Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение белка E(y)2P Drosophila melanogaster, являющегося паралогом фактора транскрипции E(y)2

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение белка E(y)2P Drosophila melanogaster, являющегося паралогом фактора транскрипции E(y)2"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

Марданов Павел Владимирович

Изучение белка Е(у)2Р Drosoph.Ua melanogaster, являющегося паралогом фактора транскрипции Е(у)2

Специальность 03.00.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов

Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук С.Г. Георгиева

кандидат биологических наук А.Н. Краснов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук О.Л. Поляновский

кандидат биологических наук С.К. Семенова

Ведущая организация: институт биологии развития им. Н.К.

Кольцова РАН

Защита диссертации состоится 2005 года, в 1 Счасов на

заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова д. 32

34/5

Автореферат разослан: ".§2" ¿3_уу&<>005 года

Ученый секретарь

диссертационного канд. фарм. наук

Грабовская Л.С.

2 0Об-</

ЛуусХГО

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Геном организма содержит всю информацию, необходимую для его жизнедеятельности. Перевод информации с уровня нуклеиновых кислот на уровень активных белковых молекул является многоступенчатым процессом со сложной многоуровневой регуляцией. Основной контроль экспрессии генов осуществляется на уровне транскрипции. К настоящему моменту исследовано большое количество разнообразных белков и белковых комплексов, участвующих в активации транскрипции. Наиболее изученными из них являются компоненты общей транскрипционной машины, которые, как считают, функционируют во всех клетках организма. Экспрессия генов в тех или иных клетках и тканях регулируется специфическими транскрипционными факторами, которые определяют доступность промотора для общих транскрипционных факторов и связывание их с промотором.

Транскрипционный аппарат клеток зародышевой линии достаточно мало изучен. Однако в последнее время появились данные, что для выполнения транскрипционной программы специфической для клеток зародышевой линии, некоторые компоненты общей транскрипционного аппарата заменяются белками паралогами. Эти паралоги кодируются генами, появившимися путем дупликации исходного гена в процессе эволюции и экспрессирующимися только в клетках зародышевой линии.

Одним из наиболее распространенных путей возникновения генов паралогов является ретропозиция. Т.к. ретрогены не имеют собственных промоторов, большинство из них, попадая в транскрипционно -неактивные районы генома, из-за накопления мутаций быстро утрачивают функциональность и превращаются в псевдогены. Однако небольшая

часть ретрогенов сохраняет транскрипционную активность (обычно тканеспецифическую) и кодирует функциональные белки.

В работе изучен новый белок Е(у)2Р Ого$орЫ1а melanogaster, являющийся паралогом ранее описанного общего активатора транскрипции Е(у)2. Показано, что в то время как Е(у)2 экспрессируется во всех клетках организма, Е(у)2Р является специфическим белком для зародышевых клеток в половой системе самцов. Т.о. выявлен новый компонент общего транскрипционного аппарата регулирующего активацию экспрессии генов в половых клетках. Показано, что е(у)2Р является исходным геном, в то время как ген е(у)2 представляет собой его ретрокопию, которая функционально заменила исходный ген в процессе эволюции.

Результаты, полученные в данной работе, свидетельствуют о том, что ретрокопия исходного гена попала в транскрипционно-активный район и заместила функции исходного гена практически во всех тканях организма О. теЬпо^аяГег, а исходный ген приобрел узкую специфичность для клеток зародышевой линии самцов. Данные результаты могут быть использованы при создании повсеместно и тканеспецифично экспрессируемых у О. melanogaster трансгенных конструкций.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось изучение обнаруженного нами гена е(у)2Р и его белкового продукта. В данной работе предполагалось решить следующие задачи:

клонирование и изучение структуры гена е(у)2Р Б. melanogaster, исследование экспрессии е(у)2Р, сравнение ее с экспрессией е(у)2 й. те1апо§аз1ег и гомологами из других организмов, установление функции белка Е(у)2Р у ОгоБоркИа melanogaster, анализ структуры гомологов е(у)2 у других организмов, изучение происхождения генов е(у)2Р и е(у)2 в процессе эволюции.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе изучен новый транскрипционный фактор, Е(у)2Р, паралог транскрипционного фактора Е(у)2. Белок Е(у)2 является компонентом убиквитарного мультибелкового комплекса, содержащего гистонацитилтрансферазу СК^5 (<ЗСК5-НАТ-комплекс) и участвующего в активации транскрипции путем ацетилирования гистона НЗ и взаимодействия с И-концом гистона Н4. Показано, что транскрипция гена е(у)2Р является тканеспецифической, в то же время ген е(у)2 транскрибируется во всех тканях организма. Убиквитарная транскрипция показана и для гомологов из других организмов.

Е(у)2Р функционирует в клетках зародышевой линии самцов О. melanogaster. Его экспрессии соответствует зона перехода от делений митоза к мейотической программе. Таким образом, впервые получены указания о существовании тканеспецифического ОСК5-НАТ-комплекса, который функционирует на данной стадии.

С помощью создания трансгенных линий мух показано, что Е(у)2Р не способен функционально замещать Е(у)2, что указывает, на то, что белки дивергировали достаточно далеко друг от друга.

Исследована экзон-интронная структура генов е(у)2Р, е(у)2 и их гомологов у других организмов. Показано, что ген е(у)2 не содержит интронов, в то время как экзон-интронная структура е(у)2Р и других гомологов сохранила консервативность в эволюции. На основе сравнения белковых последовательностей и филогенетического анализа приблизительно оценено время возникновения генов е(у)2 и е(у)2Р. Установлено, что е(у)2 является ретрокопией е(у)2Р.

Таким образом, в работе исследован и описан уникальный случай, когда ретрокопия гена не превратилась в псевдоген, а заменила исходный ген.

Предложена модель, объясняющая, каким образом ген е(у)2 приобрел убиквитарную экспрессию и функционально заменил ген е(у)2Р.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Международном съезде биохимического общества (С.-Петербург, 2002), Международной конференции «Molecular Genetics of Eukaryotes» (Москва, 2003), на Конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, 2003) и на Международной конференции «Advances in Molecular Cell Biology» (Москва, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах и состоит из разделов: введение, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа включает 14 рисунков и 3 таблицы. Список библиографии состоит из 166 источников.

Содержание работы

Клонирование гена е(у)2Р и изучение его структуры. Ранее был охарактеризован белок Е(у)2 Drosophila melanogaster, кодирующий убиквитарный активатор транскрипции РНК полимеразы II (Georgieva et al, 2001а). В работе был проведен поиск генов и белков D. melanogaster, гомологичных гену и белку Е(у)2 соответственно. Найти гены, гомологичные е(у)2 дрозофилы, не удалось. В настоящей работе был проведен поиск белков, гомологичных белку Е(у)2 дрозофилы. Поиск осуществляли среди различных последовательностей, имеющихся в базах данных GeneBank, Berkeley Drosophila Genome Project (BDGP) с помощью программы BLAST. С достоверной степенью вероятности (7*10-13 при

установках программы, принятых по умолчанию; для сравнения, при этом же поиске сам Е(у)2 определяется с вероятностью 2*10'43), обнаружен белок, кодируемый предполагаемым геном (номер отчета во Flybase CG14612). Мы назвали этот ген паралогом гена е(у)2 (е(у)2Р). Ген е(у)2Р расположен на правом плече хромосомы III в районе 84В6.

Геномную копию е(у)2Р клонировали в вектор pBlueScript SK+. кДНК гена клонировали при помощи обратного ПЦР. Сравнением последовательностей геномной ДНК и кДНК определены положения интронов и экзонов гена. Установлено, что е(у)2Р имеет 3 экзона и содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок длиной 95 аминокислот. Полученные результаты совпали с опубликованными во FlyBase данными.

Ранее было показано, что ген е(у)2 не содержит интронов и кодирует белок длиной в 101 аминокислоту. Мы сравнили аминокислотные последовательности белков-паралогов у D. melanogaster (рис. 1а). Белки Е(у)2 и Е(у)2Р имеют 29% идентичных и 19% гомологичных аминокислот. Гомологичные районы преимущественно расположены в средних районах белков.

