Исследование свойств субпопуляций мезенхимных стромальных клеток, различающихся по адгезии in vitro, из органов миелоидного кроветворения крысы

Молчанова, Евгения Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование свойств субпопуляций мезенхимных стромальных клеток, различающихся по адгезии in vitro, из органов миелоидного кроветворения крысы
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Исследование свойств субпопуляций мезенхимных стромальных клеток, различающихся по адгезии in vitro, из органов миелоидного кроветворения крысы"

На правах рукописи

МОЛЧАНОВА ЕВГЕНИЯ АНАТОЛЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СУБПОПУЛЯЦИЙ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО АДГЕЗИИ IN VITRO, ИЗ ОРГАНОВ МИЕЛОИДНОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ КРЫСЫ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

2010

Работа выполнена в лаборатории Гистогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Старостин Валерий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Бродский Всеволод Яковлевич

доктор медицинских наук, профессор, Дубовая Татьяна Клеониковна

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится « 8 » декабря 2010 года в «14» часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии

наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, г. Москва,

ул. Вавилова, д. 26)

Сайт: http://idbras.comcor.ru

e-mail: idbras@bk.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан « 8 » ноября 2010 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук e-mail: ele0806@yandex.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкий биологический и клинический интерес к изучению мезенхимных стромальных клеток (МСК) связан с уникальностью их свойств, таких как высокий пролиферативный потенциал, способность к самоподдержанию и дифференцировке во многие типы клеток соединительной и других тканей. Согласно современным представлениям, популяция МСК in vitro является гетерогенной и представлена стволовыми и родоначальными клетками различной степени зрелости. При этом содержание МСК в органах крайне мало (Digirolamo et al., 1999; Pittenger et al., 1999; Wexler et al., 2003), и для выделения, а также наращивания их численности используют различные методические приёмы. Однако ни один из известных способов не позволяет получить значительного числа равноценных по потенциям клоногенных МСК. Для выделения МСК как пост- так пренатального происхождения используют свойство этих клеток прикрепляться к пластику и формировать колонии. В большинстве исследований указывается на разное время прикрепления подавляющей части МСК, в пределах от 2- до 72-х часов (Фриденштейн и др., 1973; Castro-Malaspina et al., 1980; Derugina et al., 1995; Phinney et al., 1999; Yamada et al., 2000; Peister et al., 2004). Однако отсутствуют исследования, которые убедительно и в полной мере определили условия, необходимые для выделения и прикрепления всей популяции МСК. Не исключено, что в составе популяции МСК могут существовать клетки, которые проявляют свои адгезивные и клоногенные свойства после длительного пребывания во взвеси. Для исследования свойств клеток, отличающихся по адгезии к субстрату, возможно применение различных подходов. Одним из них является изучение чувствительности МСК к факторам роста, таким как эпидермальный фактор роста, EGF, основный фактор роста фибробластов, bFGF, и фактор рост, выделенный из тромбоцитов, PDGF, которые оказывают многостороннее влияние на процессы роста и дифференцировки клеток. Однако данные литературы по влиянию факторов роста на МСК в целом не однозначны и чувствительность к ним МСК разного органного происхождения практически не исследована.

Основными органами миелоидного кроветворения в пре- и постнатальный периоды онтогенеза являются эмбриональная печень и зрелый костный мозг соответственно. Всесторонний сравнительный анализ МСК из этих органов кроветворения, функционирующих в разные периоды онтогенеза и выполняющих сходную функцию в организации кроветворного микроокружения, позволит глубже исследовать биологию МСК, изменения их свойств в пре- и постнатальном онтогенезе, а также оценить степень их функциональной близости.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств субпопуляций МСК, различающихся по адгезии in vitro, из органов миелоидного кроветворения крысы, зрелого костного мозга и эмбриональной печени.

Были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить субпопуляции МСК, различающиеся по адгезии in vitro, из зрелого костного мозга и эмбриональной печени:

- по клопогонному потенциалу;

- по экспрессии поверхностных антигенов CD90, CD73, CD29, CD144 и рецепторов адгезии avp3, avp5, a5(il;

- по содержанию ранних остеогенных клеток-предшественников;

- по способности к индуцированной дифференцировке в остео- и адипогенном направлениях.

2. Оценить содержание менее зрелых 5-фторурацил-резистентных предшественников в стандартных культурах МСК из двух органов.

3. Сравнить влияние факторов роста EGF, bFGF, PDGF на субпопуляции МСК, различающихся по адгезии in vitro, из зрелого костного мозга и эмбриональной печени:

- на рост и колониеобразующую способность;

- на содержание ранних остеогенных клеток-предшественников;

- на остеогенную дифференцировку;

- на адипогенную дифференцировку.

Научная новизна. Впервые показано, что МСК в составе органов миелоидного кроветворения крысы, зрелого костного мозга и эмбриональной печени, отличаются по своим адгезивным свойствам, которые они реализуют постепенно в течение многократных переносов в новые культуральные флаконы на протяжении 4-6 недель. Впервые проведен анализ свойств субпопуляций МСК, различающихся по адгезии in vitro. Субпопуляции МСК в пределах исследуемых органов не отличаются по способности к клональному росту, потенциям к остео- и адипогенной дифференцировке, по поверхностному иммунофенотипу. В то же время субпопуляции МСК из двух органов различны по остеогенным потенциям. Проведен анализ влияния факторов роста на МСК в ходе индивидуального развития. МСК субопуляций в составе каждого органа обладают сходной чувствительностью к факторам роста EGF, bFGF и PDGF. Кроме того, показано, что в стандартной костномозговой культуре МСК in vitro доля резистентных к цитостатику 5-фторурацилу клеток сходна с таковой МСК печеночного происхождения.

Теоретическое и практическое значение. Результаты работы представляют существенный интерес для клеточной биологии и регенеративной медицины. Выявленные в процессе пролонгированного культивирования адгезивные субпопуляции МСК позволяют говорить о длительном сохранении в суспензии МСК, постепенно реализующих свой клоногенный потенциал. Суммарное количество клоногенных МСК субпопуляций в 6 - 8 раз превышает их число в стандартной популяции и представляет собой значительный резерв близких по свойствам МСК, никогда ранее не используемый в научных и практических целях. Пролонгированное культивирование субпопуляций МСК может представлять собой подход для изучения гистогенетического ряда стволовых клеток мезенхимного происхождения, многие этапы которого до сих остаются неизвестными. МСК, сохраняющие свои свойства в ходе длительного культивирования, были обнаружены в органах кроветворения крысы как пре-, так и постнатального происхождения, что даёт основания говорить о возможной универсальности такого поведения клеток в культуре.

Полученные данные расширяют представления о системе МСК в процессе индивидуального развития. Изучение влияния факторов роста на субпопуляции МСК, отличающихся по адгезии in vitro, имеет важное значение для понимания регуляции процессов пролиферации и дифференцировки стромальных родоначальных клеток.

Работа имеет важное практическое значение, так как в ней представлен простой и воспроизводимый метод получения значительной массы полноценных МСК, что в перспективе представляет интерес для практической медицины. Использованная схема культивирования МСК происходит без повреждающих воздействий на клетку, что существенно для применения МСК в медицинских целях. Предварительные опыты подтвердили присутствие субпопуляций МСК в культуре из зрелого костного мозга человека, что усиливает прикладной аспект подобных исследований.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2007, 2008), Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре на тему «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009), VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2010).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано II печатных работ. Из них статей в рецензируемых журналах, соответствующих Перечню ВАК - 4, тезисов докладов и материалов конференций - 7.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на йиЬ страницах, содержит таблицы, ЦС рисунков, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственного исследования, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего ЪЦ цитируемых источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Работа выполнена на 3-4-месячных самках крыс Wistar неинбредного разведения и на 16-суточных эмбрионах. В каждом опыте костный мозг получали от 3-х половозрелых крыс (бедренные и болыпеберцовые кости), а печень - не менее, чем от 10-ти эмбрионов.

Культура МСК из зрелого костного мозга и эмбриональной печени.

Культивирование МСК в стандартной монослойной культуре. Клеточную суспензию, полученную из костного мозга или эмбриональной печени в концентрации 1 х 106 клеток на 1 мл ростовой среды экплантировали в пластиковые флаконы и культивировали при 37° С в атмосфере 5% С02 в воздухе. Состав контрольной ростовой среды: среда а-МЕМ, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, 1% раствора 20 мМ L-глютамина (всё Hyclone, США). В контрольных культурах после 7-ми сут роста проводили смену среды и продолжали культивировать МСК костного мозга до 11-14 сут, а МСК эмбриональной печени 9-11 сут, то есть до формирования дискретных колоний.

Пролонгированное культивирование субпопуляций МСК. Для получения клоногенных МСК после 7-ми сут роста в стандартной культуре, не прикрепившиеся за это время к дну флакона суспензионные клетки переносили в новые флаконы, а прикрепившиеся клетки продолжали культивировать до образования видимых колоний. В дальнейшем суспензию клеток из костного мозга или эмбриональной печени последовательно переносили в новые флаконы каждые 7-мь сут роста и, по аналогии с описанной выше схемой, прикрепившиеся клетки культивировали до образования колоний (рис. 1).

Выросшие колонии фиксировали 96° этанолом в течение 30 мин и окрашивали по Гимза. Число колоний подсчитывали с помощью бинокулярной лупы. Величину колоний оценивали по их площади с помощью программы Image J (США).

Факторы роста. В экспериментах было использовано 3 рекомбинантных фактора роста человека - EGF, bFGF, PDGF (Sigma, США) в концентрациях от 1 до 10 нг/мл. При изучении влияния факторов роста на остеогенную и адипогенную дифференцировки их концентрация составляла: EGF - 10 нг/мл, bFGF - 5 и 20 нг/мл, PDGF - 10 нг/мл. Ростовые факторы добавляли в первичные культуры при посадке клеток и при каждой смене среды.

нп

AC 1 AC 2 AC 3 AC 4

2ч-7 сут 14 сут 21 28 «VT

Рис. 1. Схема пролонгированного культивирования МСК из кроветворных органов крысы. Обозначения: АС 1 - стандартная контрольная адгезивная культура; НП - популяция неприкрепившихся клеток; АС 2 - АС 4 - последующие адгезивные субпопуляции 2-4.

Анализ потенций МСК к дифференцировке.

Индукция остеогенной дифференцировки. МСК субпопуляций культивировали по описанной выше методике, рассаживали в 12-луночные культуральные планшеты в контрольную ростовую среду с добавлением остеогенных индукторов (10 мМ ß-глицерофосфата, 50 мкг/мл фосфата аскорбиновой кислоты и 10"8 М дексаметазона). Смену среды проводили каждые 3-4 сут. На 15-21 сут индукции клетки фиксировали. Для выявления очагов минерализации клетки окрашивали раствором ализиринового красного S (Sigma, США). Гистохимическую реакцию анализировали с помощью микроскопа Olympus АН - 3 (Япония). Оценку площади очагов проводили с помощью программы Image J (США).

Оценка остеогенных потенций. Содержание ранних остеогенных предшественников в стандартных культуральных условиях определяли по активности щелочной фосфатазы, выявляемой с помощью набора "Alkaline Phosphatase Kit" (Sigma, США).

Индукция адипогенной дифференцировки. По аналогии с предыдущей схемой, МСК субпопуляций рассаживали в контрольную ростовую среду. Через 3 сут при смене среды добавляли индукторы адипогенеза - 0.5 тМ индометацина, 100 нг/мл инсулина, 0.5 тМ З-изобутил-1-метилксантина, IBMX, 10"6 М дексаметазона. Смену среды проводили каждые 3-4 сут. Через 16-18 сут индукции клетки фиксировали и окрашивали раствором жирового красного О (Sigma, США).

Оценка влияния цитотоксического препарата 5-ФУ на МСК первичных культур. In vitro добавляли 5-ФУ (Sigma, США) в ростовую среду к первичным суспензиям из костного мозга и эмбриональной печени (10 х 106 кл/мл) в концентрации 50 мкг/мл и инкубировали клетки в течение 2 ч при +37° С в атмосфере 5% С02. Затем клетки отмывали, добавляли новую стандартную ростовую среду, помещали их во флаконы и культивировали 8-11 сут. Для оценки влияния препарата in vivo, животным за 1 сут до взятия костного мозга или извлечения эмбрионов вводили внутрибрюшинно 5-ФУ в дозе 150 мг/кг.

Выделение МСК из органов и их дальнейшее культивирование проводили как описано выше.

Иммуноцитохимический анализ. Исследование иммунофенотипа МСК всех популяций проводили по стандартной методике с использованием антител к CD90 (1:100, Abeam, Великобритания), CD73 (1:700, BD Pharmingen, США), CD29 (1:150) и CD144 (1:500, Abeam), рецепторам адгезии - avß3 (1:150), avß5 (1:150), a5ßl (1:100) (Abeam). Для анализа остеогенных потенций МСК использовали антитела к белкам внеклеточного матрикса остеокальцину, OCN (1:10, QED Bioscience, США) и костному сиалопротеину, BSP (1:3500, Chemicon, США), адипогенных потенций с использованием антител к маркеру зрелых адипоцитов ALBP (1:100, Abeam). Использовали вторые универсальные флуорисцентные антитела Alexa Fluor 488 (1:1000) или 568 (1:1000, Invitrogen, США). Ядра окрашивали Hoechst 33342 (1:1000, Sigma, США). Анализ реакции проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus 1X51 (Япония).

Клетки фиксировали 4 % раствором параформальдегида (PFA). Затем, последовательно инкубировали в 0.25% растворе Тритона Х-100, приготовленном на трис-солевом буфере (TBS) с добавлением 0.1% Твин 20 и в блокирующем растворе (0,1% Твин 20, 3% БСА, на TBS). После чего инкубировали клетки с первыми антителами, отмывали 0,01 M PBS и помещали в блокирующий раствор со вторыми антителами и Hoechst 33342. Затем промывали их и заключали в глицерин.

