Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследования по молекулярной филогенетике растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Троицкий, Алексей Викторович, Москва

0

/Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

^ /е> ^ - ЫА

№ правах рукописи УДК 77.123:582.893

Троицкий Алексей Викторович

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ ФИЛОГЕНЕТИКЕ РАСТЕНИЙ: ОТ ВНУТРИВИДОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА ДО МАКРОСИСТЕМАТИКИ.

03.00.03 - молекулярная биололгия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва-1999

Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии им.А. Н. Белозерского МГУ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Б.Ф.Ванюшин

доктор биологических наук, действительный член РАЕН,

профессор Г ОСУ ДА р^-^р- *'. ^^(-'КВ0РЦ0В

доктор медицинских наукБИБЛИОТЕКА

член-корр. РАН, действительный ¿-л 1 \ •-/ ,) £) ( \

член РАЕН, профессор '- I ' А» ' ^ 1 ^ Л.И.Корочкин

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится «25» мая 1999 г. в П) часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.70 при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ ФХБ им.А.Н.Белозерского.

С диссертацией можно ознакои . алогического факультета

МГУ

Диссертация разослана «2^» ¿¿^

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук В.Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Актуальность проблемы. Многие известные ученые, указывая на ключевую и определяющую роль теории эволюции и эволюционного подхода в биологии, высказывали мысль, афористически выраженную Т.Добжанским: "nothing in biology makes sense except in the light of evolution" (Dobzhansky 1973). Наука об эволюции (эволюционисти-ка) является интегрирующей частью биологии. Со времен Ламарка она проделала огромный путь, и ее достижения являются базисом развития всех остальных разделов биологии. Филогенетика является составной частью эволюционистики. Ее задачей является реконструкция путей эволюции - генеалогических отношений между живыми организмами, как ныне существующими, так и вымершими за долгий период существования жизни на Земле. Эволюционистика и особенно филогенетика являются в значительной степени историческими науками, поскольку оперируют с уникальными, принципиально не воспроизводимыми фактами и процессами. Поэтому любая филогенетическая схема является лишь менее или более обоснованной филогенетической гипотезой.

Молекулярная эволюционистика и молекулярная филогенетика имеют дело с объектами и процессами, протекающими на уровне информационных макромолекул. Молекулярную эволюцию можно определить как процесс изменения генетических текстов (генотипов) и их физических носителей - информационных макромолекул (ДНК, РНК и белков) в ходе биологической эволюции. Более широкое определение молекулярной эволюции включает эволюцию путей и механизмов реализации генетической информации, т.е. эволюцию молекулярно-генегической системы ^ управления клетки, состоящей из совокупности ее информационных мак-| ромолекул и молекулярных подсистем, обеспечивающих их превращение в | - организме (Ратнер 1975, 1985).

; Развитие концепции молекулярной эволюции происходило парал-

|*лельно с развитием биохимии, а затем молекулярной биологии и связано с . прогрессом в понимании принципов, на которых основана видоспецифич-; ность информационных макромолекул, и характера влияния этой " (зменчивости на анатомо-морфологические и др. фенотипические призна-в_ ! ки' организмов. Основы молекулярной филогенетики были заложены

конце 50-х - начале 60-х годов нашего века А.Н.Белозерским и его учениками, обнаружившими корреляцию нукяеотидного состава ДНК с положением организмов в системе, - сначала у бактерий, а затем и у эука-риот. В 1962 - 1963 гг. Э.Цукеркандл и Л.Полинг впервые использовали данные о первичной структуре глобинов для построения филогенетического дерева. Значительную роль в развитии теоретических основ сыграла концепция «молекулярных часов», выдвинутая этими же авторами в 1965г. и теория нейтральности молекулярной эволюции, разработанная в конце 60-х годов М.Кимурой, а также Дж.Кингом и Т.Джуксом.

Первые опыты 60-х - начала 70-х годов позволили сформулировать основные концепции геносистематики, целями которой (как и классической систематики) являются выделение таксонов, выяснение их места в иерархии таксонов и присвоение им определенного ранга (Антонов 1974).

