Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение эффектов меланокортинов в модели вызванной стрессом депрессии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение эффектов меланокортинов в модели вызванной стрессом депрессии"

На правах рукописи

ЯЦЕНКО Ксения Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТОВ МЕЛАНОКОРТИНОВ В МОДЕЛИ ВЫЗВАННОЙ СТРЕССОМ ДЕПРЕССИИ

03.03.01 - физиология

2 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2013. 005540268

005540268

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики соматических клеток Отдела вирусной и клеточной молекулярной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Лаборатории молекулярной генетики соматических клеток ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН

Долотов Олег Валентинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий

сотрудник кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Иноземцев Анатолий Николаевич

доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории патофизиологии нервной системы ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН Крупина Наталия Александровна

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ фармакологии имени

В .В. Закусова» РАМН

Защита диссертации состоится " 16 " декабря 2013 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова» по адресу: Москва,119234, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан" 15 " ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, | у п /

доктор биологических наук [/ Б. А. УМАРОВА

/I '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Клиническая депрессия является одним из наиболее распространённых и тяжелых типов аффективных расстройств. Согласно прогнозу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), к 2030 г. депрессия станет ведущей причиной бремени болезней в глобальном масштабе. Депрессия связана с повышенным риском суицида, провоцирует развитие различных соматических заболеваний и существенно ухудшает качество жизни. Несмотря на наличие эффективных фармакологических методов лечения депрессии, существенная часть пациентов (не менее 30%) невосприимчива к действию применяемых в настоящее время антидепрессантов, вызывающих также широкий спектр негативных побочных эффектов, несмотря на значительное улучшение их переносимости (Keitner et al., 2006; Kennedy, Rizvi, 2009; Connolly, Thase, 2012). Таким образом, поиск принципиально новых путей лечения депрессии является актуальным направлением современной медицины и фармакологии.

Гетерогенность и многофакторность депрессии существенно затрудняют исследование патофизиологии этого заболевания и поиск адекватной стратегии лекарственной терапии. Точные патофизиологические механизмы, приводящие к развитию депрессии, до сих пор остаются неизвестными, что ограничивает разработку новых антидепрессантных подходов. Кроме того, не вполне ясно, каковы молекулярные и физиологические механизмы ответа организма на антидепрессантную терапию (Krishnan et al., 2008). Почти 50 лет моноаминовая система мозга считалась основной мишенью действия антидепрессантов и рассматривалась как точка фокуса исследований, направленных на изучение молекулярных и физиологических механизмов развития депрессии. Однако к настоящему времени достаточно очевидно, что понимание механизмов развития депрессии и разработка новых стратегий терапии этого заболевания требуют принципиально новых теорий возникновения депрессивных расстройств.

Одной из таких теорий является так называемая нейротрофическая модель депрессии, основанная на данных о вовлеченности нейротрофических факторов, регулирующих выживаемость нейронов, нейрогенез и нейрональную пластичность, в процессы, лежащие в основе возникновения депрессии и антидепрессантных эффектов (Duman, Monteggia, 2006). В частности, было показано, что клинически применяемые антидепрессанты способны увеличивать экспрессию в гиппокампе нейротрофического фактора мозга (BDNF) и нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF) и/или их рецепторов (Nibuya et al., 1995; Karege et al., 2005; Liu et al., 2012). В связи с этим представляется важным с фундаментальной и практической точек зрения исследование наличия про- или антидепрессантной активности у факторов, способных регулировать уровни нейротрофичесих факторов и их

рецепторов в гиппокампе. Ранее было показано, что периферическое введение клинически применяемого синтетического аналога фрагмента 4-10 адренокортикотропного гормона (АКТГ) Семакса (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) стимулирует экспрессию BDNF и его высокоаффинных рецепторов в гиппокампе крысы (Dolotov et al., 2006), что может указывать на потенциально возможную активность данного пептида при депрессивных состояниях. Однако физиологические и поведенческие эффекты Семакса и других меланокортинов при депрессии не исследованы.

Достаточно реалистичной и широко используемой экспериментальной моделью депрессии считается модель непредсказуемого хронического стресса (НХС), предложенная Паулем Виллнером (Willner et al., 1987) и заключающаяся в предъявлении животным комбинаций чередующихся мягких стрессоров, что в течение нескольких недель может приводить к развитию состояний, сходных с депрессией у человека и нормализуемых хроническим введением клинически используемых антидепрессантов. Важно отметить, что данная модель вызывает развитие ангедонии (снижение способности испытывать удовольствие) — одного из двух, наряду со сниженным настроением, ядерных симптомов депрессии (Kennedy, 2008), и только этот ядерный симптом может быть исследован в модели in vivo (обычно детектируемый у грызунов как снижение предпочтения сладких растворов воде). Предметом данной работы являлось изучение влияния Семакса и ряда родственных ему меланокортинов (семейство, включающее АКТГ и меланоцитстимулирующие гормоны, их фрагменты и аналоги) на выраженность у крыс эффектов НХС как экспериментальной стрессовой модели депрессии.

Цель исследования: проверка гипотезы о наличии у природных и синтетических представителей пептидного семейства меланокортинов (Семакс, АКТГ (4-10), а-меланоцитстимулирующий гормон (а-МСГ) и меланотан П) антидепрессантноподобной активности в экспериментальной модели депрессии, вызванной хроническим стрессом. Задачи исследования:

• Изучить влияние Семакса на продукцию нейротрофического фактора GDNF в культивируемых астроглиальных клетках крысы линии Сб.

• Изучить влияние Семакса на продукцию нейротрофических факторов GDNF и BDNF в гиппокампе крысы при остром периферическом введении.

• Изучить влияние хронического периферического введения меланокортинов на выраженность эффектов НХС (ангедония, уменьшение набора массы тела, гипертрофия надпочечников, изменение уровня BDNF в гиппокампе) у крыс.

Научная новизна работы. В представляемой работе впервые показана

способность Семакса дозозависимо стимулировать продукцию GDNF в культивируемых астроглиальных клетках крысы линии Сб. Впервые показано, что острое внутрибрюшинное введение Семакса приводит к повышению уровней GDNF и BDNF в гиппокампе крысы. Полученные данные согласуются с показанной ранее способностью Семакса стимулировать уровень нейротрофина BDNF в гиппокампе крысы при периферическом (интраназальном) введении и расширяют представление о вызываемой Семаксом стимуляции продукции нейротрофических факторов различных семейств. Обнаружена ранее неизвестная способность периферически вводимых эндогенных и синтетических меланокортинов ослаблять ключевые поведенческие и физиологические эффекты НХС (ангедония, замедление набора массы тела) и предотвращать вызванное им снижение уровня BDNF в гиппокампе. Получены данные, указывающие на вовлеченность меланокортиновых рецепторов 3 и 4 типа в осуществление этих эффектов. Обнаружено, что отложенное хроническое периферическое введение Семакса и АКТГ (4-10) в условиях НХС эффективно корректировало ангедонию и замедление скорости набора массы тела.

Научно-теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные свидетельствуют об антидепрессантноподобном действии периферически вводимых представителей пептидного семейства меланокортинов в условиях НХС, что, с учетом ранее известных депрессогенных эффектов центрально вводимых меланокортинов, позволяет расширить представление о роли эндогенных меланокортинов в регуляции поведенческих и физиологических эффектов стресса. Практическая значимость работы связана с обнаружением способности периферически вводимых меланокортинов значительно ослаблять в широко применяемой экспериментальной модели депрессии выраженность ядерного симптома депрессии — ангедонии. Следует отметить, что представители пептидного семейства меланокортинов являются достаточно безопасными при периферическом введении, а пептид Семакс на протяжении длительного времени является клинически применяемым ноотропным и нейропротекторным лекарственным средством. Исходя из очевидной потребности в новых фармакологических подходах к лечению депрессии, полученные в. представляемой работе данные могут быть использованы для дальнейшего исследования возможности и эффективности применения меланокортинов в терапии и профилактике депрессивных расстройств.

Положения, выносимые на защиту:

1) Показана способность клинически применяемого синтетического меланокортина Семакс регулировать уровни нейротрофического фактора GDNF в клетках мозга крысы в моделях in vitro и in vivo.

2) Обнаружена способность Семакса существенно ослаблять в экспериментальной модели вызванной стрессом депрессии (непредсказуемый хронический стресс) ядерный симптом депрессии — ангедонию и ряд других эффектов непредсказуемого хронического стресса.

