Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения гормонального баланса как один из путей регуляции покоя и устойчивости клубней картофеля

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменения гормонального баланса как один из путей регуляции покоя и устойчивости клубней картофеля"

Академия наук СССР Ордена Ленина Институт биохимии им. А. Н. Баха

На правах рукописи УДК 5/7.175.1+581.143.28

ВЕРУЛИДЗЕ ГУЛНАРА РЕЗОЕВНА

ИЗМЕНЕНИЕ ГОРМОНАЛЬНОГО БАЛАНСА КАК ОДИН ИЗ ПУТЕЙ РЕГУЛЯЦИИ ПОКОЯ И УСТОЙЧИВОСТИ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

03.00.04 — Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1988

Работа ¡выполнена в лаборатории иммунитета растений Института биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Научный руководитель — доктор биологических наук Н. П. Кораблева.

Официальные оппоненты: доктор "биологических наук В. И. Кефели; доктор биологических наук Н. В. Карапетян.

Ведущая организация — Главный ботанический /сад АН СССР.

Защита диссертации состоится

/глО * '

1988 г. в /V таеов на заседании 'специализированного совета ()К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Бах/а АН СССР (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Мо-•сква, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан

1988 г.

Ученый секретарь спецсовета доктор биологических наук

М. И. МОЛЧАНОВ

. О ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Зтдел Актуальность проблемы. Среди многочисленных проблем, связан-изучением роста и развития растений, весьма важным является познание механизмов регуляции покоя запасаицих органов расте-'ний. Исследования в этой области представляют общебиологический ' интерес и служат теоретической основой для решения ряда практических задач. Одной из таких задач является предупреждение прорастания клубней картофеля для сокращения потерь при длительном хранении. Ранее было показано, что глубокий покой и переход к росту в клубнях картофеля регулируются системой фитогормонов и что особенно важная роль в индукции и поддержании покоя принадлежит абсцизовой кислоте. Шло также установлено, что во время глубокого покоя клубни обладают более -высокой устойчивостью к болезням. На основании этих исследований было сформулировано положение о том, что изменение баланса фитогормонов и, в первую очередь, содержания абсцизовой кислоты в тканях клубней позволит управлять функциями не только покоя, но и устойчивости к фитопатогеннш микроорганизмам.

К числу способов, с помощью которых можно изменить содержание абсцизовой кислоты в тканях клубней относится обогащение их фитогормоном-этиленом. Удобной формой введения этилена в растения является обработка донорами этилена, например, 2-хлорэтил-фосфоновой кислотой или ее производными. При постановке такого рода опытов можно было рассчитывать также получить новую информацию о роли этилена и его непосредственного предшественника в растительных тканях - 1-ашноциююпропан-1-карбоновой кислоты в регуляции покоя клубней картофеля и их устойчивости к неблагоприятным факторам.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании гормонального баланса в тканях клубней картофеля при переходе от глубокого покоя к росту и возможности его использования дая управления функциями покоя и устойчивости,

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать удобную модельную систему для изучения взаимодействия фитогормонов.

2. Найти пути изменения гормонального баланса в тканях клубней картофеля,

3. Изучить изменение содержания абсцизовой кислоты, X-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты и интенсивность вдделв-

ния этилена в процессе формирования клуйней и при их хранении.

4. Исследовать некоторые особенности биосинтеза этилена из эндогенного предшественника 1-ашноциклопропан-1-карбоновой кислоты.

5. Исследовать действие обработки донорами этилена на покой и устойчивость клубней картофеля.

Научная новизна работы. Была показана возможность использования изолированных точек роста клубней картофеля дая исследования гормонального баланса в модельных опытах.

Изучено изменение содержания свободной и связанной форм абсцизовой кислоты в тканях и показано, что основная роль в регуляции покоя клубней принадлежит свободной форме абсцизовой кислоты.

Установлено, что интенсивность выделения этилена тканями клубней картофеля зависит от их физиологического состояния. Впервые в клубнях картофеля обнаружен эндогенный предшественник этилена - 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота и показано, что в ее превращении в этилен участвует ферментативная система, связанная со структурами, осаждающимися центрифугированием при 20 ООО е.

Впервые установлено, что обработка клубней картофеля этиленом приводит к изменению гормонального баланса в тканях: повышению содержания абсцизовой кислоты, 1-аг,шноциклопропан-1-кар-боновой кислоты и интенсивности выделения этилена. Изменение гормонального баланса под действием доноров этилена вызывает удлинение периода глубокого покоя и повышение устойчивости клубней к прорастании и поражению фитопатогенными микроорганизмами.

Практическая ценность работы. На основании проведенных исследований, предложен способ защиты клубней картофеля от прорастания и болезней при хранении. Разработана методика применения доноров этилена для этой цели. В настоящее время предложенный способ проходит производственную проверку в различных регионах страны.

Атюбашя работы. Материалы диссертации докладывались на: конференции "Молодые ботаники Литовской и Белорусской ССР по выполнению продовольственной программа" (Вильнюс, 1985), Международном симпозиуме "Структура, метаболизм и функции коныогЬро-ванных форм фитогормонов" (Гера, ГДР, 1986), Международном сим-

позиуме по регуляторам роста растений (Падаорово, НРБ, 1986), 21-ом и 22-ом научно-координационных совещаниях СЭВ (Варшава, ПНР, 1985; Херцет Нови, СФРЮ, 1986).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура g объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы., Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками и таблицами. Список литературы содержит наименований работ, из них отечественных и зарубежных авторов.

'МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ

Объектом исследования служили клубни картофеля сорта "Янтарный", выращенного на полях опытного хозяйства "Большевик" (Московская обл.), а таете сорта "Раменский", втащенного на полях опытно-производственного хозяйства Научно-исследовательского института картофельного хозяйства Госагропрома РСФСР, урожаев 1984-1986 г.г. После уборки клубни хранили при температуре 4°С.