Е(у)2

Е(у)2Р

Консенсус

Е(у)2 Е(у)2Р Консенсус б

------MSTSGAVDOVyLTCaKSKIMHCS»MHpDEVKI.

S TL S DKA IKDLL SRL ECGW DIK M RNIIMEK

TEIEEEPDEPEDES DK-

DQL А I P AR LVPD VK ELLLKI

DM

Е(у)2 Е(у)2Р

HS 37/19 29/21

Рис 1 Анализ последовательностей белков Е(у)2 и Г.(\)2Р О melancgaster (а) выравнивание последовательностей Идентичные аминокислоты обозначены темно-серым фоном, а схожие - серым фоном Фрагмент Е(у)2Р, использовавшийся для синтеза пептида и получения антител обозначен жирным курсивом (б) сравнение последовательности белка Е(у)2 млекопитающих (Ш, белки Е(у)2 человека, мыши, крысы одинаковы) с последовательностями гомологичных белков й (ОМ) Показаны проценты идентичных/схожих аминокислот

Степень гомологии белков Е(у)2 и Е(у)2Р с соответствующими белками млекопитающих различна (рис. 16). Больший процент схожих и идентичных аминокислот у Е(у)2 человека и Е(у)2 й. melanogaster по сравнению с Е(у)2Р говорит о большей эволюционной консервативности Е(у)2 и, следовательно, о большей консервативности его молекулярной функции у различных организмов.

Ген е(у)2 обладает повсеместной экспрессией, в то время как е(у)2Р экспрессируется в половых клетках самцов. Было проведено сравнение профилей транскрипции генов е(у)2Р и е(у)2 (рис. 2а). Методом нозерн-блот-гибридизации показано, что в то время, как ген е(у)2 транскрибируется на всех стадиях развития Ого.чоркИа melanogaster, транскрипция гена е(у)2Р происходит лишь у самцов и куколок. Низкий уровень транскрипции у ранних куколок, возрастает на поздних стадиях и достигает максимального уровня у имаго (рис. 26).

И

куколки 5 2

5 I Ш II I I I

я« 2 я 2 | . « 5 V у — и С. = 2. <■! ^

е(у)2 Яа.ч2

-«0.65 тпн -«0 55 гпн

5 Ы а 5 Ир

в в» О

е(у)2Р *». 4§' -0.65 тин К(у)2 -0 55 тпн . ррнк — е<у,2р „

антител ! и II)

3, В о

= в с.

е г ?

-13 кДа -ЮкДа -10 кДа

Рис 2 е(у)2Р и имеют различные

паттерны транскрипции (а) Нозерн-гибридизация поли(А)+ РНК (3 мкг на дорожку). выделенной на различных стадиях развития й те1апо%а^ег с зондами е(у)2Р и е(у)2 Для нормализации уровня сигналов использовали зонд (б)

Нозерн-гибридизация мРНК из взрослых самцов, самцов без клеток зародышевой линии (каркассы) и тестисов с зондами е(у)2Р и е(у)2 (в) Вестерн-блот анализ белковых экстрактов из семенников, каркассов и эмбрионов с антителами, специфичными к Е(у)2 или Е(у)2Р (два типа

I

Для того, чтобы установить, в каких тканях самцов происходит транскрипция е(у)2Р, был проанализирован уровень транскрипции в семенниках и самцах без клеток зародышевой линии. Обнаружено, что у самцов О. melanogaster ген транскрибируется лишь в семенниках, в то время как транскрипция е(у)2 происходит равномерно в разных тканях, в том числе и в семенниках.

Чтобы выявить белок, соответствующий гену е(у)2Р, были получены поликлональные кроличьи антитела к короткому пептиду (МТГЧКЕТОТБРОРОУКРС) (рис. 1а), специфичному для Е(у)2Р, а также антитела к полноразмерному белку Е(у)2Р. Полноразмерный рекомбинантный белок был получен с использованием экспресионного вектора р<2Е-30. При помощи полученных антител при разделении белков экстракта из семенников в ЗВЯ-полиакриламидном геле обнаружен белок, молекулярная масса которого соответствовала рассчитанной для Е(у)2Р -10 кДа (рис. 2в). Таким образом, ген е(у)2Р действительно кодирует белок, который экспрессируется в половых клетках самца.

Для более детального изучения экспрессии е(у)2 и е(у)2Р, были получены конструкции, в которых ген р-галактозидазы был поставлен под контроль вышележащих областей соответствующих генов (рис. За). Указанные конструкции были использованы для микроинъекций в эмбрионы О. те1апо%а$1ег. Показано, что под контролем регуляторной области гена е(у)2 (рис. Ъв) Р-галоктозидаза экспрессируется на протяжении всего семенника, а также в других органах мухи, тогда как экспрессия е(у)2Р происходит лишь в узкой зоне апикальной части семенников (рис. Зг).

Рис 3 Анализ экспрессии е(у)2 и е(у)2Р в семенниках D melnnogaster (я) Схемы трансгенных конструкций, несущих ген р-галактозидазы под контролем регуляторных областей соотвествуюших генов +1 соответствует началам ОРС генов (б) Окрашивание при помощи X-gal семенников, выделенных из самцов дикого типа (в) Окрашивание при помощи X-gal семенников, выделенных из самцов, несущих LacZ под контролем регуляторной последовательности е(у}2 (г)

Окрашивание при помощи X-gal семенников, выделенных из самцов, несущих LacZ под контролем регуляторной последовательности е(у)2Р(д) Экспрессия е(у)2Р в трансгенных мухах, несущих конструкции содержащие е(у)2Р под промотором Su(Hw) определенная с помощью обратного ПЦР

Зона экспрессии е(у)2Р соответствует переходу клеток из митоза в стадию G2 мейоза. На данной стадии дифференцировки половых клеток происходит переключение митотической программы клеточного цикла на мейотическую (Fuller, 1998). Видимо, Е(у)2Р участвует в смене этих программ. Об узкой направленности действия Е(у)2Р говорит так же тот факт, что сигнал Р-галактозидазы спадает на протяжении семенника очень быстро. Возможно, в N-концевой части белка Е(у)2Р, которая входит в используемые конструкции, существует сигнал для направленной деградации белка.

Таким образом, в то время как экспрессия е(у)2 является повсеместной, е(у)2Р функционирует только в узкой зоне в развивающихся половых клетках самцов. В нашей лаборатории показано, что Е(у)2 взаимодействует со GCN5, являющегося компонентом GCN5-HAT-комплекса, который относится к общей транскрипционной машине и активирует транскрипцию путем ацетилирования гистонов. Компоненты GCN5-HAT-KOMiuieKca обладают убиквитарной экспрессией Полученные

в данной работе результаты показывают, что на стадии перехода от митотической программы дифференцировки половых клеток к мейотической функционирует ССК5-НАТ-комплекс, отличающийся по своему белковому составу от основного комплекса.

Е(у)2Р не может функционально замещать Е(у)2. Для того, чтобы проверить, являются ли функции белков Е(у)2Р и Е(у)2 идентичными, была создана конструкция, в которой кДНК е(у)2Р находится под контролем конститутивного промотора гена Би( Ны), и получена трансгенная линия мух, несущая данную конструкцию.

Было проверено, обладает ли трансгенный е(у)2Р убиквитарной транскрипцией. При помощи обратной ПЦР на РНК из трансгенных мух было проверено наличие транскрипци е(у)2Р. Установлено, что транскрипция е(у)2Р у трансгенных мух происходит в различных тканях самцов, а также у самок (рис. Зс)), т.е. промотор Би(Ню) действительно обеспечивает убиквитарную транскрипцию

Мух, несущих конструкцию, скрещивали с мухами, несущими мутацию е(у)2"'. Полученные в результате скрещиваний особи фенотипически не отличались от мух е(у)2"1, тогда как контрольная конструкция, несущая кДНК е(у)2 полностью восстанавливала мутантный фенотип.

