Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия глутаматдекарбоксилазы из Е.СОLI. с аналогами субстрата, замещенными по С-3 и С-4 атомами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование взаимодействия глутаматдекарбоксилазы из Е.СОLI. с аналогами субстрата, замещенными по С-3 и С-4 атомами"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

РГ Б ОД

3 о С'Л

На правах рукописи

Христофоров Роман Робертович

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ ИЗ Е. COLI

С АНАЛОГАМИ СУБСТРАТА, ЗАМЕЩЕННЫМИ ПО С-3 И С-4 АТОМАМ

03.00.03 - Молекулярная биология 03.00.04- Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

т

Работа выполнена в лаборатории стереохимии ферментативных реакций Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Б.С. Сухарева

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор С.Н. Кочетков кандидат химических наук, с.н.с. Н.Г. Фалеев

Ведущая организация:

НПО "Витамины"

Защита диссертации состоится 1995 г. в час на заседании

Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования в области пиридсксалевого катализа, долгие годы проводившиеся под руководством академика А.Е. Браунштейна, сохраняют свое значение как для теоретической этимологии, так и для прикладной науки. Глутаматдекарбоксилаза (L-глутамат 1-карбокси-лиаза, КФ 4.1.1.15) является пиридоксалевым ферментом и катализирует превращение глутаминовой кислоты в у-аминомасляную кислоту и углекислый газ. Этот фермент играет важную физиологическую роль в организме животных и человека: он обеспечивает процессы возбуждения и торможения в центральной нервной системе, а также является аутоантигеном для аутоантител инсулин-зависимого диабета. Возможность направленного регулирования активности глутаматдекарбоксилазы животного происхождения вызвала многочисленные работы по поиску субстратов и ингибиторов фермента. Наряду с этими работами аналогичные исследования проводятся и с бактериальной ферментом, который доступен для работы в большом количестве и является удобной моделью для изучения общего механизма действия глутаматдекарбоксилазы, полученной из разных источников.

В предыдущие годы были проведены разносторонние исследования глутаматдекарбоксилазы из Е. coli. Изучена обратимая диссоциация гексамера глутаматдекарбоксилазы на неактивные димеры, роль коферыента, pH и сульфгндрнльных групп в формировании макромолекулы фермента. Выявлена роль аргининоаых и гистидиновых остатков в ферментативной реакции. На основе спектрокинетических данных была предложена схема последовательных стадий ферментативного декарбоксилирования, включающая как основную реакцию, так и побочную - трансаминирование кофермента. В результате исследования большой группы аналогов субстрата выявлены закономерности субстратной специфичности фермента. Получены кристаллы глутаматдекарбоксилазы и проведены предварительные рентгеноструюурные исследования.

Дальнейшая работа, связанная с рентгеноструктурными исследованиями промежуточных фермент-субстратных комплексов при большом разрешении, требует создания современной экспериментальной базы и прежде всего штамма-суп ер продуцента, позволяющего получать достаточное количество фермента. Одниц из путей для расшифровки механизма действия ферментов на уровне трехмерной структуры является исследование комплексов фермента с медленно

1 1

превращающимися субстратами; выявление последних и явилось предметом настоящей работы.

Цель данной работы - выделение рскомбинантной бактериальной глутаматдекарбоксилазы, поиск субстратов с низкой скоростью превращения и ингибиторов, способных образовывать необратимые комплексы.

Основные задачи исследования: Разработка условий для выращивания суперпродуцента и выделения гомогенной глутаматдекарбоксилазы из E.co/i. Исследование при помощи оптических и кинетических методов природы реакций, происходящих при взаимодействии глутаматдекарбоксилазы с аналогами субстрата, замещенными по С-3 и С-4 атомам.

Научная новизна и практическая ценность работы: Разработаны условия для выращивания рекомбинантного штамма-суперпродуцента E.coli

BL2i(DE3)[pGEMEXl/GAD], дающие оптимальный выход бактериального материала и ферментативной активности. Предложена процедура выделения глутаматдекарбоксилазы с высоким выходом гомогенного препарата при помощи ионообменной хроматографии на DEAE Сефарозе CL-6B.