3) Обнаружена аналогичная способность эндогенных меланокортинов АКТГ (410) и а-МСГ и синтетического агониста меланокортиновых рецепторов 3-го и 4-го типа меланотана II существенно ослаблять ряд эффектов хронического стресса.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены автором на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Поведники, Россия, 2010), VIII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток», (Звенигород, Россия, 2011), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, Россия, 2013), а также на семинарах ОВКМГ Института молекулярной генетики РАН. В завершенном виде результаты диссертационной работы были представлены на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН 21 октября 2013 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней, и тезисы 8 докладов в материалах российских конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, включает 37 рисунков. Библиография включает 223 названия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Влияние Семакса на продукцию GDNF астроглиальными клетками линии

Сб.

Определение уровней GDNF в кондиционированных средах. В работе была использована перевиваемая линия астроглиальных клеток крысы Сб. Культивирование клеток проводили с использованием пластика Corning-Costar (США), в С02-инкубаторе при 37°С в атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% С02

4

в ростовой среде (PC) DMEM (MP Biomedicals, США), содержащей 5% охарактеризованной эмбриональной сыворотки коровы (ЭСК, HyClone, США) и 2 мМ L-глютамин (MP Biomedicals, США). Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты по 15 тыс. на лунку в 100 мкл PC. Через 24 ч среду меняли на поддерживающую среду (ПС, DMEM с 1% ЭСК) по 50 мкл на лунку и после 24 ч культивирования вносили стерильные растворы исследуемых соединений (Семакс (Пептоген, Россия), амитриптилин (Sigma, США)) в 50 мкл ПС до указанных конечных концентраций. В контрольные лунки вносили эквивалентный объем ПС. Через 96 ч после введения соединений среду отбирали, центрифугировали 60 мин при 15000 g (+4°С) и определяли уровни GDNF в супернатантах с помощью количественного иммуноферментного анализа (ИФА) в сэндвич-модификации (Promega GDNF Emax, США), следуя методике производителя.

МТТ-тест. Оценку относительного количества жизнеспособных клеток проводили с использованием МТТ-теста (Mo smarm, 1983). После отбора кондиционированной среды в лунки вносили по 50 мкл раствора МТТ (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид (Sigma, США)) в ПС до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубировали в течение 4 ч в С02-инкубаторе при 37°С. Среду отбирали, добавляли по 200 мкл диметилсульфоксида (AppliChem, США) и инкубировали при 37°С до полного растворения кристаллов формазана (1030 мин). Измерение оптической плотности при 600 нм проводили на планшетном ИФА-фотометре (Metertech 2 960, США).

Эксперименты на животных.

Животные. В экспериментах использовали самцов крыс линии Sprague-Dawley массой 230-340 г на момент начала эксперимента и различиями в возрасте не более 10 дней в рамках каждой поставки, полученных из питомника лабораторных животных «Пущино». Животных содержали в стандартных условиях вивария (23°С) со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения (включение света в 8:00, выключение - в 20:00) по 5 животных на клетку (58x36x20 см). Для всех крыс была проведена 14-дневная адаптация к условиям эксперимента (ежедневный хэндлинг в течение 1-2 мин).

Острое введение Семакса. Животные были разделены на 4 экспериментальные группы. Животные контрольной группы дважды за 24 и 3 ч до декапитации получали внутрибрюшинные инъекции (100 мкл) стерильного физиологического раствора (ФР, 0,9 % NaCl (AppliChem, США), приготовленного на апирогенной воде MilliQ (Millipore, Франция). Животные групп «Семакс-24 ч» и «Амитриптилин» получали инъекции ФР за 3 ч и препаратов Семакс (Пептоген, Россия, 50 мкг/кг массы тела) и амитриптилин (Sigma, США, 0,5 мг/кг веса) за 24 ч до декапитации. Животные группы «Семакс-3 ч» получали инъекцию ФР за 24 ч и инъекцию Семакса за 3 ч до

5

декапитации. Дозы Семакса и амитриптилина были выбраны на основе результатов предыдущих исследований (Dolotov et al., 2006; Виленский и др., 2007; Marinescu et al., 2012). Гиппокампы выделяли на льду, замораживали и хранили при -80°С.

Хроническое введение препаратов. Эквимолярные дозы (60 нмоль/кг массы тела) препаратов Семакс (Пептоген, Россия, 50 мкг/кг), а-МСГ (Calbiochem, США; 100 мкг/кг массы тела), АКТГ (4-10) (Sigma, США, 58 мкг/кг) и меланотан II (PAN Biotech, Германия, 62 мкг/кг) внутрибрюшинно вводили в 100 мкл стерильного ФР. В качестве контроля вводился эквивалентный объем растворителя. Инъекции проводили 1 раз в сутки между 11:00 и 12:00.

Процедура непредсказуемого хронического стресса (НХС). В экспериментах использовали одну из классических моделей НХС (Willner et al., 1996) с модификациями. С начала процедуры НХС животные контрольных и стрессовых групп содержались в раздельных помещениях с идентичными температурными условиями. В течение 6 недель крысы ежедневно подвергались действию одного из перечисленных стрессоров (в скобках указаны интервалы времени между инъекцией и началом предъявления стрессора): депривация воды в течение 18 ч (5 ч), иммобилизация в течение 3 ч при 23°С (90 мин), иммобилизация в течение 1 ч при 4°С (2 ч), содержание в перенаселенной клетке с непредсказуемыми партнёрами (8 крыс в стандартной клетке) в течение 24 ч (5 ч; 30 мин после иммобилизации при 23°С), мокрая подстилка в течение 18 ч (5 ч), изменение светового режима (постоянный свет в течение 36 ч), помещение крыс в клетку без опилок со слоем воды 1,5 см) на 18 ч (5 ч). Каждый стрессор предъявлялся не чаще 1 раза в неделю, за исключением депривации воды (2 раза в неделю). Через 2 суток после окончания процедуры НХС проводили тесты «О-образный лабиринт» и «вынужденное плавание» (Яценко и др., 2013), и через сутки после данных тестов животных взвешивали, декашггаровали и выделяли гиппокампы и надпочечники. Относительную массу надпочечников определяли как отношение суммарной массы правого и левого надпочечников (абсолютная масса) к массе тела животного.

Экспериментальные группы. Перед началом проведения каждого эксперимента животных случайным образом распределяли по группам и затем перераспределяли так, чтобы средние массы тел крыс в экспериментальных группах значимо не различались. Использовались следующие экспериментальные группы:

1. «Контроль-ФР» - не проводилось НХС, ежедневное введение ФР;

2. «Контроль-пептид» - не проводилось НХС, ежедневное введение пептидов (Семакс, а-МСГ, АКТГ (4-10), меланотан II) в указанных выше дозах;

3. «Стресс-ФР» - процедура НХС, ежедневное введение ФР;

4. «Стресс-пептид» - процедура НХС, ежедневное введение пептидов;

5. «Стресс-пептид-Отложенное введение» - процедура НХС, ежедневное введение ФР с 1 по 14 день НХС, а с 15-го дня - ежедневное введение пептидов.

Тест на предпочтение сахарозы. Измерение предпочтения сахарозы проводили согласно стандартной методике (Gr0nli et al., 2005) с модификациями. Крысам в индивидуальных клетках (37x20x15 см) на ночь (18 ч) предоставляли свободный доступ к двум предварительно взвешенным идентичным шариковым поилкам (250 мл), одна из которых содержала питьевую воду, вторая - 1% раствор сахарозы (Рапгеас, Испания) в питьевой воде. Крысы стрессовых групп получали свободный доступ к питьевой воде по крайней мере за 24 ч до начала теста, проводимого не ранее, чем через 24 ч после окончания предъявления стрессора. Правое/левое положение поилок с сахарозой и водой регулярно менялось. Поилки взвешивали и определяли количество потреблённых жидкостей. Предпочтение сахарозы определяли как отношение массы потреблённого 1% раствора сахарозы к суммарной массе потреблённой жидкости. Для каждой крысы определяли базальный уровень предпочтения сахарозы за 3-4 дня до начала эксперимента.

Определение уровней белка BDNF и GDNF в гиппокампе крысы. Обработку образцов ткани проводили на льду в полистирольных пробирках. Образцы взвешивали и добавляли экстракционный буфер (Pollock et al., 2001; 10 мкл/ 1 мг). Образцы ткани пипетировали и затем гомогенизировали политроном. Гомогенаты разбавляли экстракционным буфером в 10 раз и ацидифицировали по стандартной методике, указанной производителем (Promega, США). Полученные образцы центрифугировали 60 мин (15000 g, 4°С). Супернатанты замораживали и хранили при -80 °С. Определение уровней BDNF и GDNF в полученных экстрактах проводили с использованием наборов BDNF Emax и GDNF Emax (Promega, США), согласно методике производителя.

Статистическая оценка результатов. Достоверности различий групповых средних оценивали с помощью непараметрических критериев (тест Манна-Уитни) и дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с post-hoc поправкой (Fischer LSD test). На графиках представлены средние значения групп с учетом стандартной ошибки среднего (Mean+SEM), п - количество животных в группе. Обозначения уровней значимости различий групповых средних в сравнении с контрольной группой: * -р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001. Обозначения уровней значимости различий групповых средних в сравнении с группой «Стресс-ФР»: # - р<0,05; ## - р<0,01; ### -р<0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние Семакса на уровень белка GDNF в культивируемых актроглиальных клетках линии Сб.

Ранее было показано, что ноотропный и нейропротекторный меланокортин Семакс способен стимулировать экспрессию генов нейротрофинов BDNF и NGF в культивируемых первичных астроглиальных клетках крысы (Shadrina et al., 2001). Нами была изучена способность Семакса регулировать продукцию другого мощного нейротрофического фактора, GDNF, в перевиваемых астроглиальных клетках крысы линии Сб, широко используемой для исследования глии in vitro. В качестве положительного контроля использовали трициклический ангидепрессант амигриптилин, для которого была показана способность увеличивать продукцию GDNF в астроглиальных клетках линии С6 (Hisaoka et al., 2001).

Как видно из данных, представленных на Рис. 1, Семакс дозозависимо увеличивал уровень белка GDNF в кондиционированных средах культивируемых клеток линии Сб. Значимые отличия от контроля уровней GDNF в кондиционированной среде через 4 дня после однократного введения пептида были обнаружены для диапазона концентраций 1 пМ - 10 мкМ (1,5 — 4 кратная стимуляция). Увеличение продукции GDNF также наблюдалось в присутствии амитриптилина, что согласуется с ранее полученными данными (Hisaoka et al., 2001). При этом не было обнаружено достоверного влияния Семакса в исследованных концентрациях на жизнеспособность и пролиферацию клеток в МТТ-тесте (данные в автореферате не приведены).

Таким образом, Семакс в широком диапазоне концентраций стимулировал продукцию белка GDNF культивируемыми астроглиальными клетками линии Сб. GDNF является мощным фактором выживаемости различных типов клеток и проявляет выраженную нейротропную и нейропротекторную активность поддерживая рост нейритов и выживание нейронов (Connor В., Dragunow, 1998; Airaksinen, Saarma, 2002). Показано, что GDNF вовлечен в генез и развитие некоторых нейропатологий, в том числе, депрессии (Otsuki et al., 2008). Интересно, что ряд антидепрессантов и атипичных антипсихотиков, проявляющих нейропротекторную активность, также стимулируют экспрессию и продукцию GDNF клетками линии С6 (Shao Z. et al., 2006; Hisaoka К. et al., 2001; 2007, 2008, 2011). Далее мы изучили способность Семакса влиять на уровень GDNF в гиппокампе крысы при периферическом (внутрибрюшинном) введении.

м

Рис. 1. Влияние Семакса на уровень

кондиционированных средах клеток линии С6 через 96 ч после введения. Данные ИФА. Меап+БЕМ. Значимые отличия от контрольного уровня отмечены: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001. Ами — амитриптилин. Средний уровень в контроле: 4,3±0,4 пг/мл среды

Влияние однократного внутрибрюшинного введения Семакса на уровни нейротрофических факторов BDNF и GDNF в гиппокампе крысы. Нами было изучено влияние однократного внутрибрюшинного введения Семакса в дозе 50 мюг/кг массы тела на уровень белка GDNF в гиппокампе крысы. Известно, что антидепрессанты способны увеличивать экспрессию GDNF также и в моделях ш vivo (Shibata et al., 2012), и в качестве препарата сравнения мы использовали антидепрессант амитриптилин в низкой дозе 0,5 мкг/кг, соответствующей нейропротекторным эффектам (Marinescu et al., 2012). Введение Семакса приводило к достоверному увеличению (30+9%) уровня GDNF в гиппокампе крысы через 24 ч после инъекции по сравнению с контрольным уровнем (Рис. 2). При этом через 24 ч после введения амитриптилина уровень GDNF достоверно отличался от контрольного на 37+11%. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что Семакс, как и широко используемый в клинической практике антидепрессант амитриптилин, стимулирует при остром введении гиппокампальный уровень белка GDNF. Введение Семакса приводило к достоверному увеличению уровня BDNF в гиппокампе крысы через 3 ч после инъекции по сравнению с контрольным уровнем (Рис. 2). В то же время, нами не было обнаружено достоверного изменения уровня BDNF через 24 ч после внутрибрюшинного введения Семакса и амитриптилина. Таким образом, и Семакс, и антидепрессант амитриптилин при однократном внутрибрюшинном введении повышали гиппокампальный уровень GDNF, однако увеличение уровня BDNF в гиппокампе было обнаружено только в случае Семакса. Ранее было показано, что острое интраназальное введение Семакса приводит к

повышению уровня BDNF в гиппокампе крысы как через 3 ч, так и через 24 ч после введения (Dolotov et al.,. 2006). При этом из данных литературы известно, что антидепрессанты способны увеличивать экспрессию BDNF как в культивируемых глиальных клетках (Kittel-Schneider et al., 2012), так и в гиппокампе крыс in vivo (Balu et al., 2008). Было показано, что антидепрессант амитриптилин способен стимулировать экспрессию BDNF в модели in vivo при хроническом введении, однако острое введение амитриптилина не приводило к увеличению экспрессии BDNF ни на уровне мРНК (Nibuya et al., 1995), ни на уровне белка (Xu et al., 2003).

Современные модели генеза депрессии связывают развитие депрессивного состояния с нарушением нейрональной пластичности (Pittenger, Duman, 2008). Нейротрофические факторы, в том числе BDNF и GDNF, вовлечены в механизм регуляции нейрональной пластичности, выживаемости нейронов и нейрогенеза. Клинические и экспериментальные данные указывают на вовлеченность различных нейротрофических факторов, прежде всего, в гиппокампе, как в развитие депрессивных состояний, так и в терапевтические эффекты антидепрессантов ( Duman, Monteggia, 2006) Таким образом, исходя из способности пептида Семакс стимулировать уровни BDNF и GDNF в гиппокампе крысы, нами далее была проведена оценка влияния периферического введения Семакса на выраженность эффектов НХС, вызывающего у животных депрессивноподобные состояния и широко

К Сем 3 ч Сем 24 ч Ами 24 ч К Сем 3 ч Сем 24 ч Ами 24 ч

используемого как экспериментальная модель депрессии (\Villner е1 а1., 1987).

Рис. 2. Влияние Семакса (Сем) и амитриптилина (Ами) на уровни ОООТ и ВООТ в гиппокампе крысы через 3 и 24 ч после однократного внутрибрюшинного введения. Уровни СОМ1 и ВО№ в контроле - 11,3+1,1 и 17,8+2,1 пг/мг ткани, соответственно. Данные ИФА. Меап+БЕМ, п=4. * - р < 0,05.

Влияние хронического внутрибрюшинного введения Семакса на выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса.

Влияние хронического введения Семакса на предпочтение раствора сахарозы крысами. Анегдония, то есть снижение способности испытывать удовольствие, является одним из основных последствий НХС и ядерным симптомом депрессии (Willner et al., 1987). В экспериментальных моделях депрессии широко используемой мерой ангедонии является потеря предпочтения экспериментальными животными сладкого раствора сахарозы воде.

Было проведено изучение влияния хронического внутрибрюшинного введения Семакса в дозе 50 мкг/кг массы тела на выраженность ангедонии, вызванной НХС. Как видно из данных, представленных на Рис. ЗА, НХС вызывал существенное снижение предпочтения сахарозы, что свидетельствует о развитии ангедонии у хронически стрессированных животных. В то же время, предпочтение сахарозы в группах «Стресс-Семакс» и «Контроль-Семакс» не отличалось достоверно от контрольного уровня (Рис. ЗА). При этом введение Семакса животным с выраженной вследствие НХС ангедонией начиная с 15-го дня стрессирования приводило к нормализации предпочтения сахарозы и отсутствию достоверных отличий этого параметра между группами «Стресс-Семакс-Отложенное введение» и «Стресс-ФР» через 2 недели после начала ежедневного введения Семакса на фоне НХС (Рис. 4Б). Выраженность эффектов Семакса в условиях НХС сходна с действием клинически применяемого трициклического антидепрессанта имипрамина (Рарр et al., 2003).

