Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение изменчивости проростков Larix gmelinil под воздействием экзотоксинов биоинсектицида

ВАК РФ 06.03.01, Лесные культуры, селекция, семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Изучение изменчивости проростков Larix gmelinil под воздействием экзотоксинов биоинсектицида"

\

I I

РГБ ОД

ВОРОНИНА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВЦА^ ^ ^

На правах рукописи

ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПРОРОСТКОВ Ьагхх итгИпи ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ЭКЗОТОКСИНОВ БИОИНСЕКТИЦИДА

Специальность: 06.03.01 - лесные культуры, селекция и семеноводство.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва

2000

Работа выполнена на кафедре генетики, селекции и дендрологии Московского государственного университета леса.

! \ а 1 '

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

гооФессорЮ.М. Шапкин|

Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор А.Я. Любавская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

М.Г. Романовский; кандидат сельскохозяйственных наук, В. А. Брынцев.

Ведущая организация Институт физиологии растений

им. К.А. Тимирязева РАН.

Защита диссертации состоится « 0? » ивня_2000 года

в Ю часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 053.31.03 при Московском государственном университете леса по адресу: 141001, г. Мытищи -1, Московской области, Московский государственный университет леса, ауд. 313.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета леса.

Автореферат разослан « 4 » _2000 года.

Ученый секретарь у^тг-// ,,

диссертационного совета СЛт/^ л В.Г. Анисочкин

Подп. к печати •ШЙСобъем 1 п л._ Зак. _Тир. 100_

Издательство Московского государственного университета леса

/73?У. 2 ~ Ы/, О

Общая характеристика работы, актуальность темы диссертации: На смену химическим пестицидам, трицательно зарекомендовавшими себя с экологической точки зрения, в конце СIX и в начале XX столетия, приходят биологические. Основная масса ыпущенных за последнее время биоинсектицидов была представлена тремя [репаратами: битоксибациллином, дендробациллином и лепидоцидом (Африкян, 970). Продуцентом указанных биологических пестицидов служат бактерии Bacillus thuringiensis ряда подвидов. В 1990 году выпуск биологических нтомоцидных препаратов в СССР составил более 10 ООО тонн.

Известно (Кандыбин, 1975, 1984; Кандыбин и др. 1976, 1982; Ohba, et al., 981), что одним из основных энтомоцидных компонентов битоксибациллина вляется ß-экзотоксин (ß-ЭТ), вещество нуклеотидной природы (Farcas et al., 979). Впервые обнаруженный Мс. Cornel и Richards в 1959 году, ß-ЭТ интезируется многими подвидами бактерий Bacillus thuringiensis. Гсследованиями последних лет (Ефимцев и др. 1988-1999) было установлено, что роме ß-ЭТ, некоторые подвиды этих бактерий синтезирует экзогенный [етаболит, близкой ß-ЭТ природы.

Действительно, в препарате битоксибациллине содержащем, а также .ендробациллине и лепидоциде, не содержащих ß-ЭТ, был обнаружен кзогенный метаболит названный ß2-3T (Ефимцев, Буров, 1989). Изучение войств второго экзотоксина показало, что он обладает энтомоцидной

активностью, а структура его молекулы близка ß-ЭТ. ßr ЭТ, в отличии от ß-ЭТ, смещает pH среды до 9,3. Природа двух бактериальных экзотоксинов -адениннуклеотиды.

Было обнаружено, что ß-ЭТ, присутствующий в битоксибациллине, подавляет функции воспроизводства насекомых (Микульская, 1989), воздействует на жизнеспособность микроорганизмов, простейших, на рост и развитие злаковых и овощных культур (Лескова, 1989). Количественные исследования показали (Валентирова,1992), что именно ß-ЭТ и ß2-3T бактериальных энтомоцидных препаратов вызывают глубокие изменения у проростков сосны. Известно (Sebesta et al., 1968), что ß-ЭТ вызывает ингибирование ДНК-зависимой РНК полимеразы. Обработка проростков сосны ß- и ß2-3T (Валентирова, 1992) сопровождалась хромосомными аберрациями в клетках корешка. Таким образом, широкое применение энтомоцидных биологических препаратов, синтезируемых на основе Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis (битоксибациллин), Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus (дендробациллин), Bacillus thuringiensis sabsp. kurstaki (лепидоцид) и имеющих в своём составе ß- и ß2-3T, может привести к необратимым изменениям в фитоценозах. Обработка указанными биопрепаратами вредителей леса и сельскохозяйственных угодий представляется экологически опасной и требует более детального изучения влияния экзотоксинов на растения.

