Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение активного центра дикарбоксилатного переносчика митохондрий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение активного центра дикарбоксилатного переносчика митохондрий"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н.БАХА

На правах рукописи УДК 577.152.1

БОНДАРЕНкСлДмитрий Иосифович

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ДИКАРБОКСИЛАТНОГО ПЕРЕНОСЧИКА МИТОХОНДРИЙ

Специальность 03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в Лаборатории биологичекого окисления Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научный, руководитель -.кандидат, биологических наук К.Ф.Шольц

Официальные оппоненты:

'доктор биологических наук Е.Н.Мохова, НШ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ ^ доктор биологически: наук профессор А.А.Дмитровский, Институт биохимик им. А.Н.Баха РАН

Ведущая организация - Кафедра биохимии Биологического факультета

Московского государственного университета им. М.Б.Ломоносова

Защита состоится 31 октября 1995 г. на заседании Специализированного совета (К 002.96.01) по присуждении учёной степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (г. Москва, Ленинский проспект, д. 33, корпус 2)

Автореферат разослан 30 сентября 1995 г.

Учёный секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Транспортные процессы - чрезвычайно ванный лемент метаболизма. Особое место в этих процессах занимают перенос- • ики, осуществляющие транспорт, субстратов в митохондриях, в которых . экализованы главные метаболические пути (цитратный цикл, р-окислеше ярных кислот, ваккые этапы аммониогенеза и метаболизма аминокислот, нательная цепь), необходимые для выполнения основной функции мито-зндрий - окислительного 'фосфорклироввнкя. К настоящему времени во утренней митохондриальной мембране идентифицировано около 12 таких зревосчиков, в том числе один из важнейших - дикарбоксилатный, ос-звной функцией которого является транспорт малата в обман на фосфат.

Молекулярный механизм функционирования переносчиков, или транс-гртеров, интенсивно изучается во многих лабораториях. Столь приемное внимание к этой проблеме объясняется ролью, которую играют >анспоргеры в живых организмах. Так, например,, с нарушением функции феносчика глюкозы связано такое тяжёлое заболевание, как сахарный -1абвт. Можно также упомянуть переносчик, ответственный за резистент->сть к лекарствам при раковых заболеваниях. В основе сопряжения давая с фосфорилированием лежит транспорт протднов в митохондриях, осредоввнный Н+-АТФазой и белками дыхательной цепи.

Многие переносчики характеризуются сложной, структурной организа-ей, что затрудняет их исследование. Решению этой проблемы способст-ет изучение механизма функционирования одного из простых переносков - дикарбоксилатного. Для установления механизма важно знать руктуру активного центра транспортера.

. Информация о дикарбоксилатном переносчике, накопленная со' времени

э идентификации в £9Б6 г. ЮЬарреЦ], до сих пор остаётся недостачу .

точной для сколько-нибудь определённого представления о молекулярном механизме его функционирования. В 1980 г. Сэйнч-Макари и Фучэр отмечали, что "очень мало известно о механизме и химической структуре ди карбоксилатного переносчика"; к настоящему времени'это положение мал изменилось, так как, в частности, транспортер'очистить не удалось, хотя такие попытки предпринимались неоднократно, и его первичная структура не установлена.

Как следует из обзора литературы, об особенностях строения активного центра дпкарбоксилатного переносчика такте известно очень мало. Предлоаенные модели позволяют предполагать, что активный, центр должез иметь участки выраженной полярной я гидрофобной природа и, в частности, содержать два близкорасположенных полоямтельных заряда [НоЫпзоп вХ а!., 19Т23. Недавно также были получены данные [1пй1тег1 ег а!., 1993], позволившие сделать вывод о том, что переносчик может связывать субстрата одновременно с обеих сторон мктохондриальной мембраны, то.есть содержат, возможно» две точки.связывания. • ...

Шли и задачи исследования. С целью установления топографии активного центра дикарбохсилатного переносчика митохондрий решались следующие задачи: (1) синтез производных субстрата переносчика, содержащих последовательно наращиваемую гидрофобную алкильную цепь; (2) изучение особенностей действия этих соединений на переносчик в интак-тной мембране; (3) определение кинетических параметров этого действие и анализ "результатов зондирования активного центра переносчика.

