-о = 1,09). Из этого следует, что в условиях эксперимента О-ацил-Ь-малаты не проникают и через плазматическую мембрану дрожжевых клеток и, следовательно, они могут взаимодействовать только транспортером этой мембране.

В работе показано, что дикарбоксилатный переносчик является лимитирующим звеном эндогенных сопряженных систем митохондрий печени крыс и клеток дрожжей, используемых для измерения скорости транспорта сукцината.

Клетки дрожжей окисляют сукцинат с максимальной скоростью, составляющей меньше 25% от скорости окисления пирувата (рис. 3), в то время как митохондрии дрожжей окисляют оба эти субстрата с близкими активностями. У клеток дрожжей Км по сукцинату на порядок больше, чем у дрожжевых митохондрий: 7,3 + 1,1 мМ (3) и 0,635 + 0,173 мМ (3), соответственно. Подавление скорости окисления в клетками дрожжей сукцината (но не ацетата) ингибитором сукцинатдегидрогеназы теноилтрифторацетоном имеет сигмоидный характер и , соответсвенно, система, начинающаяся с этого звена активнее, чем транспорт сукцината. Таким образом, несколькими способами показана пригодность эндогенных полиферментных систем для измерения активности транспортеров.

Таким образом, в подобранных условиях сукцинатоксидазную реакцию митохондрий лимитирует транспорт и эта эндогенная сопряженная система позволяет измерять ингибирование дикарбоксилатного транспортера митохондрий печени крысы алкилмалонатами и О-ацил-Ь-малатами. Для О-ацил-Ь-малатов (рис. 4Б) и остальных используемых ингибиторов (данные не приведены) зависимость скорости сукцинатоксидазной реакции митохондрий от концентрации этих соединений линейна в координатах Диксона. Линейность в координатах Диксона продемонстрирована и для

сукцинатоксидазной реакции клеток (рис. 5Б). Эти данные также свидетельствует, что транспортер - лимитирующее звено используемых сопряженных систем.

О-Ацил-Ь-мапаты ингибируют дыхание клеток с сукцинатом линейно в координатах Диксона, что можно видеть на примере О-стеароил-Ь-малата (рис. 5Б). Эти данные также

2 о

о

х з: 5

"6 о 5

х >

СП

о

2,4

2.1

1,8

1,5

1,2

0,9

0,6

1111 1 1

Г/ируват ^^

\Ацетая)

Сукцинат О—п-в---- □ □'—

Эндогенные субстратьГ |||| 0° | |

10 15 Время, ч

20

25

Рис. 3. Изменение скорости дыхания клеток 5 сегеутае при 30° с сукцинатом (20 мМ), пируватом (23 мМ), ацетатом (20 мМ), и в отсутствие экзогенных субстратов в ходе аэробной инкубации при 0°.

свидетельствуют о том, что дыхание клеток лимитируется дикарбоксилатным транспортером плазматической мембраны.

Все использованные в работе соединения являются конкурентными ингибиторами соответствующих сукцинат-зависимых процессов. Так, например, О-ацил-Ь-малаты

Рис. 4. Зависимость скорости сукцинатоксидаэной реакции митохондрий печени крыс (0,5 мг белка в 1 мл) от концентрации сукцината в присутствии О-ацил-Ь-малатов в координатах Лайнуивера-Берка (А) и от концентрации О-бутироил-Ь-малата в присутствии сукцината (3 мМ) в координатах Диксона.

повышают Км по сукцинату, не влияя на максимальную скорость сукцинатоксидазы митохондрий печени (рис. 4А) и клеток дрожжей (рис. 5А). Это означает, что в данном случае эти соединения обратимо взаимодействуют с точкой связывания субстрата в дикарбоксилатных транспортерах.

Сукцинатдегидрогеназа. Активный центр сукцинатдегидрогеназы доступен с матриксной стороне внутренней мембраны, поэтому для измерения ее активности использовали сукцинат:феррицианид-редуктазную реакцию инвертированных субмитохондриальных частиц.

Малонат является одним из наиболее эффективных ингибиторов сукцинатдегидрогеназы. По нашим данным его К, равна 8,2 ± 0,16 мкМ (3) (см. табл. 2). Как видно из данных на рис. 6, метилмалонат, а особенно 2,2-диметилмалонат, связываются с ферментом существенно слабее мапоната. В то же время, связывание с

Сукцинат, мМ-'

О-Стеароил-Ьмалат, мкМ

Рис. 5. Зависимость скорости дыхания клеток 5. сегечтае (5 мг сырого веса в 1 мл) от концентрации сукцината в присутствии О-стеароил-Ь-малата в координатах Лайнуивера-Берка (А) и от концентрации ингибитора в присутствии сукцината (24 Мм) в координатах Диксона (Б)

Таблица 2. Зависимость ингибирования сукцинат:феррицианид-редуктазной реакции субмитохондриальных частиц печени крысы от количества атомов углерода в алкильном заместителе производного мапоната.

Ингибитор Количество атомов С в алкильном заместителе ингибитора (я)

Малонат 0 5,65 ±0,10(3)

2-Метилмалонат 1 2,72 ±0,19 (2)

2,2-Диметилмалонат 1 1,55 ±0,18(3)

2-Гексилмалонат 6 2,20 ± 0,07 (2)

2,2-Дигексилмалонат 6 2,55 ±0,13 (2)

ферментом 2,2-дигексилмалоната и 2-гексилмалоната происходит с близкими константами (см. табл. 2). Это означает, что, по-видимому, вблизи точки связывания дикарбоксилатов существуют стерические препятствия для связывания производных малоната.

Необходимо отметить, что низшие моно- и диалкилмалонаты с одинаковой длиной заместителя имеют близкое сродство к дикарбоксилатному транспортеру митохондрий (табл. 3). Это означает, существование просторной зоны вблизи точки связывания субстрата в транспортере, в отличие от фермента.

Таблица 3. Константы ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий печени крыс для низших 2-алкилмалонатов и 2,2-диалкилмалонатов с одинаковыми заместителями.

Алкильный заместитель в мапонате Количество атомов С в заместителе (п) 2-апкилмалоната -lgK, 2,2-диалкилмапоната

Этил 2 3,40 ±0,10(2} 3,1010,21(3)

Пропил 3 3,55 ±0,15(4) 3,5

Бутил 4 3,70 ±0,16(6) 3,8б±0,21(4)

Как следует из рис. 6, по мере увеличения длины алифатической цепи 2-алкилмалонатов К, увеличивается, достигая максимального значения для бутилмалоната. Однако, начиная с бутилмалоната и по крайней мере до додецилмалоната, К, начинает снижаться в соответствии с уравнением: 1яК|= -0,211л - 0,958.