Результат данного эксперимента позволяет сделать вывод, что Е(у)2Р не может заменять Е(у)2 в основном (ЗСЫ5-НАТ-комплексе. Т.о. экспрессия второй копии гена е(у)2 в семенниках нужна не для повышения уровня транскрипции этого белка, а для выполнения специфической транскрипционной функции.

Область, находящаяся перед началом открытой рамки считывания гена е(у)2, содержат сильный промотор. Описанный выше эксперимент по изучению экспрессии гена под контролем регуляторных областей е(у)2 и е(у)2Р показал, что использованные для создания конструкций

11

последовательности, содержат элементы, определяющие профиль экспрессии е(у)2 и е(у)2Р: в то время, как промоторная область е(у)2 определяет повсеместную экспрессию, промотор паралога специфичен для семенников.

Для того, чтобы обнаружить район потенциального промотора, данные последовательности были проанализированы с помощью программы McPromoter 3 0 (Ohler et al, 2002), которая определяет районы, схожие с известными промоторами генов D. melanogaster. Программа предсказала существование промотора в районе -151; -136 п.н. относительно начала открытой рамки считывания (ОРС) (рис. 4а) в гене е(у)2.

Рис 4 Анализ промотора гена е(у)2 у D melanogaster при помощи программы McPromoter 3 0. (а) Результат анализа вышележащей области гена е(у}2 За +1 принято начало открытой рамки считывания. Место инсерции мобильного элемента Stalker, вызвавшего мутацию е(у)2"'у обозначено треугольником Нуклеотидная

последовательность, представленная ниже графика, соответствует анализируемому району ДНК, лирным шрифтом выделена последовательность предсказанного промотора (-151, -136) (б) Схематичное представление генов, прилегающих к гену е(у)2

Интересно, что встраивание мобильного элемента Stalker в мутации е(у)2"' (рис. 46), приводящее к резкому падению уровня транскрипции е(у)2, произошло как раз в районе предсказанного программой промотора.

В регуляторной области е(у)2Р программа не обнаружила известного промотора. Т.о повсеместная экспрессия е(у)2 объясняется наличием сильного убиквитарного промотора в его регуляторной области.

Y' '

ctagclacaaagtagctdgactgrngcutgaccactgUccaacaicaca

и

прсдсшаяный промтф'

Гены, гомологичные е(у)2 и е(у)2Р, присутствуют в геноме ОгояорЫМ рьеийооЬясига, в то время как у АпорИеШ gamЫae обнаружен только гомолог Е(у)2Р. Было проверено, существуют ли у других видов ИгозоркИа две копии гена е(у)2. В секвенированном геноме В. рзеиЛооЪЕсига обнаружено два гена, соответствующие генам е(у)2 и е(у)2Р, имеющие один и три экзона соответственно. Т.о. гомологи генов е(у)2 и е(у)2Р в рассматриваемых видах Drosoph.Ha сохранили схожую экзон-интронную структуру.

На рис. 5а изображена структура генов е(у)2Р у двух видов дрозофилы. Установлено, что положение первых интронов и экзонов полностью совпадает по размеру и положению, что свидетельствует о функциональной важности И-концевой области гена. Последовательность белка Е(у)2Р у рассматриваемых видов обладает достаточно высокой консервативностью (рис. 5в). Однако сравнение степени гомологии показывает, что Е(у)2 обладает большей эволюционной консервативностью, чем Е(у)2Р (рис. 56).

О? Пу>? Е(у)2р

1 ом\.

1 Е(у)2 63/10 33/16

! Е(у;¿р 14/¿0 42/12

Е(у)2р

О рвецсЬоЫсига

|В53НТ П№

'АКЕГЛЛ РОРСТКР'

О. т>1зтэавтяг й- -УГЧЛМКРД.'1о1-.,»зРМ'ДИ' Т^тИИ"' Д"'

Бгъррк

1К-----

Рис 5 Анализ гомологов Е(у)2 у О ряеи(1ооЬ^сига и О те1апокаиег (а) Экчон-иитронная структура генов е(у)2Р у двух видов Цифры обозначают длину соответствующего фрагмента в нуклеотидах Экзоны обозначены черными прямоугольниками, ннтроны - линиями (б) Сравнение белков Е(у)2 и Е(у)2Р О те1апо§ш1ег и О р\еи(1ооЫсига Первая цифра обозначает процент одинаковых аминокислот, вторая -процент схожих (в) Выравнивание аминокислотных последовательностей белков Е(у)2Р Одинаковые аминокислоты выделены темно-серым цветом, сходные - светло-серым Жирным курсивом выделены крайние аминокислоты соседних экзонов

Копия, соответствующая гену е(у)2 не была найдена у других видов дрозофилы, что может объясняться тем, что их геномы не сиквенированы или сиквенированы не полностью. Только одна копия, содержащая интроны, была обнаружена в полностью секвенированном геноме комара Anophelis gambiae (рис. 6а). По литературным данным An.oph.elis и Drosophila дивергировали около 250 млн. лет назад (Bergman et al, 2002). Видимо, е(у)2 образовался после расхождения двух вышеуказанных видов, но до того, как разделились два вида: D. melanogaster и D. pseudoobscura (46 млн. лет назад (Bergman et al, 2002, Gaunt and Miles, M. A., 2002)).

Ген e(y)2 является ретрокопией гена e(y)2P. Ранее были обнаружены гомологи Е(у)2 и Е(у)2Р у других многоклеточных организмов (Georgieva et al, 2001а). В настоящей работе проделан анализ экзон-интронной структуры гомологов е(у)2 у D. melanogaster, D. pseudoobscura, H. sapiens, M. musculus, R. norvegicus, A. gambiae, S. cerevisiae. Во всех гомологичных генах были обнаружены интроны. На рисунке 6 показано положение интронов в белках дрожжей, дрозофилы и млекопитающих (рис. 6а). Положение интронов в генах е(у)2 сходно между собой. Наиболее консервативен первый интрон: его положение одинаково у всех проанализированных организмов. Гомолог гена е(у)2 у мыши имеет три интрона, а не два, как у дрозофилы. Экзон-интроная структура гена мыши (Mus musculus) и человека (Homo sapiens) одинакова, а последовательность белков абсолютно идентичена (рис. 6а).

Чтобы проверить, происходит ли транскрипция обнаруженного гена у млекопитающих, был проведена нозерн-блот-гибридизация с образцами РНК из различных органов мыши (рис. 6в). Было обнаружено, что у мыши транскрипция гена е(у)2 происходит во всех проанализированных органах и не имеет выраженного тканеспецифического характера (рис. 6в). Таким

образом, белок Е(у)2 млекопитающих тоже обладает повсеместной экспрессией.

к ^ А

Дл^атдгТрг

£ аэндэээ П

Я

А детЬяр

П т^яттр^рг

в оегелгхае Вт^гщрЯг

---------МУЗК5УШХТ|Ы

---------НБТБС^оКуТУиА^ БКХК]

- -МПМКЕТеТВРВРСУКРТЬИВОСК

ВЩтшэрВЕ« __

---|ЗТЫРТО1Ь5ТУ1

1Е|-УШ1ИР||0§А|0|^Г>,

КП1§ЕМ1М>П|М

НуГЕ'ЕЕЕРВЕРЕВЕЗ |ЕЕ1\ЛЭТ12-------

1К------ - -

ПпйатвВВ-Э- НД'-ИЗ) Ппйсп^вгЗ' МГ7 п рргМтпга 5* (-ИЙ-ВД О рдгМуня 3' (+Э67;+ЗВ

Консенсус

асасасасасас

5о х оё чЗ т

о 3

з 2

те(у)2 8 т.п.н.