Цитофлуориметрический анализ. Провели количественный анализ экспрессии маркеров CD90 и CD73 МСК субпопуляций с помощью проточной цитофлуориметрии с использованием двойной флуоресцентной окраски. МСК снимали с поверхности пластика с помощью 0,25% раствора хемопсин/Версен (Sigma, США), фиксировали 4% PFA, промывали раствором FBS (0,01 M PBS, 1% БСА, 0,09% AzNa). Инкубировали клетки с первыми антителами CD90 (1:300) и CD73 (1:900) в течение ночи при 4° С, а затем со вторыми антителами Alexa Fluor 488 (1:1000, Invitrogen, США). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Cell Lab Quanta (Beckman Coulter, США). В одной пробе анализировали не менее 5000 событий. Уровень неспецифического связывания определяли по изотопическим контролям.

Статистический анализ. Опыты повторены 2-3 раза, в каждом варианте опыта использовали по 10 культуральных флаконов. Результаты обрабатывали статистически. Достоверность различий оценивали по ¿-критерию Стьюдента. Данные считали достоверными при р<0,05 (*), где р - показатель статистической значимости для оценки достоверности различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Характеристика различающихся по адгезии in vitro субпопуляций МСК из органов кроветворения крысы, зрелого костного мозга и эмбриональной печени.

Из зрелого костного мозга и эмбриональной печени крысы с помощью пролонгированного культивирования выделены МСК, длительно сохраняющие свои клоногенные свойства в суспензии и формирующие колонии-клоны на поверхности культуральных флаконов (пластике).

При переносе клеточной суспензии в различные сроки начального культивирования от 2-х часов до 7-ми сут максимальное число формируемых клоногенных МСК из зрелого костного мозга было обнаружено на 7-е сут in vitro (рис. 2). Таким образом, существенная часть популяции МСК в продолжение 7-ми сут in vitro остаётся в суспензии. При дальнейшем еженедельном переносе суспензионных клеток происходит прикрепление и последовательная реализация их клоногенных свойств. Субпопуляции клоногенных МСК, формируемые каждые 7 сут роста, из зрелого костного мозга и эмбриональной печени исследовали по ряду выбранных параметров.

Рис. 2. Колониеобразование МСК АС 1 и АС 2 из костного мозга в различные фоки начального культивирования. По оси абсцисс -время культивирования; по оси ординат - число клоногенных МСК на флакон.

Способность к колониеобразованию МСК субпопуляций. Клональный рост МСК из костного мозга и эмбриональной печени наблюдали в течение 42 и 30 сут культивирования соответственно. В течение этого времени МСК формировали ряд адгезивных субпопуляций (АС 1 - АС 7). Эффективность колониеобразования МСК была максимальной в АС 3 (костный мозг) и АС 2, АС 3 (эмбриональная печень) и превышала в обоих случаях таковую МСК стандартной АС 1 (рис. 3). МСК субпопуляций образовывали колонии в 1,5-2 раза быстрее, чем в стандартной АС 1, что свидетельствует об усилении скорости роста клеток, длительно пребывающих в суспензии. При этом в ряду субпопуляций число клоногенных МСК из обоих органов постепенно снижалось, что говорит об истощении пула МСК в суспензии.

Костный мозг

Эмбриональная печень

V *0 <0

О О О О О О >Г ^г <г т г ?

Рис. 3. Эффективность колониеобразования МСК в стандартной АС 1 и последующих субпопуляциях МСК из костного мозга и эмбриональной печени. По оси ординат - число клоногенных МСК на флакон. Условные обозначения (а): ■ -АС 1, И - АС 2 - АС 5/7.

Истощение популяции МСК из эмбриональной печени происходило быстрее (к 30 сут культивирования). Однако, суммарное число клоногенных МСК всех субпопуляций из двух органов было сходным и превосходило численность МСК контрольной стандартной АС 1 в 6 - 8 (рис. 4).

Костный мозг Эмбриональная печень

Таким образом, основной вклад в общую численность популяции МСК вносят субпопуляции клоногенных клеток, прикрепляющихся к пластику постепенно в процессе длительного культивирования.

Можно предположить, что прикрепление и рост МСК в процессе длительного культивирования при переносах происходит при действии факторов, выделяемых более зрелыми уже прикрепленными МСК. Так например, ранние стромальные КЗ-клетки вступают в активную пролиферацию под влиянием факторов, выделяемых более зрелыми МСК (1ауагоп et а!., 2001).

Стоит отметить, что по предварительным данным,

образование адгезивных субпопуляций

Т <о

Рис. 4. Суммарная численность субпопуляций МСК из костного мозга и эмбриональной печени в сравнении со стандартной АС 1. По оси ординат - число клоногенных МСК.

МСК обнаружено и при длительном культивировании клеток из зрелого костного мозга человека (неопуб. данные).

Эффективность клонирования МСК в ряду субпопуляций. На

протяжении 28 сут культивирования происходило значительное снижение содержания клеток в суспензии, тогда как число формируемых ими колоний в ряду АС 1 - АС 5 практически не менялось (рис. 5, а). Сравнив эффективность клонирования субпопуляций, получили прогрессивное увеличение доли клоногенных МСК в суспензии (рис. 5", б). Таким образом, в ряду последовательных субпопуляций эффективность клонирования МСК возрастала в десятки раз, что говорит о преимущественном сохранении в суспензии в основном высокопотентных клоногенных клеток, реализующих свой потенциал в процессе пролонгированного культивирования.

Рис. 5. Динамика численности клеток в суспензии (а) и изменение эффективности клонирования МСК АС 1 - АС 5 (б) на протяжении 28 сут in vitro. По оси ординат - число клеток в суспензии (а) и число клоногенных МСК на 1х106 клеток (б).

Содержание ранних резистентных к 5-ФУ МСК в стандартных культурах из двух органов. По аналогии с резистентностью к 5-ФУ, ранних кроветворных предшественников (пре-КОЕ-С) (van Zant, 1984), существует предположение, что устойчивостью к 5-ФУ характеризуются ранние родоначальные стромальные клетки. Согласно полученным данным, МСК стандартных культур АС 1 из двух органов сходны по чувствительности к цитостатику 5-ФУ in vitro (рис. 6). Однако чувствительность МСК костномозгового происхождения к 5-ФУ in vivo меньше таковой in vitro, а в культуре МСК из эмбриональной печени агент практически полностью уничтожает популяцию клоногенных клеток, что, вероятно, свидетельствует об их усиленной пролиферации в составе эмбриональной печени.

■костный мозг

□ эмбриональная печень

Рис. 6. Изменение числа клоногенных МСК в культурах АС 1 из костного мозга и эмбриональной печени при действии 5-ФУ in vitro и in vivo. По оси ординат - % колоний МСК от контроля.

5-ФУ in vitra 5-ФУ in vivo

Так, известно, что у плодов мыши 70 % клоногенных МСК в печени находятся в S-фазе клеточного цикла в противоположность покоящимся МСК из зрелого костного мозга (Versele et al., 1987). Причиной неодинаковой чувствительности к 5-ФУ клеток in vivo из разных источников может быть влияние органного микроокружения.

Иммуноцитохимический и цитофлуориметрический анализ экспрессии поверхностных маркеров МСК субпопуляций. Пока не найдено уникального маркера, характеризующего МСК (Dominici et al., 2006). В связи с чем, для идентификации МСК в культурах используют различные наборы антигенов. К наиболее характерным относят CD90 (Thy-1), CD73 (экто-5'-нуклеотидаза), CD29 (pi субъединица интегриновых рецепторов), экспрессия которых была выявлена на поверхности МСК субпопуляций АС 1 - АС 4 из двух органов. Иммуноцитохимический анализ показал, что большинство клеток стандартных АС 1 и последующих АС 2 - АС 4 из обоих органов несли антигены CD90 и CD73 (Рис. 7). Полученные данные подтвердили с помощью метода проточной цитометрии. Так, CD90 экспрессируют до 99 % МСК субпопуляций из костного мозга и 82 - 97 % - МСК из печени. Маркер CD73 несут на своей поверхности до 98 % МСК субпопуляций из костного мозга и 62 - 96% МСК из эмбриональной печени. Таким образом, в процессе пролонгированного культивирования субпопуляций из двух органов стабильно сохраняется фенотипический профиль клоногенных МСК.

Кроме того, по данным иммуноцитохимии, более 97 % МСК субпопуляций АС 1 - АС 4 из обоих органов экспрессировали маркер CD29. Также абсолютное большинство клеток АС 1 - АС 4 несли на своей поверхности рецепторы адгезии av|33, avp5 и а.5[31 - уровень их экспрессии МСК из обоих органов был стабильно высоким (>98 % окрашенных клеток) и не менялся в ходе пролонгированного культивирования. CD 29 (субъединица (31 интегрина) является основным участником процессов адгезии клеток к внеклеточному матриксу и входит в состав различных рецепторов, и в частности av(33, ccvp5, а5{31, которые опосредуют взаимодействие с различными белками ВКМ (Aplin, 1998; Docheva et al., 2008).

СО 90 ♦ Hoechst CD /3 • Hoechst CD 50 • Hoechst ■» . CO 73 «• Hoechst

АС1 AC1

ifj-

АС 2 ' СО 90 ♦ Hoechst I % АХ - » .. , CD 73 ♦ Hoechst M О < CO 90 ♦ Hoechst CO /3 ♦ Hoechst

CD 90 . Hoechst CD 73 » Hoechst CD 90 ♦ Hoechst CD 73 ♦ Hoechst

о О < "V ' * 1 ' ' Щ n О <

* < CD 90 ♦ Hoechst , X ' CO 73 * Hocchst • АС 4 CD 90 ""Vocclp'ti i ^ * IV ? CO 73 ♦ Hoechtt J • %

Рис. 7. Экспрессия антигенов CD90 и CD73 на МСК субпопуляций АС 1 - АС 4 из двух органов, иммуноцитохимическое окрашивание. Ядра окрашены Hoechst (синий).

В работе не выявили изменений в составе выбранных рецепторов адгезии, что говорит о том, что уже прикрепившиеся МСК сходны между собой и, вероятно, процесс адгезии связан с постепенным «созреванием» ранних родоначальных клеток и приобретением ими характерных особенностей в адгезивном комплексе. Таким образом, исследуемые субпопуляции МСК АС 1 - АС 4 из обоих органов характеризуются сходным иммунофенотипом, а именно экспрессируют поверхностные антигены CD90, CD73, CD29 и рецепторы адгезии avß3, ctvß5, ct5ßl.

Остеогенные потенции и способность к дифференцировке в костную ткань субпопуляций МСК. Способность к остеогенезу является определяющим свойством МСК (Dominici et al., 2006). Об остеогенных потенциях МСК субпопуляций судили на основании анализа содержания ранних остеогенных предшественников в стандартной условиях культивирования, а также с помощью направленной дифференцировки клеток в костную ткань. Ранние остеогенные клетки выявляли по активности фермента щелочной фосфатазы (ЩФ), характерного маркера детерминированных в остеогенном направлении клеток. В культурах МСК субпопуляций из костного мозга выявляли значительное число ЩФ+-клеток, которое варьировалось в пределах от 60 до 90 % (рис. 8).

Костный мозг

Эмбриональная печень

□ кол-во неокр. колоний МСК

■ % колоний МСК, содержащих ЩФ+~ клетки

Рис. 8. Соотношение колоний МСК, содержащих ранние остеогенные предшественники с активностью ЩФ из двух органов. По оси ординат - доля колоний, %.

Что касается эмбриональной печени, в исследуемых субпопуляциях АС 1 -АС 4 содержание ЩФ+-клеток было снижено. Кроме того, активность фермента также была ниже, чем в культурах МСК из костного мозга (рис. 8). Слабая активность ЩФ в культурах МСК субпопуляций из печени пренатального онтогенеза свидетельствует о низком содержании в ней ранних остеогенных предшественников.

В процессе индуцированного остеогенеза МСК претерпевают ряд морфофункциональных изменений. Известно, что основным признаком терминальных этапов костной дифференцировки является минерализация внеклеточного матрикса (ВКМ), синтезируемого остеогенными клетками. В процессе индуцированной дифференцировки МСК субпопуляций костномозгового происхождения выявили их способность к интенсивному остеогенезу. Уже на 11 - 12 сут in vitro в культурах всех субпопуляций МСК из костного мозга были обнаружены скопления остеогенных клеток полигональной формы и небольшие участки ВКМ. К 21 сут индукции процессы остеогенеза значительно усиливались, что выражалось в появлении множественных очагов минерализации (рис. 9), высоком уровне экспрессии специфичных маркеров зрелых остеобластов, остеокальцина и костного сиалопротеина, что характеризует выраженные потенции МСК всех субпопуляций из костного мозга к остеогенезу.

В то же время, способность к остеогенной дифференцировке МСК субпопуляций из эмбриональной печени была существенно ниже по сравнению с таковой клеток костномозгового происхождения. Так, на ранних этапах индукции (11 - 12 сут) отсутствовали признаки остеогенеза, а к 21 сут культивирования обнаруживали небольшие скопления клеток типичной полигональной формы и редкие участки минерализованного костного матрикса (рис. 9). Иммуногистохимическое окрашивание этих участков выявляло в них остеокальцин, что свидетельствует о способности МСК из эмбриональной печени к реализации полноценной, хоть и слабой, программы остеогенеза.

Рис. 10. Адипогенез субпопуляций МСК АС 1 - АС 4 (а - г) из костного мозга (А) и эмбриональной печени (Б). Окрашивание жировым красным О.

Рис. 9. Минерализованный матрикс с отложениями солей кальция в культурах МСК АС 1 -АС 4 (а - г) из зрелого костного мозга (А) и эмбриональной печени (Б). Окрашивание ализариновым красным Б.

Таким образом, МСК субпопуляций в пределах каждого органа обладают сходными остеогенными потенциями. В тоже время низкая способность МСК субпопуляций из эмбриональной печени к остеогенезу по сравнению с костномозговыми клетками свидетельствуют о реализации неодинаковых программ развития в онтогенезе.

Потенции к адипогенной дифференцировке МСК субпопуляций.