Установлено, что аналоги аспартата - 3-арсоноаланин и 3-фосфоноаланин, а также аналоги глутамата - 2-амино-4-арсономасляьая кислота, 2-амино-4-фосфономасляная кислота, 4-(метилтио)-Ь-глутаминовая кислота и её эритро-диастереоизомер являются медленно превращающимися субстратами и слабыми ингибиторами фермента. Показано, что декарбоксилирование этих соединений сопровождается побочной реакцией - трансаминированием кофермента. Обнаружено, что 3-арсоноаланин и аспарагиновая кислота кроме того связывались с ферментом, образуя необратимый комплекс.

Результаты работы могут быть использованы для развертывания работы по рентгеноструктурным исследованиям фермент-субстратных комплексов и направленному мутагенезу глутаматдекарбоксилазы.

Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на годичной научной конференции ИМБ РАН (Москва, 1994г) и 9-ом Международном симпозиуме: " Витамин Вв и карбонильный катализ " ( Капри, Италия, 1994 г.)

Публикации. По теме диссертации опубликована одна статья и одна сдана в печать.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения.

Работа завершается выводами и списком литературы ссылка). Работу

иллюстрируют /Урисунков и <г таблиц. Общий обьем диссертации страниц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Природный штамм E.coli 600 выращивали в ферментерах НПО "Витамины", приносим искреннюю благодарность его сотрудникам д.х.н. В.М. Копелевичу и к.б.н. П.Н. Королеву за предоставленную нам возможность работы. Рекомбинантный штамм E.coli BL21(DE3)[pGEMEXl/GAD], созданный и любезно предоставленный нам к.б.н. A.A. Шульгой, выращивали на качалках при 37°С. Декарбоксилазную активность определяли по методу Шукуя и Шверта манометрическим методом с помощью аппарата Варбурга типа WA 0130. Ферментативную активность в процессе выращивания и очистки декарбоксилазы выражали в мкл CO2/IO мин/мг, а удельную активность гомогенного препарата - в международных единицах (мкм СОз/мин/мг).

Концентрацию белка рассчитывали на основе коэффициента Ход

очистки фермента контролировали с помощью SDS диск-электрофореза в PAAG по методу Лэммли. Гомогенность препаратов исследовали путем сканирования гелей с помощью денситометра 300 A (Molecular Dynamics); обсчет полученных данных проводили по компьютерной программе Image Quant.

Оптическую плотность растворов регистрировали с помощью Ultraspec-4050. Спектры поглощения снимали на спектрофотометрах Shimadzu UV-160, Сагу-210 и Hitachi EPS-3T, спектры кругового дихроизма регистрировали на дихрографе Jouan-III (Jobin-Yvon). Использовались кюветы с длиной оптического пути 1 см.

Фосфонатные и арсонатные аналоги субстрата - З-Арсоноаланин, 3-фосфоноаланин, 2-амино-4-арсономасляная кислота, 2-амино-4-фосфономасляная кислота а также соответствующие им амины - 2-аминоэтиларсоновая кислота,

3-аминопропиларсоновая кислота и 2-аминоэтилфосфоновая кислота были синтезированы д-ром X. Б.Ф. Диксоном и М. Спарксом (Отделение биохимии Кембриджского университета). З-Фосфоноаланин был также синтезирован и любезно предоставлен нам проф. P.M. Хомутовым.

Смесь диастереоизомеров 4-(метилтио)-Ь-глутаминовой кислоты, эритро-4-(метилтио)-Ь- глутаминовая кислота, 4-(мегилсульфонил)-Ь-глутами новая кислота и

4-[(фенил)(гидрокси) фосфорил]-Ь-глутами новая кислота были синтезированы и

3

охарактеризованы д-ром В.П. Красновым, И.М. Букриной и А.Н. Гришаковым (Институт органического синтеза УО РАН, Екатеринбург) . Структура этих соединений подтверждена данными элементного анализа, ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа.

В работе также были использованы 2-амино-4-фосфономасляная кислота и 3-аминопропилфосфоновая кислота фирмы Aldrich, пиридоксальфосфат (ПЛФ), З-хлор-Ь-аланин фирмы Serva, пиридоксаминфосфат (ПМФ), глутамат натрия, D-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота, D-аспарагиновая кислота, З-хлор-О-аланин, р-аланин и а-метил-ОЬ-глутаминовая кислота - фирмы Sigma. Растворы аминокислот перед опытом подводили 2 М NaOH до рН 4.6. В опытах использовали 10 мМ аминокислоты, расчеты концентрации проводили на L-изсмер аминокислоты.

