Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и функция мышечной пируватдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура и функция мышечной пируватдегидрогеназы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕНИЯ НАУК Институт бхоххм» хм. А.Н.Баха

На правах рукописи ХАЙЛОВА Подняла Самухловна

УДК 577.158

СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ МЫШЕЧНОЙ ПИРУВАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

03.00.04 - биологическая ххмхя

Дхссерт&цкя на сохсканхе ученой стелен* доктора биологпвеках наук в форме научного доклада

Косква 1992

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН и в Институте физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

- академик С.Е.Северин.

- доктор биологических наук, профессор Н.К.Наградова,

-..доктор биологических наук, профессор В.В.Мосолов, .

- доктор химических каук Л.М.Гинодаан.

- Российский УниБврситет Дружбы Народов, кафедра биохимии.

Защита состоится июня 1992 г. в 10.00 часов на заседа-

нии Специализированного Совета Д.002.96.01 во защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской Академия Наук во адресу: 117071, Москва, Ленинский проспект, 33, Институт биохимии ем. А.Н.Баха РАН, кор- • пус 2.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотека биологической литературы РАН (Москва, Ленинокий проспект, 33, корпус I).

Автореферат разослан 1992 г.

и

Ученый се[фетарь Специализированного Совета доктор биологических ваук

Научный консультант Официальные оппоненты

Ведущая организация

.й.

_.,; Актуальность проблемы. Изучение структура и механизма де¡Ют-вен ферментов и полифермектнкх систем является основном 'направлением современной энзимологии. Исследования з это!; области относятся к фундаментальном разделам наук::, связанна.: с выяснением молекулярных механизмов функционирования еиекх систем. Эти исследования создают теоретическую основу для решения практических задач медицинской науки и биотехнологии. Без знаки?, з этой области невозможен прогресс з области направленного мутагенеза с целка создания белков с новкмк свойствами. Исследования полифермектных комплексов и других надуолекулярнкх структур дают ключ к пониманию физиологического смысла и коккретннх механизмов интеграции 'неточного метаболизма. Особая роль здесь лринадле.-кит исследованию белок-белковкх взаимодействий, которые не только объединяют отдельные ферменты в единкй согласованно деиству-сой блок, ко является также существенным компонентом ферментативного катализа (Фридрих, 1986; Курганов, 1956; Наградоза, 1990). Практический смысл подобных исследований заключается в том, что они являются основе!: для разработки обкей теории регуляции клеточного метаболизма и для более углубленного понимания нарушений обмена веществ.при патологических состояниях организма и для разработки методов их корречохии.

Среди большого числа ферментов, катализируюопс процессы биологического окисления, важное место принадлежит пирузатдегидрогеназ-ному комплексу (ЦП), катализирующему реакцию окислительного декар-боксилировакия шруваха с образованием ацетил ксэнзима А. Проблема изучения ПД связана с его ключевид полозекнем в обмене веществ в точке сопряжения гликолиза с циклом трккарбоковкх кислот. Скорость реакции контролируется многочисленными параметрами клеточного метаболизма, больгаксгво из которых в клетках эукариотов действует через систему фосфорилировакия (инактивации) - дефосфорили-ровакия (активации) первого компонента полиферменткого комплекса, собственно пируватдегидрогеназы (ПДГ) [К.Ф. 1.2.4.1] .

Тиаминпкрофосфат-завксимгя ПДГ катализирует пусковую необратимую лимитирующую скорость стада в обпей реакционной последовательности, которая ведет к образованию, ш существу, всех продуктов реакции - углекислоты, остатка ацетила и редокс эквивалентов. Последние передаются далее остатками лшоамида - простетической группой фермента Е2, на коэнзим А и ЕДЛ"1" з активных центрах, соответственно, кгЕлрол!ПоамиддегидрЬгеяазн №3). '.

- г -

В последние годк выявлены случае врожденных аномалий человека, связанных с повреждением ели недостаточность» функции ПДГ (Но, d.uL , 1956; KoU« vi , IS3E, I9S3; ЯЛт f^,IS83).

Б связи с этим в различных лабораториях мира развитие получили генетические и колекулярко-бкологические исследования: выделены ДНК, кодируюЕхе бпосг.ктез отдельных компонентов комплекса, на основании последовательности куклеогкдов определена их первичная структура, ведется поиск конеервативных последовательностей. Эти исследования, наряду с исследованиями проблем регуляции ферментативной активности, состазляят основное направление изучения ПД за рубежом ( Ляп. N. У. йсос/. Sei. , т.573, 1989), в стороне практически оставляя вопросы изучения структуры активных центров ПДГ, выполняющей ведущую роль в катализе и регуляции активности полиферментного комплекса.

Цель к задачи исследования. Детальное изучение свойств индивидуальных ферментов, осуществляющих элементарные стадии общего каталитического механизма - необходимый этап исследования сложных полиферментккх систем. Целью настоящей работы было изучение структурных основ функционирования Г:ДГ как ведущего и наименее исследованного звена полиферкентного комплекса. Основное внимание в работе было уделено выполнению следующих задач:

- получить общую характеристику ВД грудндо мышц голубя, определить его сходство или различия с гомологичными ферментами животного происхождения;

- отработать препаративную методику получения ПДГ и исследовать его молекулярные свойств

- исследовать характер взаимодействия апо-БДГ с ТПФ, составить представление о конформации ТГ.Ф в активном центре ПДГ, оценить вклад определенных групп кофермента в механизм связывания с белком и катализ ферментативной реакции;

- исследовать взаимодействие холо-ПДГ с пируватом;

- выявить и исследовать природу функционально важных групп ПДГ; .

- исследовать молекулярный механизм действия ПДГ в модельных реакциях.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение структуры мышечного ПД и его компонентов, показано сходство их макромолеку-ляркого и субъеданичного строения с ферментами "животного" типа.

± ■й

[мкМ]-мжг

30

- и -

Рис.4. Зависимость ско-роста реякцкк, катализируемой ПДГ, от конце нтрацки тиамЕнпкро-фосфата.

Концентрации фермента з пробе: 1-0,01 от, 2-0,02 мг, 3 - 0,046 мг и 4 - 0,09 мг.

30 50

! </[Т1ГР],»7> М"1

Таким образом, мы доказали, что в системе с мышечной ПДГ тка-миновый кофермент может действовать как модулятор ферментативной активности. Это придает ферменту обостренную чувствительность к лиганду при его низкой концентрации, что важно для обеспечения функционирования ПДГ в условиях В^-авитаминоза и снижает ответную реакциэ на его высокие концентрации, отличающиеся от физиологических. 5

Кинетика насыщения холо-ЩЕГ пируватом тоже имеет отклонения от закономерности ?>!ихаэлиса-Мзнтен (рис.5, кривая I). Значения коэффициента Хилла, разные 1,5-2, позволяют предположить в БД взаимодействие каждой пары центров, связывающих субстрат. Для доказательства кооперативного взаимодействия активных центров ПДГ нами был использован близкий структурный аналог субстрата - амад пировиноградной кислоты. Как конкурентней ингибитор, пирувамид обладает к холофедоенту тем же сродством, что а гшруваг (К-,, =■ К, =

Рис.5. Зависимость скорости пируват:акцевтор оксидоредуктазкой реакции от начальной концентрации субстрата в координатах ,Лайнуивера-Берка.

1 - в отсутствие амида пировиноградной кислоты;

2 - в присутствии пиру-вамида (1,21 «Ю-6 М).

12 3

[яируват^Ю,5 М-1

= 6 • 10"^ 11). Однако преинкубация с низкой концентрацией пирув-амкда (<К^) активирует фермент и нормализует кинетику насыщения ЦПГ субстратом (ркс.5, кривая 2). Кажущееся противоречие можно объяснить следующим образом. Связываясь в одном из центров, аналог субстрата выступает в качестве аллостерического активатора по отношению к соседнему центру. Это создает в кем условия более эффективного взаимодействия с пируватом. Бри дальнейшем увеличении концентрация лирувашд становится конкурентным ингибитором ПДГ, так как для связывания с ферментом субстрату необходимо вытеснить аналог из части активных центров. Таким образом, наличие в молекуле ПДГ двух центров связывания субстрата создает основу для кооперативных взаимодействий, когда присоединение шрувата или его аналога к одному из центров повышает сродство к субстрату второго.

Подводя итог этой части исследования, мояко заключить, что ПД, изолированный из грудной мкщы голубя, подлежит, многостороннему контролю со стороны различных параметров клеточного метаболизма. Контроль может осуществляться через аллостерические взаимодействия специфических лкгандов с белком, изменение функционального состояния яростетических групп фермента ^ ~ центрального звена согласованного каталитического механизма, или через модификацию фосфора- ' цированием-дефосфорицированием собственно ПДГ, осуществляемую специализированными ферментами-регуляторами.

П. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ АКТИВНЫХ

ЦЕНТРОВ ЕКРУЗАТДЕПДРОГЕЕАЗЫ ' .

I'. Ко^ермектная функция и связывание тиемин-мройоо'фатз о алоферментом

Ферментативное действие ПДГ неразрывно связано с проблемой тиаминового катализа, исследование которого занимает учекцх уке более полувека, Главное открытие в этой области связано о именем Бреслоу, которому удалось с помощью моделей показать, что активной формой тиамина является 2-карбанион, реагирующий с карбониль- • ной группой с^ -кетокислоты с образованием 2-карбоксиэтил-ТПФ. Декарбоксшшрование последнего ведет к образованию 2-оксиэтил-производного ТПФ (^¿¿¿см , 1958, 1962).

Долгое время невыясненным оставался вопрос о роли аыинопири-дановой части молекулы ТПФ, хотя его функциональность не вызывала сомнения уже потому, что было выяснено, что соли тазолия легко при-

римидинового кольца ТПФ.

Таким образом, изучение коферментной активности ^-замененных аналогов 7Ш в пирувагдегидрогеназной реакции обнаруживает зая-ную роль аминогруппы в механизме теамккозого катализа. Однако при использовании СК-ГПФ мы не смогли подтвердить возможность участия аминогруппы на второй стадии реакции, так как в активном центре ДЯГ данный аналог не связывает пируват.