Основным показателем адипогенеза, характерной для МСК, служит появление в цитоплазме клеток включений нейтрального жира. В результате индуцированного адипогенеза МСК наблюдали образование множества жировых клеток и их скоплений в культурах субпопуляций из обоих органов. В ряду МСК АС 2 - АС 4 через 18 сут культивирования также, как и в стандартной АС 1, присутствовали множественные адипоциты (рис. 10), что говорит о сохранении способности к данному типу дифференцировки в процессе пролонгированного культивирования.

С помощью имуногистохимического окрашивания выявили в культурах субпопуляций МСК (АС 1 - АС 4) из обоих органов маркер жировой дифференцировки АЬВР, экспрессия которого характерна для функционально зрелых адипоцитов (рис. 11).

Таким образом, клетки субпопуляций обладают хорошо выраженным адипогенным потенциалом, при этом их значительная часть способна к терминальным этапам дифференцировки. Важно подчеркнуть, что выраженность дифференцировки МСК из эмбриональной печени в адипогенном направлении, в отличие от остеогенного, была сравнима с таковой МСК из костного мозга.

И. Чувствительность субпопуляций МСК из зрелого костного мозга и эмбриональной печени к факторам роста ЕО Р, ЬРСР, РОС Г.

Влияние факторов на рост и эффективность колониеобразования субпопуляций МСК. Было получено, что субпопуляции МСК из двух органов сходны по чувствительности к ЕСР. Фактор в концентрации 10 нг/мл стимулирует колониеобразование АС 2 и 3 МСК из костного мозга, и субпопуляций МСК АС 1 - АС 3 из эмбриональной печени (рис. 12, а, г). При этом увеличение числа колоний МСК АС 1 из костного мозга наблюдали при действии ЕОР в дозе 1 нг/мл. Таким образом, МСК стандартных культур из двух органов обладают чувствительностью к ЕОР, но к его различным дозам.

В то же время, МСК из двух органов отличались по чувствительности к ЬРОБ. Фактор в концентрации 5 нг/мл подавлял эффективность колониеобразования МСК АС 1 - АС 3 из костного мозга, и не влиял на число формируемых колоний МСК субпопуляций из эмбриональной печени (рис. 12,

РБОР (10 нг/мл) не оказывал действия на эффективность колониеобразования МСК стандартных АС 1 из обоих органов, но приводил к увеличению числа колоний в АС 3 из костного мозга и в АС 2, 3 из эмбриональной печени (рис. 12, в, е).

Рис. 11. Экспрессия маркера АЬВР (а) в культурах субпопуляций МСК из двух органов. Иммунофлуоресцентное окрашивание. а" -совмещение

изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных Hoechst (а').

б, д).

АС1 AC2

AC 1 AC 2 AC3

Рис. 12. Эффективность колониеобразования субпопуляций МСК при действии ЕвР (10 нг/мл), ЬРвР (5 нг/мл) и РОвИ (10 нг/мл). По оси ординат -число клоногенных МСК на 1х106 клеток.

□ контроль ■ EGF

ДС1 АС2 АСЭ

о контроль ■ bFGF

ACI АС2 АСЗ

D контроль ■ PDGF

При этом в субпопуляции АС 2 из костного мозга наблюдали 2-кратное увеличение размеров формируемых колоний МСК, что свидетельствует об усилении роста клеток. Факторы EGF и bFGF не влияли на размеры (средняя площадь) колоний МСК субпопуляций из обоих органов.

Влияние факторов роста на остеогенные потенции субпопуляций МСК. Факторы роста принимают активное участие в регуляции потенций МСК к дифференцировке. Увеличение числа ЩФ+-клеток в культурах МСК наблюдали только при действии bFGF (5 нг/мл) (рис. 13). Фактор приводил к увеличению числа ранних остеогенных предшественников с активностью ЩФ в субпопуляциях МСК АС 1 - АС 3 из костного мозга, но не из эмбриональной печени. Факторы роста EGF (10 нг/мл) и PDGF (10 нг/мл) не оказывали влияния на число ранних остеогенных ЩФ+-клеток в субпопуляциях МСК из двух органов.

■ колонии МСК, сод. а 50 % ЩФ+-клеток и колонии МСК, сод. < 50 % ЩФ+-клеток □ неокрашенные колонии МСК

Рис. 13. Влияние bFGF (5 нг/мл) на активность ЩФ в культурах МСК АС 1 - АС 3 из костного мозга. По оси ординат - доля колоний, %.

Что касается индуцированного остеогенеза, то ЕОБ (10 нг/мл) не влиял на реализацию остеогенных потенций МСК всех субпопуляций (АС 1 - АС 4) из костного мозга. В то время как ЬБвР (5 и 20 нг/мл) и РООР (10 нг/мл) вызывали значительное усиление костной дифференцировки МСК исследуемых субпопуляций (рис. 14). Так, при действии факторов площадь очагов остеогенеза возрастала в среднем с 30 до 90 %, а время их формирования сокращалось с 21 до 14 - 17 сут. При увеличении концентрации ЬРйР до 20 нг/мл размер очагов остеогенеза дополнительно возрастал.

АС 1 АС 2 АС 3 АС 4

Рис. 14. Интенсификация остеогенеза под влиянием ЬБОР (5 нг/мл) и РБОР (10 нг/мл) АС 1 - АС 4 МСК из зрелого костного мозга. ОС - остеогенная индукционная среда. Гистохимическое окрашивание участков минерализации ализариновым красным Э.

Кроме того, по данным иммуноцитохимического анализа при действии ЬРвР в культурах всех субпопуляций МСК из костного мозга (АС 1 - АС 4) увеличивалось содержание остеокальцина и костного сиалопротеина (рис. 15).

В ходе индуцированного остеогенеза МСК субпопуляций из эмбриональной печени фактор роста ЕйР (10 нг/мл) не влиял на реализацию остеогенных потенций клеток. При действии ЬРвР (5 и 20 нг/мл) и РОСР (10 нг/мл) в индукционной среде наблюдали незначительное усиление остеогенеза во всех исследованных субпопуляциях (рис. 16), что выражалось в увеличении в 1,5-2 числа ЩФ+-клеток, размеров редких участков отложения солей Са2+, а также их количества в среднем в 2 раза. Кроме того, действие ЬРвР (5 нг/мл) и РБйР приводило к увеличению числа остеогенных клеток, экспрессирующих остеокальцин в АС 1 - АС 4.

Таким образом, МСК субпопуляций из двух органов различны по своим остеогенным потенциям и по влиянию факторов роста на них.

Рис. 15. Усиление экспрессии продукта терминальных этапов остеогенной дифференцировки остеокалыдана, OCN, в культурах МСК из костного мозга при действии bFGF (5 нг/мл). Иммуноцитохимическое окрашивание, а", б" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных Hoechst (синий) (а\ б').

АС 1 АС 2 АС 3 АС 4

и о

■О +

Рис. 16. Влияние ЬБвР (5 нг/мл) и РОйБ (10 нг/мл) на индуцированный остеогенез АС 1 -АС 4 МСК из эмбриональной печени. ОС - остеогенная индукционная среда Гистохимическое окрашивание участков минерализации ализариновым красным в.

Влияние ЬРСГ на адипогенную дифференцировку субпопуляций МСК. В индукционной среде ЬРОБ (5 и 20 нг/мл), возможный триггер между остео- и адипогенными программами дифференцировок, усиливал адипогенез субпопуляций АС 1 - АС 4 МСК как костномозгового, так и печеночного происхождения. К 15 - 18-м сут культивирования с №ОР в 2 - 3 раза увеличивалось число зрелых мультилокулярных адипоцитов, а также формируемых ими кластеров и крупных агрегатов (рис. 17). Увеличение концентрации фактора с 5 до 20 нг/мл приводило к дополнительному усилению адипогенеза субпопуляций МСК. Действие ЬРОР на МСК из эмбриональной печени проявлялось не столь ярко, однако фактор также усиливал процессы адипогенеза субпопуляций (рис. 17). Иммуноцитохимический анализ выявил увеличение числа клеток, экспрессирующих маркер зрелых адипоцитов АЬВР при действии ЪРвР в культурах всех исследуемых субпопуляций из обоих органов.

Таким образом, субпопуляции МСК в пределах каждого органа обладают сходной чувствительностью к факторам роста. В то же время, МСК различного органного происхождения отличаются по влиянию на них исследуемых факторов.

А Костный мозг Б Эмбриональна» печень

АС 1 ДС2 АС! АС 2

+ ЬГСР, 5 нг/мл

20 нг/мл

Рис. 17. Адипогенез МСК АС 1 - АС 2 из костного мозга и эмбриональной печени при действии ЬРОР (5 и 20 нг/мл). Прижизненная фазово-контрастная микроскопия (А) и окрашивание жировым красным О (Б).

выводы

1. Показано, что в популяции МСК из зрелого костного мозга и эмбриональной печени крысы кроме клеток, прикрепляющихся к пластику культуральных флаконов в течение первых 7-ми сут культивирования, во взвеси присутствует популяция клоногенных клеток, адгезивные свойства которых реализуются в процессе пролонгированного культивирования на протяжении 4-6 недель (АС 2 - АС п). При этом суммарное число клоногенных МСК из всех субпопуляций в 6 - 8 раз больше численности МСК стандартной культуры.

2. Субпопуляции МСК, различающиеся по адгезивным свойствам, как из зрелого костного мозга так и из эмбриональной печени сходны по клоногенному потенциалу, экспрессии поверхностных антигенов CD 90, CD 73, CD 29 и рецепторов адгезии avp3, av(?5, a5pi и способности к выраженному адипогенезу.

3. МСК субпопуляций из костного мозга обладают значительной способностью к остеогенезу, в то время как МСК субпопуляций из эмбриональной печени характеризуются слабыми остеогенными потенциями.

4. МСК стандартных культур из двух органов сходны по чувствительности к цитотостатику 5-ФУ in vitro, тогда как in vivo МСК из костного мозга более устойчивы к его действию, чем клетки из эмбриональной печени.

5. МСК субпопуляций в пределах каждого из изученных органов обладают сходной чувствительностью к действию факторов роста EGF, bFGF, PDGF на эффективность колониеобразования, рост, потенции к остео и адипогенной дифференцировкам.

6. МСК субпопуляций из костного мозга и эмбриональной печени отличаются по влиянию bFGF и PDGF на колониеобразование, рост колоний, индуцированный остеогенез; на число ранних остеогенных клеток-предшественников влияет только bFGF.

7. МСК субпопуляций из двух органов сходны по чувствительности к действию EGF на колониеобразование, рост колоний, число ранних остеогенных клеток-предшественников и индуцированный остеогенез; а также по стимулирующему влиянию bFGF на индуцированный адипогенез.

Список печатных работ опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:

1. Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., Буеверова Э.И., Никонова Т.М., Буторииа H.H., Молчанова Е.А., Старостин В.И. Анализ чувствительности родоначальных клеток стромы (КОЕ-Ф) костного мозга и эмбриональной печени крысы к 5-фторурацилу // Известия РАН. Серия биол. 2006. № 6. С. 660 -666.

2. Буеверова Э.И., Брагина Е.В., Молчанова Е.А. Неадгезивные популяции в культурах мезенхимных стромальных клеток из кроветворных органов крысы и мыши // Онтогенез. 2008. Т. 39. № 6. С. 420 - 429.

3. Молчанова Е.А.. Паюшина О.В., Старостин В.И. Влияние факторов роста на мультипотентные стромальные клетки костного мозга // Известия РАН. Серия биол. 2008. №. 6. С. 645 - 662.

4. Молчанова Е.А.. Буеверова Э.И., Старостин В.И., Домарацкая Е.И. Чувствительность к действию факторов роста EGF, bFGF и PDGF субпопуляций мезенхимных стромальных клеток, происходящих из органов миелоидного кроветворения и отличающихся по времени проявления адгезивных свойств / Известия РАН. Серия биол. 2010. Принято к печати.

Тезисы конференций:

1. Молчанова Е.А.. Брагина Е.В., Буеверова Э.И. Сравнительный анализ действия факторов роста на мезенхимные родоначальные клетки костного мозга и эмбриональной печени крысы in vitro // Цитология. Тезисы докладов II съезда общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. 2007. Т. 49. № 9. С. 778.

2. Молчанова Е.А. Чувствительность к ростовым факторам мезенхимных стромальных клеток костного мозга и эмбриональной печени крысы, отличающихся по адгезии к пластику // Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР имени Н.К. Кольцова РАН. Онтогенез. 2008. Т. 39. № 4. С. 316.

3. Молчанова Е.А. Дифференцировочные потенции неадгезивных и адгезивных субпопуляций мезенхимных стромальных клеток из костного мозга крысы // Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР имени Н.К. Кольцова РАН. Онтогенез. 2009. Т. 40. № 4. С. 315.

4. Буеверова Э.И., Молчанова Е.А. Неадгезивные субпопуляции клоногенных родоначальных клеток кроветворной стромы костного мозга крысы и человека - модель для исследования гетерогенного пула полипотентных мезенхимных стромальных клеток (MCK) in vitro П Тезисы докладов всероссийского симпозиума по биологии клетки в культуре на тему «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий». Цитология. 2009. Т. 50. № 9. С. 755.

5. Молчанова Е.А., Буеверова Э.И. Влияние факторов роста на мезенхимные стромальные клетки неадгезивных субпопуляций из костного мозга крысы // Цитология. Тезисы докладов всероссийского симпозиума по биологии клетки в культуре на тему «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий». 2009. Т. 50. № 9. С. 779.

6. Молчанова Е.А., Буеверова Э.И. Характеристика субпопуляций мезенхимных стромальных клеток (МСК) из костного мозга крыс in vitro, отличающихся по адгезии, и их потенции к дифференцировке под действием факторов роста bFGF и PDGF // VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород. 2009. Сборник тезисов. С. 75.

7. Молчанова Е.А.. Буеверова Э.И., Старостин В.И. Анализ иммунофенотипа, дифференцировочных потенций и чувствительности к bFGF субпопуляций мезенхимных стромальных клеток (МСК), различающихся по адгезии, из костного мозга и эмбриональной печени крысы // VII Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». Москва. 2010. Сборник тезисов. С. 126 - 127.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проекты 06-04-48209, 09-0400002), Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ НШ -1134.2008.4.

