Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование специфичности действия РНКазы Bacillus intermedius 7P

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование специфичности действия РНКазы Bacillus intermedius 7P"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

СТРУМИНСКАЯ Нина Кузьминична

УДК 577.151.4

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ДЕЙСТВИЯ

РНКазы BACILLUS INTERMEDIUS 7Р

03.00.03. — Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1990

Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР.

Научные руководители:

кандидат химических наук Г. П. Моисеев кандидат химических наук А. Г. Павловский

Официальные оппоненты:

доктор химических наук С. Н. Кочетков кандидат физ.-мат. наук К. М. Поляков

Ведущая организация —

Казанский государственный университет им. Ульянова-Ленина

Защита состоится « 1990 г.

в у / — час, на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан « _1990 г.

Ученый секретарь л

специализированного совета кандидат химических наук

рицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование механизмов действия и специфичности рибонуклеаз представляет большой научный и практический интерес. Эти фермента широко используются при структурно-функциональных исследованиях различных форм РНК, в препаративной биохимии, в генной инженерии. В клетках РНКазы участвуют как в процессах деполимеризации РШ, так и в процессах трансформации генных транскриптов до функционально зрелых компонентов трансляционной системы. В широко проводящихся исследованиях РНК-деполи-меризуицих ферментов до последнего времени основное значение уделялось пиримидин- и гуанозинслецифичным РНКазам. Эти ферменты расщепляют межнуклеотидные связи РНК в области локализации соответствующих нуклеозидов в 10^-10® раз быстрее, чем остальные связи. Кроме того известна группа неспецифических РНКаэ, расщепляющих все межнуклеотидные связи РНК примерно с одинаковой скоростью. Недавно обнаружена немногочисленная группа РНКаэ, проявляющая сравнительно невысока специфичность к пуриновым нуклео-тидам при расщеплении РНК. Эти рибонуклеазы представляют большой интерес для изучения общих структурно-функциональных взаимоотношений между ферментом и субстратом, определяющих специфичность действия РНК-деполимераз. Однако, до настоящей работы ни для одной из'РНКаэ с указанным выше типом специфичности не имелось количественных характеристик осуществляемых ими реакций.

Цель и задачи работы. В связи со систематическими исследованиями РНКаз, проводимых в течение многих лет в Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР, была поставлена задача количественно исследовать специфичность действия одной из таких РНКаз, а именно РНКаэвиэ споровых бактерий В.1п1егте<Нив 7Р.

С этой целью предполагалось провести изучение параметров реакции гидролиза РНКазой ВЛпЪегшесИиа 7? в ряду мононуклео-зид-2',3'-циклофосфатов, динуклеозидфосфатов и синтетических гомополинуклеотидов.

Одновременно ставилась задача разработки и получения кристаллов РНКазы, пригодных для рентгеноструктурного анализа.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые были получены кристаллы бактериальной РНКазы В.'ОДегаеЗДие 7р и ее комплекс с ингибитором. Впервые было установлено, что РНКаза В.!пЪегие41иа 7? при гидролизе нуклеоэид -2*,З'-циклофосфатов и динуклеозидмонофосфатов проявляет себя как гуанозинспецифичный фермент, а при переходе к полинуклеотидным субстратам она является пуринпредпочитащим ферментом. Впервые было показано, что изменение специфичности РНКазы В.1п*епав<11ив 7Р не мояет быть объяснено только влиянием природы основания нуклеотида иа 05»-конце расцепляемой фосфодиэфирной связи. Было установлено, что реакция гидролиза низкодалекулярных и полинук-леотидных субстратов осуществляется в одном и том же активном центре рнбонуклеаэы. Выла предложена гипотеза, описывавшая, каким образом взаимодействие зарядов фосфатных групп полинуклео-тядного субстрата с зарядами на поверхности молекулы фермента может модулировать специфичность действия РНКазы В.1пгвгтей1и8 7Р. Эта гипотеза наала структурное подтверждение при рентгено-структурных исследованиях комплекса РНКазы В.1^впав<11иб 7¥ о 3'-<ЖР.