Для определения продуктов реакции фермент осаждали ТХУ кислотой до конечной концентрации 5%, центрифугат трижды экстрагировали эфиро.-,!. а водорастворимый остаток упаривали. В опытах с 3-арсоноаланином пробы пропускали через колонку с Сефадексом G-25, после отделения белка низкомолекулярные соединения собирали и упаривали. Амины и ПМФ разделяли путем электрофореза на бумаге Ватманн ЗММ в 0,2 М Na-ацетагном буфере, рН 3,8; в опытах с 3-арсоноаланином для разделения использовали смесь, содержащую уксусную кислоту, муравьиную кислоту и воду в соотношении 3,5:1:35, рН 1,9. Электрофорез проводили в течение 3-6 часов при градиенте потенциала 30 V/cm, пятна проявляли 2% раствором нингидрина в ацетоне. Амины экстрагировали 0,2 мМ раствором CuS04 5НгО в 75% спирте и определяли поглощение при 523 нм. ПМФ был идентифицирован сначала по флуоресценции а после обработки нингидрином в виде оранжевого пятна.

Для выделения необратимо связанного комплекса после окончания реакции материал пропускали через колонку с Сефадексом G-25 или подвергали ультрафильтрациии через мембрану Centricon-30 (Amicon). Модифицированный фермент и низкомолекулярную фракцию собирали отдельно. Далее фермент диализовали, рН подводили до 11, при этом комплекс разрушался и освобождался продукт альдольной конденсации ПЛФ и пировиноградной кислоты, так называемый "продукт Шнеккерца ", который отделяли от белка ультрафильтрацией. Низкомолекулярную фракцию использовали для определения аммиака по методу

Нессл.ера и пирувата с помощью 2,4-динитрофенилгидразина по методу Диксона и лактатдегидрогеназы по методу Вроблевского.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выращивание бактериального материала.

В первоначальных опытах использовали бактериальный материал, выращенный из природного штамма Е. coli 600 в ферментере. В дальнейшем вся работа была проведена с суперпродуцентом E.coli BL2l(DE3)[pGEMEXI/GAD]. Оптимальные условия выращивания этого штамма были отработаны на обогащенной среде FS без применения промежуточного инокулята. Кинетика биосинтеза глутаматдекарбоксилазы в этих условиях изображена на рис. I.

- Х- Рост клеток

—О— Удельная активность

Рис.1 Динамика биосинтеза глутаматдекарбоксилазы

в процессе роста E.coli BL21(DE3)[pGEMEXl/GAD]

Из рисунка видно, что биосинтез фермента происходит в стационарной фазе роста и достигает максимума через 12 часов. Такая продолжительность выращивания и была принята для проведения дальнейших опытов. При этом оказалось возможным получить бактериальный материал с удельной активностью глутаматдекарбоксилазы в 15-27 раз превышающей активность фермента у природного штамма (Таблица 1). В результате этих опытов очевидно, что выход активного фермента из 2-2,5 литров рекомбинантной культуры может быть эквивалентен количеству активной биомассы,

которое ранее гмлучали при выращивании природного штамма в 60 л среды на ферментере. Материал, выращенный из рекомбинантного штамма Е.соН ВЬ21 (ОЕЗ)[рСЕМЕХ1/ОАО] на обогащенной среде, был далее использован для выделения и очистки фермента.

Таблица 1

Свойства бактериальной массы, полученной из природного штамма Е.соИ 600 и рекомбинантного штамма Е.соИ ВЬ21(ВЕЗ)|рСЕМЕХ1/САО|