Препараты. 2-хлорэтилфосфоновая кислота (ХЭФК) отечественного производства, содержащая 50% действуйтего вещества; кампо-зан производства ГДР, содержащий 34$ действующего вещества;гид-рел (бис-кислая 2-хлорэтилфосфоновокислая соль гидразиния), содержащий 50% действующего вещества. Абсцизовая кислота (АБК) -"Sigma", США; гибберелловая кислота (Ш) - "Sigma", США; 1-аш-ноцшигопропан-1-карбоновая кислота (АЦК) - "Sigma", США; в г-индолилуксусная киблота (ИУК) - "Serva", ШРГ.

Для изучения действия доноров этилена на покой и устойчивость картофеля проводили обработку клубней сорта "Янтарный" осенью (период глубокого покоя) путем опрыскивания водными растворами препаратов в концентрации 0,5$ (по действующему веществу) перед закладкой на хранение. После обработки клубни просушивали и хранили при температуре 4°С в течение 6-8 мес.

Обработку донорами этилена вегетируыцих растений картофеля сорта "Раменский" проводили в полевых условиях опытно-производ-

ственного хозяйства Научно-исследовательского института картофельного хозяйства. Обработку проводили за 2 недели до уборки урожая водными растворами доноров этилена в концентрации 0,2$ (по действующему веществу).

В опытах использовали супер-суперэлитный картофель, оздоровленный методом верхушечной меристемы. Учет количества проросших и загнивших клубней в течение хранения проводили в соответствии с методикой исследований по культуре картофеля (1964).

Определение содержания АБК в тканях клубней картофеля проводили по модифицированному Кораблева и др. (1980) методу МИЪогго* (1967, 1970). Навеску тканей точек роста (5г) или когуры (50г) гомогенизировали и триады экстрагировали 80$-ным этанолом при встряхивании. Гомогенат отжимали через капроновую ткань и фильтровали через двойной бумажный фильтр. Этанол отгоняли под вакуумом. Оставшийся водный экстракт подкисляли 1н Н^с^ до рН 3,0 и экстрагировали диэтиловым эфиром. С целью очистки АБК переводили в натриевув соль, промывая насыщенным раствором бикарбоната натрия и удаляли примеси экстракцией диэтиловым эфиром. Затем отделенную водную фазу вновь подкисляли Хн н^с^ до рН 3,0 и экстрагировали АБК диэтиловым эфиром. Эфирный экстракт досуха упаривали под вакуумом. Сухой остаток, содержащий АБК, обрабатывали ди-азометаяом для получения ее метилированного производного. Упаренный досуха метилированный остаток растворяли в 0,5-1 мл изо-пропанола. Раствор метилового эфира АБК в изопропаноле (5 мкл) вводили в колонку газового хроматографа Цвет-102 (СССР) с пламенно-ионизационным детектором. Для анализа использовали колонку из нержавелцей стали (3000 х 3 мм), заполненную хроматоном к-ак? ДЛХС (размер зерен 0,125-0,16, "сЬвшаро1", ЧССР). Теглпература колонки 1ЭДЯ, температура испарителя 225°. Скорость тока азота 30 мл/мин. Количество АБК в пробе определяли с помощью калибровочного графика.

Связанную форму АБК определяли после подщелачивания водного раствора раствором ыон и проводили гидролиз в течение

30 мин при Ш°С на водяной бане. Охлажденный гидролизат подкисляли 1н я^о^ДО рН 3,0 и АБК извлекали диэтиловым эфиром, как описада выше.

Интенсивность выделения этилена клубнями картофеля определяли методом газовой хроматографии (Ракитин, 1973; Ракитин, Ра-китин, 1986; Ward et al,, 1978). Среднюю пробу контрольных и обработанных донорами этилена клубней определенного веса и объема помещали в эксикаторы, снабженные газоотводной трубкой с наконечником. Эксикаторы с клубнями герметично закрывали и после определенного срока инкубации с помощью шприца отбирали пробы газа и анализировали на газовом хроматографе Хром-5 (ЧССР) с пламенно-ионизационным детектором. Для анализа использовали колонку из нержавеющей стали (3000 х2 мм), заполненную поралаком-и (США). Температура колонки 75°. Скорость тока гелия 23 ш/мин. ■ Количественное определение этилена проводили с помощью калибровочного графика.

Определение содержания АЦК в тканях клубней картофеля проводили по методу Lizada и Yang (1979). Навеску изолированных точек роста замораживали в жидком азоте и разрушали в фарфоровой ступке, экстрагировали 5/2-ной сульфосалициловой кислотой 30 глин при комнатной температуре, фильтровали на воронке Бюхнера. Аликвоту экстракта наносили на колонку, заполненную катионообменной смолой Дауэкс 50 w х 2 (200-400.меш) в Н+ форме. Колонку промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции, затем элщровали 25 мл 2н МН^ОН. Элюат упаривали досуха под вакуумом при 30°С, остаток растворяли в I га 40^-ного этанола. Реакцию проводили в герметичных флаконах, закрывавшихся резиновыми пробками, закрепленными с помощью винтовых зажимов. 0 содержании АЦК в пробе судили по количеству этилена, образующегося при обработке гипохло-ритом натрия.

Для изучения действия природных и химических регуляторов роста на содержание эндогенных АБК, АЦК и интенсивность образования этилена из клубней изолировали апикальные точки роста и инкубировали их в присутствии АБК, ИУК, АЦК, ГК или гидрела в течение 1-6 часов в среде, содеряащей 0,01 LI фосфатный буфер, 0,25 М сахарозу и антибиотики-пенициллин со стрептомицином. После инкубации точки роста промывали дистиллированной водой, подсушивали на фильтровальной бумаге и проводили определение образования этилена, содержания АБК и'АЦК, как описано выше.

Для определения внутриклеточной локализации этиленобразую-щей системы из паренхимных тканей клубней картофеля выделяли

плазмалемму по методу, разработанному Кораблевой и др. (1980). На АЦК-зависимое образование этилена проверяли все фракции,получаемые по ходу ввделения. Фракции инкубировали с АЦК в герметически закрытых флаконах и затем с помощью шпрпца отбирали пробу газа и определяли этилен, как описало выше. Содержание белка в субклеточных фракциях определяли по методу Shaffner и Vieisa-mann (1973).

Устойчивость клубней картофеля. обработанных донорами этилена, к фптопатогешшм микроорганизмам изучали, используя искусственное заражение Phytophthora infeatans Mont de Вагу - возбудителем фитофтороза. Клубни подвергали искусственному заражению зооспорами 1риба, выращенного на агаризованной овсяной среде,в разные сроки после обработки препаратами и хранения при темпера-ауре 4°С. Поверхность клубней стерилизовали этанолом, стерильным скальпелем делали надрез в области апикальных точек роста и вносили в надрез 0,1 мл суспензии зооспор гриба P.Infeatans, раса 1,3 (совместимая). Клубни помещали во влажную камеру при температуре 20° и через 2-3-6 дней оценивали степень поражения по весу побуревшей ткани.

Содержание йттоалексинов в тканях клубней картофеля определяли методом "капельных диффузатов" (Озерецковская и др., 1975) и модифицированным методом газокпдкостнон хроматографии (Henfling et al., 1978; Озерецковская и др., 1986), рассчитывая на ришитин.

Остаточные количества доноров этилена в тканях клубней картофеля определяли по методу Ыейцер и др. (1978), основанному на определении количества ХЗФК с помощью газожидкостной хроматографии. Данный метод утверзден Министерством здравоохранения СССР (№ 1918 от 27.09.78).

Полученные данные обрабатывали методами математической статистики, применяя вероятность безошибочного прогноза в = 0,95 (Пяохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСОВДОВАШЙ И ИХ ОБСУЗдаШ

Действие регуляторов роста на содоряание АБК. АПК и интенсивность выделения этилена в тканях клубней картофеля.

Для изучения влияния природных и химических регуляторов роста на содержание АБК, АЦК и выделение этилена тканями точек роста клубней картофеля проводили инкубацию (3 часа) изолированных

точек роста в присутствии фитогормонов: ГК, ЮТ, АБК, АЦК, а также химического регулятора роста - гидрела. Результаты опытов представлены на рис.1.

В тканях точек роста контрольных клубней содержание АШ наиболее высоко во время глубокого покоя, уменьшается при его окончании и особенно, при прорастании (рис.1,А). При инкубации точек роста с ГК заметно снижается содержание АШ в тканях во время глубокого покоя и в меньшей степени - при прорастании клубней.

Полученные данные показывают, что способность ГК прерывать период глубокого покоя может быть связала не только со стимуляцией синтеза белка и РНК, но и с тем, что она с шикает содержание в тканях основного ингибитора роста, индуцирующего и поддерживающего состояние глубокого покоя клубней - АБК.

В тканях точек роста под действием ГК уменьшается содержание не только АБК, но и эндогенного предшественника этилена - АЦК, а также снижается способность тканей выделять этилен (рис.1,В). Содержание АЦК в тканях точек роста клубней картофеля повышается при переходе от покоя к росту. Обработка ГК заметно снижает содержание АЦК в тканях по сравнению с контролем, особенно сильно при окончании глубокого покоя и при прорастают (рисЛ,Б).

XII II IV VI III II IV VI XII II IV 1 Дата проведения определений,месяцы(декабрь-июль) Рис Л. Изменение содержания АБК(А), АВД(Б) и интенсивности выделения этилена(В) в тканях точек роста, изолированных из клубней картофеля и обработанных ШЮ М) и ИУК (10~7М). I - контроль; 2 - ГК; 3 - ИУК.

- 8 - ___

OópáóÓTKa ГК снижает также интенсивность наделения этилена точками роста,оказывая наиболее сильное действие при прорастании клубней.В контроле интенсивность веделения этилена точками роста по мере окончания глубокого покоя медленно возрастает и заметно увеличивается при активном прорастании.В тканях точек роста, обработанных ГК, интенсивность вьщеления этилена увеличивается при переходе от покоя к прорастанию очень незначительно (рисЛ,В).

Таким образом, ГК понижает в тканях точек роста клубней картофеля содержание АБК, АЦК и интенсивность выделения этилена. Можно предположить, что уменьшение ввделения этилена точками роста под действием ГК обусловлено снижением содержания его эндоген-. ного предшественника - АЦК. Не исключено также, что ГК влияет на активность этиленобразутацей системы, разлагающей АЦК с образованием этилена. По-видимому, действие ГК в покоящихся клубнях, сопровождающееся прорыванием глубокого покоя, связано, главным образом, с понижением в тканях содержания AHÍ. Стшлулирушцее действие ГК на прорастание клубней может быть обусловлено изменениями в содержании не только АБК, но и в содержании АЦК и интенсивности образования этилена.

На рисЛ представлены данные об изменении содержания АБК,АЦК и интенсивности выделения этилена тканями точек роста, обработанными ИУК. Под действием ПУК содержание АБК в тканях точек роста понижается. Так же, как в случае с ГК, наиболее сильное действие ИУК оказывает на содержание АБК во время глубокого покоя(рис.1 ,А).

Следует отметить, что при обработке точек роста ИУК возрастает их способность ввделять этилен. Можно предположить, что усиление образования этилена точками роста под действием ИУК связано с тем, что ИУК является кофактором фермента - АЦК-синта-зы, участвующего в биосинтезе этилена.

Таким образом, ИУК поникает содержание АБК в точках роста, изменяет содержание АЦК и стимулирует выделение этилена. Возможно, что одной из причин неэффективности применения ПУК с целью прерывания глубокого покоя является ее влияние на образование этилена в тканях клубней. В настоящей работе установлено, что повышенная способность к выделению этилена тканями точек роста <коррелирует о накоплением АБК (в процессе хранения), способствуя тем самым удлинению периода глубокого покоя.

Как наш было показано, экзогенно введенный предшественник биосинтеза этилена - АЦК, так же, как ГК и ИУК, изменяет содер-

держание АБК, ЛЦК и интенсивность выделения этилена точками роста. Под действием АЦК наиболее резко содержание АБК увеличивается при прорастании клубней. Это особенно важно, если учесть,что именно в этот период повышение содержания АБК в тканях может способствовать удлинению периода покоя клубней. Обработка точек роста АЦК вызывает также повышение интенсивности ввделешш этилена, особенно в предшествующий активному прорастанию период.

На рис.2 представлены данные о влиянии АБК и гидрела на содержание АБК, АЦК и интенсивность выделения этилена тканяш точек роста. Под действием экзогенной АБК содержание эндогенного фитогормона возрастает, что обусловливает, по-видимому, ингиби-рующее действие этого фитогормона на прорастание клубней как во время покоя, так и после его окончалия. При обработке тканей АБК содержание АЦК в 1шх падает, а интенсивность выделения этилена возрастает, особенно резко во время глубокого покоя.

Дата проведения определений,месяцы (декабрь-июль) Рис.2. Изменение содержания АБК(А), АЦК(Б) и интенсивности вьщеления этилена(В) в тканях точек роста, изолированных из клубней картофеля и обработанных АБК (Ю~7М) и гидрелом (0,5%). I - контроль; 2 - АБК; 3 - гидрел.

Нами было показано, что при обработке точек роста гидрелом способность тканей к накоплению АБК возрастает, содержание АЦК

снижается и очень сильно в 40-50 раз увеличивается выделение этилена (рис.2). По-видимому, такое сильное увеличение связано как с распадом препарата в тканях, так и с повышением эндогенного содержания этилена.

Таким образом, обработка гидрелом изменяет баланс фитогормо-нов в сторону увеличения содержания ЛВК и этилена. На основании полученных данных было высказано предположение, что,изменяя содержание АБК и этилена, можно регулировать состояние глубокого покоя клубней и их устойчивость к болезням. Доказательства этого предположения были получены при изучении изменения баланса фито-гормонов в тканях клубней в процессе созревания и хранения.

Изменение содержания АВК в тканях клубней картофеля в зависимости от физиологического состояния и гои обработке донорами этилена.

Известно, что АБК присутствует в растениях как в свободной, так и связанной формах и основная связанная форма АБК в тканях клубней - глюкозный эфир (абсцизил-в-в-глюкопаранозид) (миъоггсж, 1970). Содержание обеих форм АБК в тканях зависит от стадии роста и развития растений (Леман, 1981; ЬааЬет et а1,, 1974;1Уй^М, 1975). Поэтому была поставлена задача изучить содержание свободной и связанной форм АБК при обработке донорами этилена вегети-рувдих растений и клубней перед закладкой на хранение.

Результаты проведенных наш опытов показали, что общее содержание АБК (суша свободной и связанной форм) в тканях клубней изменяется при переходе от покоя к росту. Наибольшее количество АБК обнаружено во время глубокого покоя в тканях точек роста. В тканях точек роста АБК содержится в 2 раза больше, чем в кожуре (табл.1).

- Таблица I

Содержание АБК (мкг/г сырой ткани) в различных тканях

клубней картофеля в разном физиологическом состоянии

тнчяпттл-пя ¡Ткани точек роста (мери- !Кожура (перидерма и норовая

шзиолога-||Стема и коровая паренхима).' паренхима)_ _

„ Iобщее со- сво-! £ свя-!общее со- сво- 1% свя-сос^ояние Держание !йотоИ!зашгой ¡держание !йодной 'занной _! АБК ' АБК ! АБК ! АБК . ! АБК ! АБК

Глубокий покой 5,42*0,2 86 14 2,08*0,1 85 15.

Окончание покоя 0,59*0,03 66 34 0,37*0,03 81 19

Прорастание 0,14*0,01 29 71 0,17*0,02 48 52

Обнаружено, что содержание обеих фор!,5 АБК изменяется при переходе от глубокого покоя к росту. На фоне уменьшения абсолютного содержания свободной и связанной форм АБК в тканях точек роста при выходе из покоя отмечено изменение соотношения этих форм. Как в тканях точек роста, так и в кожуре клубней по мере зфанения увеличивается содержание связанной АБК. Вероятно,одним из первых этапов катаболизма свободной формы ABS является ее связывание с углеводными компонентами клетки.

Таким образом, содержание АБК в тканях клубней повышено во время глубокого покоя. При выходе клубней из состояния покоя и переходе к росту содержание связанной формы АБК в клетке возрастает, а свободной - снижается. По-видалому, свободная форма АБК может переходить в связанное состояние и этот процесс важен для регуляции покоя клубней картофеля. В таком случае, обработка клубней донорами этилена в концентрации, задерживающей прорастание .должна была бы привести к изменению содержания АБК и соотношения свободной и связанной форм АБК.

Из полученных нами данных следует, что в тканях клубней, обработанных гидрелом в концентрации 0,5%, повышается содержание АБК. Наибольшее количество АБК обнаруживается в тканях клубней через 30 дней после обработки и затем постепенно снижается. В тканях точек роста необработанных клубней содержание свободной АБК снижается значительно сильнее. Заметное уменьшение начинается через 90 дней после обработки и совпадает с окончанием покоя.

s к

« о

о 7

C-, \ С-,

Ü 5

ё3 х

<а о

1

Ш

Ш

Рис.3. Изменение содержания свободной (Г~1) и связанной (|7ТП) ДБК в тканях точек роста клубней картофеля, обработанных гидрелом в концентрации 0,5%.

1 - контроль;

2 - гидрел.

¿Ш

исх. 30 90 210

Дни после обработки гидрелом

Через 7 месяцев после начала опыта содержание свободной АБК в тканях точек роста контрольных клубней падает с 4,52 до 0,08 мкг/г, составляя лишь 1/10 часть ее содержания в клубнях, обработанных гидрелом.

Содержание связанной АБК повышается в тканях точек роста, обработанных гидрелом клубней, достигая максимума через 90 дней после обработки. Затом наблюдается снижение содержания связанной АБК в тканях обработанных клубней. Через 7 месяцев после обработки уровень связанной АБК в тканях точек роста контрольных клубней падает от 0,88 до 0,1 мкг/г, составляя 1/5 часть ее содержания в тканях обработанных гидрелом клубней.

При переходе от покоя к росту в обработанных гидрелом клубнях изменяется не только содержание, но и соотношение свободной и связанной форм АБК (табл.2). Сравнение количественного соотношения свободной и связанной форм АБК в контрольных и обработанных гидрелом клубнях свидетельствует о том, что в период глубокого покоя (30 дней хранения) баланс свободной и связанной форм АБК в тканях точек роста сдвигается незначительно. На фоне повышения общего содержания АБК обнаружено накопление ее связанной формы по сравнению с контролем (рис.3). Обратная закономерность наблюдается при окончании покоя (90 дней хранения клубней) и прорастании (210 дней хранения).

Отношение свободная/связанная АБК в контрольных и обработанных гидрелом клубнях на разных этапах периода хранения.

Таблица 2

Сорт Янтарный

Ткань ^риант

Дни после обработки гидрелом

опыта

30

90 210

Точки Контроль. роста Гидрел

Кожура

Контроль

6,0*0,2 1,9*0,04 0,4*0,01

4,0*0,3 9,8*0,7 1,9*0,03

6,0*0,3 4,3*0,5 0,92*0,03

9,1*0,6 17,0*1,7 5,6*0,3

Через 90 дней после обработки отношение свободная/связанная форма было несколько выше, а через 7 месяцев - почти в 5 раз выше, чем в контроле.

Таким образом, повышение содержания АБК в тканях точек роста в результате обработки клубней гидрелом в концентрации 0,5$ происходит, в основном, за счет увеличения ее свободной формы, особенно после окончания глубокого покоя. Аналогичные данные получены и для кожуры (табл.2).

На основании этих данных можно сдёлать вывод, что в регуляции покоя основную роль играет свободная форма АБК. Можно предположить, что изменение соотношения между свободной и связанной формат.® АБК является одним из путей быстрой регуляции содержаний -свободной АБК как наиболее активной в биологическом отношении формы. Связывание свободной АБК может служить для запасания АБК или инактивации ее избыточных количеств на различных этапах покоя и роста клубней картофеля. Можно заключить, что связанная форма АБК не монет служить существенным источником повышения свободной формы АБК, как при прохождении периода естественного покоя, так и при удлинении его с помощью донора этилена.

Действие доноров, этилена на прорастание клубней картофеля и их устойчивость к болезням.

В настоящем разделе представлены результаты изучения влияния доноров этилена на прорастание клубней картофеля и их устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам в процессе хранения.

В табл.3 представлены данные а действии гидрела на прорастание клубней картофеля при хранении при разных способах обработки. Поскольку картофель хранился при 4°С, т.е. оптимальной температуре и проросших клубней после семи месяцев хранения не было ни в одном варианте, то клубни всех вариантов помещали на 14 дней в провокационные условия, т.е. благоприятные для их прорастания (тешература 20°С и влажность воздуха до 100$). Полученное данные свидетельствуют о том, что предуборочная обработка растеши': картофеля гидрелом в концентрации 0,2$ и обработка клубней перед закладкой на хралсште гйдрелом в концентрации 0,5$ удлиняет период покоя и предупреждает прорастание клубней.

Как било показано ранее, во время-глубокого покоя клубни обладают большей устойчивости«« фитопатогенным микроорганизмам, поэтому представлялось интересным выяснить, сохраняется ли их устойчивость к болезням при продлении глубокого покоя с помощью доноров этилена.

Таблица 3

Влияние обработки гидрелом на прорастание клубней I -картофеля и на поражаемость их болезнями после 8 месяцев хранения

! Количество ! Количество Вариант' опыта ¡проросших клуб-!пораженных _1_.'ней. % ! клубней. %

о 1 Сорт "Янтарный"

Контроль - вода 9,2 13,4

Гидрел 0,5/о (обработка клубней -¡- е 2 8

перед закладкой на хранение)

Сорт "Раменский"

Контроль - вода 12,5 33,6

Гидрел 0,2$ (обработка вегетирушдих 3 4 4 9

растений за 2 недели до уборки)

В табл.3 представлены данные о поражаемости контрольных и обработанных гидрелом клубней. При обработке клубней перед закладкой на хранение, количество больных клубней уменьшалось почти в 5 раз, а при обработке вегетирующих растений за 2 недели до уборки урожая - в 7 раз.

. Данные о влиянии предуборочной обработки гидрелом на пора-жаемость клубней разными болезнями после 8 месяцев хранения представлены в, табл.4. Обработка гидрелом сильно снижает потери картофеля от болезней при хранении. Особенно сильно снижаются потери от фитофгороза и сухой гнили.

Для выяснения вопроса о действии доноров этилена на устойчивость, клубни обрабатывали ХЭФК в концентрации 0,5% и в разные сроки после обработки проводили искусственное заражение зоо-'спорами совместимой расы P.infestarш. Изменение устойчивости определяли по уменьшению массы побуревшей ткани. Через 3 дня после заражения (рис.4) проявляется разница в устойчивости контрольных и обработанных ХЭФК клубней. Обработанные клубни поражаются в меньшей степени и их способность противостоять болез-

Таблица 4

Влияние предуборочной обработки гидрелом на поражаемость

клубней болезнями через В месяцев хранения.Количество пораненных плубнеи,%•Сорт' Раменскли .

Вариант опыта } Фитофяо-{ роз !. Сухая гниль • ! Парша {обыкновенная •¡Ризок-|тониоз ! Общие } потери

Контроль -вода 4,9 17,3 0 3,8 26,0

Гидрел 0,2$ 0,9 2,8 0 4,6 8,3

ням увеличивается по мере хранения. Через 6 дней после заражения разница в устойчивости контрольных и обработанных донорами этилена клубней становится более четкой.

Ранее было показано, что во время покоя клубни образуют больше фэтоалексинов в ответ на заражение фитопатогенным грибом, чем при окончании покоя и при прорастании (Барская и др., 1978).

На рис.5 представлены данные об образовании фитоалексинов ' в тканях клубней картофеля, обработанных гидрелом ж кашозаном в концентрации 0,5$, в ответ на заражение совместимой расой P.infestens« Содержание образуицихся фитоалексинов в ответ на

Рис.4. Изменение пора-каемости клубней картофеля , обработанных ХЭФК.при искусствен-' ном заражении совместимой расой Р«1п£еа-tana. Инкубирование в течение 3 дней.

1 - контроль;

2 - ХЭФК' 0,5^.

Дни после обработки

заражение грибом определяли в контрольных и обработанных клубнях в течение всего периода хранения картофеля.

Установлено, что клубни, обработанные донорами этилена, обладают большей способностью к образованию фитоалексинов, в ответ на заражение грибом, чем контрольные. По мера хранения клубней, обработанных ищрелом, способность к образованию фитоалек-синов в ответ на заражение увеличивается и в наибольшем количестве ришитин образуется в ответ на заражение через 6 месяцев после обработки: в обработанных гидрелом клубнях ришитина образуется в 3 раза больше, чем в контроле. ,

Таким образом, в тканях,обработанных донорами этилена клубней, повышается способность к образованию фитоалексинов в ответ на заражение. P.infestans. Эта способность сохраняется в точение всего периода хранения. Можно предположить, что одной из причин меньшей поражаемости клубней, обработанных донорами этилена, является способность тканей интенсивно образовывать фитоалексины в ответ на заражение фитопатогеннши ш1фоорганиз!лаш,1_ .

и §24 а ю

со 05 ^

I &16'

р/

о

(О §

&

8-

I

I

/у .•*

ш

XI

I III IV VI

Дата проведения опытов,месяцы(ноябрь-июнь) ГИо.5. Влияние обработки донорами этилена на содержание фитоалексинов в тканях клубней картофеля. Заражение проводили совместимой расой P.infeвtaas.(czZIl) - контроль; (¡223)-Гидрел 0,5%; (БЭ) - кампозан 0,5$.

Таким образом, продлевая период глубокого покоя с помощью доноров этилена, можно удлинить период устойчивости клубней к •¿птопатогенгаш микроорганизмам.

Изучение интенсивности выделения этилена тканями клубней карто(Ъеля.

Поскольку действующим началом доноров этилена является этилен, необходимо било выяснить, как изменяется способность клубней к образованию этого фитогормона. Изучали интенсивность образ овалгая этилена клубнями при обработке, донорами Этилена растений картофеля перед уборкой или клубней перед закладкой на храпение.

Обработка вегетирующих растений картофеля за 2 недели до уборки урожая растворами гидрела и кампозана повышает в 2-2,5 раза выделение этилена по сравнению с контрольными клубнями (рис.6). Максимальное количество этилена выделяется в период до 14-30 дней после обработки. Затем интенсивность.выделения этилена снижается и после 150 дней, оставаясь почти без изменений. Следует отметить, что у контрольных клубней также повышается способность к образованию этилена в течение 14 дней перед уборкой. Некоторое повышение интенсивности образования этилена контрольными клубнями отмечено также через 120 дней от начала опыта, во •

Дни после обработки донорами этилена Рис.6. Изменение выделения этилена клубнями картофеля, обработанным донорат,и этилена в концентрации 0,2%. Сорт "Рамен-ск:!-';". I - контроль; 2 - гидрел; 3 - кампозан.

Определение остаточных количеств доноров этилена показало, что содержание гидрела и кампозана в тканях клубной чорез 25-30

дней после обработки ниже допустимого уровня. С увеличением времени после обработки до 60 и более дней препараты в клубнях полностью распадаются. Однако, интенсивность образования этилена клубнями с обработанных растений остается более высокой, чем в контроле, и спустя 60-120 дней после обработки, т.е. в тот период, когда гидрел и кампозан в клубнях уже не обнаруживаются. В этой связи можно предположить, что экзогенный этилен, образувдийся при разложении доноров этилена, стимулирует синтез эндогенного этилена в клубнях картофеля. Доказательства этому были получены при определении интенсивности образования этилена клубнями картофеля, обработанными гидрелом после уборки (табл.5).

Определения показали, что интенсивность образования этилена изменяется в зависимости от физиологического состояния клубней. Интенсивность образования этилена контрольными клубнями во время глубокого покоя и при его окончании примерно одинаковы, наибольшее количество этилена выделяется после окончания покоя и при прорастании. Под действием гидрела интенсивность выделения этилена увеличивается: установлено, что в образовании этилена наблюдается 2 пика - спустя 2-3 и 30-90 дней после обработки. При этом интенсивность образования этилена на 2-3 день после начала опыта обработанными клубнями была в 100-130 раз больше, чем в контроле. После падения к 14-му дню интенсивность образования этилена клубнями вновь возрастает через 30 дней после хранения. Этот'высокий уровень образования этилена сохранялся длительный период (от 30 до 150 дней). Затем интенсивность выделения этилена постепенно уменьшалась, оставаясь, однако, на более высоком уровне', чем у контрольных клубней.

В этой серии опытов также было установлено, что через 30 • дней после обработки содержание остаточных количеств гидрела падает ниже допустимого уровня (0,15-0,10 мг/кг), а через 60 дней обнаруживаются лишь следы препарата в клубнях. Таким образом, второй максимум в интенсивности образования этилена ■приходится на время, когда в клубнях картофеля уже практически доноры этилена не обнаруживаются. На основании этих данных можно сделать вывод, что обработка экзогенным этиленом вызывает автокаталитическое стимулирование образования эндогенного этилена.

Таблица 5

Изменение интенсивности образования этилена клубнями картофеля при обработке гидрелом (время обработки -октябрь, хранение в опытной холодильной камере при температуре 4°0)'. Сорт "Янтарный" .

Дни после обработки! Интенсивность выделения этилена (нл/г/ч) гидрелом Iконтроль{ гидрел 0,5%

I 0,4 42,6

3 0,7 45,0

6 0,7 10,8

14 0,8 6,2

30 1,0 14,2

60 1.2 18,0

90 1,4- 21,0

120 1.8 17,2

150 2,0 15,8

■ 180 2,3 8.4'

210 2,5 5,0

Изучение содержания АЦК и внутриклеточной локализации эти-ленобразувдей системы.

Непосредственным предшественником этилена в растительных тканях является 1-агягаоциклопропан-1-карбоновая кислота (Adams Yang, 1979). По литературным данным АЦК представляет собой транспортную форму этилена, подобно коньюгатам других фитогормонов, . перемещающимся в тканях растений. Поэтому при изучении гормонального баланса клубней картофеля было необходимо изучить содержание и динамику АЦК в контрольных и обработанных 'донорами этилена тканях клубней картофеля.

Гнло установлено, чао в тканях клубней картофеля присутст-' вует АЦК и ее содержание в тканях точок роста изменяется в зависимости от физиологического состояния клубней. Содержание АЦК повиыеио во время индукции покоя и при прорасталии. Во время вынужденного покоя содержание АЦК в тканях точек роста несколько понижено.

Обработка донорами этилена вызывает увеличение содержания АЦК в тканях точек роста клубней картофеля. Ее содержание сильно увеличивается сразу же после обработки и через 14-20 дней достигает максимума, когда ее содержание в тканях точек роста обработанных клубней в 5 раз выше, чем в контрольных .клубных (рис.7). Через 30 дней содержание АЦК в тканях обработанных клубней начинает уменьшаться и через 60-90 дней минимально, хотя примерно в 2 раза больше, чем в контрольных, необработанных клубнях. К концу хзйнения' содержание АЦК в тканях точек роста обработанных донорами этилена клубней картофеля вновь начинает возрастать.

Заметное увеличение содержания АЦК при обработке донорами этилена можно объяснить двумя причинами. Во-первых, в это время (сразу после обработки) идет очень сильное выделение этилена за счет разложения доноров этилена. Можно предположить, что в это время эндогенная АЦК не расходуется. Во-вторых, есть все основания очитать, что обработка донорами этилена стимулирует образование АЦК и таким образом - автокаталитическое образование эндогенного этилена в тканях клубней картофеля.

Дни после обработки донорами этилена Рис.7. Изменение содержания АЦК в тканях точек роста клубней картофеля, обработанных донорами этилена в концентрации 0,2$. Сорт "Раменсютй". Обработка за 2 недели до уборки. I - контроль; 2 - гидрел; 3 - кампозан. ,

Известно, что ионы кобальта является специфическими ингибиторами образования этилена, подавляя ферментативное превращение АЦК в этилен. Результаты опытов по изучению действия хлористого кобальта на интенсивность образования этилена показали, что обработка в течение 5 часов хлористым кобальтом в концентрации 5,0 мМ на 75% ингабировала образование этилена в тканя£ точек роста клубней картофеля (рис.В). Обработка хлористым кобальтом точек роста, изолированных из обработанных ХЭФК клубней картофеля, также на 70-75$ ингабировала образование этилена тканями. Можно •" сделать вывод, что образование этилена как в контрольных, так и обработанных донорами этилена клубнях картофеля является ферментативным процессом.

- Рис.8. Действие хлористого

кобальта на выделение этиле-" на точками роста изолированными из обработанных ХЭФК • клубней картофеля. I - контроль; 2 - контролы-хлористый кобальт 5 мМ; 3 -ХЭФК 0,5%; 4 - ХЭФК 0,55? +. хлористый кобальт 5 мМ.

2С

I и

Р

аз о

§< а

о и

т1

и К А

Р/4— чэ

о

2

т.

4

0 заключительной стадии образования этилена в тканях растешь - превращении АЦК в этилен известно очень мало. Для определения субклеточной локализации этиленобразутащей системы мы_ исследовали АЦК-зависимое образование этилена разными фракциями, полученными из паренхпмшх тканей клубней картофеля. Из данных табл • 6 следует, что максимальное АЦК-зависимое образование этилена наблюдается в присутствии осадка, полученного центрифугированием при 20 ООО е. Электронномикроскопический контроль показал, что эта фракция содержит митохондрии и их обломки, то-, нопласты и крупные фрагменты плазмалемш.

С использованием осадка 20 000 е мы изучали оптималыше условия образования этилена из АЦК. Оптимальная величина рН для АЦК-зависшлого образования этилена составляла 7,0-7,2, а оптимальная температура была равна 27-33°С. Дальнейшее повышение температуры приводило к снижению интенсивности' образования этилена. Около 45°С АЦК-зависимое образование этилена становится

Таблица 6

Образование этилена из АЦК субклеточными фракциями из ларенхимных тканей клубней картофеля. Сорт "Янтарный"

Фракция

Гомогенат б

Осадок 2 7008 I

рсадок 20 ООО е . 8

Супернатант 80 ООО в О

Осадок 80 ООО е I

Плазмалемма- О

практически равным нулю. Это является еще одним доказательством ферментативного образования этилена из АЦК. Превращение АЦК в этилен происходило только в присутствии субклеточной фракции, осаздапцейся при центрифугировании 20 ООО в. Опыты показали также, что без добавления АЦК этилен не образуется, следовательно , выделяемый этилен не является- продуктом превращения эндогенной АЦК или окисления жирных кислот. При добавлении в инкубационную смесь хлористого кобальта в концентрации 5,0 мМ образование этилена ингибируется на 80$.

Следовательно, можно заключить, что в тканях клубней картофеля -функционирует ферментативная система, разлагающая АЦК до этилена.. Максимальное выделение этилена наблюдалось при использовании фракции, осаздавдейся центрифугированием при 20 ООО е.

Таким образом, проведенные исследования позволили предположить, что один из путей регуляции покоя состоит в изменении .. гормонального баланса, .а именно - в обогащении тканей стимуля-' тором или ингибитором роста для прерывания или удлинения покоя соответственно. Последнее удалось реализовать путем обогащения тканей фитогормоном этиленом.

Было показано, что под действием доноров этилена в тканях повышается содержание абсцизовой кислоты, этилена и его эндогенного предшественника - 1-аминовдклопропан-1-карбоновой кислоты. Изменение гормонального баланса сопровождается удлинением периода покоя и большей устойчивости к болезням. Одной из причин более высокой устойчивости к Заболеваниям является повышение спо- .

! Образование этилена ! пмолъ/ч мг белка

собности тканей обработанных растений к образованию индуцированных защитных соединений. На оснований проведенных исследований предложен способ защиты клубней картофеля от прорастания и болезней при хранении.

. ВЫВОДЫ •

1. Установлено, что чувствительность тканей точек роста клубней картофеля к фитогормонам зависит от физиологического состояния и,используя регуляторы роста (стимулятор или ингибитор)., можно прервать состояние глубокого покоя и стимулировать прорастание или напротив, подавить прорастание и удлинить период глубокого покоя. .

2. Установлено, что ткани клубней картофеля содержат эндогенный предшественник этилена 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту и что ее содержание изменяется в зависимости от физиологического состояния клубней.

3. Показана способность клубней картофеля ввделять этилен.-Интенсивность выделения этилена различна в меристематических и запасающих тканях.

4. В тканях клубней картофеля показано функционирования ферментной системы,образущей этилен из АЦК. Максимальное выделение этилена наблюдалось при использовании фракции, осаждающейся центрифугированием при 20 ООО в.

5. Показано, что в клубнях картофеля содержится свободная

и связанная форма АБК. Изучение содержания й соотношения свободной и связанной форм АБК позволяет сделать вывод, что в регуляции • глубокого покоя принимает участие преимущественно свободная форма АБК.

6. Введение в ткани клубней дополнительных количеств этилена с помощью доноров этилена приводит К изменению гормонального баланса, а именно, к увеличению содержания АБК, АЦК и усилегага • образования этилена.

7. Изменение гормонального баланса под действием доноров этилена приводит к удлинению периода глубокого покоя и повышению устойчивости клубней к прорастанию и поражению фитопатоген-ными микроорганизмами.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Верулидзе Г.Р., Сухова Л.С. - Динамика содержания абсцизовой кислоты, 1-ашноцяклопропан-1-карбоновой кислоты и этилена в

' точках роста клубней картофеля в покое и при прорастании // Тез.докл.конференции "Молодые ботаники Литовской и Белорусской ССР по выполнению продовольственной программы". -■ Вильнюс,-1985,-С.10

2. Сухова Л.С., Верулидзе Г.Р., Кораблева Н.П. - Изучение содер-ж&шя абсцизовой кислоты и этилена при изменении физиологического состояния точек роста клубней картофеля // Регуляция метаболизма первичных и вторичных цродуктов фотосинтеза. Тез.докл. ИКС СЭВ. - Варшава, ПНР,.-1985,т-С.22.

3. Korableva N.P., Sukhova L.8,, Trofimets L.H., Antonova Q.I., Verulidee O.R. » Effect of ethylene donors of the potato tuber dormancy and tuberization // Abst, Intern. Symp. "Regulation of Plant Integrity", Brno, СzechoelovaltlB,-1985,-P.3Î.

4. Верулидзе Г.Р., Сухова Л.С., Королева Н.П. - Влияние фито- • гормонов на выделение- этилена изолированными точками роста клубней картофеля в разном физиологическом состоянии // Тез. докл. 22 НКС и симпозиума по теме СЗВ I9.02K. - Херцет Нови, СФРЮ, 15-21 сентября, -I986.-C.3.

5. Sukhova L.S., Verulidze G.R.- Effecte of abecisic aoid on the ethylene evolution by the isolated growth pointa of potato tubers // Abet«Intern. Symp. Plant Qroiwth Regulators. - Pamporovo, Bulgaria,-1986,-Pi 48

6. Sukhova L.S., VerulidZê S»R., Korableva Ы.Р, - Funotion of abBcisto aoid conjugated in the regulation of dormancy of potato'// Abstr.Intern.Symp. "Conjugated Plant Hormones Structure, Metabolism and Function" - Gera, 0Ш,И93б,-Р,40.

«"ft*