Практическая ценность работы. РИКаэ ВЛг^егтеЗ^в 7р является отечественный препаратом, получаемы* в настоящее время путем крупномасштабно го вццеления на Экспериментальном заводе Институт» органического синтеза АН Латвийской СССР. В данной

работе получена кинетические характеристики фермента, которые широко используются в медицинских исследованиях, препаративной биохимии и генной инженерии. Наш предложено и апробировано использование препаратов фермента в качестве ингибитора фитови-русов и вироидов, на что получены авторские свидетельства,

Ддробашя работы. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме по двустороннему свветско-итальянско-му сотрудничеству "Макромолекулы в функционирующей клетке",Пу-щино, 1980 г., 1У Всесоюзном симпозиуме "Физико-химические оо-новы ферментативного катализа и еТ'о регуляция", Москва, 1982 г., 17 Международном симпозиуме "Метаболизм и энзимология нуклеиновых кислот", Братислава, 1982 г., совещаниях координационного совета межвузовской межотраслевой целевой программы работ по решению научно-технической проблемы "Цклгазы мшросркм«*<рв и их практическое использование", Казань, 1984 г., У Международном симпозиуме "Метаболизм и внзимологая нуклеиновых кислот", Братислава, 1984 г., годичных конференциях научно-исследовательских работ Института молекулярной биолопш им. В.А. Энгельгард-та АН СССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов п методов исследования, обсувдения результатов п выводов, а также спи ока цитируемой литературы.

Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на ИЗ страницах машинописного текста, включает 20 таблиц, а также включает 16рисунков? список цитируемой литературы из141 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЕАНИЕ ЭКСНЕРШЕНТАЛЪНОЙ РАБОТЫ Характеристика химически гомогенного Фетмента Необходимый для исследования химически гомогенный препарат РНКазы в.шгегтеНив 7Р получали путем дополнительной очистки препарата РНКазы, выпускаемой Экспериментальным заводом медицинских препаратов Института органического синтеза АН Латвийской ССР. В исходном заводском препарате содержалось около 101555 примесных белков. Дополнительную очистку фермента проводили на фосфоцеллтаозе Р-11 в линейном градиенте натрий-фосфатного буфера 0,05-0,15 М при рН 7,0. После концентрирования,обео-соливаюзя и лиофилизацаи каждую партию фермента проверяли на функциональную и химическую гомогенность.

Препарат фермента в концентрации, превышающей ферментатив-

к

щи количества в 10 раз, проверяли на присутствие фоофодиэоте-разной, фосфомоноэстеразной, ДНКазноЙ активностей. Согласно определенным тестам в препаратах РНКазы В.1п1епае<шш 7Р не было обнаружено побочных активностей в пределах погрешности данных методов определения.

По данным электрофореза в полиакрилададном геле и последующего сканирования гелл на тдаюз^Хь , чистота фермента составляла 99$ при удельной активности в принятых единицах ; ! Юб ед. на I мг белка (рис. I).

Дополнительным методом,подтверждаицим гомогенность препарата, служил эксперимент по проведению изоэлектрофокусирования. Разделение шло на колонке ькв в стабилизирущей смеси ем$оли-нов, образующей на колонке градиент рН от 8,0 до 10,0 и 1рада-енте плотности сахарозы от 0 до 40^. Длительность электрофореза составляла 48 ч, напряжение 500 В:}, температура 4°. После окончания фореза фракции собирали по 0,5 мл, в кавдой определяли рН и поглощение при И^дГ Белок концентрировался в виде единст-

венного пике в области |Н 9,5, т.е. ивотоиш фераэнта соответствует этому значению. В собранных фракциях белкового пика быт «мерена актяшооть по отношении НЖ я сро • Ревультаты электрофону окрования представлены на рио. 2.

Было обнаружено, что отношение активноогей ШКа? - про но-пользовании в качестве субогратов НЖ в аре одинаково для каждой фракции.

Рис. I. Сканирование дорожки электрофоре грамш о содержаниям белка а пробе 20 икг.

Определение изоточки фериента была необходимой характеристикой при подборе условий кристаллизации я получешги крота л лов.

При электрофорезе фермента в поякакртавмвднои геле в 'присутствии додецилсульфата катрпя ups pH 7,2 вовща была только одна полоса.

Таким образом гомогенность фермента, о которым проводили исследования показана по функциональным, хлшпвсхим я физическим тестам.

V.

см

¿а ¿V

Белковый пиу. 7Р

изолированный методом пзофэкусиругадего фореза Вертикальная дтриховка актива, при гидролизе РНК Косая штриховка активн. лри гидролизе' &РС

Получаниэ кристаллов ИКазы и ее когящекоа о иягибитором-3'£,;р , пригодных для рзнт-. гоносгрукгуряого анализа.

В даниоы вослвдоващш зкопершвнтадьно иаИдзны оптимальные усяовиз урнотаяяваацш бактериальной РН&ааа В. 1гЛегте<11ип7Р -- кгучеио влияние концентрация балка, нслн ой силы, рН среды. Образование кразтаялов пера ой форш происходило при концентрации бедка около 12 мг/мя, ишной свив 0,05-0,1 и натряй-фоофатного буфера, рН 7,0; 3 Ы свС1 н сврногиопого аммония. Криоталяы росли пра коынагноИ температура а стеклянных пробирках (5x30 им) я чареа 5-6 дней доогягада раэшроа 0,3x0,6x0,8 мм, Рентгенографией й «наш криоталлов беляв проводила в Институте врастал-

-э-

лографш АН СССР при совместной работа сотрудников двух лабораторий, руководим! академиком Б.К.Вайншгейном (Инотитуг краотал-лография) и дол торга! химических наук М.Я.Карпейским (Институт молекулярной биологии) руководитель исследовательской работа -- к.х.п. А.Г.Павловский.

Прецзсоионша рентгенограммы доказали, что кристаллы принадлежали к цроотранотванной группе В2 и иыэли .следунциа параметр!

о о о

элементарной ячвйки а= 114,5 А,: 78,9 А;о = 33,3 А» гв

О

в 119,2 А; кристаллы содержали две молекулы в независима части

о

ячейки. Максимальное разрешение кристаллов - 3,2 А.

Однако о кристалла на этой форш получить комплекс фэрыента с ингибитором З-ОМР не удалооь. Поэтому была предпринята попытка поиска условий получения кристаллов другой формы.

Кристаллы второй форш были выращены ив раствора ПЭГ. Метод кристаллизации основан на ди$фузш паров летучих веществ. Принцип метода - медленный обмен паров в закрытом сосуде между бояьаш объемом растворителя а малым ойьвиои образца. ¡Кристаллизации проводили в чашках Петри при комнатной тошературэ. Для роота кристаллов в этом случае ваяно было соблюдать соотношвниз моаду обьа-мои сосуда и количеством растворителя. На дао чаши Петри наливали раствор, который содержал - 0,05 М глициновый буфер рН 9,6, 22-24$ ПЭГ (вес/объем), 2-3$ от насыщения сернокислый аммоний. На крышку чажи наносили белковый раствор в объема 25 ккл, содержащий 0,025 М глициновый буфер в 12% ПЭГ. Максимальная раадэры кристаллов через 3-4 недели были 0,8x0,8x1,5 мм '' (фотография)

Кристаллы комплекса РНКазы В. Шваа«41ив 7Р с ингибитором получали методом совместной кристаллизации. Способ кристаллизации был тот во, что н для нативного белка с той лишь разницей, что в капля о белком добавляли ОрС в концентрации, 4-5 раз прввыдающей концентрации балка. Кристаллы в этом случае как нативного, так н комплекса принадлежали к пространственной

группе Р2Т2Т2Т с параметрами элементарной ячейки а» 111,38 о 1 о

А, ь о 69»56'А, о * 33,46 А и содержали две молекулы в независимой части ячейки. Максимальное разрешение кристаллов -о

2 А.

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ НЖазы В. internedi.ua 7Р : .'.

Гчдролиа шШо^ш Для исследования субстратной специфичности в качесгае субогра-гов были взята нуклеозвд-2'1,3 '-цшлофосфаты пуринов ого и пиримвди-нового ряда. Для определения относительных скороотей гидролазной реакции применяли полуколичесгвенный хромагвграфичэский метод анализа продуктов распада, йсспврикэнт проводили при нейтральных значениях рН, а количество суботрата, трансформированного в продукт рэакцщ,;'измеряли через 10 мш, 2 ч. и 24 ч. Результата по исследованию действия ШКазы В. тегтеНиа 7Р на нуклеозвд-Я'.^ртлофоо-фата представлены в таблица I.

Таблица I

Результаты хроматографпча ского енализа реакции гидролиза нуклеозвдциклофосфатов ИССазой В. 1п*вгвв<Цив 7Р

(Концентре-!Отношение! Количество субстрата, [Яродукш |цш субст-!концентра! трансформированного в Субстрат!рата, . !ций суб- I продукт. % _¡реакции

ата, ций су б- продукт. 1

Н'Ю4 [Д^

чао.

24 час

I

в> р А>р С >р и > р

0,07. 1.0

1,0

1,0

1740 900 600 700

20 О О О

32 О о о

50 О О О

• 3 - ШР

Проведенный эксперимент позволил сделать вывод о том, что и> р, С > р, А > р не гидролизуются даже при очень высоких концентрациях фермента. Однако при этих же значениях рЯ н в присутствии каталитических количеств фермента было зарегистрировано быстрое расщепление 0 >р о о0рв«ованнэи в ха частя в продукта З'-щр,

-12В связи с этим представляло интерео выяснить характер взаимодействия B.lntermedius 7Р о нуклеотидами. С этой целью было изучено ингибирупцее влияние з'-АМР, З'-омр, З'-омр в З'-анр на катализируемый РНКазой гидролиз субстрата GpC. Из экспериментальна данных этого исследования, представленных в таблице 2,мы сделали следующие вывода:

1. Конотанта ингибированая З'-AUP, Э'-снр, Э'-иир мелы и

t

близки медду собой.Можно думать,что b втих комплексах отсутствует специфическое взаимодействие нуклеинового основания о белком.

2. Э'-СИР оказался примерно в 300 раз аффективнее в качестве ингибитора при катализируемой РНКазой реакции гидролиза ОрО, чем остальные 3 -дуклеотиды.

3. Полученные результаты позволяют считать, что РНКаза B.inteimediua 7Р проявляет специфичность к основанию иуклеоти-дов соответственно ряду Ока, Ade, Oyt, Ura.

Таблица 2

Константы ингпбироваивл реакции гидролиза GpC РНКазой B.intorasiiua 7Р ыононуклоотадами и свободная внергня связывания комплекса фармент-пугдаотид

Нуклеотид j K-t-.ICT*, i fr1 | -лв-! ^'ял/моль

З'-АМР 1,94 4,5

Э'-ОИР 2,01 4,5

З'-имр 2 4,5

З'-аыр 620 7,8

Для выяснения характера взаимодействия фермента В.1п1;«лм>41ш 7Т о нуклеозхдошм ^рапнэнтом субстрата были измерены кинетические параметры гидролиза иуклеозидциклофосфа-тов пуринового ряда и их аналогов. Сопоставление параметров

гпдролиза РНКазой В.1п*егав<ц.ил 7Р в ряду производных гуанози-па (табл. 3) позволяет заключить:'.

Таблица 3

Кинетические параметры реакций гидролиза

низкомолекулярных субстратов РНКазой в.1п^гт«(11ия 7Р (в скобках даны значения для гуанилспецифичной РНКазы Р.Ъгет1оошрао*ия рН 6,2, I и 0,2 М И 25°

Суботрат 1 т [■ ккат» 0 ! ^ ю4, г1 }ккаА,. (Г1[ГГ

оио-г'.з'-Р 0,12 (0,067) • 1,9 (1,9) 632 (363)

1по-2',3'-Р 0,029 (0,018) 8,3 (2,4) 34,9 (75)

0,043 80 5,4

1И«-1по-2',3'-Р 0,029 87 3,3

у^авог-г'.з'-р 0,018 83 2,2

что из всех использованных нуклеозидциклофосфатов только а^ является хорошим субстратом. Отсутотвие аминогруппы во втором положении у этих соединений приводит к увеличению Ку, у иноэин-циклофоо$ата в 4 раза, у 1ао-2',3'-Р, Шв-1ло-2',3'-р, У1гаао1 -2',з'-Р увеличивается более чеглг■ на порядок. Константа скорости гидролиза аналогов субстрата РНКаэой БавЛгПегавйЦия 7Р снижается почти на порядок. Снижение кяат и увеличение Ку у 1-Ме-инозина возможно объяснить тем, что метальная группа в первом положении стерически препятствует, продуктивному связыванию гетероциклического состояния. У впразолциклофосфата Ку больше на порядок, чем у гуано8ина. Это может быть обусловлено большими энтропийными потерями в результате замораживания дополнительных степеней свобода при связывании субстрата. Из таблицы 3 видно, что разница в параметрах гидролиза гуаяозин-

И инозин-2* .з'-циклофосфатов ТНКазой B.lntermediue IV и внсо-но специфичной ИШаэой P.brevloompaotiiBневелика. Поэтому можно ожидать, что структура контактов гуанинового основания с белком в фермент-субстратных комплексах обеих РНКаэ должна быть примерно оданиковой.

Изучение субстратной спешДрчнооти B.lptera«dlna 7Р

Ма.Т9ДРМ ШТтРРТШТУРНЗДР ШЭДШ

Исследование взаимодействия нуклеотида с ферментом проведено совместно с сотрудниками Института кристаллографии АН СССР

им. A.B. Щубникова А.Г, Павловским, Р.Г. Саншшили и др. Иссле-

о

дование было проведено о разрешением 2 А, Еа рве. 3 показано расположение з'-чш? в активной центре B.intennediua 7Р. В активном центре фермента можно выделить узнанций и каталитические участки: узнающий учаотоя сформирован фрашентом полипептидной цепи о номерами остатков 55-59. В каталитическом участке находятся Qlu 72, fjx 102, а также несколько положительно заряженных остатков: Ьув 26, Н!е 101, Arg 82, Arg во. При образовании ферментнуклеотидного комплекса основание нуклеотида располагается в гидрофобной области, сформированной боковым радикалом^ РЬ» 55 м алифатической чаотью боковой группы Arg 58. Определяющую роль в узнавании субстрата ферментом играют водородные связи, которые образуют гетероатомы основания нуклеотида с узнающими группам белка.

1. В случае взаимодействия фермента с основанием гуанозина (рио.Э ) может'образоваться максимальное число водородных связей (6-6).

/ ,

2. С основанием инозина - меньшее количество водородных овязбй (4-5).

3. О основанием ксантозина образуется дестабилизирующее взаимодействие О««- ♦О вместо водородной овязи mi.....о.

Рио. 3. Схема возможных контактов в узнающаи участке активного центра ШКавн ВДЫ:егте<Нив 7Р при связывании гуанв-нового основанш субстрата.

4. и (1)Ие* груша иновша образует огеричэское препятствие дяя образовани^водородных связей о . 01^59.

5. Фра же нт -б-ш^ у вира зола обладает дополнительными

вращательными степенями свободы, в результате не сохраняется яесткий мотив как в случае 'Сш*.

ГВДТОИЗ ШЩдзачвДдоФЗШ

В качестве следующего этапа изучения субстратной специфичности РНКазн В.1^»тв(11ив 7Р на низкомолекулярннх субстратах проводили сравнителиое исследование скоростей расщепления различных дшуклеозвдфосфатов. В таблице 2 приведены результаты хромагографячесиого анализа реакция гидролиза дщунлэозидфосфа-тов ГНКавы В.1^вгтв(11ив 7Р при нейтральных значениях рн.

Из экспериментальных данных, представленных в таблице, видно, что в присутствии каталитических количеств фермента гидролиз ара происходит, по крайней мере, в 100 раз быстрее, чем гидролиз остальных исследованных динуклеозидфосфатов. Таким образом, приведенные результаты показывают, что РНКаза ВЛпгегтесииа 7Р проявляет специфичность в отношении гуанозинсодерхацих ниаяо-

Таблица 2

Результаты хроматографического анализа гидролиза динухяеозидфосфатов РНКазой В. 1пгегтес11иа 7Р 15111 рН 7 и 25°С

Суботрат

8-10*

s/в

Юмин

24 ч.

Продукты

АРА 1.4 70 следы 20 30 А>р, Ado

СрА 2,5 100 следы 15 35 с»;, Ado

GPO I.I 2200 40 70 90 ' G>P,CMP,Cyt

АрО Г.1 300 0 0 следы А> р, Cyt

срс 1.2 300 0 0 следы -

молекулярных субстратов. Вместе с тем для случая, когда в.качестве субстратов используются динуклеозидфосфаты, превышение скорости расщепления гуанозинсодержащего субстрата аре по отношению к другим динуклеозндфосфатам невелико. Так, в случав гуанилепе-цифичной РИК&зы Tj из Apperglllus огуввв отношение скорос-

е

тей расщепления оро и АрС составляет 10 . В случае исследуемой РНКазы это отношение при сравнении, например, орс и ара на три порядка ниже. В связи с этим РНКаэу в.intermeiiua 7Р следует отнести к гуанозинпредпочитащим РНКаэам, подчеркивая тем самым ее сравнительно низкую специфичность к гуаниловым нуклеотидам.

ртотачиая специфичность Фошепта (влияние второго основания)

С целью изучения механизма дейотвия и получения более полных представлений о специфичности действия РНКааы в.1пгвгтв<ииа 7Р на стадии транозтерификации были проведены измерения кинетических параметров гидролива этим ферментом ряда динуклеозидфос-фатов (табл. 3).

Таблица 3

Кинетические параметры реакций гидролиза гуанозинсодержодих динунлеозидфосфатов РНКазой В.1хЛегие41иа 7Р при рН 6,2 I о 0,215 я 25°с

Субстрат Кат.0-1: | Км'104« М"Г ("•жаЛ-ИГ4.«"1.»"1

ОрА 14,0 2,3 6,1

ОрО 3,0 1,1 2,7

ОрО 1,2 2,0 0,6

Ори 0,6 0,83 0,7

Из таблицы видно, что скорость расщепления динуклеозид-фосфатов типа ОрХ, где ЬЛ, 0, 0, и уменьшается в ряду А > 3 С, О, Изменение скорости в этом ряду составляет около одного порядка и обусловлено главным образом вариацией каталитической константа скорости к„„„, тогда как коно-

кат

танта Михаэлиоа остается практически поотоянной.

Рдопедлеяие полинуклеотидов С целью изучения механизма действия бактериальной РНКази 7Р И субстратной специфичности ее на полинуклео-твдах были измерены кинетические параметры реакции расщепления »тим ферментом Ро1у<1), ро1у(А), ро1у(и), ро1у(С) на стадии транозтерификации. В таблице 4 представлены данные по гидролизу полирибонуклеотидов РНКазой В.±п*егте<11иа 7Р.

Таблица 4

Кинетические параметры гидролиза гомопвлирибонуклеотидов РНКазой В.1^вгав(11ив 7Р при рН 6,2 и 25°С

Субстрат ]ккат- 0-1 \ «м 1о4. М"1 | "каА,. С"1 И"1

Ро1у(1) 65 0,22 3,5.10е

Ро1у(А) 180 1Д 1.6.106

Рогу(О) 2,2 2,5 8,8. Ю3

Ро1у(0) 0,025 1.7 1,5.102

Из таблица видно, что пуриновие полинуклеотида расщепляют-2 1

ся в 10 -10 раз быстрее, чем пиримидиновые. Если реакция рао-щепления, пуриновых и'пиримидиновых полинуклеотидов осуществляется под действием одних и тех же каталитических групп фермента, т.е. протекает в одном и том же активном центре,то следует ожидать сохранения установленного выше характера влияния природы 05'-концевого нуклеозида на скорость расщепления.Тем не менее более высокая скорость расщепления ро1у/А)и рс1у(1)по сравнению с ро1у(о;и ро1у(0)не может бить объяснена только влияний» типа нуклеозида на 05'-конце расщепляемой связи.

Для выяснения вопроса о том, гидроллзуются ли пуриновыо и пиримидиновые полинуклеотпды в одном и том же активном центре

ШКазы В, intenjeaiua 7Р, изучали зависимость отношения жинети-чесних параметров *ка? и Ку от jfl для рееяций распрпления poly (А) и poly(и) (рио. 4)

г 6'

i 5

3"

t -

р 3 2-

V^Ah)

5

* 9

РН

Рио. 4. Зависимость ^ар/Кщ от Ш для реакшй

гвдролпааара ' (I), ро1у(и)(2), ро1у(АX3) ГОКазоЯ В.1пгвпае(Иив 7Р.

Из рио.4 ввдно, что завиоимооти *катАи от рН в облаоти рН 6,5-9 для реакций пиролиза брС, ро1у(А)и ро1у(и }практически одинаковы. На основании этого мсашо заключить, что реакция всех указанных субстратов протекает в одном и той хе активном центре НЖазы.

Возникает вопроо: почему ШКазы ВДп*«та*41и» 7Р, проявляющая гуаниловую специфичность при гидролизе низномолекуляркых

3

ч

7

субстрагов, окашивается иуршспеця$ично0 при гвдроявзз полири-ботуклеотвдов? В случае динуклеозддфосфатов, содержащих гуано-вин на ОЗ'-конце фоофодиэфирюй связи, продуктивный фермент-субстратный комплекс образуется за счет специфической фиксации белком гуанилового основания и фосфатной группы. При гидролиза полинуклеотвдов вместе со специфичной фиксацией фосфата расщепляемой связи может происходить связывание ближайших к ОЗ'-нукле-оавду фосфатных групп (как указывалось выше, изоточка ШКазы в.1пгвшв(11и* 7Р равна 9,5). При определенном расположении зарядов на поверхности белка, возможно реализующимся для ШКазы з,1^егтв(11ив 7Р, в результате такого связывания ОЗ'-нуклео-8ида, не являющимся производным гуанозина, макет оказаться в положении, близком к локусу белка, в котором связываются производные гуановина. При этом за счет ограничения конфорыационной подвижности ОЗ'-нуклеозвд макет болшую или меньшую часть времени находиться в том локусэ фермента, где специфически связывается гуаноэин. В этил случае его продуктивная ориентация относительно фоофата и каталитических групп фермента достигается но специфичным связыванием с белком.

Анализ литературных данных дозволил нам предположить, что более высокие значащи ккаг для пуриновых полинуклеотвдов по сравнению с пиримвдиновыми отражают более сильное станин г- взаимодействие ОЗ'-нуклеозвда с ароматическим аминокислотным остатком белка. Этот вывод хорошо согласуется с данными РСА по комплексу РНКазы о З'-ШР, где показано, что основание бив/ находится в стакинг-взашодействии с фенилышм кольцом Туг 102.

Рассматриваем^ механизм расщепления полинуклеотвдов ИйСазой в.1пгвгтв(11и» 7Р согласуется с наблюдаемой разницей величин каталлтических констант скоростей гидролЯза ро1у(и)п ро!у(с )(табл.4). Величина ккат определяется отношением кон-

центраций продуктивных и непродуктивных комплексов форманту с по-линуклеотидом. Поэтому следует ожидать сравнительно меньших аначе-ний к кат для тех нуклеозидов, основание которых имеет больное сродство к воде.

Из литературных данных известно, что сродство цитозина к воде в 60 раз выше, чем урацила. Это значение близко к величине отношения к Каг для реакций гидролиза ро1у^ц)я poly ( 0 )о поправкой на вторичную специфичность РНКаза, Обсуждать на подобной оонове различие скоростей poly. 1 )и ро1у(А)не представляется возможным, так как трудно вычленить вклад специфичных взаимодействий ,гип£ксантина с белков при образовании продуктивного комплекса РНКазы о poly'fl).

ВЫВОДЫ

1. Разработана метода кристаллизации белка. Полученч две кристаллические модификации кристаллов РНКазы b.intermediue 7р, пригодные для рентгеноотруктурного анализа.

2. Получен кристаллический комплекс РНКаза B.intennedius 7Р с нуклеотидом, позволяющий провеоти рентгеноструктурные исследования о разрешением 2 8.

3. Показано, РНКаза B.'.interm'edlua 7Р при гидролизе нукло-озид-2'-3'-циклофосфатов и динуклеозидфоофатов проявляет себя как гуаноэинпредпочитавдий фермент. В отличив от высокоспецифичных гуаниловах рибонуклеаз, для которых отношение скоростей раощепления, например GpC и АрС составляет Ю5 и более, для ШКазы В. Intermedins 7р оно равно 102#

4. На основании результатов реакции гидролиза различных аналогов гуаяозинового циклофоофата РНКазой в.1л*вгвв<11цв 7Р, полученных методом стационарной кинетики в рентгеновского анализа, показано, что определяющую роль в специфическом овяз-

вывания гуанилового нуклеотида яграют водородные овязи.

б. Иооледоваиа вторичная специфичность РНКааы в, inters, ■•diu« 7Р. Обнаружено, что величина скороотя расщепления динуклеозидфосфатов типа оря, где н » А,о,с,и изменяется в пределах одного порядка и уменьшается в ряду Ai?,c*c,u.

6. Определены кинетические параметр« реакций гидролиза синтетических гомополирибонуклеотидов под действием ШКаза

B.lnterm«diae 7Р. Обнаружено, что бимолекулярные константы окороотя гидролиза poly (I) в poljr (А) практически равна между собой и превышают практические значения для poly (и ) в poly (С) в I02 я Ю3 раз, соответственно, т.е. ШКава B.iu»«rm«4iue 7Р является пурикпредпочитающим ферментом

при раощеплении синтетических гомополинуклеотидов. Показано, что реакция гидролиза мвкомолекулярных и высокомолекулярных субстратов протекает при участии одних и тех же ионогенных групп

активного центра фермента.

7. Предложена гипотеаа, описывающая, как электростатические взаимодействия между фосфатными группами полинуклеотидов и зарядами на поверхности белка могут моделировать" специфичное» и аффективное» действия FHK-деполимерав в зависимости от размеров суботрата, и объясняющая наблюдавшиеся изменения специфичности гаКазн 7Р при переходе от низко- к високомолекулярным субстратами Гипотеза нашла подтверждение при рентгеноотруктурннх исследованиях.

Материалы диссертации отражены в следующих публикациях:

1. Голубенко ИД,, Клайнер Г.И., Балабан Н.П., Филимонова Т.В,, Чепурнова Н.Г. Тез,докл.Всесоюзной конф. "Методы получения

и анализа биохимических препаратов". Тез.докл. 1977 г., с. 69, г. Олайне.

2. Голубенко H.A., Балабан Н.П., Лещинская И.Б., Волкова Т.И., Клейнер Г.И., Чепурнова Н.К., Афанасенно Г,А, и Дудкин С.Н, Рибонуклеаза Baoiliue interaediue 7Р. Очистка хроматографией на фосфоцеллшозе и некоторые характеристики гомогенного фермента. Биохимия, 1979, т. 4, с. 640-647.

3. Карпейский М.Я., Чепурнова Н.К., Яковлев Г.И,, Ханданян АД., Голубенко И.А. - Изучение субстратной специфичности и строе-, ния активного центра, механизм действия рибонуклеазы Baoillue intermediua 7P. - Тезисы докладов Второго двустороннего советско-итальянского симпозиума "Макромолекулы в функционирующей клетке", Цущино, 1980, с. 48.

4. Голубенко И.А., Чепурнова Н.К., Лещинская И.Б.,Балабан Н.П. Препараты внеклеточной в.intermediua 7Р. Прикладная биохимия и микробиология, 1977, т. 14, вып. 6, с. 3-6.

5. Карпейский М.Я., Ханданян АД., Чепурнова Н.К., Платонов А. Л., Яковлев Г.И. Изучение субстратной специфичности и механизм действия рибонуклеазы Baeillua intermediuo 7Р. Биоорганическая химия, 1981, т. 7, « И, с. 1669-1679.

6. Чепурнова Н.К., Моисеев Г.П., Бочаров А.Л., Карпейский М.Я., Яковлев Г.И. Вторичная специфичность РНКазы Baoillus int его 4iue 7Р. Гидролиз полинуклеотидов. - Тезисы доклада на конференции "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое применение", Рига, 1985 г.

7. Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Лопатнвв C.B., Волкова Т.И., Карпейский М.Я., Чепурнова Н.К., Яковлев Г.И. Разработка

препарата бактериальной рибонуклеавн Baoiliw internadlo* TP« - Доклад на У Всесоюзной конференции, Црмала, 1987 г., О. 79.

6. Яковлев Г,И., Чепурнова Н.К., Моисеев Г.П., Бочаров А.Л., Лопатнев C.B. Специфичность РНКазы Baolllu* intercedí ад» 7Р в реакциях расщепления полинуклеотидов ~ Виоорган. химия, 1987, т. 13, JÍ 3, о. 338-343.

Эф Pavlorelcy A.Q., Vagin A.A., Vainstein B.K., Chepurnova Ï.K., Kcrpelaky U.Ys. Thxee-dimenalonal structure of ribonnoleaeo fron Eaoillue lntermediue 7P at 3,2 £ resolution - РЕВЗ, 1983» p. 167-170.

10.PnTloTsky A.0., Cbepurnora H.K., ilallnlna L.V. X-ray study of rlbonuoleoee from Bacillus intermediua 7P. - In booki "Ue-t ato Нош end ensyjnologjr of nuolelo golds lnoludlng gene nanl-pulatlona", 1984, p. 373-380.

11.PavloYBlcy A.0., Borlsova S.U., Strokopytor B.V., Sanlehrlll H.O., Vagin A.A., Chepurnova U.K. Struoture, bases for nuol*o-tlde reoognltlon by guanyl-epeolflc rlbonueleasee. - In booki "Metabolism and etymology of nuolelo acida Including gene nanl-pulationa", 1987, i?. 323-330.

12. Павловский A.P.,Борисова C.H., Санишвилл P.Г., Челурнова H.K. Яковлев Г.И. " Структура двух кристаллических модификаций рибонуклеазы в.lntermediue 7Р и ее комплекса с гуанозин-3--монофосфатом.-Тезисы докдада на УП Всесоюзном симпозиуме по химики белков и пептидов. Таллин, 1987г.,с.88

13. Павловский А.Г. ,Санинвилн Р.Г., Борисова С.Н., Строкопытов Б. Вагин A.A., Чепурнова Н.К., Вайнштейн В.К.."Структура двух кристаллических модификаций рибонуклеазы Bacillus intermedia» 7Р - Кристаллография, I9Ö9, т.34, JM, с. 137-142.