Молекулярная филогенетика, основанная на анализе генотипов, а не фенотипов, имеет принципиальное преимущество перед традиционным "классическим" подходом. Она открывает возможности сравнения весьма отдаленных организмов, которые могут совсем не иметь общих морфологических признаков (например растений и животных). При этом подобные сопоставления производятся на основе строго формализованных критериев, а не на гипотетических представлениях о возможных путях возникновения новых форм. Формализованность критериев (сводящихся в конечном счете к количеству нуклеотидных замен) позволяет избежать туманных и часто весьма субъективных оценок значимости тех или иных признаков для филогенетических построений, критериев оценки их "продвинутости", т.е. направленности изменений в ходе эволюции.

Использование молекулярно-биологических подходов в наибольшей степени приближает исследователей к созданию наиболее естественной, т.е. филогенетической системы живых организмов.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы состояла в исследовании возможностей использования различных молекулярных маркеров для решения конкретных филогенетических и систематических задач для таксонов растений разного ранга.

При этом решались следующие задачи:

1. Установление филогенетических отношений между таксонами растений высокого ранга - от порядков до отделов - путем сравнительного анализа кодирующих и некодирующих участков хлоропластных и ядерных оперонов рДНК.

2. Геносистематический анализ семейства зонтичных (Apiaceae) на основании данных по нуклеотидным последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров ITS 1 и 2 ядерного генома.

3. Изучение геномного разнообразия агамных видов манжеток (Alchemilla) с помощью RAPD-анализа.

4. Использование RAPD-анализа для исследования внутривидового геномного полиморфизма у гороха.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Определены и включены в международную базу данных GenBank нуклеотидные последовательности 26 низкомолекулярных рРНК из разных видов семенных растений, последовательности 5'-концевого участка 18S рРНК в 260 нуклеотидов из 14 видов высших растений, последовательности ITS 2-4 спейсерных участков хлоропластной рДНК из 88 видов растений, последовательности участка ITS 1-2 ядерной рДНК из 82 видов зонтичных и 3 видов аралиевых.

Впервые показана универсальность присутствия хлоропластной 4,5S рРНК у наземных растений. Обнаружение гена 4,5S рРНК у хары является дополнительным свидетельством происхождения наземных растений от харовых водорослей.

Впервые в результате исследования участка рибосомного оперона хп-ДНК предложена филогенетическая гипотеза, описывающая основные этапы эволюции наземных растений. Показана неравномерность темпов эволюции исследуемого участка в разных филетических линиях.

Анализ спейсерных участков хп-ДНК привел к ряду выводов. Сделано заключение о монофилетичности голосеменных и возникновении антофитной линии эволюции, приведшей к современным покрытосеменным задолго до мелового периода, на границе девона и карбона 360 млн. лет назад. Наиболее рано отошедшей от общего ствола группой цветковых растений являются нимфейные. За ними следует гетерогенная группа

палеотрав с Austrobaileyales и Illiciales, затем остальные магнолиевые и наконец монофштетическая клада высших двудольных.

Древнейшими наземными растениями были печеночники. Антоцеро-товые появились на более поздних стадиях эволюции, и они близки к лисгостебельным мхам. Мхи являются сестринской группой по отношению к семенным растениям. Печеночники монофилетичны. Папоротниковидные, включая псилотовых и хвощовых, являются монофи-летической группой; плауновидные представляют независимую линию эволюционного развития.

Предложена новая модификация системы наземных растений, учитывающая данные по нуклеотидным последовательностям спейсеров хлоропластной рДНК.

В результате анализа внутренних транскрибируемых спейсеров ITS 1-2 сделан вывод о парафилии зонтичных, немонофилетичности большинства триб Apioideae и необходимости радикального пересмотра систематики Apiales и семейства Apiaceae на основе полученных молекулярных данных.

Исследования с использованием RAPD-метода впервые позволили определить уровень генетической изменчивости у агамных видов Alchemilla и сопоставить его с уровнем внутривидовой вариабельности у гороха. Показано удовлетворительное соответствие классификации микровидов системе, основанной на анализе морфологических признаков, и сделаны конкретные предложения по ее модификации. Молекулярные данные не подтверждают предположения об общности генофонда у совместно произрастающих микровидов и о возможности их рассмотрения только как морфологических вариантов в составе агамно-полового комплекса.