Рис 6 (а) Выравнивание аминокислотных последовательностей гомологов белка В(у)2 из различных организмов с последоваетльностями белка Е(у)2 человека Идентичные ; '*"* * аминокислоты обозначены темно-серым

фоном, а схожие изображены на светло-сером фоне Жирным курсивом выделены крайние аминокислоты соседних экзонов (б) Структура прямых повторов, расположенных в прилегающих областях генов е(у)2 О те1апо%а$1ег и О рзеие1ооЬ5сига В скобках указаны границы нитронов относительно начала ОРС Гомологичные с консенсусом нуклеотиды показаны на темно-сером фоне (в) Нозерн-блот анализ с образцами РНК из различных тканей мыши Для контроля количества нанесенной РНК использовали зонд ОЗРОН

Сходство экзон-интронной структуры е(у)2Р со структурой гомологов из других видов эукариот указывает, что этот ген появился крайне давно у их общего предка. В то же время, как описано выше, ген е(у)2 обнаружен только у дрозофилы и следовательно возник гораздо позднее гена е(у)2Р.

Известно, что копии генов, не содержащие интронов, представленные в эукариотических геномах, получаются в результате ретропозиции. Отсутствие интронов у гена е(у)2 позволяет утверждать, что он является ретрокопией гена е(у)2Р.

В прилегающих областях генов е(у)2 И. melanogaster и Э. р$еи<1ог)Ь$сига обнаружены прямые повторы длиной 12 п.н. (рис. 66). Не удалось найти других особенностей ретротранспозиции, таких как З'-поли(А) последовательности. Однако, как показано, многие ретрогены не имеют данных особенностей строения (Вгобшб, 1999), т.к. они быстро исчезают в процессе эволюции.

Таким образом, ретрокопия гена функционально заменила его в процессе эволюции. Убиквитарная транскрипция обнаруженная для гена -гомолога е(у)2 мыши предполагает, что ген е(у)2Р ранее тоже транскрибировался повсеместно, затем постепенно был заменен своей ретрокопией и приобрел узкую тканеспецифическую функцию.

Обсуждение полученных результатов

В работе описан новый транскрипционный фактор Е(у)2Р, являющийся паралогом общего транскрипционного фактора Е(у)2. Идентифицирован белок Е(у)2Р и исследована его экспрессия. Показано, что в отличие от Е(у)2, обладающего повсеместной экспрессией, Е(у)2Р экспрессируется только на определенной стадии дифференцировки половых клеток самцов ОгозорЫ1а при переходе от митотической программы к стадии 02 мейоза. Эта стадия характеризуется высокой уровнем экспрессии генов, белковые продукты которых необходимы для мейотических делений и последующей дифференцировки (элонгации) гаплоидной клетки.

Известно много генов, которые транскрибируются только на этой стадии. Кроме того, ряд генов, работающих в соматических клетках, для экспрессии в первичных сперматоцитах используют альтернативные

промоторы. Все это дает основание предполагать, что на данном этапе дифференцировки в клетке существует специфический транскрипционный аппарат. Ранее предполагалось, что белковый состав основных транскрипционных комплексов в клетках зародышевой линии не отличается от комплексов в соматических клетках, а специфичность транскрипции определяется действием специфических активаторов и репрессоров. Однако недавно у дрозофилы были найдены паралоги нескольких компонентов основного комлекса TFIID, которые экспрессируются только на стадиях сперматогенеза: nht является паралогом dTAF4, сап - dTAF5, mía - dTAFó, sa - dTAF8 и rye - dTAF12 (Hiller et al, 2004). Для всех указанных компонентов не показано, что они непосредственно взаимодействуют с компонентами TFIID (из-за экспериментальной сложности задачи). Однако продемонстрировано, что nht и rye физически взаимодействуют между собой, но не со своими гомологами TAF12 и TAF4. Также установлено, что nht, mía, sa и rye имеют в своей структуре гистон-фолд мотивы (Hiller et al, 2004). Эти результаты показывают, что основной преинициаторный комплекс TFIID имеет тканеспецифическую конформацию, ответственную за выполнение транскрипционной программы специфической для данной стадии.

Полученные в работе результаты позволяют предположить, что другой основной транскрипционный фактор GCN5-HAT вероятно так же имеет тестис- специфическую форму. Интересно, что стадия экспрессии Е(у)2Р и тестис- специфических TAF совпадает. Возможно, что два тестис-специфических комплекса взаимодействуют между собой в выполнении предмейотической транскрипционной программы.

В работе показано, что Е(у)2Р не заменяет функционально Е(у)2. Замена промоторной области е(у)2Р на убиквитарный промотор, приведшая к повсеместной экспрессии гена, не компенсировала мутацию гена е(у)2, но

и не вызвала каких либо дополнительных нарушений, что говорит о том, что белок Е(у)2Р в данных условиях не функционален скорее всего из-за неспособности включиться в комплекс. Данный эксперимент подтверждает узкую тканеспецифическую функцию белка.

Анализ структуры генов показал, что е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Р, которая функционально заменила исходный ген в процессе эволюции. Эта замена, по-видимому, произошла вследствие того, что ген е(у)2 при транспозиции попал в благоприятный для транскрипции район, что в свою очередь привело к повсеместному и высокому уровню его экспрессии.

Наши результаты показали, что ген е(у)2 находится под действием транскрипционно-активного промотора, который возможно находился в этом районе до встраивания е(у)2 Кроме того, вероятно, район, в который произошла инсерция, был транскрипционно активным на протяженном участке до встраивания е(у)2. По полученным нами данным гены, окружающие е(у)2 так же обладают убиквитарной конститутивной экспрессией. В другую сторону от направления ОРС е(у)2, расположена ОРС предполагаемого фактора транскрипции СО 11695 (рис. 46), расстояние между ОРС е(у)2 и С011695 составляет всего 287 п.н. Рядом с е(у)2 находится ген, кодирующий субъединицу РНК-полимеразы И.

Активная убиквитарная экспрессия гена е(у)2 привела к тому, что этот ген постепенно заменил функции гена е(у)2Р в соматических клетках. Кроме того, он попал под давление отбора, и, как следствие, белок Е(у)2 является более эволюционно-консервативным, чем Е(у)2Р. И наоборот, промоторная область гена е(у)2Р, как показали наши эксперименты, стала специфичной для семенников, и белок Е(у)2Р приобрел тканеспецифические функции.

Еще одним интересным механизмом, который привел к замене гена е(у)2Р его ретрокопией е(у)2 является встраивание последней в X-хромосому (по статистике пятая часть всех ретропозиций у дрозофилы происходит в Х-хромосому (Betran et al, 2002)). Механизм дозовой компенсации существующий у самцов (Hall and Lawrence, J. В., 2003) (Gilfillan et al, 2004) и приводящий к двукратному увеличению транскрипции генов, находящихся на единственной Х-хромосоме самцов, должен был привести к соответственному увеличению уровня транскрипции гена е(у)2. Если бы инсерция е(у)2 произошла в аутосому, то уровень его экспрессии был бы ниже, что не позволило бы ему заменить исходный ген. Интересно, что даже достаточно невысокое снижение уровня транскрипции гена е(у)2, обнаруженное в мутации е(у)2и1, вызвало множественные нарушения во всем организме мухи.

Известно, что у человека и мыши, у которых механизм дозовой компенсации работает в другом направлении и вызывает репрессию транскрипции одной из Х-хромосом самки, ряд генов, изначально расположенных на Х-хромосомах, имеет транскрипционно- активные ретрокопии, расположенные на аутосомах (Wang, 2004). Произошло это, по всей видимости, потому, что соответствующие белки необходимы для компенсации недостаточного уровня экспрессии гена, находящегося на X-хромосоме.