;ль исследования заключалась в определении характера и особенностей ^действия р- и р2-экзотоксинов бактериального инсектицида битоксибациллина t проростки голо- и покрытосеменных растений. дачи исследования:

Выделение и количественное определение р- и р2- экзотоксинов в промышленном биопрепарате битоксибациллин.

Изучение влияния экзотоксинов битоксибациллина на биометрические показатели проростков лиственницы и гороха.

Воздействие экзотоксинов биоинсекгацида на пигментный аппарат и процесс фотосинтеза растений.

Изучение влияния экзотоксинов битоксибациллина на процесс биосинтеза хлорофилла у проростков лиственницы.

1учная новизна: Впервые изучено индивидуальное влияние р - и Рг-зотоксинов, выделенных из битоксибациллина, на биометрические показатели оросгков лиственницы (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) (далее- лиственница), из мян, собранных с маточников в популяциях России и Китая, а так же гороха •sum sativum L.) сорта Торсдаг ( далее- горох).

У двух видов растений обнаружена зависимость между концентрацией вдого из токсинов и изменениями биометрических параметров проростков, зрастание концентраций экзотоксинов в среде приводило к уменьшению длины зокотиля у лиственницы и стебля у гороха, корней у этих видов растений, что

отражалось в снижении их биомассы на 20-35%. Изменялась пространственна} ориентация корневой системы проростков, что свидетельствовало о потере им! геотропизма, по-видимому, объясняемое нарушениями в балансе гормонов Показано, что подавление темновых стадий биосинтеза хлорофилла являете) одной из основных причин, отмеченных эффектов торможения роста и развита проростков.

Ранее были выявлены случаи малой активности промышленны? препаратов битоксибациллина. Причина этого была неясна. В результат« проделанной нами работы получены дополнительные сведения, позволяющж объяснить утрату биологической активности промышленного препарата. Так, I ходе роста проростков лиственницы и гороха на фоне разных концентращн только р2-ЭТ отмечали эффект подавления роста и синтеза хлорофилла. В это\ случае, как правило, в конце опыта наблюдали гибель растений. Однакс совместное воздействии |3- и Рг-экзотоксинов снимало отмеченный эффект. Естс данные, что два токсина образуют комплекс (Шабарова, 1976 ), который вероятно, биологически малоактивен. Поэтому именно увеличение отношения (3-ЭТ к р2-ЭТ в конкретном товарном препарате в ряде случаев могло быть причиной его низкой биологической активности.

Отсутствие изменений формы спектра поглощения образца в опьт против контроля свидетельствует о неизменности соотношения различных форм хлорофилла во всех вариантах опыта. Соотношение форм хлорофилла а и Ь I

пиртовых экстрактах из проростков при воздействии экзотоксинов и их суммы по равнению с контролем в наших экспериментах было неизменным. Однако, юрма спектра поглощения гомогената проростков в опыте (на фоне экзотосинов их суммы) заметно отличалась от контрольного варианта. Поэтому сделан вывод влиянии экзотоксинов именно на пигмент-белковый комплекс отосинтетического аппарата растения.

По изменению формы кинетических и световых кривых семядолей иственницы и листьев гороха и снижению уровня насыщения фотосинтеза оказано отрицательное воздействие экзотоксинов на растения. При увеличении эдержания экзотоксинов в среде отмечали падение скорости выделения ислорода на свету. Следует отметить, что на проростках гороха выделение нслорода на свету при всех вариантах обработки растений вообще не роисходило. Однако, непосредственно после выключения света в том же опыте темноте следовал выброс кислорода. Сам эффект, по нашему мнению, редполагает временное торможение фотолиза воды и/или перехват отосинтетического кислорода.

Полученные результаты, в свою очередь, подтверждаются наблюдаемой ¡аимосвязью между процессами падения скорости фотосинтеза, изменениями в агмент-белковом комплексе и биосинтезе хлорофилла.

