Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ И СВОЙСТВ ФИТОТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ «GLOCLADIUH ZALESKII. [...] И CHAMOMIUM AUREUM CHIVERS 6583

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ И СВОЙСТВ ФИТОТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ «GLOCLADIUH ZALESKII. [...] И CHAMOMIUM AUREUM CHIVERS 6583"

/ СРХЕЯАЖНЯНА. ИОРДЕНА РУЖЭД ИАРОД<В

А1ШЕМШ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР • ■

СРДБНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЭЯАШШ ' ИВСТ1П7Т МИКРОБИОЛОГИИ И.ВИРУСОЛОГИИ им.' Д.К.зшояохного

УДК 576.8»097.89: 631.427.2^; На правах рукописи

, НАДКЕРНИЧНАЯ " 'Л ■ " ..

ЕленаВладинировяа

аЗУЧЕНЯЕХШЧЕСК0ЙПРИ,0даИСВ0ЙСТВФИТ0Т<ЖСИЧЕСШ« - ВЕЩЕСТВ

- я сяАмашдаАташвд^яшгЕнз ■ В583 •' - ;

03,00.07 - микробкожфгмя

АВТОРЕ*-!РАТ

диссертации на ооясканме ученой степени. кандндатайиолргическмхяауЕ

Киев - 1982

; Работа ввполнека в отделе почвенной микробиологии

Украинского научво-ясоледоветельского институте " сельскохозяйственной микробиологии ; ■

»»учний руководитель: ' ■

• : Заслуженны ^деятель науки'УССР.

'-*;■ "-т.-'у .'" доктор биологических наук Я.Я.Захаровл

О&шиальяяооплонентв:

^ докторбиологичеоогхнаук И.А.Дудка '

г;....кандидат биологических наух А.Н.Зайчвмко

Ведущйяоргапизация-ВсесоозйыЯнаучно-нсоледовательскив

-институт.сельскохозяйственной . : ; ; микробиологии " * *• .

VЗавдтасмигои^ 1982 г. : .'.. .

• -» • час.Уна-заседаний специализированного совета. X-Q16.06.01 позащитвдиссертацийнасоисканиеученоЯстепенв : лектора биологических наук при Институте, микробиологии и . г ' «ярусологии им. Д.К.ЗаболотногогАЙ УССР: :,'•, .Ц-у :

/252143, у л. За б олот н от о,26 ^ Институт:микр обиол огнк-

г * «рус ол огии и м .Д .К. За бол оти ого- АН У ОСР/ **

; С диссертадиеЯ можно оэнакояи'Ппгй в библиотеке Институт? микробиологии и вирусологии як. Д.К.Заболоткого АН УССР*

• Автореферат разослан "727, КДЛ^ЬУ " 1982 г. \

■1 ■■

1 Учений секретарь -'у у ; у.; ,. „-с: '

специализированного совета ■,'■". л" ' ■-■■"" ' ■

юмцидат биологи че ских наук у у . : . А.Г.Коа „.--у. ■ с'-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем». Важнейшим условием успешной реализации Продовольственной программы СССР, разработанной з соответствии с решениями XXУТ съезда КПСС и принятой майским (1982 г.) Пленумом ЦК КПСС, является всемерная интенсификация сельскохозяйственного производства, предусматривающая значительный рост урожайности сельскохозяйственных культур и повышение плодородия почв.

Положительную роль з создании почвенного плодородия иг-раят сапрофитное грибы, обитающие в почве, т.е. почвенные гриба. Осуществляя такшзйтие этапа биологического превращения веществ в почве, синтезируя физиологически активbus соединения, они обеспечивавт условия для роста и развития высотах растений. Наряду с ovhm многие вида сапрсфитиах грибов в процессе жизнедеятельности могут образовывать токсические для растений.вещества илк ^итотоксииа. При определенных условиях фитотоксинц-образуются непосредственно в почве, накапливаются в ней и оказывают существенное влияние «а плодородие, вызывая токсикоз почв, проявляющийся в угнетении всхожести семян, снижении урожайности растений (Красильниксэ, 1958; Мирчинк, 1957, 1963; Берестецкий, 1971, 1978; Korstaüt, eíc.

Calla ,.I?7I и др.).

Часткнм случаем явления токсикоза является почвоутомление. Почвоутомлением назалают прогрессирующее снижение плодородия почв, наступающее при повторном воздедавании некоторых сельскохозяйственных растений на одном и том же месте. Одной из причин почвоутомления является накопление фитотоксических веществ в почве, образующихся в результате жизнедеятельности гдябав (Мирчинк, 1963; БерестецкиЙ, 1971 и др.).

Поэтому проблема взаишогиошеиый иикрооргакизлоз, лходя-оч в состав естественных биоценозов почвы и высших растений является весьма актуальной и заслуживает внимания со стороны згукк » проиэЕОдства. Особенно возрастает се актуальность в связи с.интенсификацией зеадеделия» вызывающей необходимость пересмотра существующих севооборотов в сторону каксяиальдого насцце-2ЕЯ I л основными культурами.

Некоторые фитотоксические веществе грибов оказиьазт специ-

1

фпческое действие только на растения и не проявляет антибиотической активности ( \ibeeler Д&53; З^аиЪе,■ Ег^есЫ ,1978). Такие.соединения благодаря высокой избирательности действия ио~ гут представлять ннтерес-кав гербициды микробного происхождения или как модели для синтеза вновь создаваемых средств защити растений. Продукты микробного синтеза' якест существенные яре и иу пест за по сравнен«» с хитнесюш! средствами' защиты растений. Они обладают высокой и в той или иной степени специфической биологической активность», и вместе с тег быстро разлагается г не накал ливаится в почве и других субстратах; что очень важно с точки зрения охраны окруааюней среды.