Научная новизна и практическая значимость работы. Ранее подобные исследования активного центра дикарбоксилатного переносчика не проводились. Практическую значимость имеют исследованные конкурентные ингибиторы переносчика, -.которые могут быть использованы как основа лекарственных препаратов.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 работы и 1 находится в печати.

Апробация работа. Результаты исследования докладывались на Меаду-гародной конференция "Chemical Physics oi Enzyme Catalysis" (Tallinn, • (98T), Всесоюзной школе-конфзренщш "Проблемы мембранной биоэнергети-сия (Пущино, 1991 г.), на Молодежной конференции Института биохимии пл. А.Н.Баха РАН (1988 г., 2-я премия), на конкурсе лучших работ Инс-жтута биохимии (1993 г., 2-я премия).

Объём работы. Диссертация изложена на 130 с. и включает введение, >бзор литературы, описание методов исследования, изложение полученных юзультатов, их обсувдение, выводы и список использованной литературы 286 публикаций). Работа иллюстрирована 17 рисунками и 12 таблица?,и.

ЭКСПШйШИЕАЛЬНАЯ ЧАСТЬ АТЕРШИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Работа проводилась на митохондриях печени рыс, выделенных по методике Вайнбаха, модифицированной в Лаборатории юлогического окисления ИНБМ РАН. Субмитохондриальныа частицы голу-вля по модифицированной методике Сэйнт-Макари.

Измерение дыхания митохондрий. Активность переносчика в интактных ¿гохондриях определялась путём измерения скорости сопряжённой 'рэак-т сукцинвтоксидазн в условиях, в которых переносчик контролирует сорость процесса. 1

Сукцинатоксидаза митохондрий определялась при- 25° С ампероматри—. )ски на полярографэч.в термостатаруемой кислородной ячейке с закрыты-

г---------Ч .

ми электродами в среде, содержащей сахарозу (125 мМ), трас (20 мМ, рН 7,2), ЭДГА (2 i&j), хлориды калия (20 мМ) и магния (2,5 мМ), фосфат (10 мМ), ротешн (1 мкМ), протонофор 3,5-ди-шрет-бутил-4-оксибензили-денмалононитрия (0,2 мкМ).. Сукцинатдегидрогэназа субмитохондриальных частиц определялась фотометрически, при 420 вм'с^феррицианидом. Низшие алкилмалонаты добавлялись в виде водных растворов "их калиевых солей, высшие - в виде растворов свободных кислот в этаноле.

Синтез ингибиторов. Высшие н-алкилбромида получали по реакции Бородина - Хунсдаккора по модифицированной методике Оромдекарбоксилиро-ванием соответствующих жирных кислот в присутствии окиси ртути (метод 1). Сложные эфяры жирных кислот получали этерификацией этанолом в толуоле в присутствии серной кислоты (метод 2). Алтшалоновыа кислоты получали гидролизом их диэтиловых эфиров, полученных малоновым синтезом (методы 3 и 4) или конденсацией Кляйзена из сложного эфира жирной кислоты и диэтшюксалата с последующим декарбоншшрованием а-этокса-лилпроизводного (метод 5). 2,2-Диэтилмалоновая кислота была получена щелочным разложением 5,5-даэтилбарбитуровой кислоты (метод 6).'

Очистку алкилмалоновых кислот проводили перекристаллизацией из различных систем растворителей. Продукты характеризовали по максимуму поглощения (Ащах) и коэффициенту молярной эжстинкщш (smax) (см. таблицу), а также да температуре плавления. Содержание основного вещества в препаратах определяли с помощью ГЖХ их даметиловых эфиров; проверну индивидуальности соединений, кроме' того, проводили методом TGX.

Расчёты. Коэффициенты распределения алкилмалонатов ыавду липидыой фазой митохондрий и средой определялись ло методике, основанной на зависимости величины эффекта соединяя от содержания лшшда в суспензии митохондрий [Шольц, Захарова, 1980]. В расчётах принималось, . что содержание лшшда в митохондриях составляет 0,133 мг/мг белка.

иблица. Характеристика 2-алкил- и г.г-диалпммалоровнх кислот.

Содержание Тешэратура

меститель Мет°Д Выход, осн_ в_ва> ХШах. £шах плавления, ■ "СИЫТ9за * не менее/* ш 0 С

- - 99,5 213 84+2 134(р)

ТШ1 - - 99,0 214 137+6 .131-133

ил з 61 97,4' ' 214 146+2 111,2-111,8

опил 3 46 99,6 - - 97,1-97,5

тил 3 - - 99,8 212, ,5 - 156+6 101,6-102,5

нтил 3 51 99,7 213 161 ±7 83,0-83,8

ксил 3 47 99,1 - - 103,8-104,8

птил - - " 99,2 214 157+7 95,4-97,5

тил - - 98,5 213, ,5 163+4 111,2-112,0

НИЛ 3 58 99,1 213 157+7 103,0-104,0

ЦДЛ . - - 98,5 213 159+5 114,7-115,0

децил 2,5 26 99,4 - - 107-108

децил 3 21 99,0 2.13, ,5 159±3 119,2-120,0

адецил 2,5 25 97,0 - - 109,6-110,6

градецил 2,5 35 98,0 120,4-121,5

згадэцкл 1,3 31 98,0 214 168±3 112,0-113,2

гоадацил 2,5 46 97,0 - - 121,0-122,2

ггадецкл - - 78 - - 112-114

.гатил - _ _ ' - 99,98 _ _ _

)ТИЛ 6 52 99,8 213 175+4 126,3-126,7

фОШЕЛ ' 4 10 99,9 - - - 15Б-158(р)

!утил 4 27 99,7 214 193±3 157(р) '

Е9НТИЛ 4 5 99,8 214 170±2 111-113

"ексил 4 29 99,98 - - 109,8-110,4

1КТИЛ 4 75 99,0 213 193±3 91,5-92,0

[ОД6Ш1Л 4 ' 34 99,7 - - 81,8-82,4

т

Константы ингибирования рассчитывались по формулам: К± = Шк/(Кк - Ем) И ■ К± = I502M/(S + Яи),

где Кц и Ям - константы Михаэлиса для субстрата (найдены в координатах Лайнуивера - ВЭрка) в отсутствие и в присутствии ингибитора;' 1ао'

и I - концентрация ингибитора, вызывающая 50%-ное ингибирование (Haft's

дена в координатах Диксона), и использованная; S - концентрация субстрата.

Средние величины наблюдаемых констант ингибирования (К±) получены на 3 + 9 различных препаратах митохондрий. Исправленные значения piCi (pifi) определялись по" формуле, учитывающей действунцув (равновесную) концентрацию вещества в среде: pK'i = pKi + lg(ift + 1), где Я - коэффициент распределения ингибитора между мембранами митохондрий и средой, А. - концентрация липидного компонента мембран митохондрий в среде, в г/мл.

Инкременты свободной энергии мвкфазного переноса (ДЛСш) .и связы- . вания (ДДмвтиленовой группы алкильной цепи малонатов рассчитывались по формулам:

ДДСи = EELii(Hn/iJn+-i) И Мвъ Krin(Zi(n)/Ki(n+1>), где п - количество атомов углерода в алкильной цепи. \

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью прог-

N

раммы Scientific Fig. Processor. Для расчёта внутримолекулярных расстояний использовалась программа Desktop Molecular Modelling.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМИТИРУЮЩЕГО ЗВШ СУИДИНМОКСЗДАЗЫ ШТОХОНДОЙ

Прямые метода определения активности дикарбоксилатного переносчика сопряжены с методическими трудностями измерения начальной скорости транспорта и малопригодны для рутинных определений кинетических параметров взаимодействия переносчика с ингибиторами. При некоторых условиях этот переносчик может лимитировать скорость дыхания митохондрий дачени крыс [0иа^1аг1е11о et а!., 1968]. Поскольку измерение активности переносчика по дыханию значительно упростило бы условия эксперимента, а также позволило бы использовать более информативную непрерывную регистрацию процесса, необходимо было решить вопрос о возмож-юсти применения такого подхода в наших опытах.

Вило установлено, что зависимость скорости суквднатоксидазы ин-гакуных митохондрий от концентрации сукцината имеет линейный характэр-) координатах Лайнуиввра - БЭрка (см. рис. 1). Константа Михаэлиса по ¡укцинату в условиях наших экспериментов составляет 1,09 ± 0,21 ММ данные по 23 препаратам митохондрий) й близка к 2К по сукцинату для вреносчика, найденной изотопным методом [Оиа^1аг1е11о et а1., 974]. При этом максимальная скорость процесса - 258 нмоль-(мин-мг елка)-1 при 25°С - также близка к активности дикарбоксилатного пере-осчика в митохондриях.

Зависимость скорости дыхания митохондрий от концентрации моноал-илмалонатов в координатах Диксона имеет линейный характер (см. рис. ). Линейность этой зависимости обнаружена для- всех исследованных на-соединений этого 'ряда. Найденное Н8ми значение Кх для 2-бушямало-

"Ч

СУКЦИНАТ, мМ 1

Рис. 1. Зависимость скорости дыхания митохондрий печени крнс от концентрации сукцината в отсутствие и в присутствии 2-пентаде-щшмалоната при 25° С. Координаты Лайнуивэра - БЗрка. V - скорость дыхания в присутствии данной концентрации сукцината; У - максимальная скорость днхания.

2-АЖИЛМАЛОНАТ, мкМ

2. Зависимость скорости дыхания митохондрий печени крыс от концентрации 2-алкилмалонатов в координатах. Диксона. Vo я Vi - скорости дыхания с сукцинагом (3 мМ) в отсутствие я в присутствии ингибитора соответственно.

чата на сукцинатоксидазе равно 0,170 ± 0,025 мМ (8), что близко к К± эадго ингибитора, определённой прямым методом на переносчика, встроенном в липосош (0,4 Ш ГЗлсИтег! еХ а.1., 1989]). В опытах на сукцинатоксидазе 2-пентилмаловат обладает несколько большим сродством к переносчику ,0,149 ± 0,020 Ш (3)), что согласуется с данными, полученными на митохондриях прямым катодом [НоМпзоп а.1., 1972].

Таким образом, в условиях наших опытов дикарбоксилатннй переносчик лимитирует скорость сукцинагоксидазной реакции митохондрий. На это указывает, во-первых, то, что при атом Кж и максимальная скорость по сукцинату близки к соотвегствувдим параметрам переносчика. Во-вторых, найденные в этих условиях 21 2-бутил- и 2-пеншшалонатов близки

г

к их К1, определённым на переносчике прямым методом. В-третьих, в координатах Диксона наблюдается характерная для этих ингибиторов линейная зависимость их эффекта от концентрации. Из этого следует, что сукцинатоксидаза может быть использована в качестве сопряжённой системы для измерения активности дикарбоксилатного переносчика.

Окисление сукцината митохондриями включает три этапа: (1) транспорт субстрата через мембрану, (2) его окисление, катализируемое сук' цинат:убихинон-оксидоредуктазой, и (3) перенос электронов по дыхательной цепи от убихинона .до цитохромоксидазы на кислород. Последние звенья сукцинатоксидазной системы могли'иметь активность, близкую к активности транспортера, поэтому при изучении действия ингибиторов на дикарбоксилатннй переносчик важно было установить, не влияют ли эти ингибиторы на другие звенья системы. \

На третье звено, как нами было установлено, алкилмалонаты в использованных концентрациях на влияют. На это, в частности, указывает их слабое действие на р-оксибутиратоксидазу митохондрий '(см. рис: 3),. включающую в себя упомянутый участок дыхательной цепи.

1.0

0.8

р-ОКСИБУТИРАТ

0.6 -

0.4 -

0.2

0.0

СУКЦИНАТ

0 4 8 12 16 20 2-ДОДЕЦИЛМАЮНАТ, мкМ

с. 3. Зависимость скорости дыхания митохондрий о р-оксибутиратом и сукцинатом от концентрации 2-додецшмалоната. Концентрация обоих субстратов - 10 мМ. Обозначения: см. рис. 2.

13

I

В то же время было установлено, что алкилмалонаты, как и малонат, являются конкурентными ингибиторами сукцинатдегидрогеназн (см. рис. 4). При этом значение рК1 малоната (5,Б4 ± 0,33) близко к значении его рЯх на сукцинатоксидазе (5,09 ±:0,01), и, следовательно, эффект этого ингибитора на сукцинатоксидазную систему-, может быть связан с его действием на сукцинагдегидрогеназу, а не на переносчик. Действительно, значение рЙ1 малоната, определённое прямым методом на переносчике (3,43 Ш<И.гег1 еХ а!., 19891), значительно ниже приведённых величин. В то ш время алкилмалонатсЗв на дегидрогеназе на 0,5 - 3 порядка ниже, чем на оксидазе. Из этого следует, что ингибирование алкшмалонаташ сукцинатоясидазы в основном связано с их действием на транспортное звено этой системы.

2. ДЕЙСТВИЕ НА ДИКАЕБОЮИАТНЫП ПЕРЕНОСЧИК 2-Ы0Н0-К-АЖШШАЛ0НДТ0В

Бее изученные 2-алкилмалонаты, подобно^ 2-пентадецилмалонату (см. рис. 1), не изменяют максимальную скорость транспорта субстратов ди-карбоксилатным переносчиком и повышают его К% по сукцинату, являясь, таким образом, конкурентными ингибиторами этого переносчика. Из этого следует, что точка действия этих соединений находится в активном центре транспортера.

Надо отметить, что эффект всех изученных моноалкилмалонатов зависит от их концентрации и имеет линейный характер в координатах Диксона. Это означает, что переносчик имеет только одну доступную для моноалкилмалонатов точку связывания.- Однако не исключено, что в транспортере имеется вторая точка связывания, локализованная на матриксной стороне мембраны и недоступная для ингибиторов данного типа.

»

рК-,

5 4 3 2 1

[с. 4. Зависимость константы ингибироваяия (К±) сукцинатдагидрогена-зы субдатохондриальных частиц печени крыс от числа атомов углерода в алкильной цепи 2-алкилмалояатов (гг) -

Линейная зависимость наблюдаемых высших алкилмалонатов от' концентрации митохондрий (см. рис. 5) связана с высоким сродством соединений этого ряда к липидной фазе упомянутых органелл. При этом зависимость коэффициента распределения (Я) алкилмалонатов мавд- липидной фазой митохондрий и средой от числа углеродных атомов в алкильной цепи (п) ■ (см. рис. 6) подчиняется уравнению:

= 0,244я + 1,075 (г = 0,99853, из которого следует, что инкремент свободной энергии переноса метиле-новой группы ингибиторов в липидную фазу составляет 0,333 ккал/моль.

Путем экстраполяции нами были определены Л и рассчитаны действительные значения констант ингибировашиГ(Я£) для всех изученных моно-алкилмалонатов. Надо отметить, при введении поправки изменение значений наблюдаемых К± существенно лишь для высших членов этого ряда (см. рис. 7).

Было обнаружено, что зависимость наблюдаемого рй^ от длины ал-кильного заместители ингибиторов (см. рис. 7) имеет сложный характер. На участке от 2-метйл- до 2-бутилмалоната происходит уменьшение К±, что указывает на увеличение сродства переносчика к ингибитору при повышении гидрофобиости госледаего. Экстраполяция этого участка да&'т для малоната значение К^ ~1 мМ, что несколько выше К* этого соединения, найденной прямым методом. ; ... . Аналогичный результат получается и в случае сукцинатдегидрогеаазы, где экстраполяция приводит к ещё ббльшм различиям (см-, рис. 4, пунктир). По-видимому, алкильный заместитель влияет на ориентацию молекулы малоната в активных центрах как переносчика, так и фермента.

В области Сд - С7 наблюдается плато, затем происходит линейный .рост рКх, который .сгоняется областью умеренного увеличения рЯ* для

г'

высших алкилмалонатов.

к. 1-2

I

мкМ

(мМ) о_д

0.6 -

0.3 -

0

ПЕНТАДЕЦИЛ (мкМ)

О 0.2 0.4 0.6 0.8 1 . МИТОХОНДРИИ (МГ БЕЖА/МЛ)

Pug. 5. Зависимость константа ингибировашш di) 2-пвнтвдещи- и 2-бутилмалоната по сухцинатоксидазе от концентрации митохондрий.

|дя

6 г 5 4 >

О 3

9 12 15 п

Рис. 6. Зависимость коэффициента распределения (Я) мекду липодной фазой митохондрий и средой от числа углеродных атомов в алкиль-ной цепи 2-алкилмалонатов (га).

О 3 6.-9 12 -15 1-8, п

ис. 7. Зависимость наблюдаемой и приведённой констант ингибирования (Й1) дикарбоксилатного переносчика митохондрий от числа атомов углерода в алкильной цепи 2-моно-н-алкилмзлонатов (п).

3. ДЕЙСТВИЕ НА ДШШгБОКСИДАТНЫЙ ПЕРЕНОСЧИК 2,2-ДИ-Н-АЛК1ШШ10НАТ0В

Было установлено, что диалкилмалонаты также являются конкурентными ингибиторами дикарбоксилатного переносчика, однако зависимость скорости процесса от концентрации ингибиторов в координатах Диксона (см. рис. 8) линейна только для низших производных (вплоть до 2,2-ди-пентилмалоната); для высших она гиперболична.

Зависимость рЯ^ ог числа углеродных атомов в алкилызом заместителе для диажилмалонатов (см. рис. 9) сходна с аналогичной зависимостью для моноалкшшроизводных (см. рис. 7), однако на ней отсутствует плато в области СЦ - С7.

Анализ зависимости эффекта от концентрации диалкилмалонатов показал, что начиная с 2,2-дигексилмалоната порядок реакции взаимодействия ингибиторов с переносчиком изменяется с 1-го на 2-й (см. рис. 10 К Такая особенность действия этих соединений может быть связана с тем, что по мере наращивания длины ажильных заместителей ингибиторы приобретвют-спосоОность проникать через мембрану митохондрий и благодаря этому взаимодействовать не только с внешней, но и с возможной внутренней точкой связывания субстратов-переносчика. -

Нами была предпринята попытка показать справедливость последнего предположения. Поскольку диалкилмалонаты являются амфифильными соединениями и концентрируются по крайней мере во внешнем лепестке мембраны, прямое определение их'в митохондриях не позволяет решить вопрос о проницаемости этих соединений. Однако если эти слабые гидрофобные кислоты способны проникать в митохондрии, они могут проявлять разобщающий эффект и, следовательно, активировать дыхание митохондрий в состоянии 4. Поэтому нами была исследована способность диалкилмалонатов активировать р-оксибутиратоксидазу митохондрий.

/ 6 5

4

3

2

О

О - 4 8 12 16

ЛИПР0ПИУ1МА710НАТ, и М ....... ДИОКТИЛМАЛОНАТ, мкМ ■ ; ■

8. Зависимость скорости дыхания митохондрий печени крыс на сук-цинате от концентрации 2,2-даалкшмалонатов в координатах Диксона.

рК, 7 6 5

4 3

- ДИАЖИЛ

МОНОАЖИЛ

J_I_1_|_и

0 3 6 9 12 15 18

Рис. 9. Зависимость константы ингибирования {К±) дикарбоксилатного переносчика митохондрий печени крыс от числа атомов углерода в алкильной цепи 2,2-да-к-алкилмалонатов (п).

П

2.5

=Г <

ш о_

2.0

1.5

О

[X о_

О 1.0 с -

0.5

-сгсг

О

1_I . I_I

0.2.4 6.8 10 .. 12 .п.

1с. 10. Зависимость порядка реакции 2,2-даалкилмалонатов с дикарбок-силатным переносчиком от числа атомов углерода алкильного радикала (п).

Было установлено, что диалгашгалонатн активируют дыхание митохондрий, и зависимость эффекта от концентрации имеет сигмовдный характер (см. рис. 11). Такой'тип зависимости присущ разобщителям-каналогенам, действие которых связано с образованием в мембране липидных доменов. При этом на границе между доменами образуются водные поры. Есть основания полагать, что молекула диалкилмалонатов в области этих пор могут быстро перемещаться из внешнего лепестка мембраны во внутренний [Ра1Да1 сЛ1994]. Как было показано,, каналогенным действием обладают как низшие, так и высшие диалкшиалонаты, однако только последние оказывают ивгибиторный эффект на сукцинатоксидазу при концентрациях, вызнващих выраженное активирующее действие. Из этого следует, что сигмоидный характер действия высших диалкилмалонатов может быть связан с их взаимодействием с двумя точками связывания субстратов, поскольку в этом случае будет образовываться тройной комплекс' переносчика с ингибитором.

ОБСУЗДЩИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ...

В данной работе была поставлена задача изучения дикарСоксилатного переносчика в условиях, интактной мембраны митохондрий, поскольку реконструкция переносчика в мембрану липосом может приводить к изменению его свойств (в частности, из-за инвертированного встраивания части молекул переносчика). Это позволило использовать для измерения активности переносчика сукцинатоксидазу - эндогенную сопряжённую систему. Как следует из данных, приведённых в разделе 1 Результатов, активность этой системы в условиях наших опытов лимитируется дикарбок-силатным переносчиком. Надо отметить, что в других условиях, например, в отсутствие протонофора или при температуре выше 25°С, скорость

у/ч

о 1.0

0.8 0.6 0.4

0 12 3 4

2,2-ДИД0ЛЕЦИЛМА710НАТ, мкМ"

11. Активирующее действие 2,2-дидодецилмалоната на (3-оксибути-ратоксидазу митохондрий в присутствии (и-ц) и отсутствие (£>0) протонофора.

процесса начинает определяться другими звеньями системы. Так, в первом случае 1к по сукцинату становится на порядок ниже Кы для переносчика, а во втором энергия активации процесса значительно ниже Е& ди-карбоксилатного переносчика [Дливердаева, 1985].

Исправленные значения малонатов были использованы для. расчёта инкрементов свободной энергии связывания метиленовых групп ингибиторов (ДДСь) в активном центре переносчика. На рис. 12-показано изменение ДДОь концевых метальных групп ингабитора по мере их удаления от субстратсвязываодего участка в переносчикеИз рисунка следует, что в активном центре переносчика могшо выделить пять зон. Так, вблизи точки связывания субстрата (зона А), в которой находятся два взаимодействующих, с субстратом полоштельных заряда, расположены отличаициеся по гидрофобности липоф&льные площадки (зоны в л Т>), между которыми, на расстоянии ~0,7 нм от точки связывания субстрата, локализован полярный домен (зона С). В то время как гидрофобность зоны Б соответствует гидрофобности октанола, гидрофобность наиболее удалЭнного участка, зоны Е (ЛЛСь 0,25 - 0,42 ккал/моль), близка к таковой для мембраны митохондрий, АДСШ которой составляет 0,333 ккал/моль. Поэтому можно предположить, что внешний участок активного центра (зона Б) форми-' руется фосфолипкдом, нацршэр кардомишшом, который не обходил для реконструкции функционально активного дикарбоксилатного переносчика 1Кар1ап ег т., 1990].

Как сладует из этих данных, расстояние от точки связывания субстратов до поверхности мембраны (-1,7 нм) близко к толщине липидного монослоя (-2 нм), что согласуется с гипотезой о наличии глубоких каналов в транспортерах ИШсЬеП, 1957; Скулачйв, 1991). Такое расстояние субстратсвязывавдэй точки от-поверхности мембраны означает, что эта точка локализована вблизи центра молекулы переносчика. Исходя из

-ЛАС , ь 0 5 10 15 п

ккнл/иоль .0-8 . " 1 1 1 " " 1

0,6 - Э О

0,4 - Л О /

0,2 п М 1 1 f .1 о 0 1

0 1 2 ни

Точна 'азыдатя •убстрсвпа

I 1

оч - Активный

Лг^а^^я^а^о^-о-^-о^о 3™тр "о"^ 2-Алшшалонат первн

А В

2-Алкшшионш переносчика

с. 12. Энергетический профиль активного центра дикврбоксилатного переносчика митохондрий печени крыс.

принципа симметрии, можно допустить сходство топографии активного центра с внутренней и внешней стороны мембраны.

' Как отмечалось вше, моноалкилмалонаты взаимодействуют' только с внешней точкой связывания субстратов. Из данных, полученных с высшим« диалкишалонатани, порядок реакции с которыми близок к 2-м (см. рис. 10), следует, что в переносчике присутствует также внутренняя точка связывания. Действительно, анализ взаимодействия переносчика с ингибитором в этом случае приводит к заключению, что соотношение v0/v± будет в первом приближении пропорционально (I/K±)z (при I/Ii >1). • Надо отметить, что для модели с одной точкой связывания характерна линейная зависимость vQ/ui от I как для проникающего, гак и для не-проникащего ингибиторов.

Исчезновение характерного для ыоноалкилмалонатов (рис. ?.) плато на зависимости, p^i от числа углеродных атомов в алкильном заместителе в случае для диалкилмалонатов (см. pic. 9) можно объяснить изменением конформации переносчика. Это, по-видимому, является следствием того, что алкильная часть у моноалкилмалонатов имеет меньший диаметр, чем у диалкилпроизводных," где этот диаметр равен ~0,75 нм (если исходить из параллельной ориентации заместителей в этих соединениях).