По-видимому, такое изменение характера ингибирования сукцинатдегидрогеназы свидетельствует о выходе концевых участков алифатической цепи высших

алкилмалонатов из зоны стерических ограничений. Кроме того, поскольку по мере увеличения л наблюдается увеличение эффективности алкилмалонатов, эти концевые участки вступают в липофильные взаимодействия с липофильными остатками аминокислот в активном центре фермента.

Л

Рис. 6. Зависимости константы ингибирования сукцинат:феррицианид-редуктазы |

субмитохондриальных частиц печени крыс для 2-алкилмалонатов и 2,2-диалкилмалонатов от количества атомов С (и) в алифатических остатках этих ингибиторов

1

Коэффициент распределения О-ацил-Ь-малонатов в системе октанол/вода увеличивается с увеличением п с инкрементом № около 0,40 (рис. 1). В то же время инкремент ^К, для сукцинатдегидрогеназы существенно ниже (0,211). Это означает, что в

активном центре сукцинатдегидрогеназы присутствуют как липофильные, так и гидрофильные остатки аминокислот и их соотношение таково, что липофильные взаимодействия с ингибитором не достигают максимально возможных значений, которые реализуются в системе октанол/вода.

Дикарбокеилатный транспортер митохондрий печени крыс. Зависимость ^К, от л для 2-алкилмапонатов имеет сложный характер (см. рис. 7). Так, л от 1 до 3 снижается («малый липофильный участок»). Затем наблюдается область с практически одинаковыми значениями К„ в которую входят малонаты с л от 3 до 7 (полярный участок вблизи точки связывания субстратов). Затем имеет место крутое линейное снижение ^К, на участке с л 7 до 13 («большой липофильный участок»), с которого начинается замедленное снижение ^К, вплоть до 2-гептадецилмалоната («липофильно-гидрофильная область»).

-з

-4

1дК

-в -7 -в

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 П

Рис. 7. Зависимость константы ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий печени крыс 2-апкилмалонатами и О-ацил-Ь-малагами от количества атомов С (л) в алифатической цепи ингибиторов

Зависимость ^К, от л для О-ацил-Ь-малатов имеет значительное сходство с соответствующей зависимостью для 2-алкилмалонатов. Так, для низших ацилмалатов с п от 3 до 7 имеет место площадка. Затем наблюдается линейное снижение ^К, до я, равного 13, и в области высших производных наблюдается замедление этого снижения по крайней мере до л, равного 17. Надо отметить, что ацилмапаты не позволяют провести зондирование «малого липофильного участка» вблизи с точкой связывания субстратов в транспортере, т.к. размеры полярной головки у этих соединений больше, чем у манатов

Таблица 4. Константы ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий печени крысы для О-ацил-Ь-малатов и О-ацил-О-малатов с одинаковым заместителем.

Ингибитор Количество метиленовых звеньев в алифатической цепи ингибитора (п)

О-миристоил-Ь-малат 13 5,5±0,2

О-миристоил-Б-малат 13 5,22±0,12

О-стеароил-Ь-малат 17 б,4±0,12

О-стеароил-О-малат 17 6,6±0,14

Особенностью действия О-ацил-Ь-малатов является то, что их К| примерно на порядок выше К, 2-алкилмалонатов (см. рис. 7), хотя константы ингибирования транспорта сукцината через дикарбоксилатный транспортер для Ь-малата и малоната близки и составляют соответственно 0,5 мМ и 0,35 мМ. Такое снижение сродства, по-видимому, связано с блокированием ОН-группы в молекуле маната, присоединением по ней остатка жирной кислоты. Эта группа может принимать участие в связывании Ь-малата в активном центре транспортера и блокирование ее может снизить сродство

О-ацил-Ь-малатов к точке связывания субстратов. Роль гидроксильной группы в связывании Ь-малата подтверждается, меньшим сродством Б-малата (К, в 2,5 раза выше), и близким сродством к транспортеру О-ацил-Ь-мапатов и О-ацил-Б-малатов (табл. 4).

Зависимость К, от п для высших 2-алкилмалонатов с п от 7 до 13 подчиняется уравнению: ^Кл = - 0,_39п + 0,49, а для О- ацилмапатов в этой же зоне, уравнению:

= -0,38п + 1,41. Из этих данных следует, что инкремент ^К, для обеих зависимостей существенно превышает соответствующий инкремент для сукцинатдегидрогеназной зависимости (0,211), но совпадает с инкрементом для ^К. в зависимости коэффициента распределения О-ацил-Ь-малатов в системе октанол/вода при рН 7,2 (0,41). Это свидетельствует о преимущественно липофильном взаимодействии алифатической цепи ингибитора в соответствующей зоне активного центра транспортера. Вместе с тем инкремент ^К, на участке активного центра транспортера, соответствующем п от 13 до 17, (см. рис. 7) близок к инкременту для сукцинатдегидрогеназы, что, по-видимому, можно рассматривать как признак выхода концевого участка молекул ингибитора из канала переносчика, в котором присутствуют как полярные, так и липофильные аминокислотные остатки.

Зависимость ^К, от и для а,ю-Алкилендималонатов сходна с соответствующей зависимостью для 2-алкилмалонатов (см. рис. 8). На ней имеет место плато на начальном участке зависимости до п, равного б, и снижение ^К, на участке с п от 6 до 11.

По-видимому, равноудаленные от точки связывания субстрата метиленовые звенья ингибиторов всех трех гомологических рядов (О ацил-Ь-малаты, 2-алкилмалонаты и а,ю-алкилендималонаты) взаимодействуют с одинаковыми зонами в транспортере.

Разница в связывании производных с алифатической цепью одинаковой длины для 2-алкилмалонатов и а,ю-алкилендималонатов обусловлена дополнительной малонатной группировкой. По-видимому, наличие второй полярной группы в ингибиторе

препятствует липофильному взаимодействию а,со-алкилендималоната с «малым липофильным участком» активного центра транспортера.

-1 -2 -3 -4

|дк.

-5 -6 -7 -8

О 2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 П

Рис. 8. Зависимость константы ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий печени крыс а,ю-алкилендималонатами от количества атомов С (и) в алифатической цепи ингибитора.

Дикарбоксилатный транспортер плазматической мембраны дрожжей.

На рис. 9 видно, что О-ацил-Ь-мапатов линейно зависит от и в диапазоне и от 14 до 18 (т.е. на протяжении —0,6 нм), в соответствии с уравнением: ^К, = - 0,51п + 2,99.