Токсические вещества грибного происхождения ухе сейчас находят практическое применение при селекции к создании сортов и гибридов сельскохозяйственных культур, устойчивых к неблагоприят пыи факторам среды, невосприимчивых к бодезняи (51;гаиЪе, РгИгзсЬ 1978).

Следовательно, исследования по выявлению ишероорганизиов-продуцентов биохогически активных веществ и всестороннему изуче-нпк> продуцентов и образуемых иии соединений представляют научный и практический интерес.

Задачи исследований. Основными задачами настоящей работа явилось: I. Изучение фитотоксичесхих свойств и физиологии токси-яообразования О11оо1а<1±ии аа1ез)с11 11313 и СЬав1ош±иш аиге-шл 8563.

2« Оптимизация условий для максимального накопления фнтотокси-ческих веществ изучаемыми грибами.

3. Выделение и очистка фн тот о к си че ских веществ.

4. Изучение физико-химических свойств фитотоксина С1. заДееИ.! 11313 и установление его структуры.

5. Изучение химической природы фитотоксического соединения сь. аитеиш 3583.

6. Изучение характера действия индивидуальных фитотоксических веществ на растения.

Научная новизна результатов. Впервые выявлена способность 61. га1езк!1 Я СЬ.аигешв к образованию фитотоксических вещзств, изучена физиология токсиноойразования этих грибов. С помощь» метода математического планирования эксперимента определены условия для максимального накопления фитотоксичесгих соединений.

Йз куяьтуральной жидкости 01, гаАезкИ впервые выделено вещество, ответственное за фититоксические свойства гриба- продуцента, изучены его физико-химические свойства и предложена структура.

Вещество с высокой фитотоксической активностью впервые выделено из культуральной жидкости сь.аигеша. Изучена химическая природа этого соединения, что позволило отнести его к пиполипи-дам. Способность грибов к образованию високотоксичных в отношении растсниЙ гликолипидов показана впервые.

Изучен характер действия полученных токсических соединения на растения. Впервые показано, что фитотоксические вещества спо-

ЬоСны подавлять сиабиотическую азотфиксецис клубеньковых бак- 1 терий люпина, не проявляя антибиотической активности в отношении Hblzobiua lupini.

Практическая значимость работа. Результата исследований могут быть использованы при селекции и создании новых сортов и гибри дов люпина и других боровах культур, устойчивых к неблагоприят ним факторам среды и заболеваниям. 1

Апробация работы.Основные положения диссертации доложены на У конференции по низшим растениям Закавказья (г.Баку, 1979), на Республиканской конференции по проблемам адлеяопатли (г.Белая Церковь, 1962), на научной конференции молодых ученых Украинского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г.Чернигов, Е982) на научной микробиологической секции Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР (I9C2). Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано шесть научных работ.

Структура и-объем работ». Диссертация состоит из введения; обзора литературы (3 главы); окспериментальной части (5 глав), вклочаищеЯ главу "Материалы и методы исследований"; обсуждения результатов; выводов и списка литературы, содержащего 292 источника, из них 189 иностранных авторов. Работа изложена ка 136 страницах машинописного текста и иллюстрирована 24 табли- . цами, 12 рисунками, 13 микрофотографиями, 3 электронн»-микроскопическими фотографиями.

Объекты исследований. В работе использованы почвенные сапрофитные грибы, проявившие высоку» Фитотоксическую активность: Gl. zaleskll х!313, изолированный нами из пахотного слоя (0-27 см) тепно-каштановоЯ почвы под озимо!) пшеницей (опытное поле Украинского НИИ орошаемого земледелия) и Сл. aureum 8563

h3 пахотного слоя (0-20 см) дерново-подзолистой почвы под лв- ' пином (.стационар Черниговской сельскохозяйственной элитной станции). Зти грибы часто встречаются в основных типах почв Украины.

Материалы и методы исследований. Чистые культуры изучаемых грибов идентифицировали до-вида по определителям Н.Я.Пидопличко (1953) и Г.С.Кириленко (1978).

Для изучения фитотоксических свойств грибов, физиологии токсинообразования, а также при оптимизации условий культивирования для максимального накопления фитотоксических веществ грибы выращивали поверхностно на среде Ролэн-Тома при 2б°С.

Пригодность различных соединений в качестве источников углеродного, азотного и фосфорного питания определялась по максимальному накоплении фитотоксических веществ в культураяь-ной жидкости грибов.

Оптимальное сочетание весовкх соотношений компонентов среды и времени культигирования грибов определяли с помощь» полного факторного эксперимента П$Э (Максимов. Федоров, 1966, 1969). Проверку значимости коэффициентов регрессии осуществляли методом статистической проверки и графика полу-нор-кального распределения ( Daniel , 1959).

Оптимизацию условий культивирования грибов о це^ью повышения выхода фитотоксических веществ проводили методом крутого восхозэдения (Максимов, Федоров, 1966, 1969).

Фитотоксическую активность грибов определяли с помощью метода последовательных разведений (Егоров, 1969) на растительных тестах (Берестецкий, 1972), антибиотическую _ методом диффузии в агар (Егоров, 1969).

Биделение фитотоксических веществ из культуральни* жид-

костей грибов производили методом экстракции органическими растворителями. Выбор растворителей осуизствляли на основании данных суммарной"хроматографии на'букаге с исполь"зовгккем зл»от-ропного ряда Траппе (Кейл, 1966).