В темноте биосинтез хлорофилла у этиолированных проростков тственницы и гороха подавлен. В спектре флуоресценции наблюдали

Единственный максимум при длине волны 655 нм (Пхб55 )• Освещение образу; приводило к образованию флуоресцирующих форм хлорофилла при длине волнь 685, 696 (главный максимум) и 734 нм. Следует отметить необычное дш выращивания этиолированных проростков лиственницы на фоне Р- ЭТ явление формирования у проростков как I, так и П фотосистем даже в темноте. В отличие от Р - ЭТ, в случае выращивания этиолированных проростков лиственницы I присутствии Рг - ЭТ отмечали лишь частичное формирование П фотосистемы. Е спектре флуоресценции этиолированного проростка помимо максимумов 685 и 696 нм мы так же наблюдали полосу с максимумом 655 нм. Однако, в этом случае ] фотосистема полностью отсутствовала. Оба токсина были способны к «запуску» механизма биосинтеза хлорофилла в темноте. При этом в случае с р - ЭТ процесс биосинтеза хлорофилла в темноте у этиолированных проростков так же не был завершен. Поэтому биологические активности р- и р2- экзотоксинов различны.

Итак, нами установлено, что р- и р2 - экзотоксины биопрепаратов в рекомендуемых заводом изготовителем дозах специфично влияют на темновой биосинтез протохлорофиллида и протекание процесса его фотопревращения в хлорофиллид и хлорофилл.

Практическая значимость исследования. Известно, что рекомендуемые фирмой -производителем дозы применения битоксибациллина варьируют в 2,0 - 2,5 раза. Это происходит из - за отсутствия количественных данных по содержанию в нем экзотоксинов. Установлено, что допустимая концентрация битоксибациллина и

пидоцида для применения на лиственнице и горохе должна быть снижена, как обоснованная.

Установлено, что рекомендуемые заводом - изготовителем дозы обработок ктериальными инсектицидами не учитывали их влияние на растения, что приводит юрфологическим, физиологическим и биохимическим нарушениям.

Доказана видоспецифичность в действии каждого из токсинов на растения, э указывает на необходимость дифферинцированного подхода при применении гпаратов, содержащих р-ЭТ и р2 -ЭТ (битоксибациллин). Показано, что р2 -ЭТ держится в препаратах лепидоцид и, возможно, дендробациллин.

Рекомендованы, апробированы и дополнены методы биологической жгрофотометрии и оценки уровня фотосинтеза в качестве основы экспресс -шиза прижизненного состояния растений.

защиту выносится следующее положение: угнетающее действие гоксибациллина на растения определяется как содержанием р2- , так и этношением р-/р2 - экзотоксинов в препарате.

робация работы: Результаты работы доложены на П съезде Биохимического цества Российской Академии Наук (Пущино, 1887), на IY Международной 1ференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1997); на гференции « Мониторинг состояния зеленого фонда города» (Москва, 1999); на Международной межвузовской школе - семинаре «Экология 2000: эстафета юлений» (Москва, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 тезисов, на указанных выше съезде и конференциях, 1 статья в журнале «Физиология растений», 2 методических указания.

Структура диссертации: Диссертация содержит следующие разделы: введение, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, отраженные в 5 главах, в которые вошли данные литературы, результаты экспериментов и их обсуждение. Отдельно даны, выводы, список литературы (128 источников) и приложение. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста и включает 12 таблиц, 41 рисунок, 5 фотографий.

Материалы и методы. Растительный материал. Работу проводили на 10-33 дневных проростках семян лиственницы (iMrix gmelinii (Rupr.)Rupr.), собранных с маточников двух популяций произрастающих на территориях России и Китая, с близкими координатами, а так же гороха (Pisum sativum L.) сорта Торсдаг. Выделение и количественное определение ß- и ß2- экзотоксинов в водном растворе осуществлялось по ТУ на битоксибациллин и разработанному методу (Ефимцев и др., 1991). Биологический промышленный энтомоцидный препарат битоксибациллин был получен с Бердского химического завода (г. Бердск, Новосибирской области). Выращивание растений проводилось в средах с одинаковым содержанием каждого из токсинов: 0,14x10^; 0,29х104; 0,57x1г/л. Контролем служили проростки, выращенные на дистиллированной воде. Водный раствор двух экзотоксинов имитировал соотношение их содержания в заводском

препарате (1часть р- и 2,3 части р2-ЭТ или 0,8x10"4 и 1,6x10^ г/л). Проростки выращивали при температуре 24°С, 97% влажности и освещённости 1,4х103 люкс интегральным светом ламп накаливания.

Эффект воздействия препарата на биометрические показатели оценивали в % к контролю (контроль был принят за 100%). Для определения оценки воздействия на проростки измеряли длину гипокотиля и семядолей у лиственницы; стебля у гороха, корня и сырой вес растений обоих видов.

Пигменты определяли по \\^ийегтап8 et а1 .(1965) на спектрофотометре БресоМ 1 'Карл Цейс, Германия).

Спектры поглощения проростков изучали на фотометре СФ-18 (ЛОМО, Россия) с

1/2= 3,5 нм в интегрирующей сфере. Низкотемпературная флуоресценция. Опыты по низкотемпературной {шуорометрии (77°К) зеленых и этиолированных растений проводили на образцах ; величиной оптической плотности 0,01-0,05 единицы. Спектры регистрировали в штоматическом режиме при ДХш= 0,3 нм.

кинетические и световые кривые фотосинтеза изучали при освещении гатегральным светом в полярографической ячейке, амперометрическим методом. Статистическая обработка результатов 5-10 биологических повторностей каждого шыта проведена по критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Количественное определение содержания р - и р экзотоксинов в заводскоу биоинсектициде битоксибациллине. Продуцентом битоксибацшгаша являла сероварнант ВасШих /¿шг<п£ге>ш£ ьиЬзр. Мипп&епяк, Н1а1в, заводской штамм 98 10. В опытах для выделения экзотоксинов использовали стандартный заводско! препарат битоксибациллин. Концентрация экзотоксинов в пробе определяли пс оптической плотности при длине волны 259 нм, рН35 , 1=20±2"С на фотометре СФ-46 в водном растворе и рассчитывалось по закону Ломберта- Бугера- Бера. Коэффициент молярного погашения р-ЭТ составляет е= 13,2x103 л/моль см (БгакаБ, 1969), Е1%1СЫ- удельный коэффициент погашения, имеет величину 192±3 л/г см, при тех же условиях (Соломин и др., 1989). Величина £ и Е для Р 2-ЭТ принята равной р -ЭТ. Содержание Р-ЭТ и рг-ЭТ, для препарата используемой партии, составило 1,1 и 2,8 мг/г сухого препарата, соответственно. Исследование влияния р- и р_т- экзотоксинов на биометрические показатели проростков лиственницы и гороха. Всхожесть семян лиственницы из двух популяций России и Китая составили 67 и 86 %, соответственно. Всхожесть гороха- 99%. Изучение воздействия ЭТ разного содержания на проростки лиственницы показало, что их присутствие в низкой концентрации (0,14x10^ г/л) оказывало стимулирующий эффект на рост гипокотилей и семядолей. В результате повышения концентрации (0,57x1г/л) отмечали усиление

нгибирующего эффекта (от 20 до 50%) основных биометрических параметров роростков лиственницы (длины корня, гипокотиля, семядолей).

Показано, что проростки, развившиеся из семенного потомства иственницы, собранного на территории Китая, были более устойчивы к действию кзотоксинов.

Отмечены некоторые отличия в воздействии экзотоксинов и их суммы на роростки гороха и лиственницы. Рост проростков гороха на средах с кзотоксинами вызывал увеличение длины и количества боковых корешков, [нгибирование ростовых процессов у проростков гороха составило более 80 %. [о отдельности каждый из двух экзотоксинов снижал развитие проростков гороха. Совместное их применение сглаживало негативный эффект. Все исследованные иометрические показатели при воздействие каждого из экзотоксинов и их суммы осили сходный характер. Общая тенденция воздействия Р-ЭТ и р 2-ЭТ была недующей. Из двух токсинов р 2-ЭТ всегда оказывал максимально ингибирующее ействие (рис.1, 2). Совместное применение двух токсинов, как правило, снимало нгибирующее воздействие р 2-ЭТ. Таким образом, на проростках лиственницы и зроха р2-ЭТ проявлял больший, в сравнении с р -ЭТ, биологический эффект. оздействие экзотоксинов на пигментный аппарат и процесс фотосинтеза астений. Наблюдение за содержанием хлорофилла а и Ь у контрольных растений процессе онтогенеза (18, 21, 26, 30, 33 сутки), показало его слабое изменение с величением возраста растений.