Из этого уравнения следует, что зависимость характеризуется высоким инкрементом ^Кь который близок или даже несколько превышает соответствующий инкремент для коэффициента распределения (И) производных Ь-малата в системе октанол/вода 0- Эта зависимость имеет место при таких п (см. рис. 9), при которых в случае

Т I-1-1 I I I I I г

а,ю-Алкилендималонаты

2-Алкипмэпонаты \

' ' ' ■ ■ | ■ ' ' '

дикарбоксилатного транспортера митохондрий наблюдается переход в «липофильно-гидрофильную область» активного центра. По-видимому, такая особенность транспортера плазматической мембраны 5 сегечтае связана с тем, что активный центр у плазматического транспортера в области выхода из канала имеет более липофильное окружение, чем у митохондриального транспортера.

-3

-4

-5

|дк -

-6

-7

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 П

Рис. 9. Зависимость константы ингибирования дыхания клеток сегеуише с сукцинатом О-ацил-Ь-малатами от количества атомов С (л) в алифатической цепи ингибиторов

Другой особенностью дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны дрожжей является то, что в данном случае К, О-ацил-Ь-малатов (рис. 9) примерно на порядок выше, чем К, этих соединений для митохондриального транспортера (рис. 7). По-

видимому, основная причина этого связана с тем, что в данном случае измерения проводятся в среде с рН 5,5 (на митохондриях печени- рН 7,2). Кроме того надо отметить, что сродство сукцината к митохондриальныму и дрожжевыму транспортерам отличается почти на порядок (1,03 и 7,3 мМ, соответственно).

Необходимо заметить, что дикарбоксилатный транспортер плазматической мембраны клеток S. cerevisiae относится к другому типу переносчиков, чем соответствующий транспортер митохондрий. В отличие от дикарбоксилатного транспортера митохондрий, который является антипортером, транспортер плазматической мембраны переносит субстраты в симпорте с протонами.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В работе используется набор производных субстратов дикарбоксилатного транспортера, представляющих собой субстрат с липофильным алифатическим заместителем различной длины (рис. 11). Поскольку эти соединения, являясь конкурентными ингибиторами, взаимодействуют с точкой связывания субстратов, они является своеобразным калибровочным устройством, позволяющим зондировать окружение вблизи точки связывания субстрата с шагом, равным длине метиленового звена. При этом уменьшение сродства после удлинения ингибитора на одно метальное звено интерпретируется как наличие стерических препятствий в области этого звена. Увеличение же сродства рассматривается как признак попадания этого звена в липофильное окружение на данйом расстоянии от точки связывания субстрата.

Зондирование активного центра сукцинатдегидрогеназы (рис. 6 и табл. 3) с помощью моно- и. диалкилмалонатов показало, что на расстоянии 0,38 - 0,62 им от точки связывания субстрата в активном центре фермента есть стерическое препятствие.

На расстоянии от 0,62 до 1,2 нм от точки связывания субстрата в ферменте присутствует область, в которой, по-видимому, присутствуют равномерно распределенные липофильные и гидрофильные остатки аминокислот, так как инкремент ^К, в этой области в два раза ниже характерного для липофильного окружения (рис. 1).

>

Рис. 10. Модель функционирования транспортера дикарбоксилатов. При освобождении субстрата (Э2") канал остается открытым, чему способствует положительно заряженные группы в канале, локализованные на подвижных а-спиралях. После нейтрализации зарядов, что происходит при связывании субстрата, переносчик флуктуирует между двумя альтернативными состояниями в результате теплового ■ движения подвижных мембранном сегментов (обозначены серым). При наличии двух субстратов и Бг) может происходить их обмен в точке связывания.

В дикарбоксилатном транспортере митохондрий печени крыс область вблизи точки связывания субстратов просторна. Ее диаметр составляет не менее 0,72 нм (диаметр молекулы дилкилмалоната при параллельном расположении алифатических заместителей) (см. рис. 11). В то же время гидрофильная зона на расстоянии 0,45 - 0,72 нм от точки связывания субстрата, сменяется липофильной, на расстоянии до 1,7 нм, и снова липофильно-гидрофильной с инкрементом, близким к характерному для просторной зоны сукцинатдегидрогеназы.

Возможно, в отличие от транспортеров в сукцинатдегидрогеназе вблизи аминокислотных остатков, связывающих дианион субстрата, существуют дополнительные остатки, обеспечивающие за счет многоточечного взаимодействия, высокое сродство фермента к малонату. Они то и создают стерические препятствия.

Результаты зондирования активного центра дикарбоксилатного транспортера митохондрий крыс с помощью трех рядов ингибиторов (рис. 7 и 8) показали, что. малый липофильный домен вблизи точки связывания субстрата (расстояние 0,4 - 0,72 нм) и большой липофильный домен (расстояние 1,2-1,9 нм) разделены гидрофильной областью (расстояние 0,72 - 1,2 нм), в котором отсутсвуют положительно заряженные аминокислотные остатки. Если увеличение гидрофильности в зоне 1,9 - 2,3 нм свидетельствует о достижении относительно полярного выхода из канала, то точка связывания субстрата погружена вглубь транспортера и находится примерно в 2 нм от поверхности мембраны. Эти результаты позволяют поместить точку связывания дикарбоксилата на модели в центр транспортера. В просторную область, диаметром не менее 0,72 нм. Возможно, консервативный А^-69, локализованный в центре сегмента II, может входить в ее состав. Гидрофильная область канала способствует проникновению к точке связывания гидрофильного субстрата, а большой липофильный домен является элементом воротного механизма.

Рис. 11. Основные субстраты дикарбоксилатногб транспортера и его конкурентные ингибиторы, использованные в данной работе для зондирования активного центра переносчика

Сравнительное зондирование двух транспортеров (рис. 7 и 9), принадлежащих 4 эволюционно далеким организмам и отличающихся по механизму действия показало, что достаточно протяженная липофильная зона (0,6 нм), занимающая по крайней мере четверть длины канала, удаленная от точки связывания дикарбоксилатов на 1,2 нм

присутствует и в дикарбоксилатном транспортере плазматической мембраны 5. сет151ае (рис. 9). Таким образом, канал с поверхностью, выстланной гидрофобными аминокислотными остатками между точкой связывания субстрата с одной стороны и выходом из канала является общей особенностью плазмолеммного и митохондриального транспортеров, для симпортера и антипортера.

В построении модели функционирования дикарбоксилатного транспортера митохондрий (рис. 10 и 11) использованы литературные и изложенные выше экспериметальные данные. Канал образован двумя одинаковыми субъединицами. Трансмембранный а-спиральный сегмент И, содержащий в центре инвариантный остаток аргинина - подвижный. Дикарбоксилат нейтрализует положительные заряды точки связывания и способствует открыванию транспортера на противоположную сторону мембраны в ходе тепловой флуктуации. Если там присутствует субстрат, то происходит обмен. Флуктуации канала транспортера без субстрата невозможно. Наши данные позволяют количественно описать переменную липофильностъ стенок канала по мере удаления от точки связывания субстрата и объяснить функциональный смысл этого (см. выше). Существование раздвигающихся сегмей|ов согласуется с движением относительно друг друга гидрофильных петель, связанных с этими сегментами в ходе акта транспорта. Последнее продемонстрированоКлингенбергом и соавторами для аденилатного переносчика дрожжей.