Исследуемые штаммы Среда ■ (л) выход* (г/л) удельная активность**

Е.соН 600 Е.соН ВЬ21(ОЕЗ)[рОЕМЕХ1/ОАО] 60 2-2,5 6,5 4,53-7,0 59,4 896-1644

* Данные приведены на единицу сырого веса **мкл С02/10шш/мг сырого веса

2. Выделение гомогенного препарата из Е.соН В1_21(РЕЗ)ГрСЕМЕХ1/САР1

Ход выделения глутаматдекарбоксилазы из рекомбинантного штамма представлен в таблице 2. Клетки, взвешенные в 0,05 М фосфатном буфере, разрушали ультразвуком, затем материал прогревали 3 минуты при 60°С, в результате чего балластные белки выпадали в осадок, который отделяли центрифугированием, а глутаматдекарбоксилаза, будучи термостабильным белком, оставалась в растворе. К надосадочной жидкости добавляли протаминсульфат до полного осаждения нуклеиновых кислот и кислых белков, образовавшийся осадок центрифугировали. Белковый раствор высаливали сульфатом аммония на холоду до 60% насыщения. Далее проводили диализ против 0,04 М ацетатного, рН 4,4 и 0,05 М фосфатного, рН 6,0 буферов. Затем препарат фермента наносили на колонку с ДЕАЕ Сефарозой СЬ-6В и проводили хроматографию в фосфатном буфере, рН 6,0 при линейном градиенте концентраций от 0,05 М до 0,3 М. Фракции собирали и высаливали сульфатом аммония на холоду до 70% насыщения. Предложенная процедура выделения глутаматдекарбоксилазы позволяет из 10-12 г биомассы (2 л клеточной культуры ) выделить 210-250 мг гомогенного препарата фермента.

( ■

Таблица 2

Очистка глутаматдекарбоксилазы из рекомбинантного штамма E.coli BL21(DE3)|pGEMEXl/GAD]

Стадии выделения Общая активность (Ю4) Выход (%) Общий белок, ( мг) Удельная активность (мклЛОмин/мг) Степень очистки X

Озвучивание 1531 100 1283* 1

Прогрев, 60°С 1465 96

Осаждение протаминсульфатом 1326 87 1169 11343 8,8

Высаливание 60% (N114)2 804 1458 95 520 28000 21,8

Ацетатный диализ 1130 74 399 28320 22,1

Фосфатный диализ 1187 78 390 30435 23,7

Хроматография на БЕЛЕ Сефарозе СЬ-6В 982 64 256 38341 29,9

* Удельная активность на мг сырого веса

Гомогенность была подтверждена данными диск-электрофореза в PAAG: при нанесении 10 мкг белка после электрофореза было обнаружена только одна полоса; сканирование геля также не выявило примесей в полученном препарате (рис.2).

Сравнение свойств природного и рекомбинантного фермента, приведенное в таблице 3, показало, что выход глутаматдекарбоксилазы при использовании суперпродуцента увеличивается на два порядка. По каталитической активности рекомбинантный фермент даже несколько превосходит природный фермент, однако сродство субстрата (глутамата) к рекомбинантному ферменту ниже. Величины Аз8о/А42о, обычно используемые для характеристики пиридоксалевых ферментов, отличаются мало.

I

Рис.2 Электрофореграмма препарата очищенной глутаматдекарбоксилазы. 1-Пик, полученный при сканировании геля.

Таблица 3

Свойства очищенной глутаматдекарбоксилазы, выделенной из природного (E.coti 600) и рекомбинантного (E.cott BL21(DE3)[pGEMEX/GAD|) штаммов.

Свойства препаратов природный фермент рекомбинантный фермент

Выход фермента, мг /л среды 0,33-1,00 42-128

Удельная активность, ед/мг белка 156-165 171-176

кал, sec-1 137,6 142,6

Кт, мМ 0,6 1,6

A2S0/A420, рН4.6 8,5 8,17; 8,21

3. Взаимодействие глутаматдекарбоксилазы с аналогами субстрата, замещенным по С-3 и С-4 атомам.

Значительное снижение эффективности декарбоксилирования было ранее отмечено при использовании аналогов субстрата, у которых дисгальный карбоксил заменен на другую кислую группу ( гомоцистеат и сульфиноаланин) или вместо трео -4-оксиглутамата взят эритро- диастереизомер

Группа 1

ОН

ОН

I

0=As-CHrCHrCH~C00H

0=As~CHrCH—соон I I он nh2

он

nh2

З-Арсоноаланин

4-Арсоио-2-аминомасляная кислота

ОН I

0=Р~СНГСН—COOH

I i он nh2

З-Фосфоноаланин

4-Фосфоно-2-аминомасляная кислота

ОН I

0=р-СНГСНГСН—СООН

ОН NH2

Группа 2

НООС \

,соон

Н..........с—CH2-Ci

4-(Метилтио)-Ь-глутаминовая кислота (смесь диастереоизомеров)

э/*иш^о-4-(Метилтио)-Ь-глутаминовая кислота

4-(Метилсульфонил)-Ь-глутаминовая 4-[(Фенил)(гидрокси)фосфорил]-Ь-кислота (смесь диастереоизомеров) глутаминовая кислота

(смесь диастереоизомеров)

Схема 1.Формулы исследованных аналогов субстрата.

г

Для продолжения этой работы нами были взяты две новых группы аналогов субстрата глутаматдекарбоксилазы: 1 - соединения , где дистальная карбоксильная группа заменена на арсонатную и фосфонатную, 2 - диастереоизомеры метилтиоглутамата, содержащие заместитель по С-4 атому (схема 1).

3.1. Ингпбнторные свойства. При одновременном добавлении аналога и глутамата к инкубационной смеси, содержащей фермент, активность декарбоксилазы тормозится слабо или вообще не меняется, несмотря на то, что аналог был взят в концентрации на порядок превосходившей концентрацию субстрата (Таблица 4). В этих условиях нельзя было даже определить & , поскольку достижение необходимой для ингибирования концентрации аналога ограничивалось его растворимостью.

Таблица 4

Инактивация декарбоксилазы

Исследуемый аналог % инактивации время прединкубации h(1 ( мМ ) после часовой

0* 1 час** прединкубации

З-Арсоноаланин 24,3 82,8 3,0

4-Арсоно-2-аминобутират 0 11,5 56,0

З-Фосфоноаланин 11,0 65,9 3,8

4-Фосфоно-2-аминобутират 16,0 81,6 4,6

эритро-4-(Метнпгио)-Ь-глутамат 0 20,0 19,5

4-(Метилтио)-Ь-глутамат 0 11,7 25,0

4-(Метилсульфонил)-Ь-глутамат 0 0

4-[(фенил)(гидрокси) фосфорил]-Ь-глутамат 0 0

"1.5-2 мкг/ыл фермента, 1мМ глутамата; 10 мМ аналога. **10 мМ глутамата добавлено после прединкубации.

Снижение активности фермента можно было выявить, когда глутамат добавляли после часовой прединкубации аналога с ферментом при комнатной температуре; концентрации аналога и глутамата в этих были одинаковыми. В указанных условиях были определены величины /50. Наиболее эффективным ингибитором оказался

10

3-арсоноаланин, далее следуют 3-фосфоноаланин и 4-фосфоно-?-аминобутират.

4-Арсоно-2-аминобутират является самым слабым ингибитором из всех исследованных аминокислот. Амины, соответствующие этим аминокислотам:

2-аминоэтиларсоновая кислота, 2-аминоэтилфосфоновая кислота,

3-аминопропиларсоновая кислота, 3-аминопропилфосфоновая не влияли на активность декарбоксилазы, подобно природному продукту реакции -у-аминомасляной кислоте. По своей эффективности смесь диастереоизомеров

4-(метилтио)-Ь-глутамата и эритро-4-(метилтио)-Ь-глутамат были ближе к 4-арсоно-2-аминобутирату. 4-(Метилсульфонил)-Ь-глутамат и 4[(фенил)(гидрокси)фосфорил]-I.-глутамат оказались неактивными.

3.2. Субстратные свойства. Данные о декарбоксилировании изученных аналогов субстрата и соотношении между основной и побочной реакцией приведены в таблице 5. Как видно из этой таблицы, декарбоксилирование исследованных соединений было выражено слабо по сравнению с глутаматом и аспартатом. В опытах с арсонатными и фосфонатными налогами субстрата выделение углекислоты в ходе реакции за 10 мин при 37°С ( в стандартных условиях определения активности) обнаружить не удалось, nos тому определить величину /ссз/ было невозможно. Декарбоксилирование было показано после длительной инкубации путем идентификации и определения другого продукта - соответствующего амина. Таким образом было показано, что субстратные свойства сохраняются при замене карбоксильной группы на арсонатную или фосфонатную группу, однако эффективность декарбоксилирования при этом резко снижается. Эти результаты находятся в соответствии с ранее полученными данными о субстратных свойствах гомоцистеата и сульфиноаланина, у которых дистальный карбоксил заменен на другую кислую группу. Возможность замены дистального карбоксила субстрата на арсонатную и фосфонатную группу для осуществления ферментативной реакции была ранее показана в опытах с другим пиридоксалевым энзимом - аспартат-трансаминазой (Хуре, Осипова, Хомутов !389; Али и Диксон 1993).

Декарбоксилирование в опытах с 4-(метилтио)-Ь-глутаматом и его эритро-диастереоизомером было обнаружено по выделению углекислоты. Смесь диастереоизомеров 4-(метилтио)-Ь-глутамата оказалась несколько лучшим субстратом, чем его эритро-<\юр>ла. Ранее аналогичные данные о преимуществе трео-конфигурзции были получены для 4-оксиглутамата.

Субстратные свойства аналогов

Таблица 5

Субстрат и его аналоги Декарбоксилирование Трансаминирование

Глутамат 142,60 зооооо3

4-(Метилтио)-Ь-глутамат 0,05 49'

эритро-(Метилтио)-Ь-глутамат 0,02 27а

4-Фосфоно-2-аминобутират - 3Ь

4-Арсоно-2-аминобутират - 1ь

Аспартат 0,06 80а

З-Фосфоноалании - 7Ь

З-Арсоноаланин - 2,5Ь

Отношение выражено в молекулах продукта, образовавшегося за врет реакции, на молекулу кофермента. Окончание реакции определяли по прекращению декарбоксилирования или по исчезновению КД при 420 ни. Декарбоксилирование измеряли по образованию СОг' *' или амина'ь

4-(Метилсульфонил)-Ь-глутамат и 4-[(фенил)(гидрокси)фосфорил]-Ь-глутамат не реагировали с ферментом. Возможно, это вызвано влиянием заместителей у С-4 атома: как стерическими препятствиями для связывания вследствие большого объема заместителя, так и присутствием дополнительных заряженых групп.

3.3. Трансаминирование кофермента. Взаимодействие глутаматдекарбоксилазы с аналогами субстрата изучали с помощью оптических методов. Исходный фермент имеет дихроичный спектральный максимум при 420 нм, характерный для протоййрованного шиффова основания, образованного е-НКз группой лизина белка и альдегидной группой кофермента.

Как видно из рис. 3, в результате инкубации декарбоксилазы с аналогами первой группы происходит значительное снижение величины поглощения и КД при 420 нм и появление нового недихроичного спектрального максимума при 325=330 нм.

Скорость трансформации фермента была значительно выше в опытах с производными аланина, чем с производными аминомасляной кислоты.

ДА* 10 4

310 33 0 3 60 370 390 410 430 460 470 490

Рис.3 Спектры поглощения (А) и КД (Б) комплексов

глутаматдекарбоксилазы с арсонатными и фосфонатными аналогами субстрата после 24 часов инкубации в 0,1М пиридин-хлоридном буфере, рН 4,6.

1. - фермент,1мг/ыл;

2. - фермент + 3-арсоноаланин;

3. - фермент + 3-фосфоноаланин;

4. - фермент + 4-фосфоно-2-аминобутират;

5. - фермент + 4-арсоно-2- аминобутират;

Спектральные изменения сопровождались инактивацией фермента на 70-100%.

Эта инактивация обратима: при добавлении 0,1 мМ ПЛФ в пробу активность восстанавливается в значительной степени или даже полностью. Исключением стали опыты с арсоноаланином, где реактивация составила лишь 42-46% от исходной активности фермента.

Г ■>

Продукты реакции фермента с 3-фосфоноаланином, 4-фосфоно-2-аминобутиратом и 4-арсоно2-аминобутиратом были разделены с помощью электрофореза на бумаге при рН 3,8. Разделение продуктов реакции в опытах с арсоноаланином удалось при использовании смеси с рН 1,9. Схема этой электрофореграммы представлена на рис.4. ПМФ был идентифицирован по флуоресценции в ультрафиолете и по характерной окраске с нингидрином.

Л

т

12 3 4

Риа. 4 Схема электрофореграммы продуктов реакции

глутаматдекарбоксилазы с арсоноаланином.

(7,4 мг фермента инкубировали с 10 мМ

арсоноаланина 48 часов)

1. - опытная проба;

2. - п^ф;

3. - 2-аминоэтиларсоновая кислота;

4. - 3-арсоноаланин.

Реакция э/)и/я/>о-4-(метилтио)-Ь-глутамата с ферментом проходит несколько медленнее, чем смеси диастереоизомеров. Активность фермента в этих пробах составила соответственно 56% и 41% от контроля, добавление 0.1 мМ ПЛФ приводило к реактивации фермента. Поскольку инкубация фермента с 4-(метилтио)-Ь-глутаматами приводила к появлению того же спектрального максимума, падению

активности и реактивации при добавлении ПЛФ можно полагать, что образование ПМФ происходило и в этих опытах.

Чтобы исключить возможность неферментативного образования ПМФ в контрольных опытах ПЛФ инкубировали с указанными соединениями в отсутствие фермента, при этом мы не наблюдали спектральных изменений. Столь медленная скорость реакции и низкая величина соотношения между основной и побочной реакцией ( в пределах одного порядка) обнаружены впервые. Поэтому комплексы этих аналогов с ферментом могут быть использованы для длительных физико-химических экспериментов, например, при рентгеноструктурных исследованиях. Своеобразной оказалась реакция фермента с 3-арсоноаланином, при которой часть кофермента трансформируется в ПМФ, а часть - связывается необратимо.

4. Исследование природы необратимых фермент-субстратных комплексов

Ранее было показано, что глутаматдекарбоксилаза катализирует не только декарбоксилирование аспартата, сопровождающееся образованием ПМФ, но и элиминирование 3-хлораланина. (Сухарева и Браунштейн,1971; Ликос и др. 1982). Для выяснения природы взаимодействия фермента с арсоноаланином(1) было проведено сравнительное изучение свойств полученного комплекса и комплексов декарбоксилазы с аспартатом (II) и З-хлораланином (III).

ОН

I

0=А5-СНГСН—СООН НООС-СН^-СН—СООН С1-СН—СН—соон

I I I I

он мн2 ин2 ын2

З-Арсоноаланин Аспарагиновая кислота З-Хлораланин

Схема 2. Формулы аспарагиновой кислоты и её аналогов.

4.1 Свойства конечных комплексов фермента. Прежде всего были проведены спектральные исследования. Как видно из рис. 5, в опытах с арсоноалапином и аспартатом исходный фермент с максимумом при 420 нм полностью переходил в комплексы с максимумами при 327 нм и 329 нм соответственно. Декарбоксилаза образует с З-хлораланином стабильный комплекс с максимумом при 333 нм.

15

Рис.5 Спектры поглощения комплексов глутаматдекарбоксилазы с

аналогами аспартата после 24 часов инкубации

0. - фермент, 1,2 мг/мл;

1. - фермент + 3-арсоноаланин

2. - фермент + аспартат;

3. - фермент + 3-хлораланин.

Условия опыта см. рис.3

Как видно из таблицы 6, спектральные изменения сопровождались потерей активности. В случае с 3-хлораланином инактивация чистого фермента не была полной. Добавленный ПЛФ частично восстанавливает активность в опытах с арсоноаланином, в значительной степени - с аспартатом, комплекс с 3-хлораланином не реактивируется.

4.2 Продукты реакции. После окончания реакции декарбоксилазы с арсоноаланином и аспартатом из реакционной среды были выделены и идентифицированы с помощью электрофореза на бумаге - ПМФ и амины (2-аминоэтиларсоновая кислота и р-аланин); аммиак и пируват не обнаружены. В отличие от этих аналогов 3-хлораланин подвергался Ртэлиминированию, образуя аммиак и пируват (25-30 М/М ПЛФ), продукты декарбоксилирования и ПМФ найдены не были.

Для дальнейшего изучения спектров фермент-субстратных комплексов было взято 18 кратное количество декарбоксилазы и после окончания реакции с аналогами аспартата препараты были пропущены через Сефадекс G-25 для отделения ПМФ.

.100 .3-50 ЗАО 360 400 420 440 460 4Й0 500 620 5-Ю Й0О Г'бо 600

Рис.6 Спектры поглощения комплексов глутаматдекарбоксилаэы (21мг)с аналогами аспартата после пропускания через Сефадекс С-25, рН 4,6.Обозначения те же, что на рис.5

Рис.7 Спектры поглощения комплексов глутаматдекарбоксилаэы с аналогами аспартата после пропускания через Сефадекс С-25, рН 11. Обозначения те же, что на рис.6

Из рис.6 ясно, что после отделения ПМФ во всех трех опытах спектры имели максимум поглощения при 333 нм. Далее рН этил трёх растворов был подведён до 11, при этом они приобретали желтую окраску, как видно из рис.7, спектры с в этом случае имели максимум поглощения при 41) нм. Спектральные свойства "желтого продукта", полученного из необратимо связанных комплексов фермента с 3-арсоноаланином, аспартатом и 3-хлораланином весьма сходны (таблица 6). "Желтый продукт" был обнаружен также и при взаимодействии аспартата с

природным ферментом. В опытах с Э-аспартатом, О-глутаматом, З-хлор-О-аланином и а-метил-Э.Ь- глутаматом"желтый продукт" не образовывался.

Таблица 6

Реакция глутаматдекарбоксилазы с аналогами аспартата

З-Арсоноаланин Аспартат З-Хлораланин

Свойства конечных комплексов:

Амахс (НМ) 327 329 333

Инактивация (%) 100 100 71

Реактивация (+ПЛФ) 34 76 0

Продукты:

Амин + + -

ПМФ + +

Аммиак - - +

Пируват - - ' +

"Желтый продукт" + + +

А,Иакс спектра рН 4,6 (нм) 333 333 333

А.иакс спектра рН 11 (нм) 411 411 411

Тип реакции:

Декарбоксилирование + + -

Трансаминирование + -г -

Элиминирование + + ' +

Исходя их полученных данных можно высказать некоторые предположения о механизме реакции. "Желтый продукт" был ранее идентифицирован как 3-(фосфопиридоксилиден)пируват, полученный в результате щелочного гидролиза фосфопиридоксилиденаминоакриловой кислоты - продукта р - элиминирования серин-О-сульфата и 3-хлораланина ( Ликос и др. 1982).

Рио.8 Схема возможных путей образования необратимых комплексов глутаматдекарбоксилазы с аналогами аспартата.

Обнаруженный "желтый продукт", предполагает наличие р-элиминирования у аспартата и 3-арсоноаланина по типу I (см.рис.8). В опытах с аспартатом реактивация декарбоксилазы и образование "желтого продукта" были весьма значительными; поэтому здесь предпочтителен путь I. В опытах с арсоноаланином степень реактивации и образования "желтого продукта" была невелика, по-вицимому необратимое связывание в этом случае обусловлено преимущественно алкилированием активного центра глутаматдекдрбоксилазы по типу II, аналогично предложенному ранее для аспартат-р-декарбоксилазы ( Релиа, Тейт, Майстер, 1974).

выводы

1. Разработаны условия для выращивания суперпродуцента глутаматдекарбоксидазы из E.coli BL21(DE3)[pGEMEXl/GAD].

2. Разработана процедура выделения и очистки гомогенной глутаматдекарбоксидазы из рекомбинантиого штамма E.coli с высоким выходом.

3. Установлено, что аналоги аспартата - 3-арсоноаланнн, 3-фосфоноаланин и аналоги глутамата - 2-амино-4-арсономасляная кислота, 2-амино-4-фосфономасляная кислота, 4-(метилтио)-Ь-глутаминовая кислота (смесь диастерео изомеров), зрнл1/>о-4-{метшггио>-Ь-глутаминовая кислота являются медленными субстратами и слабыми ингибиторами фермента.

4. Показано, что декарбоксилирование исследованных аналогов субстрата сопровождается трансаминированнем кофермента.

5. Обнаружено образование необратимых фермент-субстратных комплексов при взаимодействии глутаматдекарбоксилазы с 3-арсоноаланином и аспартатом .

Ооювныс результаты диосерташюпиои рампы (пложены в следующих публикишых:

1. Khristoforov, R.R.. Sukhareva. S.S., Dixon. H.B.F., Spark es,MJ„ Krasnov, V.P, Bukrina I.M. (1995) The interaction of glutamate decarboxylase from Escherichia coli with substrate analogues substituted at C-3 and C-4. Biochem.Mol.Biol.Intern., V.36, №1, P.77-85

2. Christophorov, R.R., Berezhnoy, S.N., Sukhareva, B.S., Dixon, H.B.F., Sparkes, MJ.,Krasnov, V.P. (1994) Glutamate decarboxylase from E. coli: interaction of the enzyme with substrate analogues. Vitamin B« and carbonyl catalysis. 9th Meeting. Capri, Abstracts., P.254-256.

3. Sukhareva, B.S., Schulga, A.A., Darii, E.L., Christophorov, R.R.(1994). Studies on the bacterial glutamate decarboxylase. Vitamin B& and carbonyl catalysis. 9th Meeting. Capri. Abstracts.. P.253.

4. Христофоров P.P., Сухарева Б.С., Диксон Х.Б.Ф., Спаркс МД., Краснов В.П., Букрина И.М., Гришаков А.Н. Реакции декарбоксшшрования и побочного траисамшшроваыия при взаимодействии глутаматдекарбоксилазы из Escherichia coli с аналогами субстрата, модифицированными по С-3 и С-4 атомам. Биохимия. 1995 в печати.