Работа выполнена при использовании оборудования Центра коллективного пользования «По биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов» на базе Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Формат 60x90/16. Заказ 960. Тираж 100 экз. Подписано в печать 02.11.2010 г.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Молчанова, Евгения Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Мезенхимные стромальные клетки. Биологические свойства МСК.

1.1. Уникальные собенности МСК.

1.2. Гетерогенность популяции МСК и её дифферон.

1.3. Способы выделения МСК.

1.4. Антигенный иммуннофенотип МСК.

1.5. Кинетика роста и пролиферативный потенциал МСК.

1.6. Потенции МСК к дифференцировке МСК.

1.6.1. Остеогенный потенциал МСК.

1.6.2. Адипогенный потенциал МСК.

2. Особенности МСК пренатального периода развития.

3. Функция создания кроветворного микроокружения МСК в преи постнатальном онтогенезе.

4. Теоретическое и практическое значение МСК.

5. Адгезия МСК к субстрату и её влияние на свойства клеток.

5.1. Особенности адгезии МСК к субстрату.

5.2. Влияние адгезии на МСК.

6. Влияние факторов роста на МСК in vitro.

6.1. Факторы EGF, bFGF, PDGF и их влияние на рост МСК.

6.2. Влияние факторов роста на потенции МСК к дифференцировке.

6.2.1. Регуляция факторами роста остеогенного потенциала МСК.

6.2.2. Контроль bFGF адипогенной дифференцировки МСК.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Приборы, материалы, реактивы.

2.2. Культура МСК из зрелого костного мозга и эмбриональной печени.

2.3. Анализ потенций МСК к дифференцировке.

2.4. Иммуноцитохимический и цитофлуориметрический анализ.

2.5. Статистический анализ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Характеристика различающихся по адгезии in vitro субпопуляций МСК, из органов кроветворения крысы, зрелого костного мозга и эмбриональной печени.

3.1.1. Колониеобразующая способность МСК исследуемых субпопуляций.

3.1.2. Эффективность клонирования МСК в ряду субпопуляций.

3.2.3. Морфологические особенности МСК субпопуляций.

3.1.4 Влияние цитотоксического агента 5-фторурацила (5-ФУ) на МСК стандартных культур АС 1.

3.1.5. Иммуноцитохимический и цитофлуориметрический анализ экспрессии поверхностных маркеров МСК субпопуляций.

3.1.6. Оценка остеогенных потенций и способности к дифференцировке в костную ткань МСК субпопуляций.

3.1.7. Оценка способности МСК субпопуляций к адипогенной дифференцировке.

3.2. Чувствительность МСК субпопуляций из зрелого костного мозга и эмбриональной печени к факторам роста EGF, bFGF, PDGF.

3.2.1. Влияние факторов роста на способность к колониеобразованию МСК субпопуляций.].

3.2.2. Рост клоногенных МСК субпопуляций под действием факторов.

3.2.3. Морфология клеток в колониях, образуемых МСК субпопуляций, при действии факторов роста.

3.2.4. Влияние факторов роста на остеогенные потенции МСК субпопуляций.

3.2.5. Влияние фактора роста ЬБСР на адипогенную дифференцировку МСК субпопуляций.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование свойств субпопуляций мезенхимных стромальных клеток, различающихся по адгезии in vitro, из органов миелоидного кроветворения крысы"

В последние десятилетия внимание многих исследователей направлено на изучение биологии мезенхимных стромальных клеток (МСК). Широкий биологический и клинический интерес к изучению МСК связан с уникальностью их свойств, таких как высокий пролиферативный потенциал, способность к самоподдержанию и дифференцировке во многие типы клеток соединительной и других тканей. В настоящее время МСК используют для изучения многих проблем клеточной биологии и биологии развития. В частности, исследуют гистогенетические ряды различных типов мезенхимных клеток, процессы регенерации органов и тканей, вопросы создания кроветворного микроокружения и механизмы регуляции роста и дифференцировки МСК.

Впервые МСК были выделены из кроветворных и лимфоидных органов А.Я. Фриденштейном с сотрудниками, которые предложили метод выращивания in vitro колоний-клонов костномозговых фибробластоподобных клеток (КОЕ-Ф - колониеобразующие единицы фибробластов), позволивший анализировать свойства стромальных клеток -предшественников (Friedenstein et al., 1970; Friedenstein, 1976). В настоящее время МСК обнаружены во многих тканях млекопитающих и человека, однако основным их источником в период постнатального онтогенеза является костный мозг (Prockop, 1997). Также МСК обнаружены в органах и тканях эмбрионального происхождения - области аорто-гонадомезонефроса, селезенке, печени и костном мозге (Van den Heuvel et al. 1987; Campagnoli et al., 2001; int'Anker et al., 2003; Guillot et al., 2007). Присутствие МСК в строме кроветворных органов связано с их активным участием в регуляции функционирования клеток гемапоэтического ряда. Однако, МСК из большинства исследуемых органов не способны организовывать и переносить кроветворное микроокружение in vivo. В пренатальный период онтогенеза основным органом миелоидного кроветворения является эмбриональная печень (Metealf, Moore, 1971; Rios, Williams, 1990), MCK которой, формируют микроокружение для гемапоэтических клеток. В процессе пренатального онтогенеза происходит миграция- клеток гемапоэтического ряда, которые последовательно заселяют различные транзиторные кроветворные органы и в постнатальном периоде колонизируют костный мозг (Muller et al., 1994; Kumaravelu et al., 2002). В связи с непосредственной ролью MCK в поддержании кроветворения, существует предположение о подобной миграции МСК в ряду гемапоэтических органов пренатального периода развития организма, что может говорить об общности происхождения МСК из зрелого костного мозга и эмбриональной печени (Campagnoli et al., 2000, 2001; Mendes et al., 2005). Такое предположение о миграции МСК подтверждается фактом присутствия этих клеток в кровотоке зародышей (Campagnoli et al., 2001; Yu et al., 2004; Mendes et al., 2005; Guillot et al., 2007). Всесторонний анализ МСК из основных органов кроветворения, зрелого костного мозга и эмбриональной печени, функционирующих в разные периоды онтогенеза и выполняющих сходную функцию в организации кроветворного микроокружения, позволит глубже исследовать биологию мезенхимных клеток-предшественников, изменения их свойств на протяжении индивидуального развития организма, а также оценить степень их функциональной близости. Однако, несмотря на сходство выполняемых функций, МСК из зрелого костного мозга и эмбриональной печени функционируют в* различных органах и периодах развития, в результате чего находятся в неидентичных условиях локального тканевого окружения, обладают неодинаковой кинетикой роста и способностью к самоподдержанию (Guillot et al., 2007). Кроме того МСК из этих органов обладают неодинаковыми потенциями к остео- и адипогенезу (Campagnoli et al., 2001; Charbord et al., 2002; In't Anker et al., 2003; Gotherstrom et al., 2005; Guillot et al., 2007). В то же время данные об дифференцировочных потенциях МСК из эмбриональной печени малочисленны и нуждаются в дополнительных исследованиях.

Согласно современным представлениям, популяция МСК in vitro является гетерогенной и представлена стволовыми и родоначальными клетками различной степени зрелости. При этом содержание МСК в органах крайне мало (DiGirolamo et al., 1999; Pittenger et al., 1999; Wexler et al., 2003), и для выделения, а также наращивания их численности используют различные методические приёмы. Однако, ни один из известных способов не позволяет получить значительного числа равноценных по потенциям клоногенных МСК. Большинство исследователей для выделения МСК как пост- так пренатального происхождения используют свойство этих клеток прикрепляться к пластику и формировать колонии (Friedshtein et al., 1970, 1978; Caplan, 1991; Prockop, 1997; Guillot et al., 2007). Этот экспериментальный подход, предложенный ещё Фриденштейном, в настоящее время широко применяется при изучении МСК различного происхождения. Способность к адгезии к пластику культуральных флаконов является особенностью МСК, отличающей эти клетки от кроветворных и многих других типов. Большинство авторов указывают на разное время прикрепления подавляющей части МСК, в пределах от 2- до 72-х часов (Фриденштейн и др., 1973; Castro-Malaspina et al., 1980; Derugina et al., 1995; Phinney et al., 1999a; Yamada et al., 2000; Tanaka - Douzono et al., 2001; Hung et al., 2002; Peister et al., 2004). Однако отсутствуют исследования, которые убедительно и в полной мере определили условия, необходимые для выделения и прикрепления всей популяции МСК. Не исключено, что в составе популяции МСК могут существовать клетки, которые проявляют свои адгезивные и клоногенные свойства после длительного пребывания во взвеси. Для исследования свойств клеток, отличающихся по адгезии к субстрату, возможно применение различных подходов. Одним из них является изучение чувствительности клеток к факторам роста.

Большое число работ посвящено изучению механизмов' регуляции пролиферативных и дифференцировочных потенций клеток факторами роста. Среди множества факторов большое внимание уделяется исследованию эпидермального фактора роста, EGF, основного фактора роста фибробластов, bFGF, и фактора роста, выделенного из тромбоцитов, PDGF, которые оказывают многостороннее влияние на процессы роста и дифференцировки МСК. Влияние этих факторов на колониеобразование, рост и способность к направленной дифференцировке в остео- и адипогенном направлении МСК из зрелого костного мозга, согласно литературе, выявляет противоречия (Locklin et al„ 1995; Hanada et al., 1997; Satomura et al., 1998; Kratchmarova et al., 2005; Tamama et al., 2006), Так, no разным данным, EGF и bFGF оказывают как стимулирующее, так и подавляющее действие на дифференцировку МСК из костного мозга в остеогенном направлении, в то время как вопрос об участии PDGF в регуляции процессов костной дифференцировки МСК пока остаётся открытым. Кроме того, слабо изучено участие такого фактора как bFGF в регуляции процессов адипогенеза МСК. В то же время чувствительность к факторам роста МСК из эмбриональной печени практически не исследована.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств субпопуляций МСК, различающихся по адгезии in vitro, из органов миелоидного кроветворения крысы, зрелого костного мозга и эмбриональной печени.

Были поставлены следующие задачи: 1. Сравнить субпопуляции МСК, различающиеся по адгезии in vitro, из зрелого костного мозга и эмбриональной печени:

- по клоногенному потенциалу;

- по экспрессии поверхностных антигенов CD90, CD73, CD29,

CD144 и рецепторов адгезии avP3, av|35, a5(31;

- по содержанию ранних остеогенных клетокпредшественников;

- по способности к индуцированной дифференцировке в остео- и адипогенном направлениях.

- на рост и колониеобразуюхцую способность;

- на содержание ранних остеогенных клеток-предшественников;

- на остеогенную дифференцировку;

- на адипогенную дифференцировку.

Научная новизна.

Впервые показано, что МСК в составе органов миелоидного кроветворения, зрелого костного мозга и эмбриональной печени, отличаются по своим адгезивным свойствам, которые они реализуют постепенно в течение многократных переносов в новые культуральные флаконы на протяжении 4-6 недель. Впервые был проведен анализ свойств субпопуляций МСК, различающихся по адгезии in vitro. Субпопуляции МСК в пределах исследуемых органов не отличаются по способности к клональному росту, потенциям к остео- и адипогенной дифференцировке, по поверхностному иммунофенотипу - выявлен высокий уровень экспрессии

CD90, CD73, CD29 и интегриновых рецепторов адгезии a5pi, a3(31, al|35, не обнаружена экспрессия антигена CD 144. В то же время субпопуляции МСК из двух органов различны по своим остеогенным потенциям. МСК

11 субпопуляций из костного мозга обладают интенсивной способностью к адипо- и остеогенезу, в то время как МСК из эмбриональной печени также характеризуются выраженными адипогенными потенциями, но весьма слабой способностью к остеогенезу.

Оценено влияние факторов роста EGF, bFGF и PDGF на МСК в ходе индивидуального развития. Проведен сравнительный анализ действия этих факторов на клоногенный рост, пролиферативный потенциал и дифференцировочные потенции субпопуляций МСК. МСК субопуляций в составе каждого органа обладают сходной чувствительностью к выбранным факторам роста. bFGF и PDGF усиливают остеогенную дифференцировку субпопуляций МСК в индукционной среде. EGF не влияет на остеогенные потенции МСК из обоих органов. bFGF оказывает стимулирующее действие bFGF на адипогенез субпопуляций МСК. В то же время субпопуляции МСК из костного мозга и эмбриональной печени отличаются по влиянию факторов bFGF и PDGF на колониеобразование, рост и остеогенные потенции.

Кроме того, показано, что в стандартной костномозговой культуре МСК in vitro доля резистентных к цитостатику 5-фторурацилу клеток сходна с таковой МСК печеночного происхождения.

Теоретическое и практическое значение.

Результаты работы представляют значительный интерес для клеточной биологии и регенеративной медицины. В настоящее время существует представление о том, что все клоногенные МСК прикрепляются к культуральной поверхности за короткий (до 3-х сут) срок начального культивирования: Выявленные спустя эти сроки в процессе пролонгированного культивирования адгезивные субпопуляции МСК позволяют говорить о длительном сохранении в суспензии МСК, постепенно реализующих свой клоногенный потенциал, вплоть до 6 недель. Суммарное число клоногенных МСК всех адгезивных субпопуляций в 6 - 8 раз превышает таковое стандартной популяции и представляет собой значительный резерв близких по свойствам МСК, никогда ранее не

12 используемый в научных и практических целях. Пролонгированное культивирование МСК может представлять собой подход для изучения гистогенетического ряда стволовых клеток мезенхимного происхождения, многие этапы которого до сих остаются неизвестными. МСК, сохраняющие свои свойства в ходе длительного культивирования, были обнаружены в органах кроветворения крысы как пре, так и постнатального происхождения, что даёт основания говорить о возможной универсальности такой модели поведения клеток в культуре.