2000

1000

2000

1000

Рис.6. Хроматографический анализ продуктов декарбокснлиро-вания сирувата в среде инкубации :

(А) аю-ПДГ ч- ТЕФ-?/^ + [2-14с]~ пируват; лик I - [2-14с1-ОЭТПФ; пик п - [2~14с] -КОЭТПФ; пекШ- [2-14С] -пируват. (Б) апо-БДГ + Н-.7.етилт диметил-, или 4 -окси-ТПФ + [2-14с] -пируват. о

10 го см

Исходя из полученных результатов и учитывая, что скорость диссоциации прогона от 2-С атома тиазолового кольца в тиамине на поря-

док выше, чем в окситиамине (GaUc , S&lPe , 1974; Suehy d.al. 1972), можно предположить, что 4-EHg-rpynna существенна для ооразо-вашя 2-карбаниона, необходимого для посадки субстрата.

Как южно представить механизм влияния аминогруппы на кислот-!.ность 2-СН-грулпы?

Индуктивное влияние аминопиримвдинового или оксипяримиданово-го кольца через метилековый мостик (Suchy , Mieya. i , Sa.$i& , 1972) маловероятно из-за несопряженности этой связи. Это подтверждается и расчетами электронной плотности у второго углеродного атома, которая у тиамина и окситиамина оказалась одинаковой (РиРР/лйп f gpenja&r-d , 1961; Gath t Ш-ie , 1974). Более вероятно предположение Бреслоу ( Bresiow , 1962), что 4-Ш2-группа может оказывать непосредственное влияние на 2-СН тиазолового кольца путем образования водородной связи с кислой СН группой. Б этом случае аминогруппа оудет способствовать диссоциации протона от 2-С атома

тиазолового кольца и образованию активной формы кофермента. Бри замене а:л::когрупск не более кислый гкдрокскл диссоциация протока от 2-С долина бить замедлена и образование 2-карбаниона затруднено. По-Епд'лоуу, в силу этих причин и нам не удалось обнаружить анионной формы 4-ОН-ТПФ в физиологической области рК с помощью тетранитрометана, использованного нами в качестве индикатора на нарбакиони ( С/гг^ , 1972, 1378). ТНК в аналогичных экспе-

риментальных условиях легко реагирует с 2-карбаниокной формой ТИФ, образующейся в растворе.

Кокфоомецг.я ТЕФ в актин но?/ центре ВДГ. Бифункциональность молекулы ТИФ требует его жесткого прикрепления к апоферменту, способного обеспечить наиболее благоприятные пространственные условия для протекания реакции. Расчеты молекулярных моделей {РёеЬсЬег' , ¿й/, 1966) показала, что необходимая конформация достигается поворотом обоих колец молекулы ТЕФ относительно связывающего их ме-ткленового мостика до сближения ¿-ИНд-группы и 2-СН тиазолового кольца. Благодаря этому в непосредственном контакте оказываются метпльная группа, стоящая при С-4 атоме тиазолового кольца и 6-Н пиримпдкновой части молекулы (рис.7). Таким образом, в области данного контакта невозможны никакие замены, кроме эквивалентных, • без искажения "правильной" конформации ГШ.'

. Рис.7. Конформеция ТПФ в-активном центре фер-^ И мента в норме и при до-

Н полнительном введении

и метальной группы вместо

/ протона при ¿-С атоме.

с.

=5С^ V

В опыте с ЕЛГ мы показали, что замена протона на метил (6-СН3-ТПФ) полностью устраняет возможность специфического взашо-' действия аналога с апофермантсм. Об этом свидетельствует как полное отсутствие подавления ферментативной активности избытком аналога (табл.1), так и отсутствие каких-либо изменений спектра' КД анофермента при добавлении 6-СНд-И1Ф. Если, лишнюю метальную группу убрать, все равно где, оставив-'единственный метил и один протон (в положении 4 или 6), наблюдается восстановление сведафачес-

кого связывания с белком и обнаруживается каталитическая эффективность аналога (б-СНд-4-нор-Щф). Полученнке результаты подтверждают предложенную Шелленбергером для каталитической конформацпи ТПО стерическую эквивалентность заместителей, стоящих при 4 и 6-угле-родных атомах, что указывает на сближение к возможность внутримолекулярного взаимодействия мекду группами 4-ffig и 2-СН ТПФ.

На основе полученных результатов мояко полагать, что каталитически активная конформацкя ТШ в активном центре ЩТ подобна постулированной Шелленбергером для активного центра дрожжевой ЦИК {Scbedenierger , 1968). Такая конформация, по-видимому, форг/лру-ется при многоточечном связывании ТПФ в структуре холофермектного комплекса.

Группы ТПФ. участвуйте во взаимодействии с апогетзментом. Результаты, полученнке при изучении связывания "стереоаналогоз", показывают, что активный центр ПДГ весьма чувствителен к относительной ориентации якркмкдкнового г тиазолового колец ТПФ. По-зидимо-му, увеличение объема С-4 и С-6* заместителей ведет к нарушению необходимых соотносекий между структурой аналога и связывающими участками белка. Заметный вклад мояет вносить также возрастание гидро-фобности 6-CHg-TTIO по сравнения с естественным коферментом.

Вклад 2-СНд-группы ТПФ в каталитическую активность или механизм связывания кофермента, ло-видимсму, ке велик, так как замена метила на протон или бензольное кольцо сохраняет от одной до двух третей каталитической эффективности аналога, но на 2-3 порядка ухудшает его связывание с белком (табл.1). Скорее всего 2-Сг!д-груп-па ТПФ в холо «информации ЦДГ остается на поверхности белка или попадает в относительно просторную гидрофобную область.

Интересно влияние модификация при 2-С-атоме тиазолового кольца на связывание аналогов с белком. Данные табл.1 показывают, что 2-оксиэтильная или 2-оксимеакльная группы не мекают связыванию со-ответствуших аналогов с апоферментом и их дальнейшему окислительному превращению. Замена этих групп на меньтий по объему, ко гидрофобный метил исключает специфическое взаимодействие аналога с белком,! так как в этом случае кет подавления ферментативной активности избытком аналога и нет изменении спектра КД апофермента, которые ■ свидетельствовали бы о связывании. Кожно думать, что в районе связывания кофермекта на белке имеется высокополярная область, которая, выталкивая гидрофобную ыетилькую группу, препятствует связыванию 2-СН-ч-ТПФ с епофермектом. ' .

Опыты с 1-аналик-8-нафталиюульфонатом, который в отличие от ДНК из дрожжей {1ШГ ich t dorm er , 1970, 1871) не конкурирует с ТИФ, свидетельствуют о том, что в области связывания конфермента ЕДГ нет выраженных гидрофобных зов.

2. Спектральная характеристика холоферлентаого комплекса

Связывание ТПФ с белком - главный фактор формирования активного центра ЕДГ, включающий конфирмационную-перестройку обоих -взаимодействующих компонентов. Выше мы обсудили результаты, полученные с использованием аналогового подхода. Эти результаты позволили составить представление о каталитической конформации ТПФ в активном центре ЕДГ. Для исследования процесса образования холо-ферментного комплекса использовали метод КД, известный высокой чувствительностью к тонким структурным перестройкам биомакромолекул.

Спектральная характеристика образования холоферментного комплекса представлена на рис.8. Видно, что взаимодействие апофермен-

Рис.8. А - Спектр круговою дихроизма пируватдегидрогеназы, Б - соотношение меацу активностью- пируватдегидрогеназы, изменением молярной эллиптичности при 330 нм и .концентрацией добавленного тиамин-г.крофосфата. ..

I - базовая линия; 2 - апофермент; 3 - холсфермент. Ка вставке -разностный спектр, полученный вычитанием кривей 2 из кривой 3. Концентрации: пирузатдегилрогеназы - 0,94 «КГ0 К; тиамкнпирофсс-ват - 1,51.Ю-5 И (при 250-290 км) и 2.I0"5 М; Г.02-Г0"5 М (при 290-360 км).__________

та с ТПФ вызывает изменения спектра КД, которые moscho интерпретировать следующим образом. .'.'аксимум при 260 км мояет быть обусловлен оптической активностью тиззолового кольца ТПФ, индуцированной ассиметричным белковьм окружением {kíírUk , Woimer , 1971), а также электронными переходами фенилаланина при днеульфидных связей (Freííe , BückPand , 1971; Jd¿er et.od. , 1973). В облссти 270-305 нм отрицательные ЭК с максимумами при 280 и 285 им могут отражать оптическую активность тирозииовьтх к триптофановьтх остатков белка, а ЭК при 295 и 305 ш могут относиться к одному и 'тому se остатку триптофана {Jkeda , Ha.tna.gudu , 1972).

Кроме этих эффектов в области 320-360 км, где ни ТПФ, ни белок сами по себе не имеют собственной оптической активности, в результате их взаимодействия появляется обпирная полоса с нечетким максимумом при 330 км. Появление новой полосы ка спектре КД свидетельствует о возникновении связи между функциональны«,ж группами белка и ТПФ. Характерные особенности полосы - положение в длинноволновой части спектра, малая интенсивность, диффузный характер, нечеткий максимум - позволяют интерпретировать наблюдаемый эффект как спектральное выражение комплекса с перекосом .заряда (КБ") (tfufe¿ ten, Ptrs.cn, 1962; Коссовер, 1964). Сходные изменения спектра наблюдали ранее при взаимодействии ТПФ со свободным триптофаном, но не с другими аминокислотами (Кочетов, Усманов, IS64), а методом ЯМР было показано, что тиамин и его производные способны образовывать молекулярные комплексы с переносом заряда с различными индолилпроЕзводни/л. Функцию доноров электронов в таких комплексах выполняет бензольное кольцо яндолильной группы, а функцию акцептора - положительно заряженное кольцо ТПФ ( Мeí a¿ t 1969).

Вслед за модельными системами образование подобного комплекса было обнаружено при спектральном исследовании холотранскетора-эы из пекарских дрожжей {КосИекр",изтап(цГ,1ЪЩ. До последнего времени это был единственный случай идентификации КПЗ в ряду тиа-миновых ферментов, так как при спектральном исследовании дрожжевой

ДЕК аналогичной связи не обнаружили ( Ullrich , IS?0).

Образование функциональной связи должно коррелировать с вели- . чикой каталитической эффективности реконструируемого холофермент-ного комплекса. Из соотношений, представленных на рис. 86, видно, что величина ферментативной активности линейно зависит от амплитуды полосы КПЗ, которая увеличивается по мере наскщешш белка ТПФ-ом. Это значит, что каталитическими свойствами обладают лишь те молекулы та, которые связываются с аг.оферментом через КПЗ, а образование КПЗ есть результат формирования истинного холофермент-ното комплекса.

Ионы магния являются существенным компонентом холоформы ПДГ» . так как их связывание комплексснами препятствует развитию полосы КГБ на спектре к блокирует ферментативную активность. Такие же до-следствия имеет замена кофермента структурно близким, но каталитически не эффективным аналогом 4-окси-ТПФ. Несмотря на наличие неизмененного тиазолового кольца и высокое сродство к апоферменту , (таблЛ), связь через ИЗ между 4-окси-ТПФ и белком не возникает.

Таким образом,.возвращаясь к вопросу о роли аминопиримидино-вой части молекулы ТЕФ в ферментативном катализе, следует подчеркнуть ее существенный вклад в образование каталитически активного ' холоферментного комплекса, способного к связыванию дирувата. Амино-яиримиднновое кольцо, обладающее большей ароматичностью по сравнению с оксипкримкданозым кольцом, по-видимому, оказывает влияние на состояние ионизации тиазолового кольца, вступающего через образование КПЗ в электронное взаимодействие с белковой группой,- с одной стороны, и обеспечивающего 2-карбанионный центр посадки для субстрата - с другой.

_ Мы показали, что КПЗ не является "застывшим" образованием в структуре действующего фермента. При взаимодействии холоформы с пируватом (или его аналогами) КПЗ распадается, о чем можно судить по исчезновению соответствующей полосы на спектре (рис.25 ,2) и вновь восстанавливается после освобождения активного центра ВДГ от продуктов реакции (рис, 25 ,3 ). Распад КПЗ при насыщении ЦЕГ ' субстратом, по-видимому, связан с исчезновением положительного заряда на четвертичном.азоте тиазолового кольца в одном из переходных состояний холофермента-субстрагного комплекса.

тазной реакции, осуществляемой реконструированным комплексом. То есть две зН-группы в тетрамериой молекуле ПДГ в равной степени важны для' (функции фермента, исг.ользуюпего для окисления "активного ацетальдегида" остатки липоевой кислоты полиферментного комплекса или нефизиологическин субстрат модельной реакции - 2,6-ДХФИ. Это позволяет выделить 2-ОЭТПФ:акцептор окскдоредуктазную активность ВДГ как тот минимальный участок сложного каталитического механизма, который зависит от состояния двух ¿Н-групп на моль ПДГ.

Для решения вопроса о принадлежности функционально важных ЙН-групп активным центрам фермента использовали бромпируват как близкий структурный аналог субстрата, способный алкилировать БК-группы белка, но, согласно контролю, не затрагивающий гистида-яовые остатки ПДГ. Изучение взаимодействия апо-ПДГ с бро!лдируватом (рис.16) показало, что процесс инактивации представляет собой сумму двух реакций.псевдопервого порядка, причем константы скорости для быстрой (К-г = I ,€6-103 ?ГЧшн-1) и медленной (^О.вВ'Ю3 ЬГ^мин"^) фаз инактивации различаются мелслу собой почти на два по-

рядка. ......

Рис.16. Скорость инактивации ПДГ в присутствии бром-пирувата. Концентрации: апо-ПДГ -4,5 мкМ, бромпируват - 0,87 мМ (I); 1,72 мМ (2); 3,33 мМ (3); 4,83 мМ (4); 5 - быстрая фаза инактивации, кривая 2. На врезке зависимость двойных обратных величин эф^ек-'. тавннх констант скорости инактивации в быстрой фазе (I) и медленной фазе инактивации (2).

ю » го »РЕМЯ.МИЙ

Зависимости кажущихся констант скорости инактивации апофер-лента от концентрации бромпирувата в быстрой и медленной реакции имеют кинетику насыщения. Это значит, что в быстрой и медленной составляющей процесса необратимой инактивации предшествует образование обратимого фермент-ингибиторного комплекса {Киг , 1962). Следовательно, бромпкруват взаимодействует с ПДГ как "метка по сродству", действие которой направлено в активные центры фермента. Другими слове;.".;?, сульфгидрильнке группы, модифицируемые в присутствии бромпирувата, принадлежат активным центрам фермента. Учитывая, что мышечная ЦДГ .имеет два активных центра на тетрамер, естественно допустить, что в каждом из них присутствует по одной 5Н-группе, существенной для ферментативной активности, но в разной степени доступной действию модификатора.

Для определения роли сульфгидрильккх групп в ферментативной активности исследовали влияние кофермента и субстрата яа кинетику взаимодействия ЕДГ с ¿Н-реагентами.

Полученные результаты показали, что уменьшение скорости инактивации холофермента происходит в результате уменьшения реакционной способности сульфгидрильных групп в холофоркё по сравнению с апо-ферментом. Бри экстраполяции к бесконечно большой концентрации ТПФ константа скорости модификации медленно реагирующих 5Н-групп и инактивации ПДГ в медленной фазе приближается к нулю. Таким образом, кофермент в достаточно большой концентрации способен полностью защищать ПДГ от действия 5Н-реагента в медленной фазе инактивации. В быстрой реакции полной защиты не наблюдается и при самой высокой концентрации кофермента. ,

Наиболее ярко особенность защитного действия ШФ проявляется в присутствии субстрат-подобного модификатора 5Н-трупп - бромпирувата. ¡Медленная стадия инактивации не обнаруживается уже при концентрациях ТПФ, близких к полунасвдению. В то же время защитное действие кофермента в быстрой фазе инактивации не выявляется даже в присутствии высоких концентраций ТПФ, на три порядка превышающих величину Кд ТПФ. Полученные результаты исключают возможнЬсть участия 5Н-групп в связывании кофермента. Этот вывод подтверждается фактом полного сохранения спосабкоети апо-ПДГ с модифицированными йН-группами связывать ТПФ в двух активных центрах с образованием в них комплекса с переносом заряда (см.табл.5).

Перейдем к анализу экспериментальных данных, голученных при изучении взаимодействия ПДГ с субстратом.

Отсутствие влияния шрувата на взаимодействие асо-ПДГ с .51!-реагентами делает маловероятным участие йН-групп в предварительной фиксации субстрата, как это бкло показано при дрожжевой гшру-ватдекарбоксилазы ( $сИе??еп-4егдес , 1966).

Добавление пирувата к холо-ПДГ в отсутствие второго субстрата реакции - лигаевой кислоты пли 2,6-ДХОИ - приводит к маскированию сульфгидрильнкх групп ПДГ, не существенных для ферментативной активности, и зависимости ферментативной активности от одной-двух 5Н-групп, остающихся доступными модификатору (рис.17). Эти результаты свидетельствуют о значительных перестройках структуры активных центров хо,Ю(|.еркента, происходят при его взаимодействии с субстратом и возможности кооперативного вэеимодействия неуду ними.

Рис.17. (А) Влияние пирувата на скорость инактивации и модификация ПДГ ДШБ-ом (-•-) - апо-ПДГ + ДТНБ, 52 мкМ; (-Д- ) -то же ■+• ТЕФ -М^,. 13,6 мкМ; (->- ) - то же пируват, 65 мкМ. (Б) - зависимость ферментативной активности от числа модифицированные ЛН-групп (вторичный график).

Следует-заметить, что аналогичные изменения реакционной способ-«ости сульфгидрильных групп апо-ВДГ происходят при взаимодействии с 2-ОЭТПФ. Это позволяет предположить, что именно образование 2-ОЭТПФ в активных центрах ПДГ в результате осуществления первой ступени пируватдегидрогеназной реакции является причиной маскирования ¿Н-групп, не существенных для активности фермента, в то время как две функционально важные группы сохраняют высокую реакционную способность. Учитывая вывод о том, что. для дегидрогеназной функции ПДГ существенны две сульфгвдэильныв группы (по "одной на активный центр),

Б

4 8 12 14 20

ВРЕМЯ, МИМ

0 2 4 6 8

мель ЭН/мольПАГ

.-редставляется вероятным, что функция этих групп может быть связано с окислительным превращением 2-ОЭТПФ. В этом случае изменение коиформеции активных центров холо-ПДГ, происходящее в результате присоединения субстрата, может рассматриваться как подготовительный этап к осуществлении дегидрогеназной реакции. По-видимому, перестройка структуры белка, выявляемая по изменению реакционной способности ¿"Н-грулп, является важным фактором осуществления де-гкдрогеназной активности фермента. Б результате такой перестройки бН-группы, не. Существенные для ферментативной активности, маскируются-, Оставляя на поверхности белка только те, которые являются функционально важными. Преимущественная зависимость ферментативной активности от. одной из них (рис.17) свидетельствует о полуцентровом характере модификации фермента сульфгидрильными реагентами.

8. Каталитический механизм пкруватдегидоогеназной реакции

ПДГ, изолированная из комплекса, катализирует первые ваги реакционной последовательности, завершающиеся образованием углекислоты и остатка ацетила. Зта реакция не зависит от липоевой кислоты, но нуждается в присутствии искусственных окислителей (pas el.aê. % 1961). Представление о механизме декарбоксилкрованмя пкрувата основано на доказательстве образования 2-0Э1ПФ в качестве промежуточного вещества. Окисление "активного ацетальдегида", образованного в активном центре ЩГГ в результате декарбоксилирования пирувата, происходит при взаимодействии с остатками липоата, ковалентно связанными с ферментом Eg. .'.Механизм реакции восстановительного ацети-лирования липоевой кислоты - наименее изученная стадия пируват-дегидрогеназной реакции; представление о ней основано на результатах 'немногих модельных исследований ( Bres^oW , 1962; UTkiU , Jnpakam, , 1962).

Образование 2-ОЭТПФ естественным образом делит сложную функцию ПДГ на две стадии, а использование 2-ОЭТПФ, синтезированного химическим путем или выделенного из реакционной смеси, позволяет исследовать окскдоредуктазную функцию фер.;екта независимо от первой реакции. Кинетика модельной реакции, использукадй в качестве субстратов 2-ОЭТПФ и искусственный окислитель, 2,6-ДХЗИ, в условиях фиксированной концентрацкк одного из субстратов реакции и изменении концентрации второго в координатах двойных обратных величин

имеет вид прямолинейных зависимостей с постоянным соотношением кажущихся величин Км/2Гмако> (рис.18). Подобные зависимости характерны для кинетического механизма типа "пинг-понг" ( С&2апс1 , 1973). Подчинение такому кинетическому механизму означает, что взаимодействие фермента с первым субстратом (2-ОЭТПФ) не зависит от присутствия второго субстрата (искусственного окислителя)и заканчивается образованием замененной формы фермента. Взаимодействие последней со вторым субстратом ведет к регенерации исходной формы фермента, способной к повторному циклу катализа. В случае реализации подобного механизма первой кинетической стадией 2-ОЭТПФ:акцептор окси-доредуктазной реакции должно быть взаимодействие некоторой белковой группы с промежуточным веществом, его окисление и перенос образующегося ацетила на белок. Роль внешнего окислителя в этом случае сводится к взаимодействию с восстановленной ацетил-замещенной '

регенерации свободного

|Рис.18. Зависимость | скорости модельной ре-:акции от концентрации 12-оксиэтил-ТПФ. ¡Концентрации 2,6-ди-1 хлорфенолиндофенола: I - 0,15 мкМ, 2 - 0,0? мкМ, 3-0,03 мкМ.

• Инактивация пирувагдегидрогеназы в присутствии субстратов. Независимые результаты в пользу участия белковой группы з ферментативном каталязэ была получены ара анализе.янгибаторного действия -кзтомасяяной'-кислоты, которое проявляется ясслз начальной фазы быстрота каталитического превращения данного аналога ферментом (рио.19). Процесс инактивации развивается во зременн м слезет кинетике первого порядка. Пируват защищает ВДГ от ингабяторного

формой фермента, восстановлению красителя и фермента.

„чйствия Ы.-квтомасляной кислоты, следовательно, аналог и пируват занимают одно и то же место на холофермекте, а процесс инактивации является ТПФ-зависимым. Значит, аналог субстрата не вступает в непосредственное взаимодействие с белком, но взаимодействует с ферментом аналогично пирувату, через ТПФ. Исследование взаимодействия ы -кетомасляной кислоты с холо-БДГ в различных условиях показало, что ингибнторное действие обнаруживается только тогда, когда в среде инкубации имеется окислитель. Следовательно,с^-кетомас ля пая кислота становится ингибитором ферментативной реакции после окисления продукта ее декарбоксклирования и образования про-пионил-фермента.

к; 1/»Г

0,6 -

Рис.19. Скорость инактивации ЩЗГ в присутствии различных концентраций Ы. -кетомасляной кислоты и постоянной концентрации пирува-та, 1,67 мМ.

2 4 6

[ <х-КЕТОМАСДЯИАЯ К-ТА] • ]<Г*М

Если допустить, что стабилизация непродуктивного пропионнль-ного.остатка, образующегося после декарбоксилироваиия и окисления о( -кетомасляной кислоты, происходит на уровне ТПФ, то скорость реактивации фермента в присутствии ТПФ-Кд и пирувата должна определяться скоростью диссоциации ТПФ от белка (при условии, что про-пионильная группа не закреплена дополнительно). Одг.ако проведенное нами исследование показало обратное - реактивация происходит гораздо медленнее (Ка = 0,035 мин"1) по сравнению со скоростью диссоциации ТПФ (Кдасс = 2 мин-1). То есть прошокильизя группа связана с белком не через ТПФ, который довольно быстро обменивается, а иначе, возможно, через какую-то белковую группу.

Данные рис. 20 (кривая I) показывают, что инкубация апо-ЦЕГ в присутствии ТПФ-^ к пирувата, без добавления внесних акцепторов электронов Еедет к инактивации фермента во времени. Инактивация ПДГ является ТПФ-эавиримой и определяется концентрацией пирувата:

наиболее высокая скорость инактивации отмечена в присутствии низких концентраций пирувата, с увеличением концентрации субстрата скорость инактивации уменьшается, а в пробах накапливаются продук тн ацилоиновой конденсации - ацетоин и сцетолактат. Скорость инак тивацяи уменьшается также в присутствии искусственных акцепторов электронов.

Рис.20. Инактивация (I) и

включение метки в белок

при взаимодействии холопи-г т4

руватдегидрогеназы с [2- > -пируватом.

Концентрации: 5 мкМ пирувы дегидрогеназа; 50 мкМ тиа-минпирофосфат; 100 мкМ Мс^С: 100 мкМ пиру ват.

51

3 и

то

Поскольку субстрат-зависимая инактивации ЩЕГ абсолютно зависит от присутствия кофермента, наиболее выражена при взаимодействия с низкой концентрацией субстрата и имеет место также при замене ТПФ н пирувата промежуточным продуктом ферментативной реакция, можно утверждать, что переход фермента в неактивное состояние включает начальные стадии катализа - образование холоферментативного комплекса - и декарбоксилярование пирувата с образованием с( -кар-банлона, При взаимодействии последнего с белковыми группами, со-эидимому, образуется замешенная,модифицированная форма фермента, которая в отсутствие субстратов-акцепторов переходит в неактивное состояние»

Доказательства образовання замещенного фермента в односуб-стратной реакционной смеси были получены в опытах с мечеными субстратом а кофзрментом» Мы показала, что субстрат-зависимая инактивация ПДГ сопровождается включением в белковую фракцию метки из [г-^чз] -парузатзд но на из -пирувата. Следовательно, с

белком связываемся лишь деяарбоксилированная часть молекулы субстрата. Вослз совобааденйя о? ннзкомодекулярных компонентов реакционной смеса аутеы гель-фильтрация на белка обнаруживается около одного моля -ТПФ на моль белка а гольво 0,3-0.4 моле

[2-^4с] -пирувата в тех же условиях (табл.4). Отсутствие стзхио-

метрических соотношений между содержанием кофермента и субстрата исключает возможность закрепления субстратной, группы на белке через ТПФ, а скорее указывает на возможность их независимого связывания.

Для более полного определения количества связанного субстра-' та с белком использовали метод фиксации белкового материала на . бумажном диске холодной 10$ трихлоруксусной кислотой с последующей отмывкой не связанных с белком компонентов спиртом и эфиром (М/xns , b/oveCf^ , 1961). Количество меченого субстратного остатка, связанного с белком,.определяли по разности между обаей величиной радиоактивности, осажденной на бумажных дисках, и остаточной радиоактивности, определенной после обработки дисков надмуравь-иной кислотой ( Barrera, et. al, 1972). На рис.20 видно, что инактивация ПДГ в присутствии кофакторов и [2-е] -пирувата сопровождается включением метки в белок в количестве около 1,5 моля на молекулу белка.

Связь субстратного остатка с белком стабильна в трихлоруксусной кислоте, метка полностью переходит в раствор при щелочной обработке белковой фракции (рН 9) и количественно разрушается в над-муравькной кислоте. Ба разностном спектре модифицированного субстратом белка появляется максимум при 235 нм, интенсивность которого пропорциональна концентрации белка (рис.21). Этот максимум стабилен в присутствии 4M мочевины, но исчезает в нейтральном гидрокскламине, в присутствии дитиотрейтола (ДТТ) или окисленной липоевой кислоты. Появлению максимума препятствует предварительная модификация SH-групл ПДГ. Бее это указывает на ацилткоэфирный характер данной связи.

Рис.21, Разностный спектр поглощения пируватдегкдрогеназы, инактиви-рованной в неполной реакционной смеси, относительно спектра поглощения хешофермента. 'Концентрации, пируват-дегидрогеназы: 0,5 -мкМ (I); I мкМ (2); 2 мкМ (3); то же, что (3), + 4M мочевина (4). Соотношение концентраций пируватдегкдрогеназь, тиаминпирофос-Фата, ¿VgCIg и пирувата во всех пробах равно соответственно 1:5:10:10.

Таблица 4

Содержание радиоактивности в белковой фракции после инкубации ЩГ в односубстратной реакционной смеси

№ Состав реакционной смеси [ 14с ]/Гпдг]

X ЩГ - 0,5-Ю~6М ТПФ - 5 • Ю"5М [2-14с]-пируваг 1.10"4М 1,2а) 0,12в)

2 ПДГ - 0,5'Ю~5М ТПФ - 5 • 10~5М [2-14с]-шруват I -10~4М 1,5а) 0,075в)

3 ПДГ - 1,5-НГ5М ТПФ - 1,3'Ю"5М М^СЬ, - 1»3-Ю"4М [2-14с]-гшруват 1,3-Ю~5М 0,35+0,05Й)

4 ПДГ - I • 1(ГаМ [2-14С]- ЯЗФ - 5-Ю_4М МдС12 - 5.10"3М Пируваг - 5-10~5М 0,92±0,6б)

а) белок, осажденный трихлоруксусной кислотой на бумажном диске; 0) обессоленный гель-фильтрацией; • в) белок , обработанный надоуравьиной кислотой.

Совокупность полученных результатов дает основание предположить, что взаимодействие холо-ПДГ с шруватом (или апофермента с 2-0ЭТПФ) в одаосубстратной реакционной смеси ве,цет к образованию ацетилтноферыента, который может быть промежуточным продуктом естественного каталитического механизма. Это предположение согласуется с данными'экспериментов, где пируватдегидрогеназа, инактивя-рованная в односубстратной реакционной смеси, восстанавливала ферментативную активность при ее включении в состав полиферментного комплекса путем добавления ферментов Е2 и Ед, в присутствии КоА и НАД*. Естественно предположить, что восстановление' ферментативной

активности в данном случае происходит потому, что ацетильные остатки и восстанавливающие эквиваленты в условиях реконструкции полиферментного комплекса передаются от модифицированных субстратом групп ПДГ на остатки липоевой кислоты, связанные с Е*,, и далее на КоА и БАД+.

Образование ацегилфермента в односубстратной реакционной смеси предполагает существование механизма внутримолекулярного окисления промежуточного о(-карбаниона в активных центрах ЕДГ с участием белковых групп. Возможно, что макроэргический ацетил первично образуется на уровне ТПФ, а потом передается на йН-групяу оелка. В пользу этого предположения говорят данные Фрей, которому удалось выделить ацетил-ТПФ из реакционной смеси {?геу , 1989). Однако без участия ЦДГ взаимодействия между ацетил-ТПФ и дагидроли-поатом не удалось наблюдать ни при каких условиях, что свидетельствует об участии аминокислотных остатков ПДГ в реакции восстановительного ацетилирования остатков лкпоата.

9. Остатки гистидина, существенные для активности ПДГ

Исследование скорости субстрат-зависимой инактивации.пируват-дегидрогенаэы при различных рН выявило важную роль ионогенной группы с величиной рКа, равной 6,4. Группой с подобной характеристикой может быть имидазольное кольцо гистидина. Эксперименты по фотоокислению и модификации ЦДГ диэтилпирокарбонатом также обнаруживают важную роль остатков гистидина для ферментативной активности. Ха-' рактерно, что модификация и инактивация ПДГ в присутствии диэтил-пирокарбоната, так же как при инактивации фермента вследствие модификации других функционально важных групп (см.табл.З), имеет двухфазную кинетическую характеристику. Порядок рег:сции в быстрой и медленной фазе инактивации относительно концентрации ингибитора близок к единице. Это значит, что инактивация фермента в присутствии даэтилпирокарсоната зависит от модификации двух, остатков гистидина на моль белка, обладающих различной реакционной способностью. Модификация этих групп в равной мере влияет йа скорость ■ пируват:НАД+, пируват:акцептор и 2-оксиэтил-тиамкнпирофосфат:ак-цептор оксидоредуктазккх реакций, катализируемых ферментом (табл. 3). Следовательно, инактивация фермента под действием даэтилпиро-кэрбоната объясняется нарушением одного и того же звена, обпего для всех 'исследованных реакций. Таким звеном является реакция образования и окисления, промежуточногос^-карСакпона в присутствии

искусственных оксидантов, либо в полиферментном комплексе.

Остатки гистидина, по-видимому, не участвуют в связывании тиаминпирофосфата, как это первоначально предполагалось нами, так как модифицированный диэтилпирокарбонатом апофермент (показано по образовании КПЗ) способен связывать кофермент. Скорость инактивации пируватдегидрогеназн при модификации остатков гистидина существенно уменьшается, если холофермент взаимодействует с пирува-том или его экологами, однако зашита ни в одном из случаев не является полной. Эти результаты исключают возможность участия остатков гистидина в связывании суОстрата. Скорее можно предположить, что имидазольная группа гистидина, так же как £Н-группа, ваяна для каталитического действия фермента, возможно участвуя в реакциях ацетилированяя-деацетилирозания фермента.

10. Кооперативное взаимодействие активных центров ПДГ в процессе катализа

Двухфазная кинетика инактивации ПДГ, обусловленная модификацией существенных остатков аргинина, цистеина, гистидина, может быть одним из проявлений межсубъединичных взаимодействий в олиго-мерной молекуле фермента. В пользу этого предположения говорит и стехиометрия ацетилирования ПДГ (большая единицы, но меньшая двух) при ее субстрат-зависимой модификации, а также кооперативное взаимодействие ПДГ с субстратом и коферментом.

Наиболее демонстративно кооперативные свойства ПДГ проявляются при взаимодействии с 2-ОЭТПФ, На рис.22 А видно, что насышениа ало-ПДГ 2-0ЭТГК> (кривая I) сопровождается появлением отрицательного эффекта Коттона при 330 нм подобно тому, как это наблюдали при' взаимодействии апо-БДГ с ТПФ (кривая 2). Однако максимальная амплитуда полосы КПЗ, индуцированной взаимодействием апофермента с промежуточным веществом, составляет лишь половину от получаемой для холоферментного комплекса.

Учитывая, что молекула 2-ОЭТПФ содержит ассиметричный атом углерода, а химический синтез промежуточного вещества ведет к получению рацемата', появляется возможность объяснить полученный результат' блокированием части активных центров непродуктивным связыванием неприродного стереоизомера. Чтобы проверить эту возможность, мы провели ферментативный синтез 2-ОЭТПФ и идентифицировали его на основании литературных данных- как Е (+)-стереоизомер \K9uger, дх4 ;

КЫцеГ , 198?, 1990). Оказалось, что природный моностереоизомер реагирует с апоферментом аналогично рацемату, то есть с половинной относительно холо-ОДГ интенсивностью полосы КПЗ. Безразличие' апофермента к пространственной ориентации групп промежуточного вещества свидетельствует об отсутствии стереоспецифичности актив-' ных центров ДИГ на стадии взаимодействия с интермедкатом.

Заниженную интенсивность полосы КПЗ могно было бы объяснить также следующим образом: I) структура КПЗ возникает в двух центрах, но его спектральная интенсивность ниже, если апофермент взаимодействует с 2-ОЭТПФ; 2) КПЗ при взаимодействии апо-ЩЕГ о 2-ОЭТИФ образуется только в одном из двух центров.

Выяснение этого вопроса было получено следующим образом. К апо-ПДГ добавляли один эквивалент И1Ф для заполнения первого центра и регистрировали появление полосы КПЗ. Ее амплитуда составляла 50$ от максимальной (рис.22 Б). После этого добавляли избыток 2-ОЭТПФ и наблюдали увеличение амплитуды спектра до 100%, то есть в два раза.

В следующей постановке опыта изменили порядок добавления лигандов: сначала апофермент насыщали 2-ОЭТПФ до максимального развития полосы КПЗ. Получали величину, равную 50%, характерную для насыщения первого центра, затем добавляли избыток ТПФ. Ко-фермент, по-видимому, заполнял второй центр, так как интенсивность полосы КПЗ опять удваивалась (100$) (рис.22 Б).

Результаты этих опытов показывают, что Т® и 2-ОЭТПФ, добавляемые к апоферменту в любой последовательности, способны взаимодействовать с активными центрами, расположенными на соседних субь-единицах, с образованием КПЗ, равной спектральной интенсивности. Появление полосы КПЗ с амплитудой, равной половине от максимальной при взаимодействии апо-ПДГ с 2-ОЭТПФ, свидетельствует о том, что промежуточное вещество реагирует только с одеш из двух активных центров фермента. Другими словами, 1ЩГ обладает полуцентровой реактивностью по отношению к 2-ОЭГБФ, которая проявляется в способности к одновременному взаимодействию с "активным ецётальдегидом" только половины от числа активных центров. При этом возможность одновременного взаимодействия с коферментом и промежуточным веществом соседних активных центров, по-видимому, не исключается.

Объяснение причин, лежащих в основе полуценгрового поведения ЕДГ в отношении Й-оксиэтил-ТШ, вытекает из предложенного нами ые-

ханизма действия фермента. Учитывая приведенные выше данные о "пинг-понг" механизме реакции окисления промежуточного вещества и субстрат-зависимой модификации ПДГ с образованием ацетилтио-фермента, представляется вероятным, что необходимым звеном каталитического механизма является стадия ковалентного присоединения окисленной молекулы субстрата к белку (ацетилирование), а затем деацетилирование и окисление соответствующих белковых групп.

В отсутствие второго субстрата превращение промежуточного вещества проходит только первую стадию и заканчивается образованием ацетилтиофермента. Отщепление молекулы субстрата от ТПФ восстанавливает структуру КПЗ в данном центре, о чем сигнализирует появление 50/&-ной амплитуды соответствующей полосы на спектре (рис.22 А, ¡фивая I), относящейся в данном случае не к адцукту апо-ПДГ - 2-ОЭТПФ, а к холофэрме, регенерируемой после ухода суб- ; стратной группы-от кофермента на белок. Аргументом в пользу такого заключения служит исчезновение полосы КПЗ при введении в среду инкубации апо-ПДГ + 2-ОЭТПФ пирувата, что аналогично взаимодействию субстрата с холо-ПДГ.

Модификация белка ацетилированием изменяет конформацию данной субъеданицн. Через белок-белковые контакты это сказывается на структуре второго активного центра, расположенного на соседней субъединице и исключает в нем возможность протекания аналогичного превращения промежуточного вещества. Если это предположение справедливо, тфвязывание ¿'Н-группи должно помешать осуществлению предложенного механизма, так как субстрат останется связанным с ТПФ и образование КПЗ в структуре белка будет заблокировано.

Модификацию ¿Н-группы проводили с помощью ДТНБ до величины остаточной активности, составляющей половину от максимальной, предполагая, что при этом затрагивается 5Н~группа только одного из центров. Данные .табл.5 показывают, что при насыщении модифицированного фермента 2-03ТПФ, полоса КПЗ на спектре не возникает, хотя этот же фермент связывает ТПФ в обоих активных центрах (КПЗ = 100$). Полученные результаты подтверждают вывод о том, что механизм, образования КПЗ при взаимодействии апофермента о промежуточным веществом связан с освобождением ИФ от остатка субстрата и являются еще одним аргументом в пользу участия Ш-групп в образовании замещенной формы фермента. Тот факт, что модификация <?Н-группы лишь одного из центров исключает возможность.окисления 2-ОЭТПФ в обоих цен-

трах функционального димера, свидетельствует об их согласованном действии в процессе катализа.

Если субстрат-зависимое сцетглировскиа- 5Н-группы в одном из активных центров препятствует осуществлению такого же превращения субстрата в соседнем центре, то, обеспечив условия деацилирования 5Н-групп, например, в присутствии дитиогреитола {ДТТ}, можно было бы наблюдать осуществление ферментативного превращения 2-ОЭТПФ в обоих активных центрах.

Опыт проводили в двух постаковках. В первой - к раствору апо-ПДГ, содержащему ДТТ, добавляли 2-ОЭТПФ и следили за разЕГТием полосы КПЗ на спектре. Получали максимальную величину молярной эллиптичности, характерную для фермента, содержащего ТПФ в двух активных центрах, то есть вдвое большую, чем при взаимодействии ПДГ с промежуточным веществом в отсутствии ДТТ (рис. 22Г).

В другой постановке опыта сначала проводили насыщение апо-ПДГ 2-ОЭТПФ. После того как величина молярной эллиптичности достигала своей предельной величины, характерной для образования холоформы только в одном из центров, добавляли ДТТ. Это приводило к увеличению интенсивности полосы КПЗ в два раза, причем ее максимальная величина соответствовала полученной в предыдущем опыте, то есть характерной для формирования двух кофермент-связывавщих центров (рис.22 В).

Как видно, в обоих случаях влияние деацилирующего реагента выражается в том, что взаимодействие 2-ОЭТПФ с ПДГ, идентифицируемое по развитию полосы КПЗ, становится аналогичны:« связыванию ТПФ по двум центрам. Это подтверждает вывод о том, что субстрат-зависимое ацетилирование одного из активных центров препятствует осуществлению аналогичного превращения 2-ОЭТПФ во втором центре до тех пор, пока не произойдет реакция деацилирования в первом центре. После деацилирования 6'Н-группы первого центра в нем остается только связанный кофермент, присутствие которого не мепзет превращению промежуточного вещества во втором центре. То есть 2-ОЭТПФ может превращаться во втором активном центре только после завершения каталитического акта в первом центре.

Совокупность полученных результатов .позволяет сделать вывод о том, что два активных центра ПДГ работают поочередно, оказывая влияние друг но друга таким образом, что в каждый данный момент времени в них протекают различные стала: каталитического механизма, как

это показано на рис. 23. Лимитирующим звеном, определяющим переключение катализа от одного центра на другой, является стадия деацетилирования белка, без осуществления которой механизм кооперативного катализа оказывается заблокированным.

Таким образом, мы показали, что межсубъединнчное взаимодействие в олигомерной молекуле ПДГ является существенным компонентом в катализе ферментативной реакции.

5

I с^*

2 О

<о

а2

и.

СП „

'о

Г&

5

сч 2 О

1* •0

гг-1 о

А

/ 1 1 ,, 1

1 2 10 - 1/[ПДГ]

Б Г / * -........ ' 1 ;" ' '

12 16 600 1200 М / [пдг]

2 4 8 12 1/[ПДГ]

8 12 I / [ПДГ]

Рис.22. (А) - изменения амплитуды полосы КПЗ при взаимодействии апо-ПДГ с 2-оксиэтшьТПФ (кривая I) по сравнению с насыщением апофермента Л1Ф (кривая 2);

(Б) - взаимодействие второго Активного; центра ПДГ с'ТТ1Ф (-•-) или с 2-оксиэтил-Т® {-в- ) после насыщения первого центра,- соответственно, 2-оксиэтил-ТПФ (-о- ) или Ш (-а- );

(В) - влияние дипюгрейтола на характер взаимодействия ПДГ

_ с 2-оксйэтил-ТШ, если ДГТ добавлен после, или

и) - вместе с 2-оксиэтил-ТПФ.

ТТ№

вчас

чОЭЩ>

> СН3С00-

Рис.23. Мэдель кооперативного взаимодействия'активных центров ЦДГ в процессе катализа. Заштрихован протомер - носитель комплекса с переносом заряда между остатком триптофана и ТПФ.

Таблица. 5

Взаимодействие ТПФ и 2-оксиэтил-ТПФ с пируватдегидро-геназой интактной или модифицированной по одному из центров

апо-ЦДГ

Взаимодействие с ТПФ

Взаимодействие с 2-оксиэтил-ТПФ

активность гд] ___

пируват-ак- [у] 330 щ цептор ок- % сидоредукт,

активность Глт 2-0ЭШиак- уколтш целтор онзи— ^¿«и™ доредукт, *

1. Кнтактный

2. Модифицированный • по одному центру:'

а) 4-0Н-ТПФ

б) ДТНБ

в) п-бромсукцинимид

100

45 55 30

100

42

89 50

44

I 0 0

46

О О О

II. Реализация кооперативного катализа ГИГ в составе лолиФерментного комплекса

Вию мы показали, что отрицательная полоса, появляющаяся на • спектре КД холо-ПДГ, отражает комплекс с переносом заряда, возникающий, между триптофановыми остатками белка и ТПФ (рис.8). Появление аналогичной полосы отмечено и на спектре полиферментного комплекса при его насыщении ТПФ (рис.24). Это свидетельствует о том, что реконструкция холоформы Е^ в составе полиферментного комплексы осуществляется так же, как изолированным ферментом в растворе.

Рис.24. Спектр КД пируватдегид-рогеназного комплекса: I - базовая линия; 2 - апоформа; 3 - холофермент.На врезке -разностный спектр, полученный вычитанием кривой 2 из 1фивой 3.

Добавление пирувата к насыщенному ТПФ полиферментному комплексу приводит к уменьшению интенсивности полосы КПЗ вплоть до ее полного исчезновения, что также аналогично тому, как это наблюдали для изолированной ПДГ (рис.25). Эффект пирувата в обоих случаях можно объяснить нарушением электронного .контакта в образующей КПЗ донорко-акцепторной паре - триптофан-Ш в результате связывания молекулы субстрата с 2-карбанионом кофермента.

В односубстраткой реакционной смеси пируват декарбоксилиру-ется с образованием 2-ОЭТИФ. Последний претерпевает внутримолекулярное окисление с образованием ацетил-тиофермента, а освобождающаяся при этом 2-карбанионная форма TDS, по-видимому, будет связывать новые молекулы субстрата, способнее, в свою очередь, превращается в 2-ОЭТПФ. Однако дальнейшие превращения промежуточного вещества лимитированы отсутствием в реакционной смеси субстратов-акцепторов. Таким образом, в.системе фермент + ТПФ + пируват полоса КПЗ

не обнаруживается из-за отсутствия свободной от субстрата холоформы ЩЕГ, что и наблюдается в эксперименте (рис.25а, кривая 2).

В ГЩ путь остатков ацетила продолжен за счет их перекоса от фермента Е^ на остатки липоата, ковалентно связанные с ферментом За счет реакций обмена между многочисленными остатками липоата, присутствующими в комплексе, число центров, способных акцептировать продукты превращения пирувата, существенно увеличивается. Поэтому для тушения полосы КПЗ, относящейся к полкферментному комплексу, необходима на порядок большая концентрация шрувата, чем в аналогичном эксперименте, проведенном с использованием такого же количества фермента Е| (рас. 25а, б, кривые 2).

Наличие деацилкрующих реагентов сдвигает равновесие в сторону освобождения холоформы. Поэтому добавление ДТГ в систему холофер-мент + пируват вызывает увеличение интенсивности голоси КПЗ до ее первоначального значения для ЦЦ, а также для фермента Е| (ряс.25 а, б, кривые 3). Это свидетельствует о появлении в обеих системах не связанной с субстратом холоформы Ер так как при наличии достаточной концентрации ДТТ в обеих системах осуществляется превращение всего добавленного субстрата.

й1с.25. Изменение интенсивности полосы комплекса с переносом заряда при взаимодействии пируватдегидротеназкых комплекса (а) и компонента (б).со специфическими лигакдами: ткамишшрофосфатом (I), пи-руватом (2), дитиотреитолом (3). Концентрации ппруватдегкдрогеназ-кпх комплекса - 1,84 мг/мл, коагонсктс - 1,03 мг/мл.

Переход от сравнительно простой системы (ПДГ компонент, действующий в модельных реакциях) к мультиферментному комплексу позволяет ближе подойти к расшифровке механизма естественной реакции. В связи с этим возникает вопрос о взаимодействии фермента с естественным акцептором ацетила - коэнзимом А. Данные рис. 26 показывают, что коэнзим А выполняет свою функцию акцептора ацетила только в системе с ПД, но не с ПДГ компонентом, так как только в первом случае его введение в реакционную смесь обеспечивает появление полосы КПЗ на спектре.связанной с освобождением холофюрмы Е^ от субстрата. Это значит, что в отличие от неспецифического акцептора ацетила (ДТТ) коэнзим А не участвует в реакции деацетилирования ¿Н-групп ПДГ, но выполняет свою акцепторную функцию исключительно на уровне ацетиллипоата. .

гН а

(У га <

" А

Л.

к

2 3 12 3

Рис.26. Действие датиотреитола (а) и КоА (б) на интенсивность полосы комплекса с переносом заряда на пнруватдегидрогеназних комплексе (заштрихованные столбики) и компоненте (незаштрихованные). К апоферменту (Г,6 мг/мл для пируватдегидрогеназного комплекса и 0.78 мг/мл для пируватдегидрогеназного компонента) последовательно добавляли 2-Ю"4 М тиаминпирофосфат (I), 2-Ю-4 М пируват (2), 8«Ю~3 М датиотреитол (За), 8-Ю"4 М КоА (36).

Результаты, полученные при исследовании динамики изменений с :ектра КД полиферментного комплекса при его насыщении ТПФ, взаимодействии с пируватом и нативнкм акцептором ацетила - коэнзимом А, подтверждают реальность реакционной последовательности, предложенной нами на основании изучения модельных реакций.

Выше мы показали,.что полуцентровое взаимодействие ПДГ, изолированной из полиферментного комплекса, с 2-0ЭТПФ объясняется кооперативным взаимодействием активных центров функционального димера фермента Е^ в процессе катализа модельных реакций. Возникает вопрос

сохраняется ли кооперативное поведение. ПДГ в интегральной структуре комплекса? Как видно из табл. 6 (.'¿ 5), ЦП взаимодействует с 2-ОЭТБФ (в эксперименте был использован И (+)-стереоизомер ин-термедиата, выделенный из реакционной смеси), в тех же количественных соотношениях, что и изолированная 1ЩГ, т.е. только в половине от общего числа активных центров. Об этом мокно судить по 50-процентному уровню спектральной интенсивности полосы КПЗ, наблюдаемой в присутствии насыщающей концентрации 2-ОЭТПФ. Для сравнения приведена величина амплитуды КПЗ ПД-наспшенного свободным ТПФ (табл.6, 1« 4). Таким образом, ПД комплекс так же, как его изолированный ПДГ компонент, проявляет полуцентровую реактивность по отношению к 2-ОЭГПФ в отсутствие субстратов-акцепторов ацетила.

Таблица 6

Изменение амплитуды полосы КПЗ ПД комплекса и ПДГ компонента, взаимодействующих с 2-оксиэтилтиаминпирофос-фатом в присутствии деацилирувдих реагентов

Состав реакционной смеси ' / ПД(ЦИГ),

мл/мг

I. ПДГ (0,82 мг/мл) + ТПФ (5'10_5М) 5,2 + 0,40

2. ПДГ (0,82 мг/мл) + ОЭТПФ (6,8-Ю~5М) 2,8 + 0,40

3.. й 2 + ДТТ (8,0-10"3М) 4,9 + 0,45

4. ПД (0,55 мг/мл) + ТПФ (4,5'Ю"5М) 10,2 + 0,60

5. ПД (0,55 мг/мл) + ОЭТПФ (4,5-10"%) 4,6 + 0,75

6. №'5 + ДТТ (5,6'Ю"3М) 10,4 2,10

7. й* 5 + КоА (Г,8-10~3М) 10,1 + 2,00

8. ПД (0,68 мг/мл) + Ко А

(2,7.Ю_3М) +■ ОЭТПФ (9,7.Г0"5М) 11,5 + 2,5(1

Результаты, представленные, в табл.6, показывают,.как изменяется интенсивность полосы КПЗ ГЩ-комплекса и, для сравнения, изолированного ПДГ компонента, реагирующих с природным энантиомером 2-ОЭТПФ после внесения в реакционную смесь деацилирушшх реагентов. В обоих случаю: наблюдаемое удвоение амплитуды полосы КПЗ в

ответ на добавление ДТТ может быть объяснено тем, что деацилиру-ющий реагент обеспечивает удаление субстрата из модифицированного центра. Это снимает ограничения для превращения интермедаата в соседнем активном центре. Освобождение ТИФ от субстрата в обоих центрах приводит к увеличению интенсивности полосы КПЗ вдвое, т.е. до величины, отражающей совокупность всех молекул ПДГ, присутствующих в комплексе.

В присутствии ДТТ, который не обладает избирательным действием, деацилированию подлежат, по-видимому, все ¿Н-группы: не только ПДГ, но и остатков липоата, связанного с комплексом. Представляло интерес исследовать поведение фермента в присутствии физиологического акцептора ацетила. Результаты, представленные в таблице 6 ('а 7, й 8), отражают последовательность добавления реагентов. Если коэн-зим А добавляли после образования КПЗ в половине активных центров ' в результате взаимодействия ДД комплекса с 2-ОЭТПФ, наблюдали удвоение амплитуды полосы КПЗ. При введении интермедаата в реакционную смесь, содержащую апофермент и коэкзим А, наблюдали максимальное развитие амплитуда полосы КПЗ, свидетельствующее о протекании ферментативной реакции в обоих центрах и их полном освобождении от субстрата в присутствии акцептора ацетила.

Полученные результаты свидетельствуют о сохранении кооперативного механизма катализа ПДГ при ее функционировании в составе полиферментного комплекса.

Межсубъединичние взаимодействия, связывающие симметричную структуру полифермектного комплекса в единый функциональный блок, исключают случайное функционирование его составных частей. Поэтому фермент, катализирующий лимитирующую скорость стадию (ПДГ-компонент в одноименном комплексе), будет навязывать свой рабочий ритм всей полиферментной системе (Гольдитейн, 1989). Какие преимущества получает полиферментная система в целом от реализации альтернативного катализа ведущим звеном?

Во-первых, реакционные стадии, разделенные во времени на каждом из центров, могут осуществляться одновременно на разных центрах ассиметричного' дамера. Учитывая наличие множественных молекул ПДГ в комплексе, это может дать существенный выигрыш в скорости.

Во-вторых, альтернативный катализ обеспечивает опосредованное белок-белковыми взаимодействиями сопряжение энергетически выгодных и невыгодных стадий катализа, что может обеспечивать его движущую

силу. Физическая интерпретация подобных кооперативных взаимодействий предложена в работе Карасева и др. ^Карасев, Стефанов и Курганов, 1989] .

вывода ■

I.Предложен модифицированный метод выделения высокоочищенных препаратов ппруватдегидрогеназного комплекса п одноименного компонента комплекса из грудных мышц голубя.

• 2. Методами электронной микроскопии п зонального электрофореза исследована макромолекулярная и субъединпчнал структура мышечного комплекса. Пцруватдегидрогеназпый комплекс содержит - и р -субъедишшы пирувагдетадрогеназного компонента с мол. массой, соответ ветствеино, 41 и 37 кДа, субъединицы лппоамидацетилтрансферазы с мол. массой 68 кДа н дигидролипоампддегидрогеназы с мол. массой 55 кДа. Субъедишщы лппоамидацетилтрансферазы образуют структуру пентагоналыгаго додекаэдра с осями симметрии 5:3:2.

3. Исследованы регуляторные свойства мышечного ппруватдегидрогеназного комплекса:

а) получены доказательства регуляции ферментативной активности посредством реакций фюсфорилированля-дефосфорилирования Ы- -субъ-едшиц ппруватдегидрогеназного компонента, катализируемых АТФ-завн-симой протепнкшазой и "^-зависимой фосфатазой, присутствующими в полиферментном комплексе;

б) доказана возможность регуляции активности мышечного комплекса концентрацией конечных продуктов реакции - ацетил коэнзнма А и НДДН;

в) показано гомотропяое взаимодействие пируватдегадрогеназн с пируватом и отрицательное кооперативное взаимодействие с тиампнпиро-фосфатом, указывающие на возможность регуляторного влияния кофермен-та и субстрата на активность полиферментного комплекса.

4. Исследованы функциональные группы и характер связывания тиа-мпшшрофосфата с шгруватдегидрогеназой. На основании анализа экспериментальных результатов и литературных данных для .активного центра пируватдегадрогеназн предложена каталитическая конформацпя тиамин-пдрофоефата, в которой а\сшо группа ппришдинового гольца сближена с 2-С атомом - центром посадки субстата. Аминогруппа существенна для образованиязоф^ективной связи тиазоловой части кофермента с белком

и образования 2-карбаюгана. Кофермент-связивающий центр исключает замены групп, у близлежащих 6-С пиримидиномго и 4-С атома тиазоло вого колец, введение гидрофобных заместителей в 2-С положение, не тлеет отрогах ограничений относительно размера и липофилыгости групп, стоящих при 2-С атоме пиримидиновоп части кофермента.

5. Исследованы молекулярные свойства пнруватдегидрогеназного компонента. Молекула пируватдегидрогеназы имеет структуру тетрамера

с двумя активными центрами равной каталитической эффективности, связывает две молекулы тиамнншроаойТата с велшпшами констант диссоциации ~10" .'.! и-10-^ М.

6. Методами химической модификации и спектрального анализа показано, что каждый из кофермент-связ'гоаэдих центров содержит остаток триптофана. Получены доказательства образования в холоформе пируватдегидрогеназы комплекса с переносом заряда между триптофановим остатком и молекулой тиаминпирофосфата. Качество связи между гай ер-ментом и белком изменяется в процессе катализа: комплекс с переносом заряда, свойственный холоформе, распадается при взаимодействии

с нируватом и восстанавливается после отщепления декарбоксплирован-пого субстрата от 2-карбаниона.

7. 3 связывающей субстрат области активных центров хологшруват-дегидрогеназн найдены два функционально важных остатка аргинина, различных по реакционной способности. Предполагается, что остатки арпшнна в каждом из центров взаимодействуют с карбоксильной группой пирувата. Определены ограничения связывающей субстрат области относительно размера &-группы субстрата до двухуглеродного звена.

8.В активных центрах пируватдегидрогеназы найдены две различные по реакционной способности сульфтадршгыше группы, существенные для 2-о1сснотпл-тиа,.сшппро<1осфат:акцептор оксидоредуктазной активности. Насыщение алофермента тиаминпирофосфатом усиливает различия в реакционной способности функциональных сульфгядрилышх групп, а взаимодействие холоформы с пируватом индуцирует информационный переход олпгомера, сопровождающийся маскированием несущественных сульфгид-рильных груш и появлением полуцентровоп реактивности функционально важных 5Н-групл в отношении модифицирующих реагентов.

9. Два существенных остатка гистидияа, обнаруженных в районе активных центров пируватдегидрогеназы, не принимают непосредственного участия в образовании холофермент-субстратного комплекса, но важны для превращения ферментом 2-оксиэтил-тиашнпирофосфата.

10. Взаимодействие холопируватдегидрогеназы с пируватом или апо-Фермента с 2-оксиэтил-тиа,.тнпирофосфатом ведет к офазовашш замещенной формы фермента. По данным физико-химического анализа замещенный фермент содержит одау-две ацегилтиэфирных связей и одну моле-• ; кулу прочно связанного тиашшпирофосфата. Предложен механизм действия пируватдегидрогеназы, согласно которому окисление 2-оксиэтиль-. .ной группы промежуточного вещества происходит без участия внешних акцепторов электронов с образованием мадроэргического ацетила на белке.

11. Показано полуцентровое взаимодействие агоппруватдегидрогена-зы с 2-оксиэтил-тиамин1шрофосхТагом, которое проявляется в одновременном образовании ацетшшгофермента голысо в одном из активных центров. Функциональная инверсия активных центров достигается реакцией деацетилирования белка. Неодинаковая реактивность одноименных. функциональных 1фупп, полуцентровое взаимодействие пируватдегидрогеназы со специфически!® лигандами отражает антикооперативное взаимодействие активних центров, осуществляющих альтернативный катализ ферментативной реакции, опосредованный меясубъеданнчныш взаимодействиями. Получены доказательства кооперативного функционирования яируватдегндрогеяазного' компонента в составе ыультпферментлого т-мллекса.

Принятые сообщения: ПД - шгруватдешдрогеназный комплекс ЩЦ1^ - пируватдегидрогеназный компонент ЛТЛ, - лппоашдацетилтрансфераза ЛДГ, Ед - дягидролипа-.шддегидфогеназа ТДФ - тиамшптрофосфат 2-ОЭТПФ г- 2-оксиэтил-тиаминпирофосфат КД - круговой дихроизм ЭК - эффект Коттона КПЗ - комплекс с переносом заряда н-БС - к-бромсукщшимид п-ХМБ - пара-хлорглеркурлбензоат ДГНБ - 5,5-датпобис-(2-питробензоат) ДГТ - датиотрейтол

Основные результаты диссертации представлены в следующих работах:

.1. Хайлова Л.С., Фейгина М.М., Георгиу С., Северин С.Е. Изучение четвертичной структуры мышечной пируватдегидрогвназы // Биохимия. 1972. Г.37. н.6. C.I3I22-I3I4.

2. Хайлова Л.С., Кереееа Д.К., Северин С.Е. Изучение активных групп мышечной пируватдекарбоксилазы методом фотоокисления в присутствии бенгальского розового // Украинский биох. журн. 1972.Г.44. Н.6. С. 718-721.

3. Хайлова Л.С., Северин С.Е., Кереева Д.Н. Доказательство участия остатков гистидинэ в формировании активного центра мышечной пируватдегидрогвназы // Тезисы докладов III Всесоюзного симпозиума "Структура и функция активных центров ферментов". Москва. Наука. 1976. С.39-40.

4. Хайлова Л.С., Северин С.Е., Юркевич Ю.М. Новые аспекты химии тиамина и механизм действия тиаминдифосфэта в реакциях окислительного и неокислитвльного декарбоксилирования «< -кетокислот // СО. "Коферменты". Москва. "Медицина". С.256-2290.

5. Хайлова Л.С., Фейгина М.М., Северин С.Е. Некоторые свойства пируватдегидрогвназы // СО. ""Структура и функция ферментов". Вып.2. МГУ. 1973. С.88-105.

6. Khailova L.S., Feigina М.М., Gomazkova V.S. Dehydrogenases of keto aoids and oontrol of their aotivities // Ergebnisse der Erperimentellen Medisin. 1974. V.18. P.135-144.

7. Северин C.E., ' Хайлова Л.С., Бвршсардт Р. Влияние С-4'-мрдификациитиаминпирофосфата на его коферментную активность в реакции окислительного декарбоксилировшшя пировиноградной кислоты // Украинский биохим. журн. 1976. Т.48. N.4. С.503-509.

8. Хайлова Л.С., Северин С.Е., Бернхардт Р. Кооперативное взаимодействие пируватэ с пируватдегидрогеназой, выделенной из грудных мышц голубя // Биохимия. 1976. Т.41. Н.8. С.1391-1396.

9. Хайлова Л.С., Кереева Д.Н., Северин С.Е. Тиаминпирофосфат . в активном центре мышечной пируватдегидрогвназы // Тезисы докладов III Всесоюзного симпозиума "Структура и функция активных центров ферментов". Ыоскеэ. наука. 1976. С.39-40.

10. Хайлова Л.С., Бернхардт Р., Хюбнер Г. Изучение кинетического механизма пируват-2,6-дихлорфенолиндо-фенол редуктазной активности мышечной пируватдегидрогвназы // Биохимия. 1977. Т.42. С.I13-117.

11. Hubner О., Bernhardt R., Sohellenberger A., Khailova b.S., Severin S.E. Inaotivation of the pyruvate dehydrogenase component from pigeon breast musole pyruvate dehydrogenase oomplex by -ketobutyrio aoid

•// FEBS Letters. 1977. V.84. N.1. P.179-182.

12. Khailova L.S., Severin S.E., Bernhardt R., Kereeva D.N. Pyruvate dehydrogenase oomplex. Structure and functions of the active site of the pyruvate dehydrogenase oomponent ft Abstracts of the 4th Joint Symposium of

. Biochemical Societies of USSR and GDH "Trioarbosylio aoid oyole and meohaniBme of ite regulation". Kiev. 1977. P.10-11.

13. Bernhardt R,f Khailova L.S., Hubner' 0., Pisher 0. Substrate epeoifioity of the pyruvate dehydrogenase

complex from pigeon breast muscle // Abstarats of the 4th Joint Symposium of Eioohemioal SooietieB of USSR and. GBR "Tricarboxylic aoid oyole and. mechanisms of ite regulation". Kiev. 1977. P.26.

14. Bernhardt R., Khailova L.S. , Neef H., Hubner G. Study of binding and conformation of thiamine pyrophosphate in the aotive site of pyruvate dehydrogenase from pigeon breast muscle // Abstracts of the 4th Joint SympoBium of Biochemical SooietieB of USSR and. GDR "Trioarboxylio aoid oyole and meohaniems of its regulation". Kiev. 1977. P.24-25.

15. Hubner G., Sohellenberger A., Bernhardt R., Khailova L.S. Inhibiting effect of=< -ketobutyrate on the activity of pyruvate dehydrogenase from pigeon, breaßt musole ff Abstracts of the 4th Joint Symposium of Biochemical SooietieB of USSR and GDR "Tricarboxylic aoid oyole and mechanisms of its regulation". Kiev. 1977. P.85-86.

16. Hubner G-, Neef H., Bernhardt R., Sohellenberger A., Khailova X.S. Two-oenters mechanism for the oxidative decarboxylation of pyruvate by the pyruvate deoarboxylating oomponent of the pyruvate dehydrogenase complex of pigeon breast muscle // FEBS letters. 1978. V.86. Ii.1. P.6-8.

17. Khailova X.S. , Bernhardt R. Pyruvate and thiamins pyrophosphatase alloeterio effectors of pyruvate dehydrogenase from pigeon breast musole // Abetraots of 12th FEBS Meeting. Dresden. 1978. N.2909.

18. Хайлова Л.С. Дэгвдрогеназы -к'втокиолот // Частная внзимология. Hypo лекций. МГУ. 1978. С.97-126.

19. Хайлова Л.С., Северин С.Е., Глемка A.A. Полиферматшый комплекс окислительного декарбоксилирования пирувата из, животных ' тканей // Сб. "ПолифермэЕТНые системы". Вильнюс. 1380. Т.2.' С.39-68.

20. Khailova X.S., Severin S.E. Modification of functionally important groups of musole pyruvate dshydrogenase //' Abstracts of th,e 6th Joint Symposium of Bxoohemioal SooietieB of GDR and USSR "Regulation iri metabolism and bioenergetios". Tallin. 1981. P.100.

21. Khailova L.B., Nemerya U.S., Severin S.K. Influenoe of phosphorylation of the deoarboxylating oomponent of pigeon breast muscle pyruvate dehydrogenase complex // AbstraotB of the 6th Joint Symposium of Bioohemioal Sooieties of GDR and USSR "Regulation in metabolism and bioenergetios". Tallin. 19B1. P.108.

22. Khailova L.S., Hubner G., Neef H. , Sohellenberger A., Severin S.E. Effect of pyruvate and ite analoge on thiamine pyrophosphate binding in the aotive centers og pigeon breast muscle pyruvate dehydrogenase. // AbBtr&ote of the 6th Joint Symposium of Bioohemioal Sooieties oi GDR and USSR "Regulation in iretaboliem and bioenergetios". Tallin. 1981. Г.60.

23. Хайлова Л.С., Лисова O.B. Модификация сульфгидрильных ■групп мышечной пируватдегидрогеназы 5,5'-дитиобис (2-нитробэнзоатом) '// Докл. АН СССР. 1981. Т.259. N.2.

С.505-508.

24. Khailova L.S., -Koroohkina L.G. Determination of the number of aotive oenters in the pyruvate dehydrogenase oomponent of the pyruvate dehydrogenase complex from

pigeon breast musole // Bioohem. Intern. 19S2. Y.5. N.4.P.525-532.

,25. Khailova L.S., Severin S.E., Hubner G., Neef H., Sohellenberger A. Effeot of pyruvate and itB analogs on the thiamine pyrophosphate binding in the aotive oentera of muBole pyruvate dehydrogenase // FEBS Letters. 1982. V.139- N.1. P.49-52.

26. Khailova L.S., Alexandrovioh 0."V., Severin S.E. Study on the role of SH-groups in the activity of muBole pyruvate dehydrogenase // Bioohem. Intern. 19ЭЗ. V.7. N.2. P.223-233.

27. Khailova L.S., Nemerya M.S., Severin S.E. The substrate-mediated inaotivation of the pyruvate dehydrogenase component of the pigeon breast muBole pyruvate dehydrogenase oomplex // Bioohem. Intern. 19B3. V.7. N.4. P.423-432.

28. Nemerya N.S., Khailova L.S., Severin S.E. Arginine residuee in the aotive oenterB of musole pyruvate dehydrogenase// Bioohem. Intern. 1984. V.8. N.3. P.369-376.

29. Koroohkina L.G., Khailova L.S., Severin S.E. localization of tryptophan residues in thiamine pyrophosphate binding sites of pyruvate dehydrogenase from pigeon breast musole // Bioohem. Intern. 19Э4. V.9. N.4. P.491-499.

30. Khailova L.S., Alexandrovich O.V., Severin S.E. Subetrate-dependent inaotivation of musole pyruvate dehydrogenase: identifioation of the aoetyl-Bubstituted enzyme form // Bioohem. Intern. 1935. V.10. N.2. P.291-300.

31. Khailova L.S., Koroohkina L.G. Half-of-the-eite reaotivity of the deoarboxylating component of the pyruvate dehydrogenase oomplex from pigeon breast muBole with reepeot to 2-hydrosyethyl thiamine pyrophosphate // Bioohem. Intern. 1985. V.11. N.4. P.509-516.

32. Хайлова JI.С. Структура и функция мышечной пируватдегидрогэназы // Тезисы докладов У Всесоюзной конференции по биохимии мышц. Тэлави. 1985. С.15.

33. Хайловв Л.С., Нвмэря Н.С., Лукин О.В. Локализация аргинина в субстрат-связыващих центрах мышечной пируватдегидрогэназы // Докл. АН СССР. C.I495-I498.

34. Корочкина Л.Г., Хайлова Л.С. Характеристика тиаминпирофосфат-связыващих центров мышечной пируватдегидрогвназы// Тезисы докладов УШ Объединенного симпозиума биохимических обществ СССР и ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии" Рига. 1985. С.94.

35. Хайлова Л.С. Рэгуляторная функция и каталитический • механизм двкврбоксилиругацего компонента пируватдегидрогеназного комплекса грудных мышц голубя //Тезисы докладов У Воэооюзного биохимического аъевда. Киев. 1986. С.64

36. Хайлова Л.С., Гомазкова B.C. Дегидрогеназы А-кетокиолот грудной мышцы голубя // Биохимия. 1986. Т.51. N.I2. С.2054-2074.

37. Severin S.E., Khailova L.S. , Gomazlcova V.S. Dehydrogenases of a-ketoaoids: essential groupe of the aotive oentere // Advances Enz. Reg. 1986. V.25. V. 347-375.

38. ХаЯлсша Л.С., Корочкина Л.Г., Северин С.Е. Идентификация каталитических центров декарбоксилирущего компонента мышечной пируватдегидрогеназы // Докл. АН СССР. 1937. Т.295. N.4. СЛ020-1023.

39. Хайлова Л.С., Курганов Б.И., Немеря Н.С., Давыдов Д.Р. Пируватдегидрогеназз грудных мышц голубя. Химическая модификация фермента, сопровождающаяся конформационным переходом // Молек. Оиол. 1987. Т.21. N.3. С.758-763.

40. Khailova L.S., Severin S.E. Tunotional groups of muBOle pyruvate dehydrogenase // Thiamine Pyrophosphate BioohemiBtry. CP.C Press. 1983. P.45-60.

41. Khailova L.S., KorooHkina L.Q., Severin S.E. Organization and Xunotioning of musole pyruvate dehydrogenase centers // Ann. N. Y. Aoad. Soi. 1989. V.573. F.36-54. '

42. Хайлова Л.С., Корочкина Л.Г., Бабурина И.А., Григорьева Ю. А. Роль межсубъедишгчных взаимодействий в функционировании и регуляции пируватдегидрогеназы // Тезисы докладов X Объединенного симпозиума биохимических обществ СССР и ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности". Ташкент. 1939. С.85.

43. Khailova L.S., Koroohkina L.G., Severin S.E. Struoture and funotion of musole pyruvate dehydrogenase. The pyruvate dehydrogenase component // AbetraotB of International symposium "Moleoular organization of biologioal struotureB". 19B9. P.142.

44. Khailova L.S., Koroohkina L.G., Severir. S.E. Intersite oooperativity in enzyme aotion of pyruvate dehydrogenase // BioohemiBtry and Physiology- of Thiamine Diphosphate Enzymes. Blaubeuren. 1991. P.251-265.

45. Корочкина Л.Г., Хайлова Л.С., Северин С.Е.-Исследование гшруватдегидрогеназного комплекса методом кругового дихроизма // Биохимия. 1991. Т.56. N.II.

{taiiacji/.

Подписано в печать 14.04.92. Заказ Формат 60x84/16 Тираж НО

Москва. Типография РАСХН

577