Впервые с использованием RAPD-метода выявлен и исследован внутривидовой геномный полиморфизм гороха. Установлены диапазоны различий между сортами, линиями и мутантами гороха. Выявлены сортос-пецифичные RAPD-маркеры. Обнаружена значительная изменчивость геномов у сомаклональных вариантов гороха, сопоставимая по уровню с межлинейной вариабельностью.

Проведенные исследования в последние годы финансировались Российским фондом фундаментальных исследований и соответствуют задачам

этого фонда. Практическое значение могут иметь работы по геносистема-тике зонтичных - продуцентов многих биологически активных и лекарственных соединений. Работы по RAPD-анализу геномного полиморфизма гороха закладывают основы для создания молекулярных маркеров, применимых в селекционной работе.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16 конференции ФЕБО (Москва, 1984), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985), 14 Международном микробиологическом конгрессе (Манчестер, 1986), III Всесоюзном совещании «Хемосистематика и эволюционная биохимия высших растений» (Звенигород, 1986), III и VIII Московских совещаниях по филогении растений (Москва, 1986, 1991), II и III Всесоюзных совещаниях «Теоретические исследования и банки данных по молекулярной биологии и генетике» (Новосибирск, 1986, 1988), 19 конференции молодых ученых биологического факультета МГУ (Москва, 1988), VI заседании Международного общества по изучению происхождения жизни (ISSOL) и IX Международной конференции по происхождению жизни (Прага, 1989), X двухстороннем симпозиуме СССР-Франция (Киев, 1990), Международной конференции «Моделирование и компьютерные методы в молекулярной биологии и генетике» (Новосибирск, 1990), III Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Таксон, Аризона, 1991), Международном совещании «Систематика и эволюция злаков» (Краснодар, 1994); VI Международной конференции «Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского» (Москва, 1995), Международной конференции «Эволюция развития: молекулы, механизмы, филогенетика» (Бодега Бэй, Калифорния, ! 995), V Международном конгрессе по систематике и эволюционной биологии (Будапешт, 1996), IV Международной конференции «Геном растений» (Сан Диего, Калифорния, 1996), IV рабочем совещании по германо-российскому сотрудничеству в биотехнологии (Ст.-Петербург, 1996), VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997), Международном симпозиуме по магнолиевым (Гуанджоу, 1998), Н(Х) Съезде Русского ботанического общества (Ст.-Петербург, 1998), а также на научных семинарах НИИФХБ им.А.Н.Белозерского МГУ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методы исследования

Выделение и секвенирование рРНК Материалом для выделения РНК служили зеленые части растений, размельченных в жидком азоте и затем лиофилизованных. РНК выделяли из лизирующего раствора с pH 5,1 де-протеинизацией горячим фенолом при 65°.

Низкомолекулярные рРНК дополнительно очищали хроматографией на DEAE-Toyopearl 650М (Toyo Soda, Japan) и разделяли электрофорезом в ПААГ в трис-боратной системе с 7М мочевиной. Зоны, соответствующие индивидуальным компонентам, вырезали из геля, окрашенного 0,2%-ным водным раствором метиленового синего. После мечения [5'-32Р]рСр по 3'-концу с помощью Т4 РНК-лигазы индивидуальные рРНК очищали дополнительно электрофорезом в ПААГ с мочевиной, радиоактивные зоны эяюировали из геля и после переосаждения использовали для секвениро-вания по методу Максама-Гилберта в модификации для РНК (Peattie 1979).

Высокомолекулярные рРНК после депротеинизации осаждали 2М LiCl, переосаждали этанолом и секвенировали по методу Сэнгера в модификации Lane et al. (1985) для РНК и обратной транскриптазы. При секвенировании использовали праймер, комплементарный высоко консервативному участку 18S яд-рРНК или 23S хп-рРНК из 22 и 19 и.о., соответственно. Эти консервативные участки молекул отсутствуют у аналогичных SS-xn-pPHK и LS-яд-рРНК, что обеспечивает специфичность образования затравочного комплекса и синтеза комплементарной цепи. Сайты связывания праймеров граничат с вариабельными участками, нук-леотидные последовательности которых и подлежали установлению. Выделение ДНК. Для выделения препаратов суммарной клеточной ДНК использовали свежесобранные или высушенные в силикагеле листья с вегетирующих растений или гербарные образцы. ДНК выделяли с помощью нескольких модификаций метода, основанного на использовании цетилтриметиламмонийбромида для очистки ДНК от примесей полисахаридов (Murray, Thompson 1980; Doyle, Doyle 1987; Möller et all992).Для ДНК из папоротников и некоторых голо- и покрытосеменных растений применяли дополнительную очистку на Microcon 30 колонках или очистку с использованием набора GeneClean Bio 101.