Для ряда транскрипционных факторов выявлены гомологи, экспрессируюшиеся в дифференцирующихся половых клетках. Так, обнаружена альтернативная форма TAF4b, которая экспрессируется на высоком уровне в гранулярных клетках мышей (Hiller et al, 2004, Wang and Page, 2002). Установлено, что TAF1 в экстракте из яичников мышей связан с большим TFIID-подобным комплексом, необходимым для экспрессии множества генов в развивающихся фолликулах яичников

(Wang and Page, D С, 2002). Выше были упомянуто существование нескольких тестис- специфических TAF4 у дрозофилы. Однако практически во всех известных случаях исходный ген сохраняет свою убиквитарную активность, в то время как ретрокопия приобретает тканеспецифическую экспрессию. Так ранее у M. musculus были подробно описаны два гена кодирующих РАВР белкок (белок, связывающийся с поли(А)) (Kleene et al, 1998). Показано, что ретроген РаЬр2, который не имеет интронов, экспрессируется в мейотических гаплоидных клетках сперматогониев, а исходный ген Pabpl экспрессируется в соматических клетках и ранних мейотических сперматогониях.

Однако случай с генами е(у)2 и е(у)2Р примечателен тем, что ретрокопия осталась функциональной и приобрела более глобальное значение для организма, чем исходный ген.

Интересно, что недавно выявленный тестис-специфический паралог taf5 дрозофилы, cannonball (Hiller et al, 2001) имеет 4 экзона, тогда как по предсказаниям программы убиквитарно экспрессирующийся ta/5 состоит из одного. Это дает основания предполагать, что замена исходного гена его ретрокопией, обнаруженная для гена е(у)2, не является исключением, по крайней мере, у дрозофилы.

Выводы

1. Обнаружен и клонирован ген е(у)2Р, являющийся паралогом гена е(у)2 у D. melanogaster,

2. Установлена экзон-интронная структура гена е(у)2Р D. melanogaster, а также гомологов е(у)2 у H. sapiens, M. musculus, R. norvegicus, D. pseudoobscura, S. cerevisiae, A. gambiae;

3. Показано, что ген e(y)2 является ретрокопией гена е(у)2Р. На основе филогенетического анализа показано, что ретропозиция е(у)2Р произошла не ранее, чем 46 млн. лет назад;

20

Определено, что в то время как ген е(у)2 обладает повсеместной экспрессией, ген е(у)2Р транскрибируется в апикальной части тестисов самцов Э. melanogaster, в зоне в которой происходит переход от митотической программы клеточного цикла к мейотической;

Получены линии мух, в которых кДНК генов е(у)2Р и е(у)2 находятся под контролем промотора гена 8и(Нм/) На основании генетических скрещиваний этих трансгенных линий с линией мух е(у)2"', продемонстрировано, что белок Е(у)2Р функционально не заменяет Е(у)2;

Показано существование сильного убиквитарного промотора в регуляторной области гена е(у)2 и предложен механизм объясняющий, как ретрокопия заместила исходный ген.

Список публикаций

1. Пулина М.В., Марданов П.В., Краснов А.Н. Новый транскрипционный фактор ENHANCER OF YELLOW 2 и его ( гомолог. III Съезд Биохимического Общества С.-Петербург,

2002. Тезисы научных докладов, стр. 414-415.

2. Mardanov P., Nabirochkina Е. Studying Drosophila tissue-specific * homologue of transcription factor e(y)2. Internationa! Conference "Molecular Genetics of Eukaryotes". Moscow, 2003. Abstracts, p.

18.

3. Mardanov P., Nabirochkina E. The novel transcription factor E(y)2 and its homologue. Abstract book, Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics. Kyiv, Ukraine. September 25-27, 2003. p. 100.

4. Mardanov P., Shidlovskii Yu., Kurshakova M., Krasnov A., Nabirochkina E., Georgieva S. The novel transcription activation factor E(y)2. Advances in Molecular Cell Biology, Conference devoted to the 10th anniversary of the center for medical studies (1993-2003). Moscow, 2004. Proceedings pp. 103-118.

5. Марданов П.В., Краснов A.H., Куршакова M.M., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г. Исследование нового тканеспецифичного фактора транскрипции РНК-полимеразы II. Генетика, 2005. Т. 41, №4, стр. 536-541

6. Шидловский Ю.В., Марданов П.В., Федорова О., Набирочкина Е.Н. Молекулярный аппарат инициации транскрипции РНК-полимеразой II. Генетика. 2005. Т. 41, № 4, стр. 493-507.

Типография ордена «Знак почета» издательства МГУ 117234, Москва, Ленинские горы Заказ №234 Тираж 70 экз.

№-8 39 8

РНБ Русский фонд

2006-4 5289

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марданов, Павел Владимирович

Оглавление.

Введение.

Список использованных сокращений.

Обзор литературы.

Часть I. Аппарат транскрипции у эукариот.

Глава 1.1. Транскрипция у эукариот, РНК-полимеразы.

Глава 1.2. РНК-полимераза II.

Глава 1.3. Области контроля транскрипции (TCR).

Промотор.

ТАТА-элемент.

Инициатор.

CpG-островки.

Глава 1.3. Проксимальные и дистальные элементы, энхансеры.

Глава 1.5. LCR, MAR.

Глава 1.6. Инициация транскрипции РНК-полимеразой II.

Часть II. Факторы транскрипции.

Глава 2.1. Компоненты транскрипционного аппарата.

Глава 2.2. Общие факторы транскрипции (GTF).

TFIIA.

TFIIB.

TFIIF.

TFIIHи TFIIE.

Глава 2.2. Активаторы и репрессоры.

ДНК-связывающие домены активаторов (DBD).

Домены активации и репрессии.

Глава 2.4. Корегуляторы.

TFIID.

Медиатор.

Глава 2.5. Посттранскрипционные события.

Часть III. Разнообразие мобильных элементов.

Глава 3.1. Краткая характеристика и классификация мобильных элементов.

Глава 3.2. ДНК-транспозоны или мобильные элементы класса II.

IS прокариот.

ДНК-транспозоны.

Глава 3.3. Общая характеристика ретроэлементов.

Глава 3.4. Ретроэлементы, не содержащие LTR.

Ретроинтроны.

Группа LINE.

SINE-элементы.

Псевдогены.

Процессированные псевдогены.

Псевдогены, возникшие при дупликации геномной ДНК.

Судьба псевдогенов.

Экспериментальная часть.

Объект и задачи исследования.

Гены enhancer of yellow.

Общее описание.

Белок Enhancer of yellow 2 (Е(у)2).

Влияние мутации e(y)2ul на транскрипцию.

Белок Е(у)2 эволюционно консервативен.

Активация транскрипции in vitro и взаимодействие с хроматином.

Е(у)2 входит в состав белкового комплекса и взаимодействует с белками-компонентами комплекса TFIID.

Цели работы.

Материалы и методы.

Реактивы.

Работа с Drosophila melanogaster.

Программное обеспечение, базы данных.

Работа с ДНК.

Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной ДНК. Рестрикция, лигирование, переосаждение ДНК, гель-электрофорез.

Секвенирование ДНК.

Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд.

Клонирование гена е(у)2Р.

Работа с РНК.

Выделение тотальной РНК.

Очистка поли(А) РНК.

Получение кДНК, обратный ПЦР.

Нозерн-блот-анализ.

Работа с белками.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков.

Получение антител и их очистка.

Белковый гель-электрофорез.

Иммуноблоттинг (вестерн-блот-анализ).

Дот-блот.

Выделение эмбрионального ядерного экстракта.

Выделение белкового экстракта из семенников.

Детекция активности р-галактозидазы.

Результаты.

Геномная характеристика е(у)2Р.

Поиск белков Drosophila melanogaster, гомологичных Е(у)2.

Клонирование и структура е(у)2Р.

Анализ экспрессии е(у)2Р у Drosophila melanogaster.

Нозерн развития.

Нозерн-блот-анализ тканей.

Экспрессия е(у)2Р в тестисах.

Экспрессия е(у)2Р под контролем промотора гена Su(Hw).

Для того, чтобы проверить, являются ли функции белков Е(у)2Р и Е(у)2 идентичными, была создана конструкция, в которой кДНК е(у)2Р находится под контролем конститутивного промотора гена Su(Hw) и получена трансгенная линия мух, несущая данную конструкцию.