выводы

1. Проведено зондирование активного центра функционирующих дикарбоксилатных транспортеров митохондрий печени крыс и плазматической мембране клеток £ сегеуише с помощью набора алкил- и ацил-производных мапата и малоната.

2. Показано, что в активном центре транспортера митохондрий присутствуют большой и малый липофильные домены, разделенные полярным участком. В канале транспортера присутствует только одна точка связывания субстратов, в области которой отсутствуют стерические препятствия для связывания субстратов. Показано, что гидроксильная группа Ь-малата участвует в связывании этого субстрата в транспортере.

3. Показано, что в функционирующей сукцинатдегидрогеназе печени крыс область связывания субстрата имеет размеры, создающие стерические препятствия для связывания аналогов субстрата. Однако вблизи этой области находится просторный липофильно-гидрофильный участок.

4. Обнаружено, что в активном центре дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны дрожжей также присутствует большой липофильный домен, который, по-видимому, является обязательным элементом активного центра транспортеров.

5. Разработан метод оценки проницаемости клеток 5. cerevisiae для амфифильных кислот. Показано, что О-адил-Ь-малаты не проникают в клетки и поэтому взаимодействуют только с дикарбоксилатным транспортером плазматической мембраны.

6. Установленные функционально важные особенности структуры активного центра дикарбоксилатного транспортера использованы для конкретизации модели функционирования дикарбоксилатного транспортера.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шольц К.Ф., Мамаев Д.В. Взаимодействие цитохрома с с белками митохондрий и цибакрон-декстраном. II Биохимия 1985 Т. 50. №11. С. 1877 - 1883.

2. Мамаев Д.В., Шольц К.Ф. Взаимодействие цитохрома с с сукцинатоксидазой и ротенон-нечуствнтельной НАДН-оксидазой в межмембранном пространстве. "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена", Всесоюз. конференция 11-13 июня 1986 г., Пущино. Тезисы докладов.

3. Шольц К.Ф., Мамаев Д.В., Гладких А.Г. Взаимодействие 2-алкилмалонатов с дикарбоксилатным переносчиком в интакгных митохондриях. II Доклады АН СССР 1987. Т. 294. С. 1509-1514.

4. Sholtz K.F., Mamaev D.V. Mechanism of dicarboxylate carrier action: conformational or rotatory model". Abstracts of international conference "Chemical Physics of Enzyme Catalysis" (Tallinn, Sept., 21-22,1987) P. 143.

5. Шольц К.Ф., Мамаев Д.В., Бондаренко Д.И., Лагутина Л.С. Особенности взаимодействия 2-алкилмалонатов с центром связывания суб.стратов дикарбоксилатного переносчика митохондрий печени крыс. // Биохимия. 1990. Т. 55. № 10. С. 1832- 1840.

6. Sholtz K.F., Bondarenko D.I., Mamaev D.V. Probing the active center of the mitochondrial dicarboxylate transporter. И FEBS Lett. 1993. V. 327. № 1. P. 54 - 56.

7. Бондаренко Д.И., Мамаев Д.В., Шольц К.Ф. Локализация точек связывания субстратов в дикарбоксилатном транспортере митохондрий. И Доклады АН. 1996. Т. 349. № 3. С. 408 - 410.

8. Aliverdieva D.A., Mamaev D.V., Bondarenko D.I., Sholtz K.F. Studies on cell respiration of Saccharomyces cerevisiae: physiological significance of dicarboxylate transporter of plasma membrane. Abstracts of the Meeting of the FEBS (30.06.-5.07.2001), Lisbon, Portugal. (Poster PW8-005), P.223.

9. Аливердиева Д.А., Мамаев Д.В., Бондаренко Д.И., Шольц К.Ф. Роль дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны в дыхательной активности клеток Saccharomyces cerevisiae. Тезисы научных докладов на III съезде биохимического общества (26.06. - 01.07.2002, Санкт-Петербург), С.237-238.

«

с

Типография ИМАЩ РАН, г. Москва, М. Харитоньевский пер , 4

Лиц. ПД № 00492 от 12.04.2000

Зак. № 2 05 от 2& .05 2003 тир. 100 экз.

(c¿<=><=>¿-~(j

-,9 2 4 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мамаев, Дмитрий Владимирович

Введение.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Структура и предполагаемые механизмы функционирования дикарбоксилатных переносчиков.

Глава 1. Типы транспортеров, переносящих дикарбоксилаты.

Глава 2. Первичная структура транспортеров дикарбоксилатов.

2.1. Митохондриальные транспортеры.

2.2. Транспортеры бактерий.

2.3. Транспортеры плазматической мембраны.

Глава 3. Вторичная структура транспортеров дикарбоксилатов.

3.1. Митохондриальные транспортеры.

3.2. Транспортеры плазматической мембраны эукариотов.

3.3. Бактериальные транспортеры.

Глава 4. Активный центр дикарбоксилатных транспортеров.

4.1. Активный центр мембранного фермента: Сукцинатдегидрогеназа.

4.2. Четвертичная структура транспортеров.

4.3. Точки связывания субстратов в транспортерах дикарбоксилатов.

4.4. Канал в активном центре переносчиков дикарбоксилатов.

- 4.5. Организация дикарбоксилатных транспортеров в интерфазе.

Глава 5. Модели функционирования дикарбоксилатных переносчиков.

5.1. Типы рассматривавшихся моделей.

5.2. Модель переносчика с изменяющимся каналом.

5.3. Количество точек связывания субстрата в транспортере.

ЗАДАЧА ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 6. Материалы и методы.

6.1. Среды.

6.2. Выделение митохондрий.

6.3. Выращивание и подготовка дрожжей S. cerevisiae.

6.4. Измерение скоростей дыхания.

6.5. Получение субмитохондриальных частиц.

6.6. Определение состава препаратов субмитохондриальных частиц.

6.7. Определение доли доступной мембранной фазы клеток.

6.8. Другие методы.

6.9. Реактивы и материалы.

6.10. Расчеты.

Глава 7. Результаты исследования.

7.1. Характеристика сопряженных систем.

7.2. Зондирование активного центра сукцинатдегидрогеназы.

7.3. Зондирование дикарбоксилатного транспортера митохондрий печени крыс.

7.4. Зондирование дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны

Глава 8. Обсуждение результатов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизма функционирования дикарбоксилатного транспортера митохондрий"

Четырехуглеродные дикарбоксилаты (прежде всего L-малат и сукцинат) играют важную роль в метаболизме. Они являются интермедиатами цитратного цикла, локализованного в митохондриях. Окисление дикарбоксилатов необходимо для окислительного фосфорилирования, основного поставщика АТФ в клетке.