Гомогенность выделенных и очицениил препаратов подтверждали тонкослойной хроматографией на пластинках " oilufol " в различных системах растворителей (Шаршунова и др., I960).

Для идентификации лолученвьгх фитотоксических веществ производили элементный анализ, определяли температуры плавления по Кофлеру СЗазурьевский и др., 1966), снимали ультрафиолетовые и инфракрасные спектры. Спектры-поглощения в ультрафиолетовой области снимала на спектрофотометре СФ-16, в инфракрасной - на приборах ur -10 и пн~20 "Цейсс".

Молекулярную кассу определяли методом полевой десорбции на касс-спектрометре с ионизацией молекул в сильном электрическом поле.Метод разработан в Институте физической химии АН УССР.

Определение редуцирующих веществ осуществляли реакцией с фенол-серной кислотой ( Dubois et. al. , 1956).

Мокосахараднай состав определяли методом восходящей хроматографии на бумаге, а такяе методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе " Chrom -5м с пламенно-ионизационным детектором. Гидролиз препарата производили при I05ßC в запаянных пробирках в течение 2-х часов с 3.1 соляной кислотой.

Количественное определение глюкозы проводили глвкозоокеи-даэнын методом (Методы экспериментальной микологии, 1932).

Периодать'е окисление препарата фитотоксина сь. аигеша 55S3 осуществляли методом Флзури и Ланге (Fitот7, Lange, 1933) с последующим восстановлением боргидэидом натрия.

Метиловые эфиру жирных кислот были получены путем гидро-

'ляза препарата и метилирования мирных кислот 1,5% раствором серной кислоты в метаноле (Васпоенко и др., 1982). Анализ метиловых эфиров жирных кислот производили на газовой хромэтог-рафе "Цвет-ПО" о пламенно-ионизационным детектором.

С целью изучения характера действия полученных фитотокси-ческнх веществ на растения производили цитологические исследования (Лаугева,1574; Методы экспериментальной микологии,1982).

Микрофотографирование объектов осуществляли с помощью микроскопа МБИ-3 и микрофотонасадки №5Н-12У, электронно-микроскопические - на электронном микроскопе ЭМБ-100 с ускоряющим напряжением 75 кв.

Определение си«биотической азотфиксации клубеньковых бактерий люпина производили с помощью газовой хроматографии ацетиле п-зти леновым методом на хроматографе " СЬгоп -4" с пламенно-ионизационным детектором.

При обработке и интерпретации данных по характеру действия фитотоксичесхих веществ на растительную клетку исполизова-ли методы математической статистики (Лакин,1973; Доспехов,1973)-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фктотоксические и антибиотические свойства ПЗГЗ

и сь. яигеиш 6583. Фитотоксичеокие свойства '-'а. 11313 и сл. аигешп 8583 изучались на семенах и проростках однодольных и двудольных растений. 0 результате было установлено, что кативные культуральные жидкости изучаемых грибов полностью подавляли всхожесть семян и ингибировади рост проростков всех испытанных растений, ¿итотоксическое действие культуральной жидкости (¡1.га1е8Ы1 11313 наблюл л ось при разведении 1:32. Аналогичное действие культуральной жидкости СЬ. аигеиш 8583 наблюдалось при разведении 1:8, с увеличением разведения ее

активность снижалась и совсем из проявлялась в разведении 1:32,.что свидетельствует о более интенсивном биосинтезе Фи-тотоксических веществ культурой <л. 11313 я более

высокой фятотск-ической активности образуемого ев соединения.

Угнетагсщее действие культу рал ышх жидкостей грибов на всхожесть семян проявляется слабее, чем на рост корней. Так, пол*'ость я подавлялась всхожесть семян всех попутанных растений только пои воздействии неразделенных культуральных жидкостей, а при разведении 1:8 спи уже не оказывали влияния на семена люпина, вики, рапса, дикой редьки, куриного пооса и щирицы, ^иготоксйческое действие грибов на всхожесть сешн различных растений проявляется по-разному. Наиболее чувствительными к воздействию С^* заХезЫ.! 11313 оказались семена кресс-салата, редиса, озимой пшеницы, куриного проса, лзпина и щирицы; в меньшей степени подавлялась всхожесть семян клевера, рапса и вики. К воздействию СЬ. аигеи-а 3583 наиболее чув-ствит^льныии были семена кресс- салата, вики, редиса, куриного проса и люпина; к менее чувствительным можно отнести семена клевера, рапса, озимой пшеницы, дикой редьки и щирицы.

Антибиотические свойства 01- 11313 и с.Ч. амо-

ит 8533 изучали на широком спектре микроорганизмов. Полученные данные свидетельствуют о слабой антибиотической активности данных грибов. Так, нативная культуральная жидкость гамаки 1X313 из 28 культур микроорганизмов задерживала рост тольхо Аврег^Шиа :Сий1БаШз » Сашиаа зо1ап! И ЗассЬагощусез сегеие; СЬ. аи-геиш 8583 - Б^врготусев е1оЫ8рогиэ И £. гг1ееиа.

Таким образом, изучаемые штаммы грибов облазит высокой неспецифической фитотоксической активностью и слабой антибио-

ткческой.

Оптимизация состава питательной среды для максимального накопления ¿глтстоксичадких Дйасотв гоибани. КезОлсиугмым условием для солуч-г;;^ токсических згаестз является .учение физиологии их С:; сю:> чте за. Каик и с/чз ни нг;;отоэъ:с физиологические свойства с-1. :п1 езк! 1 11313 и СП, аит-еш £533 - способность усватать различные источники углеродного, азотного и фосфорного питания в связи с еикте эсм фит от о;: -и ч е с к и х с содоме ни й.