Анализ прилегающих областей гена е(у)2Р D. melanogaster.

Анализ гомологов е(у)2. е(у)2 в различных организмах.

Гены е(у)2, е(у)2Р у Drosophila pseudoobscura и Drosophila melanogaster.

Ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Р.

Обсуждение результатов.

Структура гомологов белка Е(у)2 у различных организмов.

Ген е(у)2РD. melanogaster экспрессируется в семенниках.

Белок Е(у)2 функционально заменил белок Е(у)2Р.

Предсказанный промотор гена е(у)2 находится в районе встраивания МЭ Stalker в линии е(у)2и1.

Уникальность примера генов е(у)2 и е(у)2Р.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение белка E(y)2P Drosophila melanogaster, являющегося паралогом фактора транскрипции E(y)2"

Геном организма содержит всю необходимую для его жизнедеятельности информацию. Процессы реализации генома включают в себя множество механизмов, основная цель которых - перевод информации с «архивного» уровня нуклеиновых кислот на уровень активных белковых молекул.

Точное и слаженное действие всего организма достигается при правильной работе его частей — клеток, функционирование которых, в свою очередь, зависит от корректной внутриклеточной деятельности и регуляции деятельности различных белковых комплексов. Одним из активно изучаемых в настоящее время клеточных процессов является транскрипция генов.

В соматических клетках транскрипция достаточно хорошо изучена, тогда как процессы происходящие в клетках зародышевой линии изучены гораздо меньше.

С точки зрения обычной транскрипции геномы организмов содержат множество неинформативного материала: повторы, последовательности мобильных элементов и др. Такие последовательности накапливаются в ходе эволюции и служат одним из защитных механизмов организма от возникновения мутаций. Часто посредством Р-элементов возникают «молчащие» гены, которые получаются при ретропозиции активных генов. Однако из-за попадания в транскрипционно неактивные районы, накопления мутаций, усеченности рамок считывания они утрачивают функциональность.

Целью работы являлось изучение паралога гена enhancer of yellow 2 (е(у)2) у Drosophila melanogaster и других организмов. Как показано в работе, паралог (е(у)2Р) является исходным геном, а е(у)2, кодирующий фактор транскрипции РНК-полимеразы II и экспрессирующийся во всех тканях Drosophila, является его ретрокопией. Оказалось, что ген е(у)2Р экспрессируется в апикальной части семенников самцов взрослых мух, где происходит ряд клеточных делений образующихся сперматоцитов, а также переключение программ клеточного цикла с митотической на мейотическую.

Исследована экзон-интронная структура гомологов е(у)2 у других организмов, найдена общность в строении генов. На основе сравнения белковых последовательностей и филогенитеческого анализа приблизительно оценено время расхождения е(у)2 и е(у)2Р у Drosophila.

Предложена модель, по которой белок Е(у)2 заменил функции белка Е(у)2Р. Представленная гипотеза объясняет тканеспецифичность действия Е(у)2Р и убиквитарность Е(у)2.

Таким образом, в работе исследован и описан уникальный случай, когда ретрокопия гена вытеснила и во многом заменила исходный ген.

Список использованных сокращений

AD (англ. activation domain) — домен активации

BRE (англ. TFIIB recognition element) - элемент узнавания TFIIB

CTD (англ. C-terminal domain) - С-концевой домен

DBD (англ. DNA-binding domain) — домен связывания с ДНК

DPE (англ. downstream promoter element) - нижележащий элемент промотора

DR (англ. direct repeat) - прямой повтор

EST (англ. expressed sequence tag) — конец экспрессируемой последовательности GTF (англ. general transcription factor) - основной фактор транскрипции HAT (англ. histone acetilase) - ацетилаза гистонов HDAC (англ. histone deacetilase) - деацетилаза гистонов Inr (англ. initiator) — инициатор

IS (англ. insertion sequence) - последовательность встраивания LCR (англ. locus control region) - локус контроля района

LINE (англ. large interspersed nuclear element) — длинный диспергирванный элемент

LTR (англ. long terminal repeat) - длинный концевой повтор

MAR (англ. matrix associated region) — район взаимодействия с матриксом

NC (англ. negative cofactor) — негативный кофактор

NR (англ. nuclear receptor) — ядерный рецептор

ORF (англ. open reading frame) - открытая рамка считывания (ОРС)

PC (англ. positive cofactor) - позитивный кофактор

PIC (англ. preinitiation complex) - преинициаторный комплекс

PolII (англ. RNA polymerase II) - РНК-полимераза II

RT (англ. reverse transcriptase) - обратная транскриптаза

SINE (англ. short interspersed nuclear element) - короткий диспергированный элемент

TAF (англ. transcription activation factor) - фактор активации транскрипции TCR (англ. transcription control region) - район контроля транскрипции TIR (от англ. tandem inverted repeat) - тандемные инвертированные повторы USA (англ. universal stimulatory activity) - универсальная стимуляторная активность

UTR (англ. untranslated region) - нетранслируемый район

UAS (англ. upstream activation sequence) - вышележащий элемент активации МЭ — мобильный элемент

Обзор литературы

Часть I. Аппарат транскрипции у эукариот Глава 1.1. Транскрипция у эукариот, РНК-полимеразы

Основными ферментами клетки, осуществляющими транскрипцию, являются ДНК-зависимые РНК-полимеразы, которые функционируют при участии многочисленных факторов транскрипции - регуляторных белков, осуществляющих высокоспецифические белок-белковые и белок-нуклеотидные взаимодействия. Взаимодействия факторов транскрипции с регуляторными нуклеотидными последовательностями генов, друг с другом и с молекулами РНК-полимеразы необходимы для правильного узнавания транскрипционным комплексом регуляторных последовательностей в составе генов и приводят к повышению или понижению уровня транскрипции соответствующих последовательностей как ответ клеток на внешние или внутренние регуляторные сигналы. Благодаря факторам транскрипции и регуляторным сигналам становится возможным специфический синтез РНК и осуществляется регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции.

В процессе развития гены «включаются» и «выключаются» в последовательности, определяемой внутренними и внешними сигналами, что в конечном итоге дает набор клеток различной специфичности. Данная программа развития осуществляется набором факторов транскрипции (активаторов и репрессоров), связывающихся с определенными регуляторными сайтами ДНК и запускающими или, подавляющими транскрипцию определенных генов. В указанном способе используется комбинационный контроль — регуляция каждого гена осуществляется не одним фактором транскрипции, а комбинацией убиквитарных и тканеспецифичных факторов [1].

ДНК эукариот упакована в хроматин. Считается, что хроматин в норме блокирует транскрипцию генов, т.к. ограничивает доступ транскрипционных факторов к ДНК. Существуют механизмы, открывающие матрицу ДНК для доступа факторов транскрипции.

Основной этап в процессе активации транскрипции с определенного гена -связывание с его промотором молекулы РНК-полимеразы и ее вспомогательных факторов — общих факторов транскрипции. Обычно промотор в составе матрицы хроматина не связан с факторами транскрипции. Однако, например, на промоторах генов теплового шока у дрозофилы собираются комплексы общих факторов транскрипции и РНК-полимеразы, осуществляющих транскрипцию только при наличии определенных регуляторных белков [2].

Каждый ген обычно имеет набор областей регуляции транскрипции — участков ДНК, с которыми связываются активаторы и репрессоры транскрипции. Активаторы связывают общие факторы транскрипции и молекулы полимеразы для запуска сборки инициаторного комплекса. Взаимодействие между многочисленными активаторами, репрессорами и общими факторами транскрипции осуществляется группой факторов, названных корегуляторами.

Для активации гена необходимо осуществить ремоделинг хроматина. Для этой цели в ядре имеется большой набор комплексов, которые можно отнести к двум классам: АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы и ацетилазы/деацетилазы гистонов.

Активаторы, обычно кооперативным образом, связываются с областями контроля транскрипции. Этот комплекс белков, в свою очередь, запускает сборку преинициаторного комплекса на промоторе гена и, в конечном итоге, — транскрипцию.

РНК-полимеразы бактерий и эукариот представляют собой достаточно сложные многосубъединичные белковые комплексы. Подобная сложность отражает способность осуществлять обширную программу реализации генетической информации, взаимодействовать со многими факторами транскрипции и реагировать на многочисленные сигналы регуляции.

Особенностью эукариот является специализация молекул РНК-полимераз, необходимых для транскрипции различных наборов генов. В ядрах всех эукариотических клеток обнаружены три специализированные формы РНК-полимераз. РНК-полимераза I осуществляет транскрипцию генов рибосомных РНК, синтезируя в ядрышках предшественников 18S, 28S и 5,8S рРНК. РНК-полимераза III транскрибирует гены транспортных РНК, 5S и малых ядерных РНК. РНК-полимераза II транскрибирует гены, кодирующие оставшиеся малые ядерные РНК и гены, кодирующие белки. Эти три формы полимераз могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии. Также они отличаются по чувствительности к пептиду а-амантину: полимераза I нечувствительна, полимераза II очень чувствительна, полимераза III обладает промежуточной чувствительностью.

Все три полимеразы сходны по структуре и представляют собой многосубъединичные белковые комплексы, состоящие из двух больших (120-220 кДа) и 10-14 малых (10-100 кДа) субъединиц [3, 4].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Марданов, Павел Владимирович

Выводы

0. Обнаружен и клонирован ген е(у)2Р, являющийся паралогом гена е(у)2 у D. melanogaster,

0. Установлена экзон-интронная структура гена е(у)2Р D. melanogaster, а также гомологов е(у)2 у Н. sapiens, М. musculus, R. norvegicus, D. pseudoobscura, S. cerevisiae, A. gambiae; I 0. Показано, что ген e(y)2 является ретрокопией гена е(у)2Р. На основе филогенетического анализа показано, что ретропозиция е(у)2Р произошла не ранее, чем 46 млн. лет назад;

0. Определено, что в то время как ген е(у)2 обладает повсеместной экспрессией, ген е(у)2Р транскрибируется в апикальной части тестисов самцов D. melanogaster, в зоне в которой происходит переход от митотической программы клеточного цикла к мейотической;

0. Получены линии мух, в которых кДНК генов е(у)2Р и е(у)2 находятся под контролем промотора гена Su(Hw). На основании генетических (jj^. скрещиваний этих трансгенных линий с линией мух e(y)2uI, продемонстрировано, что белок Е(у)2Р функционально не заменяет Е(у)2;

0. Показано существование сильного убиквитарного промотора в регуляторной области гена е(у)2 и предложен механизм объясняющий, как ретрокопия заместила исходный ген. 1

Благодарности

Автор выражает сердечную благодарность коллегам, без помощи которых данная работа не смогла бы появиться на свет. Среди них особо хочется отметить Набирочкину Елену, Краснова Алексея, Копанцеву Марину и Копытову Дарью за плодотворную совместную работу, а также Николенко Юлию, Шидловского Юлия, Куршакову Марию, Лебедеву Любовь, Федорову Ольгу. Тиллиба Сергея, Павла Георгиева за помощь в работе, ценные советы и обсуждение результатов. Неоценимым в работе было мудрое, опытное руководство Софии Георгиевой и Алексея Краснова. Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам данной работы. Хочется поблагодарить также Екатерину Грищук, Фазли Атуаллаханова за привитый автору подход в интерпретации получаемых результатов; Ольгу Федянину, Дмитрия Вагина и Нину Карташеву за веру в благополучное завершение данной работы; родителей и Иванову Лилию за материальную и душевную помощь. А также всех, кто проявил интерес к данной работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марданов, Павел Владимирович, Москва

1. Carey, М., Smale, S.T. (2000) Transcriptional regulation in eucaryotes. CSHL Press.ipolymerase recruitment, modification, and movement on dhsp70 in vivo in the minutes following heat shock. Mol Cell Biol 23, 7628-7637.

2. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P.,

3. Zipursky, L., and Darnell, J. (2003) Mol Cell Biol W.H.Freeman & Co.

4. Патрушев, Л.И. (2000) Экспрессия генов. Москва.

5. Shen, W.C., Bhaumik, S.R., Causton, H.C., Simon, I., Zhu, X., Jennings, E.G.,

6. Wang, Т.Н., Young, R.A., Green, M.R. (2003) Systematic analysis of essential yeast TAFs in genome-wide transcription and preinitiation complex assembly. EMBOJ22, 3395-3402.

7. Cosma, M.P. (2002) Ordered recruitment: gene-specific mechanism oftranscription activation. Mol Cell 10,227-236.

8. Lemon, В., Tjian, R. (2000) Orchestrated response: a symphony of transcriptionfactors for gene control. Genes Dev 14,2551-2569.

9. Smale, S.T., Kadonaga, J.T. (2003) The RNA polymerase II core promoter.

10. Annu Rev Biochem 72,449-479.

11. Verrijzer, C.P., Chen, J.L., Yokomori, K., Tjian, R. (1995) Binding of TAFs tocore elements directs promoter selectivity by RNA polymerase II. Cell 81 , 1115-1125.

12. Ohler, U., Liao, G.C., Niemann, H,, Rubin, G.M. (2002) Computational analysisof core promoters in the Drosophila genome. Genome Biol 3, RESEARCH0087.

13. Green, M.R. (2000) TBP-associated factors (TAFIIs): multiple, selectivetranscriptional mediators in common complexes. Trends Biochem Sci 25, 5963.

14. Cang, Y., Prelich, G. (2002) Direct stimulation of transcription by negativecofactor 2 (NC2) through TATA-binding protein (TBP). Proc Natl Acad Sci 99, 12727-12732.

15. Martinez, E., Ge, H., Tao, Y., Yuan, C.X., Palhan, V., Roeder, R.G. (1998)

16. Novel cofactors and TFIIA mediate functional core promoter selectivity by the human TAFII150-containing TFIID complex. Mol Cell Biol 18, 6571-6583.

17. Burke, T.W., Kadonaga, J.T. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserveddownstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deflcient promoters. Genes Dev 10, 711 -724.

18. Emami, K.H., Jain, A., Smale, S.T. (1997) Mechanism of synergy between

19. TATA and initiator: synergistic binding of TFIID following a putative TFILA-induced isomerization. Genes Dev 11,3007-3019.

20. George, C.P., Lira-DeVito, L.M., Wampler, S.L., Kadonaga, J.T. (1995) Aspectrum of mechanisms for the assembly of the RNA polymerase II transcription preinitiation complex. Mol Cell Biol 15, 1049-1059.

21. Levine, M., Tjian, R. (2003) Transcription regulation and animal diversity.1. Nature 424,147-151.

22. Kadonaga, J.T. (2004) Regulation of RNA polymerase II transcription bysequence-specific DNA binding factors. Cell 116,247-257.

23. Oki, M., Valenzuela, L., Chiba, Т., Ito, Т., Kamakaka, R.T. (2004) Barrierproteins remodel and modify chromatin to restrict silenced domains. Mol Cell Biol 24, 1956-1967.

24. Nikolov, D.B., Burley, S.K. (1997) RNA polymerase II transcription initiation: astructural view. Proc Natl Acad Sci 94, 15-22.

25. Featherstone, M. (2002) Coactivators in transcription initiation: here are yourorders. Curr Opin Genet Dev 12,149-155.

26. Tupler, R., Perini, G., Green, M.R. (2001) Expressing the human genome .1. Nature 409, 832-823.

27. Rekdal, С., Sjottem, E., Johansen, T. (2000) The nuclear factor SPBP containsdifferent functional domains and stimulates the activity of various transcriptional activators. J Biol Chem 275, 40288-40300.

28. Veenstra, G.J., Wolffe, A.P. (2001) Gene-selective developmental roles ofgeneral transcription factors. Trends Biochem Sci 26, 665-671.