Амплификация ДНК. Для амплификации внутренних транскрибируемых спейсерных участков хлДНК между генами 23S рРНК, 4,5S рРНК и 5S рРНК были использованы две пары праймеров:

5'-CCGGATAACTGCTG AAAGC АТС-3 'и 5 '-TCCTGGCGTCGAGCTATTTTTCC 3' для участков, обозначенных cpITS2 и cpITS3, и

5' GATATTCTGGTGTCCTAGGCGT AG 3' и 5 'CGTAGCC ACGTGCTCTААТССТСЗ' для участка cpITS4. Реакционная смесь содержала ЮмМ Трис-HCl (рН 8,3), 50мМ КС1, 2мМ MgCb 200мкМ каждого dNTP, 0,4мкМ каждого праймера, около 20нг ДНК и 2ед. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили в течение 30 циклов в режиме 50сек. при 94°С„ 40сек. при 58°С, бОсек. при 72°С.

Секвенирование ДНК. Продукты ПЦР либо клонировали в клетках E.coli с последующим секвенированием, либо сразу использовали для циклического секвенирования. Реакции секвенирования проводили с набором Pfu Exo" Stratagene cycle sequencing для ручного секвенирования. Некоторые препараты секвенировали с помощью автоматического прибора (Applied Biosystems), в этом случае использовали набор DyeDeoxy Terminator cycle sequencing.

RAPD-анализ. В RAPD-анализе гороха были использованы следующие праймеры:

В-340 - 5' -GAGAGGCАСС-3', В-450 - 5'-CGGAGAGCCC3\ В-474 - 5'-AGGCGGGААС-3', С-09 - 5'-CTCACCGTCC3\ F12 - 5ACGGTАССAG-3', В-318 - 5 '-CGGAGAGCGA3 ОР-4 - 5'-AATCGGGCTG-3', С-5 - 5'-GATGACCGCC3 Рг-10 - 5'-AGGCGGGTАС-3', Pr-11 - 5AGGCGGG AACG3'. Амплификацию ДНК проводили в условиях: денатурация - 95°, 3 мин.; отжиг - 30°, 1 мин.; элонгация - 72°, 1 мин. (2 цикла) и 35 циклов при значениях для соответствующих процессов 94°, 1 мин.; 37°, 1 мин. и 72", 1 мин. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере и окрашивали бромистым этидием. Методы филогенетического анализа {.построение деревьев). Для построения филогенетических деревьев использовали различные методы; невзвешенный парно-групповой метод с арифметическим усреднением

UPGMA (Sokal, Sneath 1963), метод совместимости (Estabrook 1983; Le Quesne 1983; Омельянчук, Колчанов 1985), метод максимальной экономии (Felsenstein 1985), метод ближайшего связывания (neighbor-joining, NJ) с использованием программы TREECONW (Van de Peer, De Wächter 1994). Для ручного выравнивания последовательностей и расчета количества мутационных замен по Фитчу (Fitch 1971) в ветвях деревьев, построенных методом совместимости, использовали пакет программ ВОСТОРГ (Zharkikh et al. 1990). Значимость генеалогических реконструкций оценивалась методом бутстрэпа (Felsenstein 1985), обычно с использованием 100 репликаций.

Для количественной оценки RAPD-гголиморфизма и определения уровня дивергенции между анализируемыми объектами полученные данные представляли в виде матрицы состояний бинарных признаков, наличие или отсутствие в RAPD-спектрах одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось как состояния 1 и 0, соответственно. Как обычно для RAPD-анализа, в спектрах имелись минорные полосы со слабой, существенно меньшей интенсивностью - им также приписывалось состояние 0.

По матрицам состояний были рассчитаны матрицы различий. При этом использовался коэффициент Жаккарда Dj = Na + Nb / Na + Nb + Nab, (см. Дюран, Оделл 1977), где Na- число полос, имеющих