Влияние хронического введения Семакса на скорость набора массы тела крыс. Уменьшение массы тела относительно контрольного уровня является одним из классических параметров-маркеров хронического стресса (Martí et al., 1994). В наших экспериментах НХС вызывал существенное снижение набора массы тела. Хроническое внутрибрюшинное введение Семакса в дозе 50 мкг/кг с начала процедуры НХС приводило к нормализации набора массы тела (Рис. 4А). При этом средняя масса тела крыс в группе «Контроль-Семакс» достоверно не отличалась от контрольного уровня (Рис. 4А). Отложенное на 2 недели начало хронического введения Семакса также существенно корректировало скорость набора массы тела (Рис. 4Б). Таким образом, Семакс при НХС оказывал нормализующее действие на скорость набора массы тела, сходное с действием антидепрессантов (Pechlivanova et al., 2012).

Влияние хронического введения Семакса на относительную массу надпочечников. Хроническая гиперактивация ГГН оси при хроническом стрессе может приводить к гипертрофии надпочечников (Ulrich-Lai et al., 2006). Нами обнаружено, что среднее значение относительной массы надпочечников в группе «Стресс-ФР» (0,17б±0,008 мг/г массы тела) было достоверно выше относительной массы надпочечников в группе «Контроль-ФР» (0,123+0,005 мг/г массы тела) (р < 0,001). Кроме того, средняя относительная масса надпочечников в группе «Стресс-ФР» достоверно отличалась от всех прочих экспериментальных ipynn, тогда как средние относительные массы надпочечников в группах «Стресс-Семакс», «Стресс-Семакс-Отложенное введение» и «Кошроль-Семакс» достоверно не различались между собой, а также не отличались от контрольного уровня. Таким образом, хроническое введение Семакса приводило к нормализации относительной массы надпочечников крыс; тот же эффект оказывает хроническое введение Семакса, на 15 дней отсроченное относительно начала НХС.

Влияние хронического введения Семакса на изменение уровня BDNF в гиппокампе крыс. В постмортальных образцах гиппокампа больных, страдающих депрессией, отмечалось снижение уровня BDNF, а лечение антидепрессантами приводило к увеличению уровня BDNF в плазме и сыворотке крови больных, страдающих депрессией (Castrén et al., 2007). Нами было проведено изучение влияния Семакса на уровоень BDNF в гаппокампе крысы в условиях НХС. Как видно из данных, представленных на Рис. 5, средний уровень BDNF в гиппокампе крыс в группе «Стресс-ФР» был достоверно ниже соответствующего контрольного уровня. Средний уровень BDNF в группе «Кошроль-Семакс» не отличался от контрольного уровня. Хроническое введение Семакса в дозе 50 мкг/кг на фоне НХС приводило к увеличению уровня белка BDNF в гиппокампе крысы по сравнению с уровнем BDNF у стрессированных крыс как в случае начала введения с первого дня НХС, так и при отложенном введении. Следует отметить, что влияние Семакса на гиппокампальный уровень BDNF сонаправлено с действием ряда антидепрессантов, хроническое введение которых приводит к увеличению экспрессии BDNF в гиппокампе крысы как на уровне мРНК (Nibuya et al., 1995), так и на уровне белка (Zhang et al., 2010).

Нами было проведено исследование влияния хронического введения Семакса на уровни GDNF в гиппокампе крысы в условиях НХС, однако не было выявлено достоверного изменения уровней GDNF под действием НХС и Семакса (данные в автореферате не приведены).

День эксперимента

Рис. ЗА. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения Семакса (50 мкг/кг) на предпочтение сахарозы крысами. Здесь и далее - группы «Стресс» - крысы в условиях НХС (начало — в день 1 эксперимента). Введение Семакса начинали в день 1 (начало НХС). Меап+БЕМ, п=8-11. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р < 0,05, *** - р < 0,001.

О Стресс-ФР

День эксперимента

Рис. ЗБ. Влияние отложенного хронического внутрибрюшинного введения Семакса (50 мкг/кг) в условиях НХС на предпочтение сахарозы крысами. Для «Отложенное введение» - введение начинали в день 15 НХС (указано стрелкой). Mean+SEM, п=10. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р < 0,05, ** - р < 0,005; от «Стресс-ФР»: # - р < 0,05; ## - р < 0,005.

Стресс-ФР

— -s — ■ Стресс-Семакс ■ О- Контроль-ФР

— — Qh — — Контроль-Сема кс

\о г*

День эксперимента

Рис. 4А. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения Семакса (50 мкг/кг) на изменение массы тела крысы. Введение препаратов начинали в день 1 (начало НХС). Меап±8ЕМ, п=8-11. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р < 0,05, ** - р < 0,005, *** - р < 0,001; от «Стресс-ФР»: ###-р< 0,001.

Рис. 4Б. Влияние НХС и отложенного хронического внутрибрюшинного введения Семакса (50 мкг/кг) на изменение массы тела крысы. Для «Отложенное введение» - введение начинали в день 15 НХС (указано стрелкой). Mean+SEM, п=10. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р < 0,05, ** - р < 0,005, *** - р < 0,001; от «Стресс-ФР»: ## - р < 0,005; ###-р< 0,001.

Рис. 5. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения Семакса

КангролЬтФР Стресс-ФР Стресс-Семакс Стресс-Семаю>Отлаженное введение

¿Я

iff

0 5 1 0 1 5 2 0 25 30 День эксперимента

(50 мкг/кг) на уровни ВБЬТ в гиппокампе крысы. Уровень в «Контроль-ФР» - 16,4±0,4 пг/мг ткани (100%). Данные ИФА. Меап+БЕМ, п=8-11. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р < 0,05, *** - р < 0,001; от «Стресс-ФР»: ###-р< 0,001. Отл.-отложенное введение.

Влияние хронического

внутрибрюшинного введения

АКТГ (4-10) на выраженность

Л

эффектов непредсказуемого хронического стресса. Семакс является стабилизированным аналогом фрагмента АКТГ (4-10), и существует значительное функциональное сходство между АКТГ (4-10) и Семаксом. Так, было показано, что АКТГ (4-10) влияет на поведение (Isaacson et al.,1986) и обучаемость крыс (Gaillard, Sanders, 1975), а также оказывает нейропротекторное действие и способствует нейропластичности (Strand et al., 1993). Исходя из этого, нами была изучена способность эндогенного меланокортина АКТГ (4-10) влиять на выраженность эффектов НХС.

Влияние хронического введения АКТГ (4-10) на предпочтение раствора сахарозы крысами. Согласно данным, представленным на Рис. 7, НХС вызывал существенное снижение предпочтения сахарозы, что свидетельствует о развитии ангедонии у хронически стрессированных животных. Хроническое введение АКТГ (4-10) в дозе 58 мкг/кг веса на фоне НХС приводило к нормализации уровня предпочтения сахарозы, то есть предотвращало развитие ангедонии, вызванной НХС. Хроническое введение АКТГ (4-10) в нестрессовой обстановке не приводило к достоверному изменению предпочтения сахарозы относительно контрольного уровня. При этом введение АКТГ (4-10) животным с выраженной вследствие НХС ангедонией начиная с 15-го дня стрессирования приводило к нормализации предпочтения сахарозы и отсутствию достоверных отличий этого параметра между группами «Стресс-Семакс-Отложенное введение» и «Стресс-ФР» через 24 дня после начала ежедневного введения АКТГ (4-10) на фоне НХС.

Влияние хронического введения АКТГ (4-10) на скорость набора массы тела крыс. В данном эксперименте НХС вызывал снижение набора массы тела. Хроническое внутрибрюшинное введение АКТГ (4-10) в дозе 58 мкг/кг с начала процедуры НХС приводило к нормализации набора массы тела (Рис. 8). При этом средняя масса тела в группе «Контроль-АКТГ» достоверно не отличалась от контрольного уровня. АКТГ (4-10) существенно корректировал скорость набора массы тела и при отложенном на 2 недели начале хронического введения. Итак, хроническое введение АКТГ (4-10) на фоне НХС приводило к нормализации скорости набора массы тела крыс как при немедленном, так и при отложенном введении.

Влияние хронического введения АКТГ (4-10) на относительную массу надпочечников. Средняя относительная масса надпочечников в группе «Стресс-ФР» (0,142+0,007 мг/г массы тела) в данном эксперименте была достоверно больше (р <

15

0,001) массы надпочечников в группе «Контроль-ФР» (0,101+0,005 мг/г массы тела). При этом средняя относительная масса надпочечников в группах «Стресс-АКТГ (410)» (0,109±0,009 мг/г массы тела) и «Стресс-АКТГ (4-Ю)-Отложенное введение» (0,108±0,006 мг/г массы тела) были достоверно меньше, чем средняя относительная масса надпочечников в группе «Стресс-ФР» (р = 0,001 и р < 0,001, соответственно), однако достоверно не отличались от контрольного уровня. В группе «Контроль-АКТГ (4-10)» средняя относительная масса надпочечников составляла 0,114±0,005 мг/г массы тела и статистически не отличалась от контрольного значения.

Таким образом, хроническое внутрибрюшинное введение АКТГ (4-10) в дозе, эквимолярной дозе Семакса, способствует ослаблению эффектов НХС, заключающихся в развитии ангедонии, уменьшении скорости набора массы тела и увеличению относительной массы надпочечников. В исследуемой экспериментальной модели депрессии АКТГ (4-10) проявлял подобное антидепрессантам действие как при немедленном, так и при отложенном введении. Следовательно, антидепрессантоподобное действие Семакса, выявленное в настоящей работе, является не уникальной характеристикой данного пептида, а свойством, присущим и эндогенному природному прототипу Семакса, фрагменту АКТГ (4-10).

Контроль-ОР Контроль-АКТГ {4-10) Стресс-ФР

Стресс-АКТГ (4-Ю)-Отложенное Стресс-АКТГ (4-10)

10 15 20 25 30 День эксперимента

Рис. 6. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения АКТГ (410) (58 мкг/кг) на предпочтение сахарозы крысами. Группы «Контроль-АКТГ (4-10)» и «Стресс-АКТГ (4-10)» - введение АКТГ (4-10) начинали в день 1 (начало НХС); «Стресс-АКТГ (4-Ю)-Отложенное введение» введение начинали в день 15 НХС. Mean+SEM, п=8. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»'. * - р < 0,05, 0,005, *** - р < 0,001; от группы «Стресс-ФР»: # - р < 0,05; ### - р < 0,001.

:-Р<

Рис. 7. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения АКТГ (4-10) (58 мкг/кг) на изменение массы тела крысы. Группы «Контроль-АКТГ (4-10)» и «Стресс-АКТГ (4-10)» -введение АКТГ (4-10) начинали в день 1 (начало НХС); «Стресс-АКТГ (4-10)-Отложенное введение» введение начинали в день 15 НХС (указано стрелкой). Mean±SEM, п=8. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: ** - р < 0,005, *** - р < 0,001; от «Стресс-ФР»: # - р < 0,05, ## - р < 0,005, ### - р < 0,001. Уровни значимости указаны для первых по времени экспериментальных точек при последующих достоверных отличиях.

Влияние хронического внутрибрюшинного введения а-МСГ на выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса.

Последовательность АКТГ (4-10) содержится не только в составе АКТГ, но и в составе другого эндогенного меланокортина, а-меланоцитстимулирующего гормона (а-МСГ). а-МСГ детектируется в циркулирующей крови как грызунов, так и человека; время его полужизни составляет порядка 20 мин (Ashton et al., 1977). Этот пептид секретируется при стрессе независимо от секреции АКТГ клетками промежуточной доли гипофиза. а-МСГ — многофункциональный пептид; его основными известными центральными эффектами являются нейропротекция (Catania, 2008), влияние на поведение и память (Datta, King, 1982) и регуляция пищевого поведения (Poggioli et al., 1986). Кроме того, ранее нами было показано (Дубынина и др., 2009), что а-МСГ стимулирует экспрессию в глиальных клетках гиппокампа крысы фактора сосудистого эндотелия VEGF - трофического фактора, также вовлеченного в патогенез депрессии и эффекты антидепрессантов (Clark-Raymond, Halaris, 2013). Основной периферической функцией а-МСГ считается регуляция пигментации (Yamaguchi, Hearing, 2009); кроме того, этот меланокортин участвует в модуляции иммунного ответа и процессов воспаления (Lyson, МсСапп, 1993), которые, как предполагается, также вовлечены в генез депрессии. Влияние хронического введения а-МСГ на предпочтение раствора сахарозы крысами. Было проведено изучение влияния хронического внутрибрюшинного введения а-МСГ в дозе 100 мкг/кг массы тела на выраженность ангедонии, вызванной

НХС. Согласно данным, представленным на Рис. 9, НХС вызывал достоверное снижение предпочтения сахарозы. При этом уровни предпочтения сахарозы в группах «Стресс-МСГ» и «Контроль-МСГ» статистически достоверно не отличались от контрольного.

День эксперимента

Рис. 8. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения а-МСГ (100 мкг/кг) на предпочтение сахарозы

крысами. Введение а-МСГ начинали в день 1 (начало НХС). МеащЭЕМ, п=8-11. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р < 0,05, ***-р< 0,001.

Влияние хронического введения а-МСГ на скорость прироста массы тела крыс. Полученные данные представлены на Рис. 10. Хроническое внутрибрюшинное введение а-МСГ в дозе 100 мкг/кг массы тела приводило к нормализации набора массы тела. При этом средняя масса тела в группе «Контроль-МСГ» достоверно не отличалась от контрольного уровня. Сравнивая влияние а-МСГ на изменение массы тела крыс на фоне НХС с действием Семакса, следует отметить, что оба пептида оказывали сонаправленное действие на изменение скорости прироста массы тела. Влияние хронического введения а-МСГ на относительную массу надпочечников. Относительная масса надпочечников в группе «Стресс-ФР» (0,176±0,008) была достоверно повышена относительно контрольного уровня (0Д23±0,005), при этом относительная масса надпочечников в группе «Стресс-МСГ» (0,137+0,006) была достоверно понижена относительно массы надпочечников в группе «Стресс-ФР» (р = 0,002), но достоверно повышена относительно контрольного уровня (р = 0,047). Хроническое введение а-МСГ в нестрессовой ситуации не приводило к значимому изменению относительной массы надпочечников.

Влияние хронического введения а-МСГ на уровень BDNF в гиппокампе крысы.

Хроническое введение а-МСГ приводило к увеличению уровня белка ВООТ по сравнению с крысами, подвергавшимися НХС (Рис. 11). Хроническое введение а-

МСГ в нестрессовой обстановке не приводило к достоверному изменению уровня

ВВ№ относительно контроля.

Рис. 9. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения а-МСГ (100 мкг/кг) на изменение массы тела крысы. Введение а-МСГ

начинали в день 1 (начало НХС).

Меап+вЕМ, п=8-11. Уровни значимости отличий от «Контроль-

500 -

475

450

425

400 ■

375

350

325

й то 300

275

250

225

200

175

150

______ Стресс-МСГ

--■ — Стресс-Семакс

---- — - Контроль-МСГ

дО л о 5 \0 \Ь

День эксперимента

от «Стресс»: # - р < 0,05.

го & да

ФР»: * - р < 0,05, ** - р < 0,005, *** - р < 0,001;

с

3 НО о.

V

2 по

1 I | | 80

2

О °

т 40

о

О.

> о

^ ^

Рис. 10. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения а-МСГ (100 мкг/кг) на уровни ВБОТ в гиппокампе крысы. Уровень ВО№ в «Контроль-ФР» - 16,4±0,4 пг/мг ткани (100%). Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р < 0,05, *** - р < 0,001; от «Стресс-ФР»: ### - р < 0,001.

Влияние хронического внутрибрюшинного введения меланотана II на выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса. Согласно полученным нами результатам, меланокортины АКТГ (4-10), его синтетический аналог Семакс и содержащий последовательность АКТГ (4-10) секретируемый гипофизом пептид а-МСГ способны при хроническом введении существенно ослаблять ряд ключевых эффектов НХС. В настоящее время известны пять типов меланокортиновых рецепторов, и только три из них (МСЗИ, МС4Ы, МС5Я) экспрессируются в ЦНС. В связи с этим мы исследовали, может ли комплекс

антидепрессантноподобных эффектов соединений, содержащих фрагмент АКТГ (410), развиваться при введении стабильного синтетического агониста MC3R/MC4 меланотана II (Hruby et al„ 1995).

Влияние хронического введения меланотана II на предпочтение раствора сахарозы крысами. Согласно представленным на Рис. 11 данным, НХС приводил к достоверному уменьшению предпочтения сахарозы. При этом предпочтение сахарозы в группах «Стресс-МТ2» и «Контроль-МТ2» не отличалось от контрольного уровня. Таким образом, хроническое введение меланотана II в дозе 62 мкг/кг нормализовало уровень предпочтения сахарозы на фоне НХС, что указывает на ослабление выраженности ангедонии у крыс.

День эксперимента

Влияние хронического введения меланотана II на скорость прироста массы тела крыс. Согласно данным, представленным на Рис. 12, хроническое введение меланотана II в дозе 62 мкг/кг массы тела вызывало нормализацию набора массы тела крыс на фоне НХС. При этом средняя масса тела крыс в группе «Контроль-МТ2» не отличалась от контрольного уровня. Таким образом, хроническое введение меланотана II фоне НХС нормализовало скорость набора массы тела крыс. Влияние хронического введения меланотана II на относительную массу надпочечников. Относительная масса надпочечников в группе «Контроль-ФР» в конце эксперимента составляла 0,117±0,008 мг/г массы тела, что достоверно меньше относительной массы надпочечников в группе «Стресс-ФР» (0,147±0,006 мг/г) (р = 0.004). При этом относительная масса надпочечников в группе «Стресс-МТ2» (0,115+0,008 мг/г) была достоверно меньше массы надпочечников в группе «Стресс-

110 -100 -90 -80 ■ 70 -BD -50 -40 -30 •

" Стресс-ФР - — — стресс-МТ2 ...........стресс-СемэКЕ

■--Контроль-ФР

■--Контроль-МТ2

Рис. 11. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения меланотана-И (МТ2, 62 мкг/кг) на предпочтение сахарозы крысами. Введение МТ2 начинали в день 1 (начало НХС). Mean+SEM, п=6-10. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р<0,05, ** - р < 0,005.

ФР» (р = 0,007), но не отличалась от контрольного уровня, как и масса надпочечников в группе «Контроль-МТ2». Таким образом, хроническое введение меланотана II в дозе 62 мкг/кг на фоне НХС приводило к нормализации относительной массы надпочечников.

Влияние хронического введения меланотана II на уровень BDNF в гиппокампе крысы. Данные представлены на Рис. 13. НХС приводил к достоверному уменьшению уровня BDNF в гиппокампе крысы, тогда как хроническое введение меланотана II на фоне НХС приводило к нормализации уровня BDNF, причем эффект меланотана II был сравним с эффектом эквимолярной дозы Семакса.

Рис. 12. Влияние НХС и хронического внутрибрюшинного введения меланотана-Н (МТ2, 62 мкг/кг) на изменение массы тела крысы. Введение МТ2 начинали в день 1 (начало НХС). Mean±SEM, п=6-10. Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: * - р < 0,05, *** - р < 0,001; от «Стресс-ФР»: # - р < 0,05, ## - р < 0,005, ### - р < 0,001. Уровни значимости указаны для первых по времени экспериментальных точек при последующих ' ' ' ~~т 1 1 достоверных отличиях.

15 20 25 30 35 40 г

День эксперимента

Рис. 13. Влияние ИКС и хронического внутрибрюшинного введения меланотана-Н (МТ2, 62 мкг/кг) на уровни BDNF в гиппокампе крысы. Уровень BDNF в «Контроль-ФР» -11,3+0,8 пг/мг ткани (100%). Mean+SEM, п=6-10.Уровни значимости отличий от «Контроль-ФР»: ** - р < 0,005; от «Стресс-ФР»: # - р < 0,05, ### -р< 0,001.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе впервые показана способность клинически применяемого ноотропного и нейропротекгорного пептида Семакс стимулировать продукцию глиального нейротрофического фактора (ОБЫ1\) в культивируемых астроглиальных клетках крысы линии Сб. Обнаружено, что Семакс при однократном внутрибрюшинном введении повышает уровень в гиппокампе крысы. Эти

результаты, в совокупности с ранее полученными данными о стимуляции Семаксом системы нейротрофического фактора мозга и его рецептора (ВБОТ-йгкВ) в гиппокампе крысы и свидетельствами вовлеченности нейротрофических факторов в развитие депрессии и терапевтические эффекты антидепрессантов, позволили выдвинуть гипотезу о возможной антидепрессантноподобной активности Семакса при периферическом введении. Для проверки этой гипотезы нами была выбрана широко используемая и хорошо охарактеризованная экспериментальная модель вызванной стрессом депрессии — непредсказуемый хронический стресс (НХС). Проведенное изучение влияния хронического внутрибрюшинного введения Семакса на эффекты НХС у крыс выявили способность данного пептида существенно ослаблять развитие ангедонии (одного из двух ядерных симптомов депрессии) и ряда других последствий хронического стресса. Более того, аналогичная защитная активность обнаружена как у родственных Семаксу эндогенных меланокортинов (а-МСГ и АКТГ (4-10), так и у меланотана И, синтетического агониста меланокортиновых рецепторов 3 и 4 типа. Таким образом, в данной работе впервые показана антидепрессантноподобная активность в экспериментальной модели депрессии природных и синтетических представителей пептидного семейства меланокортинов. Полученные результаты расширяют представления о биологической роли, возможных механизмах действия и терапевтическом потенциале меланокортинов.

выводы

1. Клинически применяемый синтетический меланокортин Семакс дозозависимо увеличивает продукцию глиального нейротрофического фактора (GDNF) в культивируемых астроглиальных клетках крысы линии Сб.

2. Острое внутрибрюшинное введение Семакса увеличивает уровни нейротрофических факторов GDNF и BDNF в гиппокампе крысы.

3. Хроническое внутрибрюшинное введение Семакса ослабляет эффекты непредсказуемого хронического стресса у крыс (ангедония, снижение набора массы тела, снижение гиппокампального уровня BDNF).

4. Хроническое внутрибрюшинное введение эндогенных меланокортинов АКТГ (410) и а-МСГ ослабляет эффекты непредсказуемого хронического стресса у крыс.

5. Хроническое внутрибрюшинное введение синтетического агониста меланокортиновых рецепторов 3-го и 4-го типа меланотана II ослабляет эффекты непредсказуемого хронического стресса у крыс.

6. Отложенное начало хронического внутрибрюшинного введения меланокортинов АКТГ (4-10) и Семакса в условиях непредсказуемого хронического стресса приводит к существенной коррекции гедонистического поведения и набора массы тела крыс.

7. Полученные данные свидетельствуют о способности исследованных меланокортинов существенно ослаблять при периферическом введении эффекты непредсказуемого хронического стресса, в том числе, ядерный симптом депрессии — ангедонию, что указывает на потенциальную возможность применения меланокортинов в терапии и профилактике депрессивных расстройств.

Список опубликованных работ по теме диссертации

(* - публикации в журналах, рекомендованных ВАК)

1. * Яценко К.А., Глазова Н.Ю., Иноземцева JI.C., Андреева JI.A., Каменский A.A., Гривенников И.А., Левицкая Н.Г., Долотов О.В., Мясоедов Н.Ф. Гептапептид Семакс ослабляет последствия непредсказуемого хронического стресса у крыс. // Доклады академии наук. - 2013. Т. 453, №5, с. 581-584.

2. *'Долотов О.В., Дубынина Е.В., Марков Д.Д., Иноземцева Л.С., Яценко К.А., Гривенников И.А. Влияние меланокортинов на экспрессию ряда нейротрофических факторов в клетках гиппокампа крысы in vitro. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. №4, с. 10-16.

3. * Дубынина Е.В., Иноземцева Л.С., Марков Д.Д., Яценко К.А., Долотов О.В., Гривенников И.А. Альфа-меланоцитстимулирующий гормон увеличивает

23

экспрессию фактора роста сосудистого эндотелия в астроцитах гиппокампа крысы in vitro. // Нейрохимия. - 2009. Т. 26, №4, с. 297-301.

4. Дубынина Е.В., Иноземцева Л.С., Яценко К.А., Долотов О.В., Гривенников И .А. Меланокортины Семакс и альфа-МСГ стимулируют экспрессию нейротрофических факторов в астроцитах гиппокампа крысы in vitro. // Сборник тезисов конференции «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008, с. 398.

5. Гривенников И.А., Долотов О.В., Дубынина Е.В., Иноземцева Л.С., Марков Д.Д., Яценко К.А., Мясоедов Н.Ф. Меланокортины в ЦНС:функции и возможные механизмы действия. // Сборник тезисов российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 2009, с. 49.

6. Иноземцева Л.С., Дубынина Е.В., Яценко К.А., Марков Д.Д., Долотов О.В., Гривенников И.А. Изменение уровня а-меланокортина и нейротрофического фактора мозга (BDNF) в плазме крови крысы в условиях острого стресса. II Сборник тезисов российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 2009, с. 198.

7. Гривенников И.А., Андреева Л.А., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Каменский A.A., Левицкая Н.Г., Марков Д.Д., Яценко К.А., Мясоедов Н.Ф. Нейродегенерация и нейропротекция в ЦНС. // Сборник тезисов 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2010, с. 11.

8. Марков Д.Д., Иноземцева Л.С., Яценко К.А., Долотов О.В., Гривенников И.А. Влияние меланокортинов на экспрессию генов про- и антивоспалительных цитокинов в моделях воспаления in vitro и in vivo. // Сборник тезисов VIII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород, 2011, с. 40.

9. Яценко К.А., Иноземцева Л.С., Марков Д.Д., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Гривенников И.А., Долотов О.В. Аналог фрагмента АКТГ 4-10 Семакс ослабляет эффекты хронического стресса у крыс. // Сборник тезисов российского симпозиума «Белки и пептиды», Уфа, 2013, с. 289.

10. Себенцова Е.А., Суханова Ю.А., Володина М.А., Яценко К.А., Левицкая Н.Г., Каменский A.A. Негативные влияния материнской депривации на адаптивные реакции потомства белых крыс и их коррекция гептапептидом Семакс. // Сборник тезисов российского симпозиума «Белки и пептиды», Уфа, 2013, с. 157.

11. Долотов О .В., Яценко К.А., Иноземцева Л.С., Марков Д. Д., Гривенников И.А. Эффекты меланокортинов в моделях депрессии. // Сборник тезисов российского симпозиума «Белки и пептиды», Уфа, 2013, с. 115.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано в печать 13.11.2013 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 371. Тел./факс: (495) 939-3890, 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 527 к.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яценко, Ксения Александровна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201п"7

ЯЦЕНКО Ксения Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТОВ МЕЛАНОКОРТИНОВ В МОДЕЛИ ВЫЗВАННОЙ СТРЕССОМ ДЕПРЕССИИ

03.03.01 -Физиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н О. В. Долотов

Москва, 2013.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ...................................5

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................11

Депрессия.............................................................................11

Гипотезы возникновения депрессии............................................12

Лечение депрессии..................................................................21

Антидепрессанты и нейротрофические факторы...........................24

Модели депрессии..................................................................25

Поведенческие и нейропротекторные эффекты меланокортинов.,34

Влияние на поведение, ноотропная активность..............................35

Семакс и нейротрофические факторы..........................................40

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................42

Экспериментальные животные...................................................42

Введение препаратов...............................................................42

Влияние Семакса на продукцию GDNF астроглиальными

клетками линии С6..................................................................43

МТТ-тест..............................................................................44

Острое введение Семакса in vivo.................................................44

Непредсказуемый хронический стресс..........................................45

Процедура непредсказуемого хронического стресса (НХС)................45

2

Схема экспериментов...............................................................46

Оценка уровня потребления корма...............................................49

Оценка абсолютной и относительной массы надпочечников...............50

Оценка уровня ангедонии..........................................................50

Оценка уровня тревожности.......................................................50

Экстракция белков...................................................................51

Определение уровней ВОМ7.......................................................52

Определение уровней СОИР......................................................53

Статистическая оценка результатов..............................................55

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................................56

Влияние Семакса на продукцию ОЭЫР культивируемыми

астроглиальными клетками линии С6...........................................56

Влияние однократного внутрибрюшинного введения Семакса на уровни нейротрофических факторов

И ОЭЫР в гиппокампе крысы............................................60

Непредсказуемый хронический стресс..........................................65

Характеризация модели............................................................65

Влияние хронического внутрибрюшинного введения Семакса на выраженность эффектов

непредсказуемого хронического стресса.......................................76

з

Влияние хронического внутрибрюшинного введения АКТГ (4-10) на выраженность эффектов

непредсказуемого хронического стресса........................................93

Влияние хронического внутрибрюшинного введения а-МСГ на выраженность эффектов

непредсказуемого хронического стресса......................................105

Влияние хронического внутрибрюшинного введения меланотана II на выраженность эффектов

непредсказуемого хронического стресса.......................................115

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................127

ВЫВОДЫ.............................................................................131

Список опубликованных работ по теме диссертации....................132

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................134

БЛАГОДАРНОСТИ................................................................153

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон, АСТН

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГГН ось - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось

Грц - глюкокортикоидные рецепторы

ИЛ - интерлейкин

ИФ-а - интерферон а

КРГ - кортикотропин-рилизинг гормон

МАО - моноаминоксидаза

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

МСГ - меланоцитстимулирующий гормон, MSH

МФТП - 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин ПОМК - проопиомеланокортин, РОМС

СИОЗН - селективный ингибитор обратного захвата норадреналина

СИОЗС - селективный ингибитор обратного захвата серотонина

СИОЗСН - селективный ингибитор обратного захвата серотонина и норадреналина

ТЦА - трициклические антидепрессанты ЦНС - центральная нервная система

BDNF - brain derived neurotrophic factor, нейротрофический фактор мозга

CREB - cAMP response element-binding protein, транскрипционный фактор, связывающий CRE-последовательность

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay, иммуноферментный анализ

FGF2 - Basic fibroblast growth factor, основной фактор роста фибробластов

GDNF - Glial cell-derived neurotrophic factor, глиальный нейротрофический фактор

MTT - 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид

NGF - nerve growth factor, фактор роста нервов

NMDA - N-methyl-D-aspartate, N-метил-О-аспартат

NT-3 - Neurotrophin-З, нейротрофин 3

PIPES - 1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота.

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

TLR- Toll-like receptor, толл-подобные рецепторы

Trk - tyrosine receptor kinase, тирозиновая рецепторная киназа

VEGF - vascular endotelial growth factor, эндотелиальный фактор роста сосудов

ВВЕДЕНИЕ

Клиническая депрессия является одним из наиболее распространённых и тяжелых типов аффективных расстройств. Согласно прогнозу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), к 2030 г. депрессия станет ведущей причиной бремени болезней в глобальном масштабе. Депрессия связана с повышенным риском суицида, провоцирует развитие соматических заболеваний и существенно ухудшает качество жизни. Несмотря на наличие эффективных фармакологических методов лечения депрессии, существенная часть пациентов (не менее 30%) невосприимчива к действию применяемых в настоящее время антидепрессантов, вызывающих также широкий спектр негативных побочных эффектов (Keitner et al., 2006; Kennedy, Rizvi, 2009; Connolly, Thase, 2012). Таким образом, поиск принципиально новых путей лечения депрессии является актуальным направлением современной медицины и фармакологии.

Гетерогенность и многофакторность депрессии существенно затрудняют исследование патофизиологии этого заболевания и поиск адекватной стратегии лекарственной терапии. Точные патофизиологические механизмы, приводящие к развитию депрессии, до сих пор остаются неизвестными, что ограничивает разработку новых антидепрессантных подходов. Кроме того, не вполне ясно, каковы молекулярные и физиологические механизмы ответа организма на антидепрессантную терапию (Krishnan, Nestler, 2008). Почти 50 лет моноаминовая система мозга считалась основной мишенью действия антидепрессантов и рассматривалась как точка фокуса исследований, направленных на изучение молекулярных и физиологических механизмов развития депрессии. Однако к настоящему времени достаточно очевидно, что понимание механизмов развития

депрессии и разработка новых стратегий терапии этого заболевания требуют принципиально новых теорий возникновения депрессивных расстройств.

Одной из таких теорий является так называемая нейротрофическая модель депрессии, основанная на данных о вовлеченности нейротрофических факторов, регулирующих выживаемость нейронов, нейрогенез и нейрональную пластичность, в процессы, лежащие в основе возникновения депрессии и антидепрессантных эффектов (Duman, Monteggia, 2006). В частности, было показано, что клинически применяемые антидепрессанты способны увеличивать экспрессию в гиппокампе нейротрофического фактора мозга (BDNF) и нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF) и/или их рецепторов (Nibuya et al., 1995; Karege et al., 2005; Liu et al., 2012). В связи с этим представляется важным с фундаментальной и практической точек зрения исследование наличия про- или антидепрессантной активности у факторов, способных регулировать уровни нейротрофических факторов и их рецепторов в гиппокампе. Ранее было показано, что периферическое введение клинически применяемого синтетического аналога фрагмента 4-10 адренокортикотропного гормона (АКТГ) Семакса стимулирует экспрессию BDNF и его высокоаффинных рецепторов в гиппокампе крысы (Dolotov et al., 2006), что может указывать на потенциальную возможность воздействия данного пептида при периферическом введении на выраженность симптомов депресии. Однако поведенческие эффекты Семакса и других меланокортинов при депрессии ранее не исследовались.

Достаточно реалистичной и широко используемой экспериментальной моделью депрессии считается модель непредсказуемого хронического стресса (НХС), предложенная Паулем Виллнером (Willner et al., 1987) и заключающаяся в предъявлении животным комбинаций чередующихся мягких стрессоров, что в течение нескольких недель может приводить к развитию состояний, сходных с депрессией у человека и нормализуемых

хроническим введением клинически используемых антидепрессантов. Важно отметить, что данная модель вызывает у животных развитие ангедонии (снижение способности испытывать удовольствие) — одного из двух ядерных симптомов депрессии (наряду со сниженным настроением)(Кеппес1у, 2008), и только этот ядерный симптом может быть исследован в модели in vivo (обычно детектируемый у грызунов как снижение предпочтения сладких растворов воде). Предметом данной работы являлось изучение влияния Семакса и ряда родственных ему меланокортинов (семейство, включающее АКТГ и меланоцитстимулирующие гормоны, их фрагменты и аналоги) на выраженность у крыс эффектов непредсказуемого хронического стресса как экспериментальной стрессовой модели депрессии.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью работы являлось изучение влияния Семакса, а также ряда представителей пептидного семейства меланокортинов на выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса у крыс.

Основные задачи исследования заключались в следующем:

1. Изучить влияние Семакса на продукцию нейротрофического фактора СОИР в культивируемых астроглиальных клетках крысы линии Сб.

2. Изучить влияние Семакса на продукцию нейротрофических факторов вОЫР и ЕЮ№ в гиппокампе крысы при остром периферическом введении.

3. Оценить влияние хронического периферического введения Семакса на выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса (ангедония, снижение набора массы тела).

4. Оценить влияние хронического периферического введения эндогенных меланокортинов, фрагмента АКТГ (4-10) и а-МСГ, на выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса (ангедония, снижение набора массы тела).

5. Оценить влияние хронического периферического введения синтетического агониста меланокортиновых рецепторов 3-го и 4-го типа меланотана II на выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса (ангедония, снижение набора массы тела).

6. Оценить влияние отложенного введения Семакса и фрагмента АКТГ (4-10) на выраженность эффектов непредсказуемого хроничесокго стресса.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Депрессия

История аффективных расстройств насчитывает уже более двух тысяч

лет: впервые заболевание, характеризующееся упадком духа и названное

меланхолией, было описано Гиппокартом в IV веке до н.э. Несмотря на это,

этиология заболевания до сих пор является предметом дискуссий. Однако

очевидно, что депрессия является комплексным заболеванием, сопряженным

не только с патологическими изменениями психики, но и с нарушениями

функционирования многих физиологических систем организма. Согласно

Диагностическому и статистическому руководству по психическим болезням

Американской Психиатрической Ассоциации (DSM-IV, 1994), симптомы

клинической депрессии проявляются одновременно на психологическом,

поведенческом и физиологическом уровнях. Среди множества симптомов

депрессии принято выделять два основных - снижение настроения и

ангедонию (Kennedy, 2008), то есть утрату интереса к тем родам

деятельности, которые обычно приносят удовольствие. Депрессию

диагностируют в случае сохранения по крайней мере одного из двух

названных ключевых симптомов в течение по меньшей мере 2 недель. Кроме

того, для уточнения диагноза существует перечень дополнительных

симптомов депрессии, среди которых нарушение локомоторной активности,

нарушение сна, чувство вины или беспомощности, неспособность

концентрировать внимание, заторможенность мышления, уменьшение

сексуального желания, нарушение аппетита или изменение веса, и

суицидальные тенденции. Диагноз «клиническая депрессия» ставится при

наличии как минимум четырех перечисленных дополнительных симптомов.

Значимость и опасность этого заболевания трудно переоценить: согласно

статистике ВОЗ, в 2004 году клиническая депрессия являлась третьим по

11

распространенности и стоимости лечения заболеванием. Согласно ВОЗ, к 2030 году депрессия станет первым по распространенности и длительности недееспособности заболеванием во всемирном масштабе. Клиническая депрессия связана с повышенным риском суицида: пожизненный риск суицида для больных клинической депрессией составляет 3,5% (Blair-West et al., 1997). Кроме того, для депрессии характерна коморбидность с другими психическими расстройствами (Mineka et al., 1998). Показано, что клиническая депрессия провоцирует развитие целого ряда патологий, среди которых сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные заболевания и ожирение (Rumsfeld, Но, 2005; Swaab et al., 2005; Bornstein et al., 2006), а также существенно снижает качество жизни и является одной из самых распространенных причин нетрудоспособности.

Гипотезы возникновения депрессии

В настоящее время существует несколько теорий, рассматривающих возможные механизмы возникновения и развития депрессии. Наиболее разработанными являются моноаминовая гипотеза, стрессовая гипотеза и теория нарушения нейрогенеза. Кроме того, существует гипотеза о воспалительной природе депрессии. Далее будут кратко рассмотрены все перечисленные гипотезы.

Моноаминовая гипотеза депрессии

Моноаминовая гипотеза депрессии была выдвинута в 1960х годах, вскоре после того, как было впервые обнаружено антидепрессантное действие моноаминов (Bunney, Davis, 1965). Согласно данной гипотезе, причиной клинической депрессии является патологический дефицит серотонина, норадреналина и дофамина - моноаминов, выполняющих функцию нейтротрансмиттеров в центральной нервной системе (ЦНС). Дефицит моноаминов может быть вызван нарушениями синтеза, выброса или

хранения моноаминов в синапсах нейронов; кроме того, моноаминовый сигналинг может быть нарушен из-за невосприимчивости рецепторов и/или нарушения системы вторичных мессенджеров. Исходя из данной гипотезы, лечение депрессии должно быть направлено на увеличение концентрации моноаминов в ЦНС, которое достигается за счет ингибирования обратного захвата моноаминов в пресинаптическое окончание или подавления метаболизирования моноаминов (Krishnan, Nestler, 2008). Гипотеза была частично подтверждена клиническими данными: было показано, что селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС) нормализовали симптомы депрессии, однако не оказывали желаемого эффекта в случае патологического понижения уровня триптофана (Nemeroff, 1998). Несмотря на то, что подавляющее большинство современных антидепрессантов повышают уровни моноаминов в ЦНС, до сих пор не удалось выявить четкую последовательность, заключающуюся в первичном нарушении какой-либо из моноаминовых систем ЦНС и вторичном возникновении депрессии (Delgado, 2000). Более того, показано, что уменьшение уровней (деплеция) моноаминов в ЦНС здоровых людей не приводит к развитию депрессии (Ruhe et al., 2007). В настоящее время предполагается, что моноаминовая гипотеза лишь частично объясняет причины возникновения депрессии (Xu et al., 2003).

Стрессовая гипотеза депрессии.

Впервые концепция стресса, являющегося адаптивным ответом организма на физиологически значимые изменения внешней и внутренней среды, была разработана Гансом Селье (Selye, 1955). Стрессовая реакция начинается с обработки сенсорной информации, отражающей появление стрессора - раздражающего стимула. В том случае, если стрессор представляет потенциальную опасность для организма, активируется каскад нервных и гормональных сигналов, воздействующий на эффекторы, которые

обеспечивают адекватную реакцию на стрессор и увеличивают вероятность выживаемости организма. При стрессе активируется гормональная система, известная как гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая (ГГН) ось. Гормоны стресса, продуцируемые гипоталамусом (кортикотропин-рилизинг гормон и вазопрессин), гипофизом (АКТГ) и надпочечниками (глюкокортикоиды), обеспечивают проявление комплекса реакций, необходимых для выживания в стрессирующей обстановке: повышение внимания, увеличение артериального давления, модуляция метаболических процессов и супрессия воспалительных процессов. Краткосрочное повышение циркулирующей концентрации гормонов ГГН оси необходимо для адекватной реакции на предъявление стрессора, однако хроническая гиперактивация ГГН оси приводит к развитию различных патологий. Согласно стрессовой гипотезе депрессии, причиной возникновения данного аффектив