29. Dasgupta, A., Darst, R.P., Martin, K.J., Afshari, C.A., Auble, D.T. (2002) Motlactivates and represses transcription by direct, ATPase-dependent mechanisms . Proc Natl Acad Sci 99, 2666-2671.

30. Sudarsanam, P., Iyer, V.R., Brown, P.O., Winston, F. (2000) Whole-genomeexpression analysis of snf/swi mutants of Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci 91,3364-3369.

31. Orphanides, G., Lagrange, Т., Reinberg, D. (1996) The general transcriptionfactors of RNA polymerase II. Genes Dev 10, 2657-2683.

32. Roeder, R.G. (1996) The role of general initiation factors in transcription by

33. RNA polymerase II. Trends Biochem Sci 21, 327-335.

34. Aoyagi, N., Wassarman, D.A. (2000) Genes encoding Drosophila melanogaster

35. RNA polymerase II general transcription factors: diversity in TFIIA and TFIID components contributes to gene-specific transcriptional regulation. J Cell Biol 150, F45-50.

36. Pugh, B.F. (2000) Control of gene expression through regulation of the TATAbinding protein. Gene 255, 1-14.

37. Muller, F., Tora, L. (2004) The multicoloured world of promoter recognitioncomplexes. EMBO J23, 2-8.

38. Svejstrup, J.Q., Vichi, P., Egly, J.M. (1996) The multiple roles oftranscription/repair factor TFIIH. Trends Biochem Sci 21, 346-350.

39. Zurita, M., Merino, C. (2003) The transcriptional complexity of the TFIIHcomplex. Trends Genet 19, 578-584.

40. Naar, A.M., Lemon, B.D., Tjian, R. (2001) Transcriptional coactivatorcomplexes. Annu Rev Biochem 70, 475-501.

41. Bushmeyer, S., Park, K., Atchison, M.L. (1995) Characterization of functional.domains within the multifunctional transcription factor, YY1. J Biol Chetn 270, 30213-30220.

42. Majello, В., De Luca, P., Lania, L. (1997) Sp3 is a bifunctional transcriptionregulator with modular independent activation and repression domains. J Biol Chem 272, 4021-4026.

43. Sauer, F., Fondell, J.D., Ohkuma, Y., Roeder, R.G., Jackie, H. (1995) Control oftranscription by Kruppel through interactions with TFIIB and TFIIE beta. Nature 375, 162-164.

44. Babb, R., Cleary, M.A., Herr, W. (1997) OCA-B is a functional analog of VP 16but targets a separate surface of the Oct-1 POU domain. Mol Cell Biol 17, 7295-7305.

45. Pugh, B.F., Tjian, R. (1990) Mechanism of transcriptional activation by Spl:evidence for coactivators. Cell 61, 1187-1197.

46. Dikstein, R., Zhou, S., Tjian, R. (1996) Human TAFII 105 is a cell type-specific

47. TFIID subunit related to hTAFII130. Cell 87, 137-146.

48. Luo, Y., Ge, H., Stevens, S., Xiao, H., Roeder, R.G. (1998) Coactivation by

49. OCA-B: definition of critical regions and synergism with general cofactors. Mol Cell Biol 18, 3803-3810.

50. Chen, B.S., Hampsey, M. (2002) Transcription activation: unveiling the essentialnature of TFIID. CurrBiol 12, R620-622.

51. Wassarman, D.A., Aoyagi, N., Pile, L.A., Schlag, E.M. (2000) TAF250 isrequired for multiple developmental events in Drosophila. Proc Natl Acad Sci 97, 1154-1159.

52. Nakatani, Y., Bagby, S., Ikura, M. (1996) The histone folds in transcriptionfactor TFIID. J Biol Chem 271, 6575-6578.

53. Kaiser, K., Meisterernst, M. (1996) The human general co-factors. Trends1. Biochem Sci 21, 342-345.

54. Maldonado, E., Hampsey, M., Reinberg, D. (1999) Repression: targeting theheart of the matter. Cell 99,455-458.

55. Kim, Т.К., Zhao, Y., Ge, H., Bernstein, R., Roeder, R.G. (1995) TATA-bindingprotein residues implicated in a functional interplay between negative cofactor NC2 (Drl) and general factors TFILA and TFIIB. J Biol Chem 270, 10976-V 10981.

56. Anderson, M.G., Scoggin, K.E., Simbulan-Rosenthal, C.M., Steadman, J.A.2000) Identification of poly(ADP-ribose) polymerase as a transcriptional coactivator of the human T-cell leukemia virus type 1 Tax protein. J Virol 74, 2169-2177.

57. Kretzschmar, M., Meisterernst, M., Roeder, R.G. (1993) Identification of human

58. DNA topoisomerase I as a cofactor for activator-dependent transcription by RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci 90, 11508-11512.П

59. Halle, J.P., Stelzer, G., Goppelt, A., Meisterernst, M. (1995) Activation oftranscription by recombinant upstream stimulatory factor 1 is mediated by a novel positive cofactor. J Biol Chem 270, 21307-21311.

60. Ge, H., Roeder, R.G. (1994) Purification, cloning, and characterization of ahuman coactivator, PC4, that mediates transcriptional activation of class II genes. Cell 78, 513-523.

61. Chiang, C.M., Ge, H., Wang, Z., Hoffmann, A., Roeder, R.G. (1993) Unique

62. TATA-binding protein-containing complexes and cofactors involved in transcription by RNA polymerases II and III. EMBO J12, 2749-2762.

63. Malik, S., Gu, W., Wu, W., Qin, J., Roeder, R.G. (2000) The USA-derivedtranscriptional coactivator PC2 is a submodule of TRAP/SMCC and acts synergistically with other PCs. Mol Cell 5, 753-760.

64. Hengartner, C.J., Thompson, C.M., Zhang, J., Chao, D.M., Liao, S.M., Koleske,

65. A.J., Okamura, S., Young, R.A. (1995) Association of an activator with an RNA polymerase II holoenzyme. Genes Dev 9, 897-910.

66. Lewis, В.A., Reinberg, D. (2003) The mediator coactivator complex: functional and physical roles in transcriptional regulation. J Cell Sci 116, 3667-3675.1. J.

67. Borggrefe, Т., Davis, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Komberg, R.D. (2002) A complex of the Srb8, -9, -10, and -11 transcriptional regulatory proteins from yeast. J Biol Chem 277, 44202-44207.

68. Myers, L.C., Gustafsson, C.M., Bushnell, D.A., Lui, M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Komberg, R.D. (1998) The Med proteins of yeast and their function through the RNA polymerase II carboxy-terminal domain. Genes Dev 12, 45-54.

69. Taatjes, D.J., Naar, A.M., Andel, F. 3rd, Nogales, E., Tjian, R. (2002) Structure, function, and activator-induced conformations of the CRSP coactivator. Science 295, 1058-1062.

70. Boube, M., Faucher, C., Joulia, L., Cribbs, D.L., Bourbon, H.M. (2000)

71. Drosophila homologs of transcriptional mediator complex subunits are required for adult cell and segment identity specification. Genes Dev 14, 2906-2917.

72. Gu, J.Y., Park, J.M., Song, E.J., Mizuguchi, G., Yoon, J.H., Kim-Ha, J., Lee,

73. K.J., Kim, Y.J. (2002) Novel Mediator proteins of the small Mediator complex in Drosophila SL2 cells. J Biol Chem 277,27154-27161.

74. Asturias, F.J., Jiang, Y.W., Myers, L.C., Gustafsson, C.M., Komberg, R.D.1999) Conserved stmctures of mediator and RNA polymerase II holoenzyme. Science 283, 985-987.

75. Baek, H.J., Malik, S., Qin, J., Roeder, R.G. (2002) Requirement of

76. TRAP/mediator for both activator-independent and activator-dependent transcription in conjunction with TFITO-associated TAF(II)s. Mol Cell Biol 22, 2842-2852.

77. Gustafsson, C.M., Samuelsson, T. (2001) Mediator—a universal complex intranscriptional regulation. Mol Microbiol 41, 1-8.65