Полученные данные расширяют представления о системе МСК в процессе индивидуального развития. Изучение влияния факторов роста на субпопуляции МСК, различающихся по адгезии in vitro, имеет важное значение для понимания регуляции процессов пролиферации и дифференцировки стромальных родоначальных клеток.

Работа имеет практическое значение, так как в ней представлен простой и воспроизводимый метод получения значительной массы полноценных МСК, что в перспективе представляет интерес для практической медицины. Использованная схема культивирования МСК происходит без серьёзных стрессовых и иных повреждающих воздействий на клетку, таких как пассирование, заморозка и других, что существенно для использования МСК в медицинских целях. Важно отметить, что предварительные опыты подтвердили присутствие различающихся по адгезии субпопуляций МСК в культуре из зрелого костного мозга человека, что усиливает прикладной аспект подобных исследований.

Изучение действия факторов роста представляет практический интерес с целью оптимизации процессов роста и дифференцировки МСК в медико-биологических исследованиях. Результаты исследования могут учитываться при проведении биомедицинских исследований. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курса лекций по клеточной биологии и биологии развития.

Публикации результатов исследования и апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены на П Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2007, 2008), Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре на тему «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009), УП Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Из них статей в рецензируемых журналах, соответствующих Перечню ВАК - 4, тезисов докладов в материалах конференций - 7.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Молчанова, Евгения Анатольевна

выводы

2. Субпопуляции МСК, различающиеся по адгезивным свойствам, как из зрелого костного мозга так и из эмбриональной печени сходны по клоногенному потенциалу, экспрессии поверхностных антигенов CD90, CD73, CD29 и рецепторов адгезии av(33, av(35, a5(31 и способности к выраженному адипогенезу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Молчанова, Евгения Анатольевна, Москва

1. Анохина Е.Б., Буравкова Л.Б. Гетерогенность стромальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга крыс // Цитология. 2007. Т. 49. № 1.С. 40-47.

2. Домарацкая Е.И., Старостин В.И., Прянишникова О.Д. Влияние 5-фторурацила на клоногенные кроветворные клетки (КОЕ-С) зародышей и половозрелых мышей // Изв. РАН. Сер. биол. 1995. № 4. С. 398 402.

3. Домарацкая Е.И., Буеверова Э.И., Паюшина О.В., Старостин В.И. Повреждение алкилирующим препаратом дипином кроветворных и стромальных клеток костного мозга// Изв. РАН. Сер. биол. 2005. № 3. С. 267 272.

4. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. Пущино: Аналитическая микроскопия, 2003. 84 с.

5. Панюхин Н.В., Вишнякова Х.С., Егоров Е.Е. Влияние парциального давления кислорода на выживаемость, пролиферацию и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга мыши // Биологические мембраны. 2008. Т. 25. № 5. С. 352 359.

6. Старостин В.И., Домарацкая Е.И., Буеверова Э.И., Брагина Е. В. Чувствительность к 5-фторурацилу кроветворной стромы костного мозга и селезёнки // Изв. РАН. Сер. Биол. 1995. № 4. С. 496 500.

7. Стойка P.C., Панчук P.P., Стойка Б.Р. Полипептидные факторы роста в процессах эмбрионального развития и опухолевого роста // Онтогенез. 2004. Т. 35. № 4. С. 254 272.

8. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лациник Н.В. и др. Стромальные клетки, ответственные за перенос микроокружения в кроветворной и лимфоидной ткани // Пробл. гемат. перелив, крови. 1973. № 10. С. 14 -23.

9. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники. — М.: Медицина, 1973. —221 с.

10. Фриденштейн А.Я., Трошева А.Г., Горская Ю.Ф. Образование костномозговых органов при трансплантации клеточных суспензий в пористых губках // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1981. Т. 91. № 5. С. 606 -608.

11. Afshari С.А., Vojta P.J., Annab L.A., Futreal P.A., Willard T.B., Barrett J.C. Investigation of the role of Gl/S cell cycle mediators in cellular senescence // Exp. Cell. Res. 1993. V. 209. P. 231-237.

12. Alhadlaq A., Mao J.J. Mesenchymal stem cells: Isolation and therapeutics // Stem cells and development. 2004. V. 13. P. 436 448.

13. Allen T.D., Dexter T.M. The essential cells of the haemopoietic microenvironment // Exp Haematol. 1984. V. 12. P. 517 521.

14. Ambrosetti D., Holmes G., Mansukhani A., and Basilico C. Fibroblast Growth Factor Signaling Uses Multiple Mechanisms To Inhibit Wnt-Induced Transcription in Osteoblasts // Mol. Cell. Biol. 2008. V. 28 (15). P. 4759 -4771.

15. Anjos-Afonso F., Bonnet D. Nonhematopoietic/endotheliar SSEA-1+ cells define the most primitive progenitors in the adult murine bone marrow mesenchymal compartment. Blood 2007. V. 109. P. 1298 1306.

16. Aoyama K., Oritani K., Yokota T. et al. Stromal cell CD9 regulates differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells // Blood. 1999. V. 93 (8). P. 2586 -2594.

17. Aplin A.E., Howe A., Alahari S.K. and Juliano R.L. Signal Transduction and Signal Modulation by Cell Adhesion Receptors: The Role of Integrins, Cadherins, Immunoglobulin-Cell Adhesion Molecules, and Selectins // Pharm. Rev. 1998. V. 50 (2). P. 197- 263.

18. Asian H., Zilberman Y., Kandel L. et al. Osteogenic differentiation of noncultured immunoisolated bone marrow-derived CD105+ cells // Stem Cells. 2006. V. 24. P. 1728 1737.

19. Banfi A., Muraglia A., Dozin B. et al. Proliferation kinetics and differentiation potential of ex vivo expanded human bone marrow stroma cells: Implication for their use in cell therapy // Exp. Hematol. 2000. V. 28. P. 707 715.

20. Barry F.P., Boynton R.E., Haynesworth S. et al. The Monoclonal Antibody SH-2, Raised against Human Mesenchymal Stem Cells, Recognizes an Epitope on Endoglin (CD 105) // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1999. V. 265 (1). P. 134 139.

21. Barry F.P., Boynton R.E., Murphy J.M. and Zaia J. Hie SH-3 and SH-4 Antibodies Recognize Distinct Epitopes on CD73 from Human Mesenchymal Stem Cells // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001. V. 289 (2). P. 519-524.

22. Barry F.P., Murphy J.M. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization // Int. J.Biochem. Cell Biol. 2004. V. 36 (4). P. 568 -584.

23. Baxter M.A., WynnR.F., Jowitt S.N. et al. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion // Stem Cells. 2004. V. 22. N. 5. P. 675 682.

24. Bellows C.G., Aubin J.E., Heersche J.N., Antosz M.E. Mineralized bone nodules formed in vitro from enzymatically released rat calvaria cell populations // Calcif. Tissue Int. 1986. V. 38 (3). P. 143 154.

25. Beloti M.M., Rosa A.L. Osteoblast Differentiation of Human Bone Marrow Cells Under Continuous and Discontinuous Treatment with Dexamethasone // Braz. Dent. J. 2005. V. 16. P. 156 161.

26. Benavente C.A., Sierralta W.D., Conget P.A., Minguell JJ. Subcellular distribution and mitogenic effect of basic fibroblast growth factor in mesenchymal uncommitted stem cells // Growth Factors. 2003. V. 21 (2). P. 87 94.

27. Ben-Ishay Z., Prindull G., Sharon S., Borenstein A. Pre-CFU-f: young-type stromal stem cells in murine bone marrow following administration of DNA inhibitors // Int. J. Cell Cloning. 1986. V. 4 (2). P. 126 134.

28. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications // Stem Cells. 2001. V. 19 (3). P. 180-192.3

29. Bianco P., Robey P.G., Simmons P.J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting

30. History, Concepts, and Assays // Cell Stem Cell. 2008. V. 2 (4). P. 313 319.

31. Blanc K., Tammik C., Rosendahl K. et al. HLA expression and immunologicproperties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells // Exp. Hematol. 2003. V. 31 P. 890 896.

32. Blanc K., Gotherstrom C., Ringden O. et al. Fetal mesenchymal stem-cell engraftment in bone after in utero transplantation in a patient with severe osteogenesis imperfect // Transplantation. 2005. V. 79. P. 1607 1614.

33. Bobis S., Jarocha D. and Majka M. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications // Folia histochem et cytobiol. 2006. V. 44 (4): P. 215 -230.

34. Bonab M.M., Alimoghaddam K., Talebian F. et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro // BMC Cell Biol. 2006. V. 7. P. 14 20.

35. Borges E., Jan Y., Ruoslahti E. Platelet-derived growth factor receptor beta and vascular endothelial growth factor receptor 2 bind to the beta 3 integrin through its extracellular domain // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 39867 -39873.

36. Bottcher R.T. and Niehrs C. Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development // Endocrine Rev. 2005. V. 26 (1). P. 63 77.

37. Boudreau N.J., Jones P.L. Extracellular matrix and integrin signalling: the shape of things to come // Biochem. J. 1999. V. 339. P 481 488.

38. Breier G., Breviario F., Caveda L. et al. Molecular cloning and expression of murine vascular endothelial- cadherin in early stage development of cardiovascular system// Blood, 1996. V. 87 (2). P. 630 641.

39. Biihring H.J., Battula V.L., Treml S. et al. Novel markers for the prospective isolation of human MSC // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2007. V. 1106. P. 262 -271.

40. Bühring HJ., Treml S., Cerabona F. et al. Phenotypic Characterization of Distinct Human Bone Marrow-Derived MSC Subsets // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2009. V. 1176. P. 124-134.

41. Campagnoli C., Roberts I.A.G., Kumar S. et al. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow // Blood. 2001. V. 98 (8). P. 2396 2402.

42. Canalis E., Centrella M., McCarthy T. Effects of basic fibroblast growth factor on bone formation in vitro // J. Clin. Invest. 1988. V. 81. P. 1572 1577.

43. Caplan A. I. Mesenchymal stem cells // J. Orthop. Res. 1991. V. 9. P. 641 650

44. Castro-Malaspina H., Gay R.E., Resnick G. et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) anf their progeny // Blood. 1980. V. 56. P. 289-301.

45. Cavalcanti-Adam E.A., Aydin D., Hirschfeld-Warneken V.C., and Spatz J. P. Cell adhesion and response to synthetic nanopatterned environments by steering receptor clustering and spatial location // HFSP Journal. 2008. V. 2 (5). P. 276 -285.

46. Celil A.B., Campbell P.G. BMP-2 and insulin-like growth factor- mediate Osterix (Osx) expression in human mesenchymal stemcells via the MAPK and protein kinase D signaling pathways // J. Biol. Chem. 2005. V. 280 (36). P. 31353 -31359.

47. Chae S.W., Jee B.K., Lee J.Y. et al. HOX gene analysis in the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells // Genetics and Molecular Biology, 2008. V. 31 (4): P. 815 823.

48. Chagraoui J., Lepage-Noll A., Anjo A. et al. Fetal liver stroma consists of cells in epithelial-to-mesenchymal transition // Blood. 2003. V. 101. P. 2973 2982.

49. Chamberlain G., Fox J., Ashton B. and Middleton J. Mesenchymal Stem Cells: their Phenotype, Differentiation Capacity, Immunological Features and Potential for Homing // Stem Cells. 2007. V. 25 (11). P. 2739 2749

50. Chen J., Shapiro H.S., and Sodek J. Developmental expression of bone sialoprotein mRNA in rat mineralized connective tissue // J. Bone Muter. Res. 1992. V. 7. P. 987 997.

51. Chen J.-L., Hunt P., McElvain M. et al. Osteoblast precursor cells are found in CD34+ cells from human bone marrow // Stem Cells. 1997. V. 15. P. 368 -377.

52. Chen S.L., Fang W.W., Qian J. Improvement of cardiac function after transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in patients with acute myocardial infarction // Chin. Med. J. 2004. V. 117. P.1443 1448.

53. Choi K.M., Seo Y.K., Yoon H.H. et al. Effect of ascorbic acid on bone marrow-derived mesenchymal stem cell proliferation and differentiation // J. Biosci. Bioeng. 2008. V. 105 (6). P. 586 594.

54. Chung C., Golub E., Forbes E. et al. Mechanism of action of (3 glycerophosphate on bone cell mineralization // Calcif. Tissue Intemat. 1992. V. 51. P. 305 -311.

55. Chung R., Foster B.K., Zannettino A.C., Xian C.J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate // Bone. 2009. V. 44. P. 878 885.

56. Conget P.A., Allers C., Minguell JJ. Identification of a discrete population of human bone marrow-derived mesenchymal cells exhibiting properties of uncommitted progenitors // J. Hematother. Stem Cell Res. 2001. V. 10 (6). P. 749-758.

57. Cell. Physiol. 2001. V. 189. P. 1 13. Davey G., Buzzai M. and Assoian R.K. Reduced expression of a5bl integrin prevents spreading-dependent cell proliferation // J. Cell Sci. 1999. V. 112. P. 4663-4672.

58. Davidai G., Lee A., Schvartz I. and Hazum E. PDGF induces tyrosine phosphorylation in osteoblast-like cells: relevance to mitogenesis // Am. J.

59. Physiol. Endocrinol. Metab. 1992. V. 263. P. 205 209.136

60. De Laat S. W., Boonstra J., Defize L. H. K. et al. Growth factor signalling // Int. J. Dev. Biol. 1999. V. 43. P. 681 691.

61. Dennis J.E., Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma // Stem Cells 2002. V. 20. P. 205 214.

62. Deryugina E.I., Ratnikov B.I., Bourdon M.A. et al. Identification of a growth factor for primary murine stroma as macrophage colony-stimulating factor // Blood. 1995. V. 86. P. 2568-2578.

63. Discher D.E., Mooney D.J., Zandstra P.W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells // Science. 2009. V. 324. P. 1673 1677.

64. Djouad F., Bony C., Háupl T. et al. Transcriptional profiles discriminate bone marrow-derived and synovium-derived mesenchymal stem cells // Arthr. Res. Ther. 2005. V. 7 (6). P. 1304 1315.