Сложная топография активного центра переносчика, по-видимому, связана с наличием в нём воротного механизма. Возможно, что полярный, участок в зоне С принимает участие в фиксации открытого состояния переносчика при- свободном активном центре, а гидрофобные зоны в, В и Е выполняют изолирующую функцию. Исходя из результатов работы можно конкретиз1фОвать ковформационную модель функционирования дикарбокси-латного переносчика [Jardetaky, 1966; Yldaver, 19663. На рис. 13 представлен гипотетический механизм.переносчика, основанный на полученных данных,с предполагаемой локализацией упомянутых зон.

13. Предполагаемый механизм, функционирования дикарбоксилатного .переносчика митохондрий.

В состоянии 1 происходит обмен субстрата в активном центре на внешней стороне мембрана в верхней части зоны А. В состоянии 2 активный центр закрыт с обеих сторон мембраны, благодаря изменению полярности в зонах А и С, причём зоны В, Б и В обеспечивают изоляцию; происходит обмен менду субстратами в зоне А. В состоянии 3 происходит обмен субстрата в активном центре на внутренней стороне мембраны в низней части зоны А. До обмена субстратов в состояниях 1 и 3 активный центр с равной вероятностью монет открываться на обе стороны .'Мембраны. • .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, использование набора алкилпроиззодных малоната в качестве "калибрующего устройства" позволило провести зондирование активного центра дикарбоксилаткого переносчика и установить неизвестные ранее особенности окружения точек связывания субстратов в этом переносчике - размеры и полярность зон, составляющих; активный центр транспортера, показать наличие точек связывания субстратов на внешне! и внутренней стороне мембраны, а такаСе предложить вероятный механизм функционирования переносчика.

ВЫВОДЫ

1. Синтезирована группа конкурентных ингибиторов дикарбоксилатного переносчика - 2-моно-к-алкил- и 2,2-ди-к-алкилпроизводных малоновой кислоты - и изучено их действие на этот переносчик.

2. Показано, что при определенных условиях сукцинатоксидазная система митохбндрий лимитируется дшсарбоксклвтным переносчиком,'и её 'активность может быть использована для определения активности переносчика в ингактной мембране.

3. Зависимость pli от числа атомов углерода в алкильной цепи 2-моно-алкилмалонатов (п) имеет сложный характер, проявлящийся в нелинейном увеличении p#i от 3,2 до 7,4, причём при п от 3 до 7. наблнь дается плато с pKi ~3,8.

4. Показано, что действие 2,2-диалкилмалонатов на дикарбоксилатный переносчик сходно с действием 2-моноалкшшалонатов, однако плато на зависимости pEi от п в области п = 3 + 7 в этом случае отсутствует, что, по-видимому, указывает на изменение конфэрмации пере-

носчика при взаимодействии с более объёмистыми молекулами дивлкил-малонатов.

В отличие от 2-моноалкилмалонатов и низших 2,2-диалкилмалонатов, взаимодействующих с дикарбоксилатным переносчиком со стехиометрией 1:1, для высших 2,2-диалкилмалонатов характерен второй порядок реакции. •

На основании полученных данных сделан вывод о том, что дикарбокси-латный переносчик имеет точки связывания субстратов, локализован- " ные в центре молекулы переносчика на расстоянии не шнее 1,7 нм от поверхности мембраны, и в его активном центре, образованном гидрофобными аминокислотными остатками, вблизи точек связывания субстратов расположен полярный домен размером ~0,5 нм. В открытом состоянии активный центр имеет диаметр не менее 0,75 нм. Полученные результаты свидетельствуют в пользу конформационной модели функционирования дикарбоксилатного переносчика с двумя точками связвания субстратов.

Полученные результаты опубликованы в следующих работах: Шольц К.Ф., Мамаев Д.В., Бондаренко Д.И., Лагутина Л.С. Особенности взаимодействия 2-алкилмалонатов с -центром связывания субстратов

дикарбоксилатного переносчика митохондрий печени крыс // Биохимия. t

1990. Т. 55. Вып. 10. С. 1832 - 1840.

Sholtz K.P., Bonflarenko D.I., Mamaev D.V. Probing the active center ol the mitochondrial dlcarboxylate transporter // TEBS bett. 1993. V. 32T. JS 1. P. 54 - 56.

Бондаренко Д.И., Мамаев Д.В., Шольц К.Ф. Локализация точек связывания субстратов в, дикарбоксилатном транспортере штохоадрий // Докл. РАН. 1995 (в,печати). \