Как ей дно из р.чс.1, изучаемое грибы обладают способность» усваивать в качестве источников углерода довольно больиоз количество органических соединения. Однако пригодность этих соединений для роста и токсинообраэованик Од. за1егк11 11313 и сь. аитецз 8583 неодинакова. Наиболее пригодными для роста

га1езк±1 11313 из .юпытанних источников углерода оказались ксилоза, мальтоза, глюкоза и сахароза; для биосинтеза фи-ютоксических веществ - сахароза. Лучший рост у си, аагепп 8563 отмечен на средах с лактозой, глюкозой, сахарозой. ;>йкси-нальную фитотокеичеснув активность гриб проявил на среде с фруктозой, при использовании лактози и сахарозы образования фитотоксичеоких веществ не кайлодалось.

Следует отметить, что рост изучаемых грибов не наблюдался на средах с органическими кислотами (винной, лимонкой, молочной, щавелевой) и их солями (лимоннокислым натрием, .щавелевокислым натрием, уксуснокислым натрием), поэтому зти среди к« вклинены з рис.1.

Изучение источников азотного питания показало (рис.2), что максимальный рост в1„аа1евм.± 11313 совпадает с максимальным накоплением фитотоксинов при использовании азотнокислого кальция и виннокислого аммония. Максимальное образование

12 13

Рис.1. Влияние различии* источников углерода не рост и фитотоксическую активность изучаемых грибов: I - а.. га1езк!1 Х1Э13, II - СИ. аигеиш 8583.

А - фитотоксическая активность при разведении культуральной

жидкости 1:16. в % к контроле Стенные столбики), Б - вес мицелиь 10-дневных культур, мг/40 мл среды (светлые столбики)* 1-арабнноэа, 2-ксилоза, 3-рамноза, 4-гдвкоза, 5-фруктоза, 6-мальтоза. 7-лактоза, 8-сахароза, 9-раффиноЗа, 10-крахмад, П-манннт, 12-ду ".ьцит, 13-инозит.

I 2 3 it 5 б 7 S 9 10 II 12 13 14 15 16 17

II

P::e.2. Влияние разлкчккх о коз qаота на рост и фкто-тскопческую активность изучавших грийоз: I - Gl. ualeskii II3I3, II ~Cli. aureun 3533.

Л - фптотоксичвская актп1;:;ость при разведении культурально^ яд.!!, к осе;':'! 1:16, з % :: коптро.чз (те ï у cvc-'OiiKll), 3 -

I С-дневных культур, >;г/it0 мл среди (сиетдыо стелен;:;;).

l-îfaMO-, 2-lOÏOj, 3-НН^:1С>5, -VCa(KÛ^>2 ВД20, 5-Кэ1ГОг,

6-bh4CÎ, ■р-ОГЛц)ъ-лЩ^дЮ^,9-KLп2Р04, [О-мочеяина, П-аспаэагкиовзя кислота, 12-алвннн, 13-вслкк, I'i-глутаминоЕая кислота, 15-лизис солянокислой, Хб-лсйщш, £7-виннокислый аммоний.

фитотоксинов сь. аигоит 8553 и максимальное накопление бионаосы гриба происходит на среде с однозамеценным фосфорнокислым аммонием и глутакиновой кислотой как источниками азота.

Использованные в качестве источников азотного питания азотнокислые*, натрий, азотнокислый кальций, мочевина, аспараги-новая кислота, аланин и лигин обеспечивали рост мицелия сь. аиг^иш 5583, однако образования фитотоксических ведеств при атом не происходило.

Все испытанные источники.фосфорного питания способствовали биосинтезу фитотсхсических соединений: щ. га!езк1± 11313 почти в одинаковой степени (рис.3). Не отмечено существенных

■ ; Г

различий и в росте гриба. Наиболее благоприятными для роста сь. ешгеш 8583 оказались одйозамеаенний фосфорнокислый калий и двухзамещенииЯ фосфорнокислый натрий,* но в их присутствий не образовывались фитотохсическве вещества. Максимальная фитоток-сическоя активность культуралькой жидкости и хороший рост гриба отмечены на :средах с однозамещеннаи фосфорнокислым натрием и одноэамешенным фосфорнокислым аммонием.

Таким образом, при использовании большинства испытанных источников углеродного, азотного и фосфорного питания для культивирования 51. Зб1ее]с11 11313 и СЬ- аигешл 8583, процессы роста иииеяия этих грибов к биосинтеза ими фитотоксических соединений не совпадали.

На основании вышеизложенного, для культивирования 01, га1еакИ 11313 была выбрана среда Ролэн-Тома, г которой источник углерода глюкоза эанеьена эквивалентным количеством сахарозы, в качестве источника азота использовал« вклнаккслыК аммоний, источника фосфора - однозамещенный фосфорнокислый натрий, ¿ля сь.аигешв 65ВЗ применяли фруктозу, однозамещенный фосфорнокис-

лый аммоний и однозамешенный фосфорнокислая натрий соответственно, При этом фитотохсичэскаР активность 31. га1езк11 11313 повысилась в два раза, сь. аигеша 6383 - в четыре раза по сравнению с исходной средой Ролэн-Тома.

Для определения оптимальных весовых соотношений компонентов, входя да* х в среду, был проведен полный факторный эксперимент ПФЭ 2е* (Максимов, Федоров, 1966; 1969). Для каждой культуры изучено влияние на фит от о к си че с куп активность четырех факторов: источников углерода, азота, фосфора и времени культивирования, Каждый из факторов исследовали на двух уровнях: нижнем (-) и верхнем (+). По плану ПФЗ 21* было изучено 16 вариантов в 4-х кратной повторности.