65. Docheva D., Haasters F., Schieker M. Mesenchymal stem cells and their cell surface receptors // Curr. Rheumatol. Rev. 2008. V. 4 (3). P. 155 160.

66. O'Donoghue K., Chan J. Human fetal mesenchymal stem cells // Curr Stem Cell Res Ther. 2006 V. 1 N. 3. P. 371 386.

67. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. 2006. V. 8. P. 315 317.

68. Doucet C., Ernou I., Zhang, Y.M. et al. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications // J. Cell Physiol. 2005. V. 205. P. 228 236.

69. Dow J.K., and deVere White R.W. Fibroblast growth factor 2: Its structure and property, paracrine function, tumor angiogenesis, and prostate-related mitogenic and oncogenic functions // Urology. 2000. V. 55. P. 800 806.

70. Ducy P., Zhang R., Geoffroy V. et al. Osf2/ Cbfal: a transcriptional activator of osteoblast differentiation // Cell. 1997. V. 89. P 747 754.

71. Ducy P. Cbfal: A Molecular Switch in Osteoblast Biology // Developmental Dynamics. 2000. V. 219. P. 461-471.

72. Durand C., Robin C., Dzierzak E. Mesenchymal lineage potentials of aorta-gonad-mesonephros stromal clones // Haematologica. 2006. V. 91. P. 1172 1179.

73. Eda H., Aoki K., Marumo K. et al. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. V. 366. P. 471 -475.

74. Engler A.J., Sen S., Sweeney H.L., Discher D.E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification // Cell. 2006. V. 126 (4). P. 677 689.

75. Estes B.T. Gimble J.M. Guilak F. Mechanical signals as regulators of stem cell fate // Curr. Top. Dev. Biol. 2004. V. 60. P. 91 126.

76. Etheridge S.L., Spencer G.J., Heath D.J., Genever P.G. Expression profiling and functional analysis of wnt signaling mechanisms in mesenchymal stem cells // Stem Cells. 2004. V. 22 (5). P. 849 860.

77. Even-Ram S., Artym V., Yamada K.M. Matrix control of stem cell fate // Cell. 2006. V. 126 (4). P. 645 647.

78. Fan V.H., Tamama K., Au A. et al. Tethered epidermal growth factor provides a survival advantage to mesenchymal stem cells // Stem Cells. 2007. V. 25 (5). P. 1241-1251.

79. Fiedler J., Roderer G., Gunther K.P., Brenner R.E. BMP-2, BMP-4, and PDGF-bb stimulate chemotactic migration of primary human mesenchymal progenitor cells // J. Cell Biochem. 2002. V. 87. P. 305 312.

80. Fiedler J., Etzel N., Brenner R.E. To go or not to go: Migration of human mesenchymal progenitor cells stimulated by isoforms of PDGF // P. Cell. Biochem. 2004. V. 93. P. 990 998.

81. Fierro F., Illmer T., Jing D. et al. Inhibition of platelet-derived growthfactor receptorbeta by imatinib mesylate suppresses proliferation and alters differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro // Cell Prolif. 2007. V. 40. P. 355 366.

82. Filion R.J., Popel A.S. A reaction-diffusion model of basic fibroblast growth factor interactions with cell surface receptors // Ann. Biomed. Eng. 2004. V. 32 (5). P. 645-663.

83. Fisher L.W, McBride O.W., Termine J.D., and Young M.F. Human bone sialoprotein // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 2347 2351.

84. Franceschi R.T. The Developmental Control of Osteoblast-Specific Gene Expression: Role of Specific Transcription Factors and the Extracellular Matrix Environment // Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1999. V.10. P. 40 57.

85. Franceschi R.T., Xiao G. Regulation of the osteoblast-specific transcription factor, Runx2: responsiveness to multiple signal transduction pathways // J. Cell Biochem. 2003. V. 88. P. 446-454.

86. Frank O., Heim M., Jakob M. et al. Real-time quantitative RT-PCR analysis of human bone marrow stromal cells during osteogenic differentiation in vitro // J Cell Biochem. 2002. V. 85 (4). P. 737 746.

87. Friedenstein A. J., Chailakhyan R. K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells // Cell Tissue Kinet. 1970. V. 3. P. 393 403

88. Friedenstein A.J. Precursor cells of mechanocytes // Int. Rev. Cytol. 1976. V. 47. P. 327 359

89. Friedenstein A.J., Gorskaya J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs // Exp. Hematol. 1976. V. 4. № 5. P. 267 274.

90. Friedenstein A.J., Ivanov-Smolenski A.A., Chailakjan R.K. et al. Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiochimeras and heterotopic transplants // Exp. Hematol. 1978. V. 6. P. 440 444.

91. Friedenstein A.J., Latzinik N.W., Grosheva A.G., Gorskaya U.F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges // Exp. Hematol. 1982. V. 10 (2). P. 217 -227.

92. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers // Cell Tissue Kinet. 1987. V. 20 (3). P. 263 272.

93. Fukiage K., Aoyama T., Shibata K.R. et al. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 indicates the differentiation potential of human bone marrow stromal cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. V. 365 (3). P. 406 -412.

94. Gabrielsson B.G., Johansson J.M., Jennische E. et al. Depot-specific expression of fibroblast growth factors in human adipose tissue // Obes. Res. 2002. V. 10. P. 608 616.

95. Gang E.J., Bosnakovski D., Figueiredo C.A., et al. SSEA-4 identified mesenchymal stem cells from bone marrow // Blood. 2007. V. 109. P. 1743 -1751.

96. Gao Z., Sasaoka T., Fujimori T. et al. Deletion of the PDGFR-beta gene affects key fibroblast functions important for wound healing // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 9375-9389.

97. Geng T., Sun H., Luo F., Qi N. Quantitative analysis of the responses of. murine bone marrow mesenchymal stem cells to EGF, PDGF-BB and fibronectin by factorial design methodology // Cytotechnology. 2008. V. 58. P. 93 101.

98. Giancotti F.G., Ruoslahti E. Integrin signaling // Science. 1999. V. 285. 1999. P. 1028 -1032.

99. Gilbertson D.G., Duff M.E., West J.W. et al. Platelet-derived growth factor C (PDGF-C), a novel growth factor that binds to PDGF alpha and beta receptor //J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 27406 -27414.

100. Gimble J.M., Robinson C.E., Wu X., Kelly K.A. The function of adipocytes in the bone marrow stroma: an update // Bone. 1996. V. 19 (5). P. 421 428.

101. Goessler U. R., Bugert P., Bieback K., Stern-Straeter J. et al. In vitro-analysis of integrin-expression in stem-cells from bone marrow and cord blood during chondrogenic differentiation // J. Cell. Mol. Med. 2009. V. 13 (6). P. 1175 -1184.

102. Gonzalez R., Maki C.B., Pacchiarotti J. et al. Pluripotent marker expression and differentiation of human second trimester mesenchymal stem cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 362 (2). P. 491 -497.

103. Gotherstrom C., Ringden O., Westgren M. et al. Immunomodulatory effects of human foetal liver-derived' mesenchymal stem cells // Bone Marrow Transplant. 2003. V. 32. P. 265 272.

104. Gotherstrom C., Ringden O., Tammik C. et al. Immunologic properties of human fetal mesenchymal stem cells // Am. J. Obset. Gynecol. 2004. V. 190. P. 239 -245.

105. Gotherstrom C., West A., Liden J. et al. Difference in gene expression between human fetal liver and adult bone marrow mesenchymal stem cells // Haematologica. 2005. V. 90. P. 1017 1026.

106. Gottschling S., Saffrich R., Seckinger A. et al. Human mesenchymal stroma cells regulate initial self-renewing divisions of hematopoietic progenitor cells by a betal-integrin-dependent mechanism// Stem cells. 2007. V. 25. P. 798 806.

107. Grayson W.L., Zhao F., Izadpanah R. et al. Effects of hypoxia on human mesenchymal stem cell expansion and plasticity in 3D constructs // J. Cell. Physiol. 2006. V. 207. P. 331 339.

108. Gregoire F.M., Smas C.M., Sul H.S. Understanding adipocyte differentiation // Physiol. Rev. 1998. V. 78 P. 783 809.

109. Gregory C.A., Singh H., Perry A.S., Prockop D.J. Wnt signaling inhibitor Dkk-1 is required for re-entry into the cell cycle of human adult stem cells from bone marrow stroma (hMSCs) // J. Biol. Chern. 2003. V. 278. P. 28067 28078.

110. Gronthos S., Simmons P.J. The growth factor requirements of STRO-1-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro // Blood. 1995. V. 85 (4). P. 929 940.

111. Gronthos S., Zannettino A.C., Graves S.E. et al. Differential cell surface expression of the STRO-1 and alkaline phosphatase antigens on discrete developmental stages in primary cultures of human bone cells // J. Bone Miner. Res. 1999. V. 14. P. 47 56.

112. Gronthos S., Zannettino A.C.W., Hay S.J. et al. Molecular and cellular characterization of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow //J. Cell Sci. 2003. V. 116. P. 1827 1835.

113. Guillot P.V., Gotherstrom C., Chan J. et al. Human first-trimester fetal5 MSC express pluripotency markers and,grow faster and have longer telomeres than adult MSC // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 646 654.

114. Guillot P.V., De Ban C., Dell'Accio F. et al. Comparative osteogenic transcription profiling of various fetal and adult mesenchymal stem cell sources // Differentiation. 2008. V. 76. P. 946 957.

115. Harting M., Jimenez F., Pati S. et al. Immunophenotype characterization of rat mesenchymal stromal cells. // Cytotherapy. 2008- V. 10 (3). P. 243 253.

116. Haudenschild A.K., Hsieh A.H., Kapila.S. and Lotz J. C. Pressure and Distortion Regulate Human Mesenchymal Stem Cell Gene Expression- // Annals of

117. Biomed. Eng. 2009.V. 37 (3). P. 492 502.143

118. Hayflick L. The limited In Vitro lifetime of human diploid cell strains // Exp. Cell. Res. 1965. V. 37. P. 614 636.

119. Hayashi I., Nixon T., Morikawa M., and Green H. Adipogenic and anti-adipogenic factors in the pituitary and other organs // Proc. NatL Acad. Sei. 1981. Vi 78 (6). P. 3969 3972.

120. Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies // Bone. 1992. V. 13. P. 69 80.

121. Helledie T., Jorgensen C., Antonius M. et al. Role of adipocyte lipid-binding protein (ALBP) and acyl-CoA binding protein (ACBP) in PPARmediated transactivation//Mol. Cell. Biochem. 2002. V. 239. P. 157 164.

122. Heldin C.-H., Westermark B. Platelet-derived growth factor: mechanism of action and possible in vivo function // Cell Regul. 1990. V. 1. P. 555 566.

123. Heldin C.-H., Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor // Physiol. Rev. 1999. V. 79 (4). P. 1283 1316.

124. Hermann A., Gastl R., Liebau S. et al. Efficient generation of neural stem cell-like cells from adult human bone marrow stromal cells // J. Cell Sei. 2004. V. 117. P. 4411-4422.

125. Ho A.D., Wagner W., Franke W. Heterogeneity of mesenchymal stromal cell preparations // Cytotherapy. 2008. V.10. N. 4. P. 320 330.

126. Hong J.H., Hwang fi.S., McManus M.T. et al. TAZ, a Transcriptional Modulator of Mesenchymal Stem Cell Differentiation // Science. 2005. V. 309 (5737). P. 1074 -1078.

127. Hong J.H., Yaffe M.B. TAZ: a beta-catenin-like molecule that regulates mesenchymal stem cell differentiation// Cell Cycle. 2006. V. 5(2). P. 176 -179.

128. Hori Y., Inoue S., Hirano Y. and Tabata Y. Effect of Culture Substrates and Fibroblast Growth Factor Addition on the Proliferation and Differentiation of Rat Bone Marrow Stromal Cells // Tiss. Eng. 2004. V. 10 (7/8). P. 995 -1005.

129. Houston B., Steward A.J. and Farquharson C. Phosphol— a novel phosphatase specifically expressed at site of mineralisation in bone and cartilage // Bone. 2004. V. 34. P. 629 637.

130. Hubert P. Growth factors of the EGF family and their receptors // Bull Cancer. 2007. V. 94. P. 137 145.

131. Hung S.-C., Chen N.-J., Hsieh S.-L. et al. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow // Stem Cells. 2002. Y. 20. P. 249 -258.

132. Hunt P., Robertson D., Weiss D. et al. A single bone marrow-derived stromal cell type supports the in vitro growth of early lymphoid and myeloid cells // Cell. 1987. V. 48. P. 997 1007.

133. Hutley L., Shurety W., Newell F. et al. Fibroblast growth factor 1: a key regulator of human adipogenesis // Diabetes. 2004. V. 53. P. 3097 3106.

134. Hynes R.O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion // Cell. 1992. V. l.P. 11-25.

135. Jaiswal N., Haynesworth S.E., Caplan A.I., Bruder S.P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro // J. Cell. Biochem. 1997. Y. 64. N. 2. P. 295 312.

136. Jaiswal R.K., Jaiswal N., Bruder S.P. et al. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated bymitogen-activated protein kinase // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 9645 -9652.

137. Janderova L., McNeil N., Murrell A.N. et al. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis // Obesity Research. 2003. V. 11 (1). P. 65-74.

138. Javazon E.H., Colter D.C., Schwarz E.J., Prockop D.J. Rat marrow stromal cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells // Stem Cells. 2001. V. 19. P. 219-225.

139. Javazon E.H., Beggs K.J., Flake A.W. Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging // Exp Hematol 2004. V. 32. P. 414-425.

140. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow // Nature. 2002. V. 418. P. 41 -49.

141. Jo D.-Y., Rafii S., Hamada T., Moore M.A.S. Chemotaxix of primitive hematopoietic cells in response to stromal cell-derived factor-1 // J. Clin. Invest. 2000. V. 105. P. 101 111.