Наряду с участием в обмене веществ особую роль играет специфический транспорт этих метаболитов через биологические мембраны. Так, например, транспорт L-малата через митохондриальную мембрану связан с так называемым транспортом восстановительных эквивалентов, необходимым для обеспечения взаимодействия между двумя изолированными пулами никотинамидадениндинуклеотидов - митохондриальным и цитозольным. Транспорт сукцината через митохондриальную мембрану обеспечивает взаимосвязь между обменом в пероксисомах и митохондриях.

Особую роль играет транспорт L-малата через плазматическую мембрану клетки, поскольку этот дикарбоксилат, благодаря его особой роли в основном обмене может служить источником углерода, необходимого для роста в аэробных условиях клеток эукариотов. На важность этого процесса указывает то, что у этих организмов дикарбоксилатиый транспортер индуцируется при наличии в среде обитания L-малата. Надо отметить, что дикарбоксилатиый переносчик был обнаружен у организмов, рост которых дикарбоксилаты не поддерживают. Хотя эти организмы могут ассимилировать экзогенные о дикарбоксилаты в присутствии других источников углерода, функция дикарбоксилатного переносчика в этом случае не установлена.

Дикарбоксилатный транспортер митохондрий относится к особому митохондриальному семейству переносчиков, которые структурно отличаются от других переносчиков этого типа. Структурные особенности этих транспортеров отражают и специфику их функционирования. Так, транспорт дикарбоксилатов немитохондриальными переносчиками сопряжен с транспортом катионов. Есть группа переносчиков, которая в качестве катионов использует ионы натрия. Другая группа переносит дикарбоксилаты в симпорте с протонами. Эта зависимость транспорта дикарбоксилатов от катионов, по-видимому, связана с тем, что этот процесс контролируется Н+-АТФазами плазматической мембраны, т.е. зависит от энергетического состояния клетки.

Изучению структуры и особенностей функционирования дикарбоксилатных переносчиков уделяется значительное внимание. В частности, для некоторых из них определена первичная структура. Однако многое остается неясным. Особенно мало известно о молекулярном механизме функционирования этих транспортеров. В частности, не установлены принципиальные для функции переносчиков особенности структуры их активного центра, включающего точки связывания дикарбоксилатов и каналы, по которым поступают субстраты к этим точкам связывания.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

СТРУКТУРА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ДИКАРБОКСИЛАТНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мамаев, Дмитрий Владимирович

выводы

1. Проведено зондирование активного центра функционирующих дикарбоксилатных транспортеров митохондрий печени крыс и плазматической мембране клеток S. cerevisiae с помощью набора алкил- и ацил-производных маната и малоната.

2. Показано, что в активном центре транспортера митохондрий присутствуют большой и малый липофильные домены, разделенные полярным участком. Во внешнем полуканале транспортера присутствует только одна точка связывания субстратов, в области которой отсутствуют стерические препятствия для связывания субстратов. Показано, что гидроксильная группа L-малата участвует в связывании этого субстрата в транспортере.

3. Показано, что в функционирующей сукцинатдегидрогеназе печени крыс область связывания субстрата имеет размеры, создающие стерические препятствия для связывания аналогов субстрата. Однако вблизи этой области находится просторный липофильно-гидрофильный участок.

4. Обнаружено, что в активном центре дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны дрожжей также присутствует большой липофильный домен, который, по-видимому, является обязательным элементом активного центра транспортеров.

5. Разработан метод оценки проницаемости клеток S. cerevisiae для амфифильных кислот. Показано, что О-ацил^-малаты не проникают в клетки и поэтому взаимодействуют только с дикарбоксилатным транспортером плазматической мембраны.

6. Установленные функционально важные особенности структуры активного центра дикарбоксилатного транспортера использованы для конкретизации модели функционирования дикарбоксилатного транспортера.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мамаев, Дмитрий Владимирович, Москва

1. Аливердиева Д.А., Шольц К.Ф. Количественное определение общего белка митохондрий с кумасси. // Прикл. биохим. микробиол. 1984. Т. 20. № 6. С. 823 - 830.

2. Виноградов А.Д. Сукцинат-убихинон редуктазный участок дыхательной цепи. // Биохимия.1986. Т. 51. № 12. С. 1944 1973.

3. Котляр А.Б., Виноградов А.Д. Взаимодействие сульфат-иона с активным центром сукцинатдегидрогеназы. // Биохимия 1984. Т. 49. № 2. С. 179 184.

4. Котляр А.Б., Виноградов А.Д. Константы диссоциации комплексов сукцинатдегидрогеназы с сукцинатом, фумаратом и малонатом. // Биохимия 1984. Т. 49. №3. С. 511-518.

5. Мосолова И.А., Горская И.А., Шольц К.Ф., Котельникова А.В. Получение прочносопряженных митохондрий из печени крысы, стабильных при хранении. // Вопр. мед. химии. 1971. Т. 17. № 3. С. 286.

6. Шольц К.Ф. Транспорт субстратов в митохондрии. // Усп. биол. химии. 1994. Т. 34. С.167.187.

7. Шольц К.Ф., Аливердиева Д.А., Снежкова Л.Г., Мирошников А.И., Котельникова А.В. Действие мастопарана из яда шершня на митохондрии. // Докл. АН СССР. 1983. Т. 273. Вып. 3. С. 747-750

8. Шольц К.Ф., Захарова Т.С. Определение действующей концентрации гидрофобных агентов в митохондриях. //В кн.: Биохимические методы. / Под ред. В.Л. Кретовича и К.Ф. Шольца. 1980. М.: Наука. С. 141 147.

9. Шольц К.Ф., Островский Д.Н. Ячейка для амперометрического определения кислорода. // В кн.: Методы современной биохимии. / Под ред. В.Л. Кретовича и К.Ф. Шольца. 1975. М.: Наука. С.52-58.

10. Ackrell В.А., Kearney Е.В., Singer Т.Р. Effect of membrane environment on succinate dehydrogenase activity. // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. № 5. P. 1582 1589.

11. Arand M., Friedberg Т., Oesch F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. // Analyt. Biochem. 1992. V. 207. № 1. P. 73 75.

12. Bai L., Pajor A.M. Expression cloning of NaDC-2, an intestinal Na+- or Li+-dependent dicarboxylate transporter. // Am. J. Physiol. 1997. V. 273. V. 2. Pt. 1. P. G267 G274.

13. Bandell M., Lolkema J.S. Stereoselectivity of the membrane potential-generating citrate and malate transporters of lactic acid bacteria. // Biochemistry. 1999. V. 38. № 32. P. 10352 -10360.

14. Barbour R.L., Chan S.H.P. Characterization of the kinetics and mechanism of the mitochondrial ADP-ATP carrier. //J. Biol. Chem. 1981. V. 256. № 4. P. 1940 1948.

15. Bay L., Pajor M. Expression cloning of NaDC-2, an intestinal Na+- or Li+-dependent dicarboxylate transporter. // Am. J. Physiol. 1997. V. 273. № 2. Pt.l. P. G267 G274.

16. Becker J.M., Enari E., Levitzki A. Guanine nucleotide regulation of adenylate cyclase in permeabilized cells of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 968. № 3. P. 408-417.

17. Belikova Y.O., Kotlyar А.В., Vinogradov A.D. Oxidation of malate by the mitochondrial succinate-ubiquinone reductase. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 936. № 1. P. 1 9.

18. Beyer K., Klingenberg M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. // Biochemistry. 1985. V. 24, № 15. P. 3821 3826.

19. Bisaccia F., De Palma A., Dierks Т., Kramer R., Palmieri F. Reaction mechanism of the reconstituted tricarboxylate carrier from rat liver mitochondia. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1142. №1/2. P. 139 145.

20. Bisaccia F., De Palma A., Prezioso G., Palmieri F. Kinetic characterization of the reconstituted tricarboxylate carrier from rat liver mitochondria. // Biochim. Biophys. Acta. 1990 V. 1019. № 3. P. 250 -256.

21. Bisaccia F., Indivery C., Palmiery F. Purification and reconstitution of two anion carrier from rat liver mitochondria: the dicarboxylate and 2-oxoglutarate carrier. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 933. № 2. P. 229 240.

22. Black S.D., Mould D.R. Development of hydrophobicity parameters to analyze proteins which bear post- or cotranslational modifications. // Analyt. Biochem. 1991. V. 193. № 1. P. 72 82.

23. Bradford M.M. // Analyt. Biochem. 1976. V. 72. № 1/2. P. 248 254. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

24. Capobianco L., Bisaccia F., Michel A., Sluse F.E., Palmiery F. The N- and C- termini of the tricarboxylate carrier are exposed to the cytoplasmic side of the inner mitochondrial membrane. // FEBS Lett. 1995. V. 357. № 2. P. 297 300.

25. Chance В., Williams G.R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. // Adv. Enzymol. 1956. V. 17. P. 65 134.

26. Chen X.Z., Shayakul C., Berger U.V., Tian W., Hediger M.A. Characterization of a rat Na -dicarboxylate cotransporter. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 33. P. 20972 20981.

27. Corte-Real M., Leao C., van Uden N. Transport of L(-)malic acid and other dicarboxylic acids in the yeast Candida sphaerica. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. № 5/6. P. 551 -555.

28. David S., van der Rest M.E., Driessen A.J.M., Simons G., De Vos W.M. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the Lactococcus lactis citrate permease gene. // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № 10. 5789 5794.

29. Duyckaerts C., Sluse-Goffart C.M., Fux J.-P., Sluse F.S., Liebecq C. Kinetic mechanism of the exchanges catalysed by the adenine-nucleotide carrier. // Europ. J. Biochem. 1980. V. 106. № l.P. 1-6.

30. Engel P., Kramer R., Unden G. Anaerobic fumarate transport in E. coli by an fur-dependent dicarboxylate uptake system which is different from the aerobic dicarboxylate uptake system. J. Bacteriol. 1992. V. 174. № 17. P. 5533 5539.

31. Engel P., Kramer R., Unden G. Transport of C4-dicarcoxylates by anaerobically grown Escherichia coli: energetics and mechanism of exchange, uptake and efflux. // Europ. J. Biochem. 1994. V. 222. № 4. P. 605 -614.

32. Fiermonte G., Dolce V., Arrigoni R., Runswick M.J., Walker J.E., Palmieri F. Organization and sequence of the gene for the human mitochondrial dicarboxylate carrier: evolution of the carrier family. // Biochem. J. 1999. P. 344. № 3. P. 953 960.

33. Franke W. Uber die Wirkung alkylierter Bernsteinsauren auf Succinodehydrase und andere Dehydrasen. // Z. Physyol. Chem. 1944. B. 280. № 1. S. 76 87.

34. Gawron O., Glaid A J., Fondy T.P., Bechtold M.M. Stereochemistry of the succinic dehydrogenase system.// Nature 1961. V. 189. № 4769. V. 1004 1005.

35. Genchi G., De Santis A., Ponzone C., Palmieri F. Partial purification and reconstitution of the a-ketoglutarate carrier from corn (Zea mays L.) mitochondria. // Plant Physiol. 1991. V. 96. № 4. P. 1003 1007.

36. Goa J. A micro biuret method for protein determination. Determination of total protein in cerebrospinal sluid. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1953. V. 5. P. 218 222.

37. Golby P., Kelly D.J., Guest J.R., Andrews S.C. Topological analysis of DcuA, an anaerobic C4-dicarboxylate transporter of Escherichia coli. II J.Bacteriology. 1998. V. 180. № 18. P. 4821 -4827.

38. Griffith D.A., Pajor A.M. Acidic residues involved in cation and substrate interaction in the Na+/dicarboxylate cotransporter, NaDC-1. // Biochemistry. 1999. V.38. № 23. P. 7524 7531.

39. Grobler J., Bauer F., Subden R.E., van Vuuren H.J.J. // Yeast 1995. V. 11. № 15. P. 14851491. The mael gene of Schizosaccharomyces pombe encodes a permease for malate and other C4 dicarboxylic acids.

40. Hackenberg H., Klingenberg M. // Biochemistry. 1980. V. 19. № 3Л. P. 548 555 Molecular weight and hydrodynamic parameters of the adenosine 5'-diphosphate - adenosine5'-triphosphate carrier in Triton X-100.

41. Hagerhall C. Succinate:quinone oxidoreductases. Variations on a conserved theme. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1320. P. 107 141.

42. Haslam J.M., Griffiths D.E. Factors affecting the translocation of oxaloacetate and L-malate into rat liver mitochondria. // Biochem. J. 1968. V. 109. № 5. P. 921 928.

43. Hatefi Y. The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. // Annu. Rev. Biochem. 1985. V. 54. P. 1015 1071.

44. Herick K., Kramer R. Kinetic and energetic characterization of solute flux through the reconstituted aspartate/glutamate carrier from beef heart mitochondria after modification with mercurials. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. P. 1238. № 1. P. 63 71.

45. Hill M. W. The effect of anaesthetic-like molecules on the phase transition in smectic mesophases of dipalmitoyllecithin. I. The normal alcohol up to C=9 and three inhalation anaesthetics. // Biochim. Biophys. Acta. 1974. P. 356. № 1. P. 117 124.

46. Indiveri C., Capobianco L., Palmieri F. // Int. J. Biochem. 1988. V. 37. № 5. P. 321A 323A. Kinetics of the mitochondrial dicarboxylate carrier reconstituted into liposomes.

47. Indiveri С., Diercs Т., Kramer R., Palmiery F. Kinetic discrimination of two substrate binding sites of reconstituted dicarboxylate carrier from rat liver mitochondria //Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 977. № 2. P. 194 199.

48. Janausch I.G., Zients E., Tran Q.H., Kroger A., Unden G. C4-dicarboxilate carriers and sensors in bacteria // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1553. № 1. P. 39 56.

49. Kahn E.S., Pajor A.M. Determinants of substrate and cation affinities in the Na+/dicarboxylate cotransporter. // Biochemistry 1999. V. 38. № 19. P. 6151 6156.

50. Kaplan R.S., Mayor J.A., Brauer D., Kotaria R., Walters D.E., Dean A.M. The yeast mitochondrial citrate transport protein. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 16. P. 12009 12016.

51. Kaplan R.S., Mayor J.A., Gremse D.A., Wood D.O. High level expression and characterization of the mitochondrial citrate transport protein from the yeast Saccharomices cerevisiae II J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 8. P. 4108 4114.

52. Kaplan R.S., Mayor J.A., Wood D.O. The mitochondrial tricarboxylate transport protein. cDNA cloning, primary structure, and comparison with other mitochondrial transport proteins. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. № 18. P. 13682 13690.

53. King Т.Е. Preparation of succinate-cytochrome с reductase and the cytochrome bcl particles and reconstitution of succinate-cytochrome с reductase // In: Methods in Enzymology. 1967. V. 10. P. 216-225.

54. Klingenberg M. // 1970 In: Essays in Biochemistry V. 6. / Campbell P.N., Dickens F., eds.1970. London, New York: Academic Press. P.l 19-159. Metabolite transport in mitochondria: An example for intracellular membrane function.

55. Klingenberg M. Molecular aspects of the adenine nucleotide carrier from mitochondria. // Arch. Biochem. Biophys. 1989. V. 270. № 1. P. 1 14.

56. Klingenberg M. Mechanistic and energetic aspects of carrier catalysis. // In: New Trends in

57. Biological Chemistry / Ed. by Ozawa T. 1991. Tokyo et al.: Japan Scientific Soc.Press and Springer-Verlag. P. 257-267.

58. Klingenberg M., Appel M. The uncoupling protein dimer can form a disulfide cross-link between the mobile C-terminal SH groups // Europ. J. Biochem. 1989. V. 180. № 1. P. 123 -131.

59. Kolarov J., Klingenberg M. The adenosine nucleotide translocator in genetically and physiologically modified yeast mitochondria// FEBS Lett. 1974. V. 45. № 1. P. 320 323.

60. Kolarov J., Kolarova N., Nelson N. A third ADP/ATP translocator gene in yeast. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. № 21. P. 12711 12716.

61. Kornfeld R., Kornfeld S. Assembly of asparagine-linked oligosacharides. // Annu. Rev. Biochem. 1985. V. 54. P. 631 634.

62. Kotlyar A.B., Vinogradov A.D. Evidence for an essential arginine residue in the substrate binding site of the mammalian succinate dehydrogenase. // Biochem. Int. 1984. V. 8. № 4. P. 545 552.

63. Krupka R.M. Interpreting the effects of specific protein modification on antiport coupling mechanisms: The case of the aspartate/glutamate exchanger. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1236. № 1. P. 1 -9.

64. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydrophobic character of a protein. // J. Mol. Biol. 1982. V. 157. №1. P. 105 132.

65. Lolkema J.S., Speelmans G., Konings J.S. Na+-coupled versus bT-coupled energy transduction in bacteria.// Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1187. № 2. 211 215.

66. Majima E., Takeda M., Miki S., Shinohara Y., Terada H. Close location of the first loop facing the matrix of the mitochondrial ATP/ADP carrier deduced from cross-linking catalyzed by cooper-o-phenanthroline // J. Biochem. 2002. V. 131. № 3. P. 461 468.

67. Marty I., Brandolin G., Gagnon J., Brasseur R., Vignais P.V. Topography of the membrane,, bound ADP/ATP carrier assessed by enzymatic proteolysis // Biochemistry. 1992. V. 31. №1116. P. 4058-4065.

68. Marty-Teysset C., Lolkema J.S., Schmitt P., Davies C., Koning W.N. Membrane potential-generating transport of citrate and malate catalyzed by CitP of Leuconostos mesenteroides // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 43. P. 25370 25376.

69. Mcintosh A.C., Oliver D.J. Isolation and characterization of the tricarboxylate transporter from pea mitochondria // Plant Physiol. 1992. V. 100. № 4. P. 2030 2034.

70. Meijer A.J., Van Woerkom G.M., Eggelte T.A. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 430. № l. P. 53 61. Phtalonic acid, an inhibitor of a-oxoglutarate transport in mitochondria.

71. Mitchell P. A general theory of membrane transport from studies of bacteria. // Nature. 1957. V.180. №4577. P. 134- 136.

72. Mitchell P. // Nature 1957. V. 180. № 4577. P. 134 136. A general theory of membrane transport from studies of bacteria.

73. Mohana Rao J.K., Argos P. A conformational preference parameter to predict helices in integral membrane protein // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 869. № 2. P. 197 214.

74. Morel F., Lauquin G., Lunardi J., Duszynski J., Vignais P.V. An appraisal of the functional X significance of the inhibitory effect of long chain acyl-CoAs on mitochondrial transports. //

75. FEBS Lett. 1974. V. 39. № 2. P. 133 138.

76. Mtiller V., Heidkamper D., Nelson D.R., Klingenberg M. Mutagenesis of some positive and negative residues occurring in repeat triad residues in the ADP/ATP carrier from yeast // Biochemistry. 1997. V. 36. № 50. P. 16008 16018.

77. Ogin C., Grassl S. M. Dicarboxylate transport in human placental brush-border membrane vesicles // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 980. № 3. P. 248 254.

78. Ojcius D.M., Young J.D.-E. Cytolytic pore-forming proteins and peptides: is there a common structural motif? // Trends in Biochem. Sci. 1991. V. 16. № 6. P. 225 229.

79. Osothsilp C., Subden R.E. Malate transport in Schizosaccharomyces pombe II J. Bacteriol. 1986. V. 168. №3. P. 1439- 1443.

80. Pajor A.M. Sequence and functional characterization of renal sodium/dicarboxylate cotransporter. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 11. P. 5779 5785.

81. Nat/dicarboxylate cotransporter//J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 30. P. 18923 18929.

82. Pajor A.M., Sun N. Characterization of the rabbit renal Na+-dicarboxylate cotransporter using antifusion protein antibodies // Am.J.Physiol. 1976. V. 271. № 6. Pt. 1. P. С1808 CI816.

83. Palmieri F., Bisaccia F., Capobianco L., Iacobazzi V., Indiveri C., Zara V. Structural and functional properties of mitochondrial anion carriers // Biochim. Bophys. Acta. 1990. V. 1018. №2/3. P. 147- 150.

84. Palmieri F., Prezioso G., Quagliariello E., Klingenberg M. Kinetic study of the dicarboxylate carrier in rat liver mitochondria// Europ. J. Biochem. 1971. V. 22. № 1. P. 66 74.

85. Parry G., Palmer D. N., Williams D.J. Ligand partitioning into membranes: its significance in determining Км and Ks values for cytochrome P-450 and other membrane bound receptors and enzymes. // FEBS Lett. 1976. V. 67. № 2. P. 123 129.

86. Passarella S., Quagliariello E. The citric cycle intermediates transport to rat liver mitochondria. //Biochimie 1976. V. 58. № 8. P. 989 1001.

87. Poolman В., Molenaar D., Smid E.I., Ubbik Т., Abee Т., Renault P.P., Konings W.N. Malolactic fermentation: electrogenic uptake and malate/lactate antiport generate metabolic energy. // J. Bacteriol. 1991. V. 173. № 19. P. 6030 6037.

88. Pos K.M., Dimroth P., Bott M. The Escherichia coli citrate carrier Cit T: a member of a novel eubacterial transporter family related to the 2-oxoglutarate/malate translocator from spinach chloroplasts. //J.Bacteriol. 1998. V. 180. № 16. P. 4160 4165.

89. Ragan C.I. The role of phospholipids in the reduction of ubiquinone analogues by the mitochondrial reduced nicotinamide-adenine dinucleotide-ubiquinone oxidoreductase complex. // Biochem. J. 1978. V. 172. № 3. P. 539 547.

90. Rentsch D., Gorlach J., Vogt E., Amrhein N., Martinoia E. The tonoplast-associated citrate binding (СВР) of Hevea brasiliensis. //J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 51. P. 30525 30531.

91. Robinson B.H., Williams G.R. The effect of mitochondrial oxidation of inhibitors of the dicarboxylate anion transporting system. // FEBS Lett. 1969 V. 5. № 4. P. 301 304.

92. Robinson K.M., Lemire B.B. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 14. P. 10101 10107.

93. Rogers S., Wells R., Rechsteiner M. Amino acid sequence common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. // Science. 1986. V. 234. № 4774. P. 364 368.

94. Runswick M.J., Walker J.E., Bisaccia F., Iacobazzi V., Palmieri F. Sequence of the bovine 2-oxoglutarate/malate protein: structural relationship to other mitochondrial transport protein // Biochemistry. 1990. V. 29. № 50. P. 11033 11040.

95. Saint-Macary M., Foucher B. Comparative partial purification of the active dicarboxylate transport system of rat liver, kidney and heart mitochondria // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. V. 133. № 2. P. 498 504.

96. Schroder I., Gunsalus R.P., Ackrell B.A.C., Cochran В., Cecchini G. Identification of active site residues of Escherichia coli fumarase reductase by site-directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. № 21. P. 13572 13579.

97. Schroers A., Burkovski A., Wohlrab H., Kramer R. The phosphate carrier from yeast mitochondria. Dimerization is a prerequisite for function // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 23. P. 14269 14276.

98. Schroers A., Kramer R., Wohlrab H. The reversible antiport-uniport conversion of the phosphate carrier from yeast mitochondria depends on the presence of a single cysteine // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 16. P. 10558 10564.

99. Skulachev V.P. Chemiosmotic systems in bioenergetics: IT^-cycles and Na+-cycles. // Bioscience reports 1991. V. 11. № 6. P. 387 441.

100. Smith R., Tanford C. Hydrophobicity of long chain n-alkyl carboxylic acids, as measured by their distribution between heptane and aqueous solutions // Proc. Natl. Acad. Sci. 1973. V. 70. №2. P. 289-293.

101. Sousa M.J., Mota M., Leao C. Transport of malic acid in the yeast Schizosaccharomyces pombe: evidence for a proton-dicarboxylate symport // Yeast 1992. V. 8. № 12. P. 1025 1031.

102. Stappen R., Kramer R. Kinetic mechanism of phosphate/phosphate and phosphate/OH antiports catalyzed by reconstituted phosphate carrier from bovine heart mitochondria// J. Biol. Chem. 1994. V. 269. № 15. P. 11240 11246.

103. Szewczyk A., Nal?cz M.J., Wojtczak L. Azido derivatives of dicarboxylic acids for photoaffinity labeling of mitochondrial carriers // J. Biochem. Biophys. Methods 1989. V. 18. №2. P. 125 134.

104. Terada H. Some biochemical and physicochemical properties of the potent uncoupler SF 6847 (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzylidenemalononitrile) // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 387. №3. P. 519 532.

105. Vik S.B., Hatefi Y. Possible occurrence and role of an essential histidyl residue in succinate dehydrogenase // Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. V. 78. № 11). P. 6749 6753.

106. Walker W.H., Singer T.P. Identification of the covalently bound flavin of succinate dehydrogenase as 8a (histidyl) flavin adenine dinucleotide // J. Biol. Chem. 1970. V. 245. № 16. P. 4224-4227.

107. Walmsly A.R. Shaw J.G., Kelly D.J. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 8064 8072. The mechanism of ligand binding to the periplasmic dicarboxylate binding protein (dct P) from Rh. capsulatus.

108. Webb I.L. Enzyme and metabolic inhibitors. V. 2. 1966. P. 36.

109. White M.K., Weber M.J. Leucine zipper motif update // Nature: 1989. V. 340. № 6228. P. 103 -104.

110. Wohlrab H. Molecular aspects of inorganic phosphate transport in mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 853. № 2. P. 115 -134.

111. Xu Y., Kakniashvili D.A., Gremse D.A., Wood D.O., Walters D.E., Mayor J.A., Kaplan R.S. The yeast mitochondrial citrate transport protein.

112. Yariv J., Steinberg I., Kalb A., Goldman R., Katchalski E. 1972 J.Theor.Biol.35(3)459-465. Permease as a rotatory carrier // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 10. P. 7117 7124.

113. Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю кандидату биологических наук Кристофору Францевичу Шольцу за конструктивные идеи, дотошное обсуждение результатов экспериментов и помощь в овладении новыми методами.

114. Я также благодарен кандидату биологических наук Дмитрию Иосифовичу Бондаренко за синтез используемых в работе соединений и кандидату биологических наук Динаре Алиевне Аливердиевой за помощь в проведении экспериментов с митохондриями дрожжей.

115. Я очень благодарен всему коллективу Лаборатории биологического окисления Института биохимии РАН за моральную поддержку, консультационную помощь и полезные советы.