Проверка значимости коэффициентов регрессии л графиков полу-нормального распределения показала, что существенное положительное влияние на биосинтез фитотоксических соединений 01. га1еаМ.1 11313 оказывает фактор Х^-время; для СЬ. аигеша 8563 - факторы: Х^-источник азота и Х^-время. Отрицательное влияние на'процесс для 01. иа1езк11 Ц?13 оказывают факторы: Х^-источник углерода и источник азота.

В результате использования-модифицированной среди Ролэн-Тома и применения метода математического планирования эксперимента для оптимизации процесса были определены условия, обеспечиваю дне повышение фитотоксической активности 61. га1ее)с11 11313 в черыре раза и сь. аигеша 6583 в шесть раз по сравнении с первоначальной (табл.Х).

Таблица I.

Результата огштоз пс оптйиизацка питательно^ среды Ролэк-Тоыа.

Варианти опытов

! Источники питания, г/л 1_

¡ксточнккк углерода !источники азота!иитечаакч !__I _¡фосфора

! | !

|гл»ко-;$рук-! саха-данно-

1 га ;тоза ! роза ¡кислы!} ( I ! (анионий

1 !•■ I (

(

Время

к/льти-

вировакия

¡ФЕТотоксическая ■активность куль-

,ТУР£1ЬНЫК 1.ИДКОО-

¡тей грабов ¡(разведетие 1:32), ¡г ъ к контролю

(контроль- среда [ Ролэн-Тоиа), ( !

61, аа!ёзШ 11313

Исходная среда . 50,0 ' .--'"■ - 2,65 ол 10 25

Оптинизированаах дреда . - . - 45,65 2,50 - 0,4 14 ' 100

" СЬ. ащгеша В533

Иоходная среда 50,0 - . - 2,66 0,4 - 10 15

Оптимизированная среда - 50,0 3.5С - 0,4 9 90

1 И

Рис.3. Влияние различных источников фосфора иа рост и фито-токсическую активность изучаемо* грибов: I - га1евк11 ПЗГЗ; II - СЬ. аигёит 6593.

А - фитотокскческйя активность при разведении культуральной жидкости 1:16, в % к контроля (темные столбики), Б - вес мицелия 10-дневных культур, кг/40 мл среди (светлые столбики). I- (КЕ^НГО;,., 2-ЕН2Р04, Ч-КаН^РО^, З-Л^у?«^.

Выделение, очистка, изучение физико-химических свойств и |идентификация фитотоксина яагеэкЛ 11313. Выделение фитоток-. сического зевдестза нз культуральной иидкости и.. ааХавКИ-11313, выращенного на модифицированной среде Р,олэн-Тома, Про-пзвочили экстракцией диэтиловым эфиром с последующей обработкой пегролейним эфиром с цель» освобождения от липяддых примесей. Для дальнейшей очистки соединения использовали распределительную колоночную хроматографию. Перекристаллизацией из снеси бензола и этанола в соотношении 2:1 было получено гомот ' генное веьэство (средний выход 55 мг из I л культуральной жидкости).

Изучаемое земство после перекристаллизации представляет'

собой бесцветные игольчатые кристаллы с температурой плавления 330-331°С. Оно хорошо растворимо в этаноле, »оде, эфире, хуже - в бензоле, четыреххлористом углероде, в гекеане раство- ■ римо при нагревании. Водный раствор вещества имеет нейтральную реакцию.

Данное элементного анализа свидетельствуют о наличии в полученном соединении углерода (С-57,35; 57,32; 57,36 водорода (Н-7,35; 7,39; 7,37 %) и об отсутствии азота, сери и галогенов.

Довольно высокая температура плавления вещества обусловила использование метода определения его молекулярной массы -масс-спектрометрический метод полевой десорбции (ГоловатаЯ и др., 1975; Король и др./ 1979). В нашем случае масс-спектр полевой десорбции содержал только один интенсивный пик, отвечавший массе иона т/е 272, что свидетельствует о высокой степени очистки выделенного фитотоксина,

/становление молекулярной массы наряду с количественным определением углерода и водорода в изучаемом фитотоксина позволили определить его брутто-форкулу; С^^Н^^О^,

Дальнейшее изучение структуры фитотоксина 01. -,а1еаки 11313 проводилось методами спектрального анализа.

В УФ-спектре не наблюдалось поглощения в области 2 00-3 ООн м что наряду с отсутствием поглощения в областях, характерных для валентных, скелетных и деформационных колебаний ароматических углерод-угдеродних связей (ПК-спектр), позволило сделать вывод о насыщенном характере выделенного соединения.

Наличие в ИК-спехтре сильной полосы поглощения при а588см~ может характеризовать присутствие в исследуемом соединении группы 00. Смещение этой полосы к более низким частотам харак-

терко для таких молекулярных структур как аминокетоны и ди-кетоенолы. Исключив возможность существования в наследуемом соединении аминокетонных структур (так как согласно данным элементного анализа азот в соединении отсутствует) и приняв во внимание наличие широкой полосы поглощения в области 27003200 ом-1, приходим к выводу, что эта полоса характеризует наличие валентных колебаний Ой группы в енолышх формах соединений типа ^д-дикетонов (рис.О.

31РО , 27р0 7 2390.....'1906'"" ПОР -.....

Рис.4. ИК-спектр фитотоксина И. га1евМ.1 11313. ■*■■.

Наблюдаемый нами в ИК-спектре дублет полос с частотами 1425 и 1444 см~глрактерен для соединений/ содержащих метиле-новце группы с аклвним атомом водорода типа -Й^СО-.

Деформационные колебания связи С-0 простых^ эфиров лают ряд полое в области 900-1100 си*"*.

Суммируя данные, полученные методами спектрального анализа, можно с большой степенью вероятности предположить структурную формулу исследуемого фитотоксика:

0 0 l t Л

!F ? ?

ИгС-СН^ I I н.с-снг

HjCXcac4c^Hn^CH¿4 снз 0/ ч0 b, ь O V

Предложенная структура подтверждается цветной реакцией с хлориим Млезоя. Красная окраска ттри до баи л си» к к спиртовому растзсру Биде ценного фитотоксин'а хлорного жлеэй свидетельствует о том, что исследуемое соединение яредетавляет собой таутомернуе систему, содержащую кете- и снольнув ферма. Для енолькой форму зцдаде¡:пзго сочинения характерно cysüüü-rsoEtiHiie сильной водородной сълз'л, и гэт а обстоятельство паря ду з ричноЯ структурой может объяснить довольно высояуи температуру плавленка исследуемого соединения.

Таким образом, на основании приведенных данных мо;?.но предложить структурнуп формулу ладеленного фитотокоина, cüütoтатическое название которого Ц,6~лш;е?о-2,0-ди(этилеидио^;со;,ано)]шнан. Виде ленне, очистка и изучгкке ■лущичсекоа г,г)1-.псди токс^на^ поодуиярУймого с.Ь,,, 6583. 'Экстракцию фитотйксическк'о

вещества из лиоф^лизированной культуральной жидкости Ch.ьигейм 8583 производили этанолом. Многократной обработкой петролейны« »фарой освобождались от липидннх примесей, Дальнейшую очистку

вещества производили хроматографией па колонке с силикагелек. После диализа и лиофилкзации получили гомогенное, вещество (средний выход 125 мг из I л культуральной жидкости). Полученное соединение хоропо растворимо в воде, спирте, хуже - а ацетоье, про-паноле, бензоле, хлороформе, совсем не растворимо в четыреххло-ристом углероде, гексане и пстролейном эфире.

Температура плавления Пб-П7°С. Данные элементного анализа ( % ): С-61,97; 61,92; 61,90; Н-Ю. 37; 10,92; 10,90, азот, фосфор, сера и галогены отсутствуя?.

Выделенное вещество в ультрафиолете не поглощает.

Для того, чтобы отнести выделенное соединение к какоцу>либо классу химических соединений были проделаны качественные реакции: Положительная реакция с антроыом дала возможность предположить наличие в молекуле исследованного соединения Сахаров.

Реакцией с фенол-серной кислотой установлено, что соединение содержит 31,6% редуцирупцих веществ.

' Данные бумажной хроютографии в двух системах растворителей свидетельствувт о том, что углеводная часть молекулы содержит только один нейтральный сахар-глвкоэу, это подтверждается также результатами' газо-жидкостИой хроматографии. Согласно данным ПХ выделенное вещество содержит глицерин 4,8%. Количество глекозы в'образце, определенное реакцией с глюкозооксидазой, составляет 26Í.

Структура углеводной части молекулы была установлена с по-. нощь» реакции периодатного окисления с посаедуощим'восстанооле-нием боргидридом натрия* 6 результате периодатного окисления, последующего восстановления боргидридом натрия и гидролиза образовались муравьиная кислота и глицерин. Это обстоятельство позволяет сделать вывод, что в углеводной части молекулы изучаемого

соединения глюкоза соединена ь цепи связью 1-6 ;г не имеет заместителей»

В Щ-спектре фитотоисина майл»далась интенсивная полоса поглощения при 1730 см-*, характерная для сложкоэфирной связи жирных кислот. Состав и соотношение .жирных кислот изучали мете дом ГЖХ на хроматографе "Цвет-ПО". Данные жирнокислитного анализа препарата приведена на рис.5.

Рис.5. Жирнокислотный профиль препарата сл. ацгешаб583. * В препарате преобладают пальмитиновая (С^.ф), стеариновая СС^д.д) и ненасыщенные кислоты с 18 атомами углерода (олеиновая и линолевая). В меньших количествах содержатся насыщенные и ненасыщенные прямоиепочечные жирные кислоты с 14-17 атомами углерода. 1ирнокислотннй спектр характерен для нейтральных липидов грибов.

Таким обраэои, качественней и количественная состав жирных кислот позволяет предположить, что жирнокислоткая часть выделенного фитотоксина представляет соСоЯ диглкцерид.

Суммируя вышеизложенное, можно отнести изучаемый фитоток-сии по химической природе к гликолипидаи. Гликолипиды - широко распространенный класс соединений, подробно изучены гликоллпи-ды бактериального происхождения ( Вгеплап о^ а1.,1970;5Ьа»,197';,, Способность грибов к образованию зысокотоксичных в отношении растений гликолипидоа нами показана впервые.

Как известно, структурные формулы гликолипидов не .расшифрованы, но исходя из химического состава, предлагают суммарную формулу: сахар-глкцеркн-г^ркые кислота. Таким образом, на основании полученных нами данных, можно предложить суммарную формулу гликолипкда:

CH^-O-CORi

Фитоток сичес кие свойства выделенного гликолипида определяются, по-видимому, егэ жирнокислотной частью, т.е'.диг лице ридом, так как нами было остановлено, ч?о Фитотоксическая активность препарата не изменялась после разрушения глюкозы периодатом натрия. Глюкоза, очевидно, выполняет другую функцию, а именно: придает фитотоксину растворимость в воде и тем самым облегчает проникновение его в с астения.

1>итотоксичность и характер действий соединений. выделенных из гл , < II3I3 и гу-. nursun 8583, на растения. Ёитотоксичес-

кие свойства выделенных индивидуальных вепсста изучали на семенах и проростках различных растений, их активность определяли при

концентрациях от 5 до 300 ккг/мл. Полученные данные свидетельству а т о высокой активности испытуемых соединений б отношении растений. Вещество 01.га1езк1111313 оказывало икгибируюцее действие на корни проростков кукурузы, озимой пшеница и редиса в концентрации 5 мкг/мз, СЬ. аагоша 9533 в концентрации 10 мкг/мл. Антибиотическую активность выделенных фктотомических веществ в концентрациях 50, 100, 200, 500 ккг/мл изучали не том же спектре микроорганизмов, что и культуральные жидкости грибов-продуцентов,; В резуяьтате было установлено, что эти соединения не оказывают антибиотического действия. '

Следовательно,:Ч,б-дихето-2,8-ди(этилендиоксолано)нонан, образуемый С1.га1егис11 Ц313 и рдиколипид из О.аигеив 8583 можно отнести к активным фитотохсинам с неспецифическим действием,

Фитотоксины( попадая в растения, вызывают нарушения клеточных структур и оказывают существенное влияние на физиологические процессы и химический состав растений С Сотэгоск, Иаг-Ь1пзоп, 1975} Кегл, 1978).

Нами изучалось влияние, фитотохсических веществ аа1вБ-

3=11 11313 и Оиаигеи» 8583 на рост и китотическое деление клеток, проницаемость цитоллазкотических мембран. При отом проводились наблюдения за патологическими изменениями, происходящими в ядре клеток. В результате установлено, что фитотоксины изучаемых грибов угнетали рост клеток корней озимой пшеницы в зове растяжения уже в концентрации 5 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации фитотоксиноа до' 100-200 мкг/мл приводило к уменьшению роста клеток более,чем в два раза.

Изучаемые фитотокоины ингибируют митотическое деление клеток. Так, е контроле митотический индекс (МЙ,#) был равен 8,1,

в сайтах с фитотоксинами 11313 и сь.ашгеид 8583

Прк кегаснгрйции 50 «кг/мл - 1,4 и 1,8 соответственко. В более высоких концентрациях (200 мкг/мл) фитотоксикн почти полностью тормозили митоз.

Под воздействием ф^тотоксическгсх веществ ¡¡зучгемих грибов позывалась проницаемость цнтоплззматячесхих мембран, Изменение их проницаемости обнаруживалось при действии ф.чтото.чеинов в концентрации 5 мкг/кл, при'более высоких концентрациях (200 ' мгсг/мл? она повышалась в 3 разе,.

Серьезные наруаения фитотоксины вызывает в ядерном аппарате клеток. Под их влиянием пабладались структурные изменения хромосом, их разрыва. При поп «иге иных концентрациях фитотокси-ноз было отмечено беспорядочное размещение фрагментов хромосом ъ цитоплазме клеток. В ясских концентрациях (200 икг/мл) фито-токсаческие соединения вызывала вакуолизации ядер и их лизис.

Таким образом, угнетение роста и развития растений фито-токешеми С1.5а1езк1ь П31Э и СИ.ашгедда 8583 происходят ' вследствие глубоких нарушений структуры растительной клетки.

Нами раскрыта еще -одна сторона в характере действия полученных фитотоксинов на растения. Оказалось, что они, не проявляя антибиотической активности а отнопен;с* ПЬ1гаМ{;а 1ир±п1, вызывает резкое снижение а з отфи к сярую кз й активности клубеньков люпина. При этом снижение продуктивности азотфиксации зависит от вида и сорта люпина. Так, под воздействием фитотоксина сь.-аигеига 8583 в концентрации I ккг/мл продуктивность азотфиксации клубеньков многолетнего люпина уменьшилась с 48,0 до 6,8 мкг азота на 1г клубеньков в сутки или в 7,2 раза по сравнению с контролем, люпина желтого сорта Факел - с 4,5 до 0,36 или более, чем в 10 раз и сорта Академический - с 2,2 до 0,12

или тмти в 20 раз (табл.2). Ингибирунщий эффект фитотокси-' нов аналогичен эффекту, вызываемому фузариозннмк заболеваниями растений долина. Это обстоятельство ложет найти практическое применение при селекции и создании новых сортов люпина, устойчивых к заболеваниям.

Таблица 2.

Влияние фитотоксина сь. аигегш 6533 на*активность симбиоти-ческой азотфиксации клубеньков многолетнего и некоторых сортов люпина желтого (фаза развития растений-бутонизация).

Концентрация ! Продуктивность !

фитотоксичес- 1 азоттиисации, ! Статистические параметры кого вещества,! мкг азота на !

мкг/мл - 1 С■" I I - *Т >7*"

Многолетний .-»пин

Контроль 48,0 1,28 - 5,3 2,6

I 6,8 0,15 31,9 4,4 2,2

5 1,8 0,05 36,0 5,5 2 7

10 1,5 0,05 36,3 6,6 3,3

50 0,6 о: се 37.0 6,6 3,3

Сорт Академический

Контооль 2,20 0,090 " - 8,2 4,1

I 0,12 0,005 . 23,1 8,4 4,2

5 0,08 0,003 23,5 7,4 3,7

10 0,08 0,003 - 23,5 7* 4 3,7

50 0,05 0,003 23,7 1 0.0 5,0 Сорт Факел

Контроль • 4,80 .0,170 . - _ 7,6 3,8

Г 0,36 0,015 24,3 ь 0 :.4 2

5 0.30 0,011 24,7 7 3 3 7

10 0.2I 0,010 25,0 ю 0 4 7

¿0 0.16 0.007 2 5,5 . 817 4^

Р'Ф____________0,013. _ _23,8_ _ 2',9 _ __

Применение: РФ - клубеньки растений люпина, пораженных фуэарио-зом, X - средняя арифметическая, т - средняя оагибке средней арифметической, ъ ф-критерий достоверности в сравнении с контролем, V - коэффициент вариации (в %*), Са- точность параметров (в Достоверность различий между средними величинами принималась при -Ъф^ ьв = 2,78.

выводи

Обитающее в почве сапрофитные гтибы ъ&1езк11 11313 И сь.аигеша 8583 проявляли высокую фитотокскческую актив* ность при культивировании их на питательных средах. Культуре льни е жидкости отих грибов полностью подавляли всхожесть семян и ингибировалв рост проростков всех испытанных однодольных и двудольных растении. -'

2. Установлено, что процесс биосинтева фитотоксических веществ наиболее интенсивно протекает на модифицированной среде Ролэк-Тома щи использовании для и. гв1е»Ы1 11313 в качестве источника углеродного питания сахарозы, источника азота - виннокислого аммония,, источника фосфора - одноэаме-ще^нного фосфорнокислого натрия; для СЬ. аигеит 8563 -фруктозы, однозамещенного фосфорнокислого аммония, однозамещенного фосфорнокислого натрия соответственно.

3, Применение метода математического плакирования эксперимента для оптимизации питательных сред к времени культивирования грибов позволило повысить фитотокскческую активность И, гаХеакИ 11313 В 4 раза и сь, аитешз 8583 9 6 раз. / Из культуральной жидкости гэйеэкИ 113^3 впервые выделено и очинено фитотоксическое вещество, изучены, его физихо химические свойства и предложена структура. Соединение идея тифицировано как 4. б-дикето-2,8-ди(этилендиокеолано!)яоион,' Ёитотоксшш подобной структуры до настоящего времени не описаны.

5. Впервые иэорирсвадо фитотоксическое вещество из культураль-ной жидкости т. аигеит 6583. Изучение химической природы данного соединения позволило отнести его к глихохипидам. *

те.

Способность грибов ,к образование высокотоксичных в отношении растений гликолипидов показана впервые.

6, Полуденные индивидуальные вещества проявляли фитотоксичес-кую активность в низких концентрациях: 4,6-дккето-г,8-ди-(эти ле н ди океолано)конаи - 5 мкг/мл, гликолипид - 10 ккг/мл.

Антибиотического действия эти соединения не оказывали,

7. Показано,, что угнетение роста и развития растений фитотскопчески ми веществами <11. га1еак11 11313 и СЬ, аагеига 053? происходит вследствие изменения проницаемости цитоплазмати-ческих мембран, ингибирования митотического деления клеток, уменьшения роста клеток в зоне растяжения. Под влиянием этих токсинов происходят также глубокие изменения и ядерном аппарате клетки: возникают структурные изменения хромосом, вакуолизация ядер и их лизис.

6. Изолированные тот оке и чес кие вещества, не проявляя антибиотической активности в отношении НМзоЪИш 1ир1я1, в низких концентрациях (Х-5 мкг/мл) вызывают резкее снижение симбиоглческой фиксации азота клубеньковыми бактериями люпина, аналогичное снижение наблюдается у растений лашша, пораженных фуза-риоэнин заболеванием..

Это обстоятельство может быть использован^ при селекции и создании новых сортов люпина и других бобовых культур, устойчивых к заболеваниям.

Основные положения1 диссертации опубликованы в следующих раоотах:

I. Назарова Е.В. (Надкерничная), Патака В.Ф. Оптимизация питательной среды для образования фитотоксических веществ вио-с1а41ии> га1еа5с11 Р14ор1.У съезд Украинского микробиологического общества. Тезисы докладов. Киев, "Наукова думка", 1950, ^.52.

г?,

2. Назарова Е.З., Патыка В.Ф., КадкерничниЯ С.П. Влияние состава питательной среда» на фитотоксическув активность СЬае-Ьопаиш с.игеиж СЫтега 8583. Микробиолог. Я., 1931, 43,

• 5, с.556-560. , ' '

3. Назарова Е.В., Патыка В.Ф., Надкерничный С.П. Влияние компонентов средн на фитотоксическу» активность С11ос1а41ил

га1оаЫ1 11313. Труды Всесоюзного паучно-неследсвательс-кого института сельскохозяйственной микробиологии.I., 1981, с.35-43.

4. Назарова Е.В., Захарова И.Я. Выделение и характеристика фи-тотокскческого вецества. 511ос1£нШш гаД-евЫ. 51X313. Кикробколог. д., 15й2, 5, .с.43-48.

Назарова Е.В. Фитотоксическио свойства векествй, продуцируемого сьае£от1ша оигеши 8583. У Республиканская конференция по проблемам алледопатии. Тезисы докладов. Киев, "Вауко-ва думка", 1982, с.150-151.

6. Назарова Е.З., Захарова Й.Я. Извлечение фитотоксическсго вещества из О11ос1аа1ша zaleвk±í 11313. У Республиканская конференция по проблемам аллслопатии. Тезисы докладов. ' Киев, "Наукова думка", 1982, с.151-152.

НПО. Лаб.оечатк.Ш Jt 02545. Зан. . -03. Т. 1*50. 0-1 .XI.82