142. Jones S.D., Hall D.J., Rollins B.J., and Stiles C.D. Platelet-derived growth factor generates at least two distinct intracellular signals that modulate gene expression// Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 1988. V. 53. P. 531 -536.

143. Jones B.J., McTaggart S.J. Immunosuppression by mesenchymal stromal cells: rom culture to clinic // Exp. Hematol. 2008. V. 36. P. 733 741.

144. Kakudo N., Shimotsuma A., Kusumoto K. Fibroblast growth factor-2 stimulates adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 359 (2). P. 239 244.

145. Kanakaraj P., Raj S., Khan S.A., Bishayee S. Ligand-induced interaction between a- and P-type platelet-derived growth factor (PDGF) receptors: role of receptor heterodimers in kinase activation // Biochem. 1991. V. 30. P. 1761 -1767.

146. Katagiri T., Takahashi N. Regulatory mechanisms of osteoblast and osteoclast differentiation // Oral Diseases. 2002. V. 8. P. 147 159.

147. Kawazoe Y., Katoh S., Onodera Y. et al. Activation of the FGF signaling pathway and subsequent induction of mesenchymal stem cell differentiation by inorganic polyphosphate // Int. J. Biol. Sei. 2008. V. 4 (1). P. 37 47.

148. Keating A. Mesenchymal stromal cells // Current Opinion in Hematology. 2006. V. 13. P. 419-425.

149. Kennea N.L., Waddington S.N., Chan J. et al. Differentiation of human fetal mesenchymal stem cells into cells with an oligodendrocyte phenotype // Cell Cycle. 2009. V. 8 (7). P. 1069 1079.

150. Kilian O., Flesch I., Wenisch S. et al. Effects of platelet growth factors on human mesenchymal stem cells and human endothelial cells in vitro // Eur. J. Med. Res. 2004. V. 9 (7). P. 337 344.

151. Kinbara K, Goldfinger L.E., Hansen M. et al. RAS GTPases: integrins' friends or foes // Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003. V. 4 (10). P. 767 778.

152. Kisselbach L., Merges M., Bossie A., Boyd A. CD90 Expression on human primary cells and elimination of contaminating fibroblasts from cell cultures // Cytotechnology. 2009. V. 59. P. 31-44.

153. Klees R.F., Salasznyk R.M., Vandenberg S., Bennett K., Plopper G.E. Laminin-5 activates extracellular matrix production and osteogenic gene focusing in human mesenchymal stem cells // Matrix Biol. 2007. V. 26 (2). P. 106 -114.

154. Klein A.K., Dyck J.A., Stitzel K.A. et al. Characterization of canine fetal lymphohematopoiesis: studies of CFU-GM, CFU-L, and CFU-F // Exp. Hematol. 1983. V. 11. P. 263 274.k

155. Koch H., Jadlowiec J.A., Campbell P.G. Insulin-like Growth Factor-I IrxciULiiices Early Osteoblast Gene Expression in Human Mesenchymal Stem C Is // Stem Cells and Development. 2005. V.14. P. 621 631.

156. Kode J.A., Mukherjee S., Joglekar M.V., Hardikar A.A. Mesenchymal stem <z:ells: immunobiology and role in immunomodulation and tissue regeneraTzfiL<z>ri // Cytotherapy. 2009. V. 11 (4). P. 377 391.

157. Koide Y., Morikawa S., Mabuchi Y. et al. Two Distinct Stem Cell Linea^^^^g jn Murine Bone Marrow // Stem cells. 2007. V. 25. P. 1213 1221.

158. Kolf C.M., Cho E. and Tuan R.S. Biology of adult mesenchymal stem, «^ells-regulation of niche, self-renewal and differentiation // Arth. Res. Ss^ ~Ther 2007. V. 9 (1). P. 204 214.

159. Komori T., Yagi H., Nomura S. et al. Targeted disruption of Cbfal resuXTts in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteot>HL^ists // Cell. 1997. V. 89. P. 755-764.

160. Komori T. Regulation of skeletal development by the Runx family of trans c^-crfLption factors // J. Cell. Biochem. 2005. V. 95 (3). P. 445 453.

161. Komori T. Regulation of osteoblast differentiation by transcription factou-r^ // j Cell. Biochem. 2006. V. 99. P. 1233 -1239.

162. Kono S.J., Oshima Y., Hoshi K. et al. Erk pathways negatively regulates xnatrix mineralization // Bone. 2007. V. 40. P. 68 74.

163. Krampera M., Pasini A., Rigo A. et al. HB-EGF/HER-1 signaling in bone arrowmesenchymal stem cells: inducing cell expansion and reversibly pre^s^enting multilineage differentiation // Blood. 2005. V. 106 (1). P. 59 66.

164. Kratchmarova I., Blagoev B., Haack-Sorensen M. et al. Mechanism of cü^vercrent growth factor effects in mesenchymal stem cell differentiation // 25=»<^ience 2005. V. 308. P. 1472-1477.

165. Kretlow J.D., Jin Y-Q., Liu W. et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells y/ BMC Cell Biology 2008. V. 9. P. 60 73.

166. Krinner A., Zscharnack M., Bader A. et al. Impact of oxygen environment on mesenchymal stem cell expansion and chondrogenic differentiation // Cell Prolif. 2009. V. 42 (4). P. 471 484.

167. Krupnick A.S., Balsara K.R., Kreisel D. et al. Fetal liver as a source of autologous progenitor cells for perinatal tissue engineering // Tissue Eng. 2004.V. 10. P. 723-735.

168. Kulterer B., Friedl G., Jandrositz A. et al. Gene expression profiling of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow during expansion and osteoblast differentiation // BMC Genomics 2007. V. 8 P. 70 84.

169. Machaj E.K., Grabowska I., Gajkowska A. et al. Differentiation potential of the fetal rat liver-derived cells // Folia Histochemica et Cytobiologica. 2005. V. 43. P. 217-222.

170. Madsen L. Pedersen L.M., Liaset B. et al. cAMP-dependent Signaling Regulates the Adipogenic Effect of n-6 Polyunsaturated Fatty Acids // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 7196-7205.

171. Maeda S., Nobukuni T., Shimo-Onoda K. et al. Sortilin is upregulated during osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells and promotes extracellular matrix mineralization // J. Cell Physiol. 2002. V. 193. P. 73 79.

172. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D. et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells // J. Cell. Physiol. 1998. V. 176 (1). P. 57 66.

173. Majumdar M.K., Keane-Moore M., Buyaner D. et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells // J. Biomed. Sei. 2003. V.10 (2). P. 228 241.

174. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al., Cardiomyocytes can be generated form marrow stromal cells in vitro // J. Clin. Invest. 1999. V. 103. P. 697 705.

175. Mandrup S., Lane M.D. Regulating adipogenesis // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 5367 5370.

176. Martin I., Muraglia A., Campanile G. et al. Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow // Endocrinology. 1997. V. 138 (10). P. 4456 4462.

177. Matter M.L., Ruoslahti E.A. Signaling pathway from the alpha5betal and alpha (v) beta3 integrins that elevates bcl-2 transcription // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 27757 27763.

178. Maximow A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und im postfetalen Leben der Säugetiere // Fol. Haematol. 1909. V. 8. P. 125 134.

179. Maximow A. Morphology of the mesenchymal reactions // Arch Pathol. 1927. V. 4. P. 557-606.

180. McBeath R., Pirone D.M., Nelson C.M. et al. Cell Shape, Cytoskeletal Tension, and RhoA Regulate Stem Cell Lineage Commitment // Dev. Cell. 2004. Y. 6. P. 483-495.

181. Mclntyre A.P., Bjornson B.H. Human bone marrow stromal cell colonies: response to hydrocortisone and dependence on platelet-derived growth factor // Exp Hematol. 1986. V. 14. № 9. P. 833 839.

182. Medvinsky A., Dzierzak E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region // Cell 1996. V. 86. P. 897 906.

183. Mehrotra M., Krane S.M., Walters K., Pilbeam C. Differential regulation; of platelet-derived growth factor stimulated migration and proliferation in osteoblastic cells // J. Cell Biochem. 2004. V. 93. P. 741 752.

184. Mendes S.C., Robin C., Dzierzak E. Mesenchymal progenitor cells localize within hematopoietic. sites throughout ontogeny // Development. 2005. V: 132. P. 1127-1136.

185. Meredith J.E., Fazeli B:, Schwartz M:A. The extracellular matrix as a cell survival factor // Mol. Biol: Cell. 1993. V. 4. P. 953 961.

186. Metcalf D., Moore. M.A.S. Embryonic aspects of haemopoiesis. In Hemopoietic Cells. Front. Biol. V. 24 (Ed. Neuberger A. and Tatum E.L.) // North Holland Research Monographs, Amsterdam, 1971. P. 172-271.

187. Minguell J.J., Conget P. and Erices A. Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells // Braz. J. Med. Biol. Res. 2000. V. 33. N. 8. P. 881-887.

188. Minguell J.J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells // Exp. Biol. Med. 2001. V. 226 (6). P. 507 520.

189. Mitlak B.H., Finkelman R.D., Hill E.L. et al. The effect of systemically administered PDGF-BB on the rodent skeleton // J. Bone Miner. Res. 1996. V. 11. P. 238-247.

190. Mizuno M., Kuboki Y. Osteoblast-Related Gene Expression of Bone Marrow Cells during the Osteoblastic Differentiation Induced by Type I Collagen // J. Biochem. 2001. V. 129. P. 133 138.

191. Montzka K., Fuhrmann T., Woltje M., Brook G.A. Expansion of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells: serum-reduced medium is better than conventional medium// Cytotherapy. 2010. V. 12 (5). P. 587-592.

192. Muller A.M., Medvinsky A., Strouboulis J. et al. Development of hematopoietic stem cell activity in the mouse embryo // Immunity. 1994. V. 1. P. 291 301.

193. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors fromhuman bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model // J. Cell Sei. 2000. V. 113. P 1161 1166.

194. Nakamura S., Yamada Y., Baba S. et al. Culture medium study of human mesenchymal stem cells for practical use of tissue engineering and regenerative medicine // Biomed. Mater. Eng. 2008. V. 18 (3). P. 129 136.

195. Nakamura A., Dohi Y., Akahane M. et al. Osteocalcin secretion as an early marker of in vitro osteogenic differentiation of rat mesenchymal stem cells // Tissue Eng. Part. C Methods. 2009. V.15 (2). P. 169 180.

196. Nakashima K., Zhou X., Kunkel G. et al. The novel zinc fingercontaining transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation // Cell. 2002. V. 108. P. 17 29.

197. Nardi B.N., Meirelles L.S. Mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion and characterization // Handb. Exp. Pharmacol. 2006. V. 174. P. 249-282.

198. Nash T J., Howlett C.R., Martin C. et al. Effect of platelet-derived growth factor on tibial osteotomies in rabbits // Bone. 1994. V. 15. P. 203 208.

199. Naveiras O., Nardi V., Wenzel P.L. et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment // Nature. 2009. V. 460. P. 259-263.

200. Navre M., Ringold G.M. Differential Effects of Fibroblast Growth Factor and Tumor Promoters on the Initiation and Maintenance of Adipocyte Differentiation // J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 1857 1863.

201. Neubauer M., Fischbach G., Bauer-Kreisel PLieb E. et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARy ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells // FEBS Letters. 2004. V. 577. P. 277 283.

202. Neuhuber B., Swanger S.A., Howard L. et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics // Exp. Hematol. 2008. V. 36(9). P. 1176-1185.

203. Perona R. Cell signalling: growth factors and tyrosine kinase receptors // Clin.

204. Transl. Oncol. 2006. V. 8 (2). P. 77 82.

205. Philips A., Huet X., Plet A. et al. Anchorage-dependent expression of cyclin A inprimary cells requires a negative DNA regulatory element and a functional Rb

206. Oncogene. 1999. V. 18 (10). P. 1819 1825.155

207. Phinney D.G., Kopen G., Isaacson R.L., Prockop D.J. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth, and differentiation // J. Cell Biochem. 1999a. V. 72 (4). P. 570 585.

208. Phinney D.G., Righter W., Kopen G. et al. Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells // J. Cell. Biochem. 1999b. V. 75. P. 424 436.

209. Phinney D.G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy // Cell Cycle. 2007. V. 6. P. 2884 2889.

210. Phinney D.G., Prockop D.J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair -current views // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 2896 2902.

211. Piersma A., Brockbank K.G.M., Ploemacher R.E., van Vliet E., Brakel-van Peer K.M.J., Visser P.J. Characterization of fibroblastic stromal cells from murine bone marrow // Exp Hematol. 1985. V. 13 (4). P. 237 243.

212. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. 1999. V. 284. P. 143 147.

213. Pittenger M., Marshak D.R. Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow // Stem Cell Biology. 2001. V. P. 349 373.

214. Porter J.C., Hogg N. Integrins take partners: cross-talk between integrins and other membrane receptors // Trends in Cell Biology. 1998. V. 8 (10). P. 390 396.

215. Porter R.M., Huckle W.R., Goldstein A.S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells // J: Cell. Biochem. 2003. V. 90. P. 13 22.

216. Powers C.J., McLeskey S.W., Wellstein A. Fibroblast growth factors, their receptors and signaling // Endocrine-Related Cancer. 2000. V. 7. P. 165 -197.

217. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues // Science. 1997. V. 276. P. 72 74.

218. Prockop D.J., Sekiya I., Colter D.C. 2001. Isolation and characterization of rapidly self renewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells // Cytotherapy. 2001. V. 3. P. 393 396.

219. Prockop D.J., Gregory C.A., Spees L. One strategy for cell and gene therapy: Harnessing the power of adult stem cells to repair tissues // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. Suppl. 1. P. 11917 11923.

220. Quirici N., Soligo D., Bossolasco P. et al. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies // Expt. Hematol. 2002. V. 30. P. 783-791.

221. Quito F.L., Beh J., Bashayan O. et al. Effects of fibroblast growth factor-4 (k-FGF) on long-term cultures of human bone marrow cells // Blood. 1996. V. 87 (4). P. 1282-1291.