Корень

Гипокотиль

Сырой вес растения

Варианты опыта

к им контроль

р I 1 а ->остмсик. 0.3x10-4 г/п !

0 3x10"* г/п

Рк^В О.йхЮ-4 г/п I

Рис .А . Изменение биометрических показателей проростков лиственницы (популяция на территории Китая) под влиянием экзотоксинов

Корень

Длина наземной части

ЮН*роль М-

Сырой вес растения

* м-

Рис. .2..' Изменение биометрических показателей проростков гороха под вдшшнем экзотоксинов гЗитоксибащллида. дояцентрадии экзотоксинов:

- О.гЗхЮ^г/л Д- - С.гзИС"4 г/л; сушы тэ'-сгооз - О.ВхЮ^г/л.

В большинстве экспериментов по воздействию экзотоксинов на проростки лиственницы существенных отличий в содержании хлорофилла (а + Ъ), между контролем и опытом, не обнаружили. Существенно, что длительное воздействие (26 суток) Рг-ЭТ всегда приводило к гибели проростков лиственницы. Между тем воздействие Р-ЭТ или суммы двух токсинов позволяло в ряде случаев избежать легального исхода.

Изучение влияния каждого из двух экзотоксинов и их суммы в разных концентрациях на 10 -15-дневные проростки гороха показало неизменную стимуляцию в накоплении хлорофилла, достигающую иногда 200 %. Однако, внешний вид проростков свидетельствовал о снижении показателей развития. Падение содержания хлорофилла у проростков гороха отмечали только в присутствие рг-ЭТ в среде. В присутствии р-ЭТ, у проростков наблюдали только накопление хлорофилла.

Спектры поглощения спиртовых экстрактов хлорофилла (а + Ь) из проростков лиственницы и гороха, выросших в присутствии экзотоксинов различной концентрации, имеют отличия от контрольных. При их сопоставлении обнаружены слабые изменения в области 600-640 и 670-710 нм. Указанные изменения в спектрах поглощения спиртовых экстрактов хлорофилла определяются действием экзотоксинов. Однако, специфики воздействия как отдельных экзотоксинов, так и их смеси на соотношение форм хлорофилла а и Ь обнаружено не было.

т л

Использование спектрофотометрии гомогенатов листьев гороха и семядолей лиственницы позволило выявить влияние экзотоксинов на белок-пигментный комплекс фотосинтетического аппарата проростков. Наибольшую деформацию спектра поглощения гомогената против контроля выявили в случае выращивания проростков в среде с Рг-ЭТ. Поэтому, изменение формы спектра поглощения гомогената служит, во -первых, независимым подтверждением большей биологической активности Р2-ЭТ. В ряду разных вариантов выращивания проростков (Р-ЭТ, Рг-ЭТ ) не было отмечено существенных изменений формы в спектре спиртовых экстрактов. Поэтому, во-вторых, нами получено косвенное доказательство воздействия Р2- экзотоксина именно на пигмент-белковый комплекс.

Исследование спектральных кривых низкотемпературной (77 0 Ю

Флуоресценции проростков лиственницы и гороха. В процессе низкотемпературного охлаждения образцов в жидком азоте наблюдали закономерные изменения формы спектров. Главным эффектом было изменение амплитуд максимумов с длиной волны 685, 696 и 734 нм. Характерно, что образцы разных вариантов выращивания проростков гороха и лиственницы изменяли форму спектра флуоресценции по разному. Динамика изменения соотношения максимумов спектров флуоресценции в процессе низкотемпературного охлаждения образца гороха отличалась от лиственницы. Существенный эффект изменения спектра флуоресценции выявлен в образцах

ороха, выращенных на фоне Рз-ЭТ. Амплитуды всех максимумов спектра [шуоресценции образцов гороха, выращенных во всех других вариантах, ■меныпались в процессе охлаждения объекта. Однако в случае варианта Рг-ЭТ, ю мере пребывания объекта в течении 20 минут в жидком азоте со временем тмечали резкое увеличение амплитуд.

Статистическая обработка результатов (по Стъюденту) воздействия кзотоксинов на форму спектра флуресценции, наряду с высокой оспроизводимостью (99%) результатов каждого отдельного варианта, не озволила обнаружить существенных различий между контролем и опытом у иственшщы и гороха. Исследование динамики изменения формы спектров шуоресценции растительных образцов в процессе низкотемпературного хлаждения может служить независимым экспериментальным подходом при зучении воздействия антропогенных факторов - на растения. Спектры шуоресценции проростков лиственницы и гороха существенно различаются юрмой, а действие экзотоксинов вызывает её видоспецифические изменения. Характерные изменения в спектрах флуоресценции отмечали при испытании бразцов во всех вариантах опыта. Каждый из экзотоксинов и их сумма пецифично воздействуют на пигментные системы исследуемых растений. лнетика выделения кислорода на свету и в темноте у проростков лиственницы и эроха. У проростков лиственницы под действием экзотоксинов происходило арушение процесса выделения на свету и в темноте, при сравнении с онтролем. Уменьшилась начальная скорость фотосинтеза при включении света,

возрос в несколько раз темновой период выхода кинетической кривой скорости выделения Ог на стационарный уровень. В отличии от этого, у проростков гороха выросших в присутствии экзотоксинов на свету не отмечали выделения и поглощения кислорода. Сразу после выключения света в полярографической ячейке наблюдали временное увеличение концентрации кислорода с последующим его падением до темнового уровня контрольного варианта. Световые кривые фотосинтеза по скорости обмена кислорода у проростков лиственниц имели «Б» - образную форму. В опыте фотосинтез растений был ниже контроля и определялся, как природой и концентрацией токсина, так и объектом исследования. Выделение Ог на свету снижалось в ряду вариантов увеличения фоновых концентраций (3-й Р2-ЭТ. Различия в действии двух экзотоксинов на процесс фотосинтеза хорошо прослеживаются по величине падения его уровня и изменению формы световых кривых. Так (Зг-ЭТ больше ингибировал процесс фотосинтеза, чем р-ЭТ, взятый в тех же концентрациях (рис. 3, 4). В варианте с Р-ЭТ в отличие от Рг-ЭТ не удалось достичь насыщения световых кривых фотосинтеза. Таким образом, по изменению формы световых кривых фотосинтеза можно заключить, что в механизме воздействия р- и Рг-ЭТ наблюдаются специфические различия.

Изучение влияния экзотоксинов битоксибапиллина на темновые и световые стадии процесса биосинтеза хлорофилла у лиственницы. Основной максимум в низкотемпературном спектре флуоресценции у этиолированных проростков

Рис. 3 Изменение светорых кривых фотосинтеза проросгков лиственницы Гмелипа (1,апх пол действием •искттоксиноа

Э1ТТОМОЦИЛНОГО биопрепарата битокенбациллин. (-контроль. 2-суммя (р эгкуто*сн»юя, равняя ик соагрж*мнк> * гррпяраге (О.Я\Ю"* I/л), 3- р-эштоксми (О.ИхЮ* |/л). «1-р^ииоюгснн (ОЛ ЫСТ* т/л)

1'нс. т Игмепсиис сястопых кривых фогопшгега щх^кчко« листвениицы Т'мелииа (Ьапх ртеПпи), пол действием Ргокчо-тксииа I- контроль; 2- Р,-ЧПР7Т>КСИН (0,29*10"* г/л), 3 - Р2-тпотр*с»ш(0,57ч10"* г/л)

травянистых растений находится при длине волны 655 нм. Низкотемпературный спектр флуоресценции этиолированного 15-дневного проростка лиственницы имел аналогичные параметры.

При выращивании проростков лиственницы в темноте на фоне Р-ЭТ не наблюдали полосы флуоресценции с длиной волны 655 нм (Пхб55)- При этом обнаружили спектр характерный для зеленого растения с максимумами: 685,696 и 726 нм. Отмеченная форма спектра означает, что процесс биосинтеза хлорофилла прошел почти до конца, была сформирована как I, так и И фотосистема. В случае этиолированных проростков, выращенных в присутствии Рг-ЭТ, наблюдали максимумы в низкотемпературном спектре флуоресценции при длинах волн 655, 685 и 696 нм. Поэтому можно заключить, что в данном варианте была сформирована только фотосистема II и присутсвовал остаток протохлорофиллида

(ПХ655).

Вероятно, действие р-ЭТ вызвало активацию механизма темнового биосинтеза хлорофилла имеющегося у хвойных. Изучение влияния освещения на этиолированные проростки лиственницы в контроле показало, что спектр их низкотемпературной флуоресценции изменился и стал близок обычному зелёному растению. В проростках, развившихся в присутствии Рг-ЭТ в темноте, после их освещения (10 минут), форма протохлорофиллида 655 исчезла. Появились формы с максимумами 685 нм, 696 нм и начали формироваться длинноволновые агрегированные формы хлорофилла с максимумом

[ фотосистемы (максимумы 685, 696 нм). Смещение максимума 726 нм, под ействием освещения, в длинноволновую область (~ 732 нм), означало езавершенность этого этапа в формировании I фотосистемы.

Выводы и практические предложения.

. Доказано, что для экзотоксинов бактериального энтомоцидного препарата битоксибациллина характерно угнетающее действие на рост и развитие растений. Подавление биосинтеза хлорофилла является одной из основных причин, отмеченных эффектов торможения роста и ингибирования развития проростков, выращенных на фоне экзотоксинов.

. Установлено ингибирование фотосинтеза проростков лиственницы и гороха под действием р- и Рг- экзотоксинов, оцененное по изменению формы и уровня кинетических и световых кривых выделения кислорода. . Доказано, что р2- экзотоксин обладай]'большей биологической активностью, чем р- экзотоксин. Применение смеси Р- и Р2 - экзотоксинов снижало ингибирующий эффект, вызванный рг - экзотоксином. Последнее свидетельствует о частичной потере биологической активности Р2- экзотоксина в присутствии р-экзотоксина.

4. Обнаружено, что в отличие от спектров поглощения спиртовых растворов пигментов формы спектров поглощения гомогената проростков в контроле и опыте заметно различались. По-видимому, это было связано с влиянием экзотоксинов на пигмент - белковый комплекс.

5. Доказано различие в характере влияния экзотоксинов на темновые стадии процесса биосинтеза хлорофилла. Р - экзотоксин индуцирует механизм темнового синтеза хлорофилла у этиолированных проростков лиственницы, формируя фотосйстему I и П. Рг - экзотоксин частично инициировал процесс биосинтеза хлорофилла. В этом случае отмечали формирование только фотосистемы П.

6. Установлено, что спектры флуоресценции проростков лиственницы и гороха, выращенных на свету, существенно различаются по форме, в зависимости от типа используемых токсинов, их концентрации и вида растений.

7. Рекомендованы, апробированы и дополнены методы биологической спектрофотометрии растений и оценки уровня фотосинтеза в качестве основы экспресс - анализа их прижизненного состояния.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Ефимцев Е.И., Воронина O.E., Методические указания по проведению исследований фотоиндуцированного обмена кислорода у проростков древесных растений и водорослей полярографическим методом // Москва: Московский лесотехнический институт. 1989. 19с.

2. Ефимцев Е.И., Буров Г.П., Воронина O.E., Мао Цзи Цзюнь. Регуляция метаболизма бактерий Bacillus thuringiensis энтомоцидными экзотоксинами // Труды II съезда биохимического общества РАН. Под ред. Скулачева В.П. и др. Пущино: Из-во ПНЦ РАН. 1997. ч. 2. С. 188 - 189.

3. Воронина O.E., Мао Цзи Цзюнь, Ефимцев Е.И., Шапкин О.М. Воздействие экзотоксинов энтомоцидных препаратов на проростки сосны и лиственниц // Тезисы докладов IV международной конференции «Регуляторы роста и развития растений». Под ред. ШевелухиВ.С. и др. Москва. Из-во ТСХА. 1997. С. 277.

4. Ефимцев Е.И., Воронина O.E. Методические указания по дисциплине «Радиационная экология леса» // Москва: МГУлеса. 1997. С.44.

5. Цзи Цзюнь Мао, Воронина O.E., Ефимцев Е.И., Воронин П.Ю. Содержание и спектральные свойства хлорофилла проростков разных видов лиственницы // Москва. Физиология растений. 1998. Т.45. № 4. С. 513-520.

6. Воронина O.E., Ефимцев Е.И., Татаринова Т.А. Пигментный аппарат растений в условиях антропогенного воздействия И Труды конференции «Мониторинг состояния зеленого фонда города». Москва. МГУ леса. Лесной вестник. №2. С.82.

7. Влияние экзотоксинов Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis на растения // Труды I Международной межвузовской школы - семинара «Экология 2000: эстафета поколений». Москва. 2000. С.9.