222. Randall T.D., Weissman I.L. Phenotypic and Functional Changes Induced at the Clonal Level in Hematopoietic Stem Cells After 5-Fluorouracil Treatment // Blood. 1997. V. 89 (10). P. 3596 3606.

223. Ranly D.M., McMillan J., Keller T. et al. Platelet-derived growth factor inhibits demineralized bone matrix-induced intramuscular cartilage and bone formation. A study of immunocompromised mice // J. Bone Joint Surg. Am. 2005. V. 87. P. 2052 2064.

224. Reigstad L.J., Varhaug J.E., Lillehaug J.R. Structural and functional specifi cities of PDGF-C and PDGF-D, the novel members of the plateletderived growth factor family // FEBS J. 2005. V. 272. P. 5723 5741.

225. Biochem Cell Biol. 1990. V. 68(1). P. 238 242. Rosen E.D., Sarraf P., Troy A.E. et al. PPAR gamma is required for the differentiation of adipose tissue in vivo and in vitro // Mol. Cell. 1999. V. 4. P. 611-617.

226. Rosen E.D., Spiegelman B.M. Molecular regulation of adipogenesis // Annu. Rev.

227. Cell Dev. Biol. 2000. V. 16. P. 145 171. Rosen E.D., Hsu C.H., Wang X. et al. C/EBPalpha induces adipogenesis through

228. Schwartz M.A., Baron V. Interactions between mitogenic stimuli, or, a thousandand one connections // Curr. Opin. Cell. Biol. 1999. V. 11. P. 197 202.158

229. Sekiya I., Larson B.L., Smith J.R. et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: Conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality // Stem Cells. 2002. V. 20. P. 530 541.

230. Selhuber-Unkel C., Lopez-Garcia Ml, Kessler H., and Spatz J.P. Cooperativity in, adhesion cluster formation during initial cell adhesion // Biophys. J. 2008. V. 95 (11). P. 5424-5431

231. Serakinci N., Guldberg P., Burns J.S. et al. Adult human mesenchymal stem cell as a target for neoplastic transformation // Oncogene. 2004. V. 23 (29). P. 5095 -5098.

232. Seshi B., Kumar S., Sellers D. Human bone marrow stromal cell: coexpression of markers specific for multiple mesenchymal cell lineages // Blood Cells Mol. Dis. 2000. V. 26. N. 3. P. 234 246.

233. Shiba T., Nishimura D., Kawazoe Y. et al. Modulation of mitogenic activity of fibroblast growth factors by inorganic polyphosphate // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P 26788-26792.

234. Schilling T., Noth U., Klein-Hitpass L. et al. Plasticity in adipogenesis and osteogenesis of human mesenchymal stem cells // Mol Cell Endocrinol. 2007. V. 271 (1-2). P. 1 17.

235. Shohei T. The mechanism of dNTP-unbalanced cell death-, induced by 5-fluorouracil and its derivatives //13 th Symp. Nucl. Acid Chem. Osaka, Nov. 6th 8th, 1985: Oxford, Wash., D.C. 1985. P. 245.

236. Shockley K.R., Rosen C.J., Churchill G.A., Lecka-Czernik B. PPARgamma2 regulates a molecular signature of marrow mesenchymal stem cells // PPAR Res. 2007. V. 2007. P. 81219.

237. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STROl // Blood. 1991. V. 78. P. 55-62.

238. Simonsen J.L., Rosada C., Serakinci N. et al. Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintains the osteogenic potential of human bone marrow stromal cells // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. P. 592 596.

239. Solchaga L.A., Penick K., Porter J.D. et al. FGF-2 enhances the mitotic and chondrogenic potentials of human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells // J. Cell. Physiol. 2005. V. 203 (2). P. 398 409.

240. Song S.J., Jeon O., Yang H.S. et al. Effects of culture conditions on osteogenic differentiation in human mesenchymal stem cells // J. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 17. P. 1113-1119.

241. Stenderup K., Justesen J., Clausen C., Kassem M. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells // Bone. 2003. V. 33 (6). P. 919 926.

242. Strayhorn C.L., Garrett J.S., Dunn R.L. et al. Growth factors regulate expression of osteoblast-associated genes // J Periodontal. 1999. V. 70 (11). P. 1345 1354.

243. O'Sullivan S., Naot D., Callon K. et al. Imatinib Promotes Osteoblast Differentiation by Inhibiting PDGFR Signaling and Inhibits Osteoclastogenesis by Both Direct and Stromal Cell-Dependent Mechanisms // J. Bone Miner. Res. 2007. V. 22. P. 1679 1689.

244. Swindle C.S., Tran K.T., Johnson T.D. et al. Epidermal growth factor (EGF)-like repeats of human tenascin-C as ligands for EGF receptor // J. Cell Biol. 2001'. V. 154(2). P. 459-468.

245. Tai G., Polak J.M:, Bishop A.E. et al. Differentiation of osteoblasts from murine embryonic stem cells by overexpression of the transcriptional factor osterix //

246. Tissue Eng. 2004. V. 10. P. 1456 1466.160

247. Tamama K., Fan V.H., Griffith L.G. et al. Epidermal growth factor as candidate for ex vivo expansion of bone marrow-derived mesenchymal stem cells // Stem Cells. 2006. V.24 (3). P. 686 695.

248. Tanaka-Douzono M., Suzu S., Yamada M. et al. Detection of murine adult bone marrow stroma-initiating cells in Lin(-)c-fms(+)c-kit(low)VCAM-l(+) cells // J. Cell. Physiol. 2001. V. 189 (1). P. 45-53.

249. Teichert-Kuliszewska K., Hamilton B.S., Deitel M., and Roncari D.A.K. Augmented Production of Heparin-binding Mitogenic Proteins by Preadipocytes from Massively Obese Persons // J. Clin. Invest. 1992. V. 90. P. 1226-1231.

250. Tokunaga A., Oya T., Ishii Y. et al. PDGF receptor beta is a potent regulator of mesenchymal stromal cell function // J. Bone Miner. Res. 2008. V. 23. P. 1519- 1528.

251. Tondreau T., Lagneaux L., Dejeneffe M. et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential // Cytotherapy. 2004. V. 6 (4). P. 372 -379.

252. Tondreau T., Meuleman N., Delforge A. et al. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheral blood and cord blood: proliferation, Oct4 expression, and plasticity // Stem Cells 2005. V. 23. P. 1105-1112.

253. Tran K.T., Griffith L., and Wells A. Extracellular matrix signaling through growth factor receptors during wound healing // Wound Repair and'Regeneration. 2004. V. 12 (3). P. 262 268t

254. Tropel P., Noel D., Platet N. et al. Isolation and characterization* of mesenchymal' stem cells from adult mouse bone marrow // Exp. Cell Res. 2004. V. 295 (2). P. 395-406.

255. Tsai M.S., Hwang S.M., Chen K.D. et al. Functional network analysis of the transcriptomes of mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid, amniotic membrane, cord blood, and bone marrow // Stem Cells 2007. V. 25 (10). P. 2511-2523.

256. Tsutsumi S., Shimazu A., Miyazaki K. et al. Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal stem cells during proliferation in response to FGFII Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 288. P. 413 -419.

257. Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering // Arthr. Res. Ther. 2002. V. 5 (1). P. 32 45.

258. Vacanti V., Kong E., Suzuki G. et al. Phenotypic changes of adult porcine mesenchymal stem cells induced by prolonged passaging in culture // J. Cell Physiol. 2005. V. 205 (2). P. 194 201.

259. Van Den Heuvel R.L., Versele S.R., Schoeters G.E., Vanderborght O.L. Stromal stem cells (CFU-F) in yolk sac, liver, spleen and bone marrow of pre- and postnatal mice // Br. J. Haematol. 1987. V. 66 (1). P. 15 20.

260. Van-Den Heuvel R.L., Mathieu E., Schoeters G.E. et al. Stromal cells from murine developing hemopoietic organs: comparison of colony-forming unit of fibroblasts and long-term,cultures // Int. J. Dev. Biol. 1991. V. 35. P. 33 41.

261. Vander Geer P., Hunter T. and Lindberg R.A. Receptor protein-tyrosine kinases and their signal transduction pathways // Ann. Rev. Ccll Biol. 1994. V. 10. P. 251-337.

262. Varghese S., Ramsby M.L., Jeffrey J.J., Canalis E. Basic fibroblast growth factor stimulates expression of interstitial collagenase and inhibitors of metalloproteinases in rat bone cells // Endocrinology. 1995. V. 136. P. 2156 -2162.

263. Versele S.R., Van den Heuvel R.L., Schoeters G.E., Vanderborght. O.L. Proliferation activity of stromal stem cells (CFU-f) from hemopoietic organs of pre- and postnatal mice // Radiat. Res. 1987. V. 111 (2). P. 185 191.

264. Vikjaer D., Blom S., Hj0rting-Hansen E., Pinholt E.M. Effect of platelet-derived growth factor-BB on bone formation in calvarial defects: An experimental study in rabbits // Eur. J. Oral. Sci. 1997. V. 105. P. 59 66.

265. Vogel W., Grunebach F., Messam C.A. et al. Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells // Haematologica. 2003. V. 88. P. 126 133.

266. Vogel J.P., Szalay K., Geiger F. et al. Platelet-rich plasma improves expansion of human mesenchymal stem cells and retains differentiation capacity and in vivo bone formation in calcium phosphate ceramics // Platelets. 2006. V. 17. P. 462-469.

267. Wagner W., Feldmann R.E., Seckinger A. et al. The heterogeneity of human mesenchymal stem cell preparations—evidence from simultaneous analysis oft proteomes and transcriptomes // Exp Hematol. 2006. V. 34 (4). P. 536 548.

268. Wagner W., Roderburg C., Wein F. et al. Molecular and Secretory Profiles of Human«Mesenchymal Stromal Cells and Their Abilities to Maintain Primitive Hematopoietic Progenitors // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 2638 2647.

269. Wagner W., Ho A.D. Mesenchymal stem cell preparations— comparing apples and oranges // Stem Cell Rev. 2007. V. 3. P. 239 248.

270. Wakitani S., Saito T., Caplan A.I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine // Muscle Nerve. 1995. V. 18. P. 1417-1426.

271. Wang Q.-R., Yan Z.-J., Wolf N.S. Dissecting the hematopoietic microenvironment. VI. The effects of several growth factors on the in vitro growth of murine bone marrow CFU-F // Exp. Hematol. 1990. V. 18 (4). P. 341 347.

272. Wang P.P., Wang J.H., Yan Z.P. et al. Expression of hepatocyte-like phenotypes in bone marrow stromal cells after HGF induction // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 320. P. 712-716.

273. Wells A. EGF receptor // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. V. 31 (6). P. 637 643.

274. Wexler S.A., Donaldson C., Denning-Kendall P. et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not // Br. J. Haematol. 2003. V. 121 (2). P. 368 374.

275. Widberg C.H., Newell F.S., Bachmann A.W. et al. Fibroblast growth factor receptor 1 is a key regulator of early adipogenic events in human preadipocytes // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2009. V. 296. P. 121 -131.

276. Wineman J., Moore K., Lemischka I. et al. Functional heterogeneity of the hematopoietic microenvironment: Rare stromal elements maintain longterm repopulating stem cells // Blood 1996. V. 87. P. 4082 4090.

277. Xian C.J. Roles of epidermal growth factor family in the regulation of postnatal somatic growth II Endocr Rev. 2007. V. 28 (3). P. 284 296.

278. Xu W., Zhang X., Qian H et al. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro // Exp. Biol. Med. 2004. V. 229. P. 623 631.

279. Yamada M., Suzu S., Wakimoto N., Hatake K., Motoyoshi K., Shimamura S. Properties of primary murine stroma induced by macrophage colony-stimulating factor // J. Cell Physiol. 1997. V. 173 (1). P. 1 9.

280. Yamada M., Suzu S., Tanaka-Douzono M. et al. Effect of cytokines on the proliferation/differentiation of stroma-initiating cells // J. Cell. Physiol. 2000. V. 184(3). P. 351 -355.

281. Young R.H., Butler D.L., Weber W. et al. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair II J. Orthop. Res. 1998. V. 6. P. 406 -413.

282. Yu X., Hsieh S.C., Bao W., Graves D.T. Temporal expression of PDGF receptors and PDGF regulatory effects on osteoblastic cells in mineralizing cultures // Am. J. Physiol. 1997. V. 272. P 1709 1716.

283. Yu M., Xiao Z., Shen L. et al. Mid-trimester fetal blood-derived adherent cells share characteristics similar to mesenchymal stem cells but full-term umbilical cord blood does not // Br. J. Haematol. 2004. V. 124. P. 666 675.

284. Zernik J., Twarog K., Upholt W.B. Regulation of alkaline phosphatase and alpha 2(1) procollagen synthesis during early intramembranous bone formation in the rat mandible // Differentiation 1990. V. 44. P. 207 215.

285. Zhang X., Sobue T., Hurley M.M. FGF-2 increases colony formation, PTH receptor, and IGF-1 mRNA in mouse marrow stromal cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 290 (1). P. 526 531.

286. Zhao Y., Ding S. A high-throughput siRNA library screen identifies osteogenic suppressors in human mesenchymal stem cells // PNAS. 2007. V. 104. P. 9673 9678.

287. Zhou Z., Jiang E.L., Wang M. et al. Comparative study on various subpopulations in mesenchymal stem cells of adult bone marrow // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2005. V. 13 (1). P. 54 58.

288. Zhu W., Chen J., Cong X. et al. Hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells // Stem cells. 2006. V. 24. P. 416 425.

289. Zimmermann S., Voss M., Kaiser S. et al. Lack of telomerase activity in human mesenchymal stem cells // Leukemia. 2003. V. 17. P. 1146 1149.

290. Zipori D. The Stem State: Plasticity Is Essential, Whereas Self-Renewal and Hierarchy Are Optional // Stem Cells 2005. V. 23. P. 719 726.

Информация о работе

Молчанова, Евгения Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Исследование свойств субпопуляций мезенхимных стромальных клеток, различающихся по адгезии in vitro, из органов миелоидного кроветворения крысы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы