Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование противоопухолевой активности аутологичных вакцин на основе белков теплового шока in vivo

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование противоопухолевой активности аутологичных вакцин на основе белков теплового шока in vivo"

На пвавахаг^кокили-

□□3451385

КОСЕНКОВ Дмитрий Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ АУТОЛОГИЧНЫХ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА IN VIVO

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О ОПТ 2003

Москва 2008

003451385

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И.М.

Сеченова

Научные руководители:

член-корреспондент РАН,

профессор, доктор химических наук Северин Евгений Сергеевич кандидат биологических наук Ляшенко Алла Анатольевна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН,

профессор, доктор медицинских наук Караулов Александр Викторович профессор, доктор биологических наук Болдырев Александр Александрович

Ведущая организация:

ГНЦ Институт Иммунологии Федерального медико-биологического агентства

Защита диссертации состоится «¿/»//¿1^3 2008 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, Д. 6.

Автореферат разослан 2008 г.

I

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.203.13

профессор ^(/¿узе&е&сё^ъ- Е.В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы

Современная медицинская наука располагает широким арсеналом средств лечения опухолевых заболеваний. Наиболее традиционным подходом к противоопухолевой терапии является сочетание хирургического и терапевтического методов лечения. При этом немаловажное значение в результативности применения противоопухолевой терапии должно отводиться иммунной системе пациента: адекватный уровень иммунной защиты зачастую определяет успех противоопухолевого лечения. Известно, что при удалении материнской опухоли риск развития метастазов многократно увеличивается, особенно у пациентов с ослабленной иммунной системой. Поэтому стимуляция, как общего, так и специфического противоопухолевого иммунного ответа является неотъемлемой частью современных подходов к лечению опухолей.

В современных иммуномодулирующих средствах используется широкий набор механизмов, приводящих к стимуляции неспецифического и специфического иммунного ответа, - базисной защиты от появления чужеродных агентов (в том числе клеток) в организме. Клетки, подвергшиеся вирусному или бактериальному заражению, при адекватном состоянии иммунной системы, в общем и целом, могут быть мишенями для иммунной системы. Однако опухолевые клетки, являющиеся частью организма человека, не распознаются иммунной системой человека. Это обусловлено в частности тем, что опухоли характеризуются низкой иммуногенностью: на их поверхности отсутствуют белки, чужеродные для организма, благодаря которым они могли бы отличаться от нормальных клеток, и, следовательно, быть распознанными и уничтоженными иммунной системой. Таким образом, наиболее важным направлением для решения данной проблемы является разработка вакцин, способных вызвать специфический иммунный ответ против опухоли.

Современные биологическая и медицинская науки успешно развивают первое направление. В настоящее время существует множество разработок противоопухолевых вакцин на основе самых разнообразных подходов. Среди них - рекомбинантные опухолевые антигены, клеточные опухолевые лизаты, целые опухолевые клетки, вакцины на основе дендритных клеток, ДНК-вакцины и т.п. Однако, наряду с их неоспоримым достоинством, а именно способностью к стимуляции специфического иммунного ответа, все они обладают рядом недостатков: недостаточная индукция специфического иммунного ответа, технологические сложности изготовления, высокая стоимость и т.д.

Наиболее перспективным подходом, направленным на решение вышеуказанных проблем, является использование аутологичных вакцин. Материалом для изготовления таких вакцин является собственная опухолевая ткань пациента, удаленная хирургическим путем. Согласно многочисленным литературным данным, наибольшую противоопухолевую активность проявляют аутологачные вакцины на основе белков теплового шока (HSP, от англ. heat shock protein). Выполняя шаперонную функцию, они практически постоянно находятся в комплексах с пептидами, характерными для данной клетки. Это свойство позволяет выделять из опухолевых клеток комплексы, состоящие из HSP и антигенов, специфических для данной опухоли.

Аутологичная вакцинация активно изучается во многих ведущих медицинских центрах: согласно данным компании Antigenics, в настоящее время к участию в проведении клинических испытаний на основе HSP-вакцин допущено 69 клиник Европы и Америки. В настоящее время проводимые испытания находятся на различных стадиях (I, И, III фазы), что подтверждает противоопухолевую эффективность HSP-вакцин. В проведенных на данный момент клинических испытаниях уже показана стимуляция специфического иммунного ответа у 75% пациентов, что является высоким показателем и свидетельствует в пользу перспективности данного метода.

Несмотря на успешные результаты, полученные при изучении иммунотерапевтического лечения аутологичными НБР-вакцинами, остается нерешенным вопрос о том, как, при наличии специфического иммунологического стимулятора (комплексов «НБР-пептид»), повысить собственную иммуногенность опухоли и ее метастазов.

Важной проблемой, которая не позволяет расширить использование данного метода, является ограниченное количество опухоли, что осложняет получение необходимой дозировки вакцины. Следовательно, актуальным является поиск способов повышения иммуногенности опухоли и ее метастазов, а также повышение в ней количества антигенного материала, составляющего основу данной вакцины (в данном случае пептидных комплексов с НБР).

В данной работе предложена попытка решить указанные проблемы с целью повышения противоопухолевой эффективности аутологичных вакцин. Эта задача решалась двумя способами. Во-первых, основу получаемой вакцины составили не один, как в исследованиях Srivastava е/ а/., а три белка теплового шока: ЬБр70, ЬврЭО и Бф94 (далее ЬБр96). Это позволяет существенно увеличить количество ант игенного материала и расширить его спектр. Во-вторых, до хирургического удаления опухоли пациенту проводилась терапия препаратом Онкофер™ на основе радиоактивного железа (59Ре). 59Ре способно накапливаться в опухолевой ткани за счет связывания с белками-переносчиками, количество которых в новообразованиях повышено, и за счет у-излучения вызывать некроз опухолевых клеток и тромбозы в микроциркуляторном русле. Это, в свою очередь, вызывает гипоксический стресс, который способствует усилению продукции комплексов НБР со специфическими пептидами и, как следствие, ведет к повышению иммуногенности опухолевых клеток.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: изучение противоопухолевой активности продукта на основе антиапоптотических аутологичных HSP в комплексе с опухолевыми антигенами, а также их комбинации с внешним стрессовым фактором in vivo. Задачи исследования:

1. Разработать методику выделения и очистки комплексов «HSP+опухолевый антиген» из опухолевой ткани.

2. Оценить цитотоксичность полученного продукта in vitro.

3. Изучить влияние полученного продукта на неспецифический иммунный ответ ex vivo.

4. Оценить возможность использования внешнего стрессового фактора для повышения продукции HSP, как источника иммуногенного материала.

5. Провести сравнительную оценку противоопухолевой активности аутологичных HSP (монопрепарат), внешнего стрессового фактора, а также их сочетания.

Научная новизна

Впервые разработана методика единовременного выделения и очистки пептидных комплексов на основе трех белков теплового шока, показана цитотоксическая безопасность данных комплексов in vitro. Продемонстрирована способность полученного продукта активировать неспецифический иммунный ответ ex vivo в зависимости от используемой дозы и времени. Впервые исследована возможность применения Fe59, как внешнего стрессового фактора, с целью повышения содержания белков теплового шока в опухолевой ткани, и впервые доказано, что эффективность комбинации полученного продукта с исследуемым стрессовым фактором in vivo является более высокой по сравнению с использованием монопрепаратов.

Практическая значимость работы

Результаты представленной работы позволяют повысить эффективность использования аутологичных противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока за счет одновременного увеличения количества иммуногенного материала в вакцине и повышения иммуногенности самой опухолевой ткани.

Апробация диссертации

Апробация работы проведена на заседании кафедры биохимии ГОУВПО ММА им. И.М. Сеченова (6 декабря 2007 г.)

Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались: -на II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (февраль 2005 г., г. Москва);

-на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (октябрь 2005 г., г. Москва);

-на научно-практической конференции «Молекулярш основи i юншчш проблеми резистентности до лжарських засоб1в» (ноябрь 2006 г., г. Киев); -на XXXII конгрессе FEBS «Molecular Machines» (июль 2007 г., г. Вена).

Публикации

По результатам проведенных исследований опубликовано 8 печатных работ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложена методика единовременного выделения и очистки аутологичной вакцины на основе трех белков теплового шока.

2. Аутологичные белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами не обладают цитотоксической активностью по отношению к клеткам линии MCF7.

3. Полученный продукт дозо- и времязависимо увеличивает продукцию TNF-a в крови больных животных, то есть обладает способностью к активации неспецифического иммунного ответа.

4. Применение 59Fe, как внешнего стрессового фактора, п озволяет добиться повышения уровня эндогенных белков теплового шока - материала для аутологичных вакцин.

5. Сравнительная оценка противоопухолевой активности аутологичных комплексов на основе HSP (монопрепарат), 59Fe, а также их сочетания показала, что наибольшей противоопухолевой активностью обладает комбинированное применение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав и выводов; включает библиографический указатель из 147 источников, в том числе 17 отечественных, 130 иностранных, иллюстрирована 16 таблицами, 53 рисунками.

Результаты исследования

Для выделения и очистки HSP-пептидных комплексов нами была разработана методика, включавшая следующие стадии: гомогенизация в гипотоническом буфере, центрифугирование, двухступенчатое осаждение белков, гель-фильтрация на Sephadex G50, аффинная хроматография на гепарин-сефарозе (Рис. I) и ультрафильтрация. Свойства полученного продукта оценивали по содержанию эндотоксина при помощи LAL-теста, а также по содержанию белков теплового шока при помощи иммуноферментного анализа (ELISA). В результате было показано, что содержание эндотоксина составило менее 0,06 ЕЭ/мл, при этом количество белка в конечном продукте составило около 1 мг/мл.

Время хроматографии

Рис. 1. Фракционирование белков на колонке с гепарин-сефарозой (0 = 1,5 см, Ь = 9,7 см; V = 12,9 мл).

Разработанная методика позволила с высокой степенью очистки (около 60%) единовременно выделить пептидные комплексы на основе 3 белков теплового шока: Ьзр70, Ьзр90, Ьзр96, что было доказано окрашиванием серебром геля после электрофоретического разделения белков в денатурирующих условиях (Рис. 2), а также методом вестерн-блота (Рис. 3).

97 кД.

вйкД

К Щ

1 »зсчищ.

2 КДИНЭ

Рис. 2. Электрофореграмма белковых фракций после гомогенизирования (дорожка 1) и после ультрафильтрации (дорожка 2).

sis« 66

«щ

30 щ

hsp70 hsp90 hsp96

Рис. 3. Определение молекулярной массы Н8Р в полученном продукте методом вестерн-блота в денатурирующих условиях на ПААГ.

Для изучения возможности применения полученного продукта in vivo полученного продукта нами было проведено исследование цитотоксичности от vitro на опухолевых клетках линии MCF7 (аденокарцинома молочной железы человека) с использованием МТТ-теста и теста на стимуляцию синтеза ДНК (т.е. стимуляцию пролиферации). В ходе исследования было показано, что продукт не вызывает гибели клеток: при сравнении с контролем статистически достоверных отличий не было (Рис. 4). Таким образом, был сделан вывод об отсутствии влияния выделенных пептидных комплексов на выживаемость клеток линии MCF7.

ЬЛкг белка в лунке

Рис. 4. Результаты исследования цитотоксической активности полученного продукта.

Кроме того, продукт не снижал пролиферации опухолевых клеток (включение С14-тимидина статистически достоверно не отличалось от контроля) (Рис. 5), следовательно, отсутствовало влияние пептидных комплексов на основе ШР на пролиферацию клеток линии М№7. Таким образом, было доказано отсутствие у полученного продукта цитотоксической активности.

Включение СН-тимидина

3 ТЛ

Мкгбелгавлунке

- контрол ь

Рис. 5. Результаты исследования влияния полученного продукта на синтез ДНК (пролиферацию клеток).

Для определения биологической активности полученных аутологичных НБР-пептидных комплексов нами было проведено исследование их влияния на продукцию ЮТ-а - одного из основных цитокинов, выделяющихся при неспецифическом иммунном ответе.

В ходе эксперимента было показано, что при совместной инкубации клеток моноцитарно-макрофагального ряда из мышей с аденокарциномой молочной железы с ШР-пелтидными комплексами происходила активация продукции Т№-а . Как показано в таблице 1, изменение концентрации данного цитокина у мышей с аденокарциномой молочной железы до лечения зависело от добавляемого в лунку количества белка (НБР-пептидных комплексов). Аналогичные данные были получены при добавлении в лунку с клетками

стандартного иммуномодулятора - Полноксидония™ (Таблица 2). Однако достоверные различия в концентрациях ТКР-а в лунках с добавлением 1 и 10 нг иммуномодулятора отсутствовали. Различия по концентрации были достоверными в лунках с добавлением 10 и 100 нг препарата.

Последующее сравнение полученных данных с данными от добавления НБР-пептидных комплексов или Полноксидония™ к клеткам моноцитарно-макрофагального ряда здоровых мышей (Таблицы 1,2 ) также показало зависимость действия препаратов от добавляемой дозы.

Полученые сведения позволили сделать вывод о зависимости стимуляции неспецифического иммунного ответа от используемой дозы препарата, причем зависимость от используемой дозы в большей степени наблюдалась у ШР-пептидных комплексов. Это свидетельствовало о большей специфичности, по сравнению с Полиоксидонием™, их влияния на стимуляцию выделения провоспалительного цитокина ЮТ-а.

Таблица 1

Концентрация ТОТ-а у мышей через 24 часа после добавления НвР-пептидных комплексов

Концентрации Т№-а 1 нг белка/лунка 10 нг белка/лунка 100 нг белка/лунка

Мыши с аденокар-циномой молочной железы до лечения 115,4 ±9,7* пкг/106клеток 404,8 ±20,1* пкг/10б клеток 202,3 ± 9,6* пкг/106 клеток

Мыши с аденокар-циномой молочной железы после лечения 3,8 ±0,8 пг/106 клеток 2,6 ±0,6 пг/106 клеток 5,99 ±1,0* пг/106 клеток

Здоровые мыши 77,5 ±11,7 пкг/106 клеток 90,9 ±12,4 пкг/106 клеток 49,5 ± 5,7* пкг/106 клеток

* - р < 0,05

Таблица 2

Концентрация Т№-а у мышей через 24 часа после добавления Полноксидония™

Концентрация ТЧР-а 1 нг белка/лунка 10 нг белка/лунка 100 нг белка/лунка

Мыши с аденокар-циномой молочной железы до лечения 28,2 ± 2,7 пкг/106 клеток 32,0 ±3,8 пкг/106 клеток 14,6 ±0,9* пкг/106 клеток

Мыши с аденокар-циномой молочной железы после лечения 0,28 ±0,1 пг/106 клеток 0,57 ± 0,2 пг/106 клеток 0,77 ± 0,3 пг/106 клеток

Здоровые мыши 111,9 ±4,8* пкг/106 клеток 30,5 ±3,8* пкг/106 клеток 10,2 ± 1,5* пкг/106 клеток

* - р < 0,05

На основании полученных данных была проведена оценка изменения концентрации TNF-а в зависимости от времени. Было показано, что после добавления HSP-пептидных комплексов к клеткам больных мышей со временем происходило увеличение концентрации TNF-a в лунках (Рис. 6А). При этом, подобный эффект не наблюдался в случае применения Полиоксидония™ (Рис. 6Б).

Основываясь на полученных результатах, был сделан вывод, что полученный продукт способен специфически (дозо- и времязависимо) индуцировать продукцию TNF-a, в отличие от стандартного иммуномодулятора (Полиоксидония™), то есть стимулировать неспецифический иммунный ответ.

Стоит отметить, что данные, полученные нами по препарату Полиоксидоний™, совпадают с данными, полученными ранее в работах по изучению активации неспецифического иммунного ответа лимфоцитов периферической крови [Dyakonova V.A., 2004] и свидетельствуют об отсутствии специфической стимуляции продукции TNF-a этим препаратом.

2 часа

48 часов

Б

Рис. 6. Концентрация ЮТ-а в клетках мышей с аденокарциномой молочной железы до лечения через 24 часа после добавления 10 нг/лунку ШР-пептидных комплексов (А), 10 нг/лунку Полиоксидония™ (Б).

При оценке продолжительности влияния вакцины было показано, что при воздействии как вакцины, так и Полиоксидония™ на клетки моноцитарно-макрофагального ряда мышей с аденокарциномой молочной железы после лечения практически не происходит активации продукции ТНР-а, по сравнению со здоровой мышью. Эти данные доказывают, что его продукция стабилизировалась и находилась на постоянном низком уровне.

Зависимость от используемой дозы Н8Р-пептидных комплексов сохранялась и после лечения, однако, как было указано, в значительно меньшей степени.

Так, при добавлении того или иного препарата в лунку к клеткам больных мышей после лечения концентрация ЮТ-ос изменялась в зависимости от дозировки (таблицы 1, 2), однако в обоих случаях эти изменения были статистически не значимыми.

Таким образом, показано, что полученный продукт, обогащенный «ШР-пептидными комплексами», выделенный по разработанной методике из ткани аденокарциномы молочной железы, вызывает специфическую активацию продукции ЮТ-а клетками макрофагально-моноцитарного ряда мыши с аденокарциномой молочной железы. Выделенные по разработанной методике белковые фракции на основе ШР способны индуцировать продукцию ТОТ-а специфически, то есть в зависимости от используемой дозы и времени с момента введения. Кроме того, дальнейшая стабильная продукция данного цитокина на низком уровне во время и после лечения свидетельствует в пользу отсутствия в организме больных животных активного некроза и воспалительных реакций, что косвенно свидетельствует об активации апоптоза, вызванного стимуляцией специфического противоопухолевого иммунного ответа.

Для повышения содержания ШР (стресс-белков) нами в качестве внешнего стрессового фактора был выбран химиотерапевтический препарат Онкофер™ на основе радиоактивного железа, способный избирательно накапливаться в опухолевой ткани молочной железы. Содержание белков теплового шока исследовалось методом иммуногистохимии. В ходе эксперимента было показано, что после воздействия радиации в опухолевых клетках значительно возрастает продукция НБР (Рис. 7).

Таким образом, использование внешнего стрессового фактора позволяет добиться повышения содержания иммуногенного материала в опухолевой ткани.

Рис. 7. Влияние радиоактивного железа 59Fe на продукцию HSP в опухолевой ткани молочной железы. Окрашивание гематоксилином. Стрелками показан белок hsp70.

Для исследования противоопухолевого действия полученных вакцин нами был проведен эксперимент in vivo.

Содержание экспериментальных животных и работу с ними проводили в сертифицированном виварии с использованием общепринятых методов в соответствии с требованиями правил Надлежащей Лабораторной Практики (GLP) и Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Хабриев Р.У., 2005].

Экспериментальным животным (мышам линии С57В16) была перевита опухоль аденокарциномы молочной железы Са755 (в соответствии с нормативной документацией по доклиническому изучению новых фармакологических веществ, стандартом по изучению противоопухолевых препаратов для лечения опухоли молочной железы на экспериментальных животных), из которой затем были выделены и очищены комплексы на основе белков теплового шока hsp70, hsp90 и hsp96, то есть получена противоопухолевая вакцина.

Мыши были разделены на 5 групп (по 18 животных в каждой):

- норму (отрицательный контроль),

- группу, не получавшую терапию (аутологичную вакцину или Онкофер™) (положительный контроль),

- группу, получавшую только аутологичную вакцину,

- группу, получавшую только внешний стрессовый фактор 59Fe,

- группу, получавшую комбинированную терапию, то есть аутологичную вакцину и 59Fe.

Оценка противоопухолевого действия была проведена в соответствии с общепринятыми требованиями, а также требованиями Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Хабриев Р.У., 2005]. Измерение частоты метастазирования было исключено вследствие того, что аденокарцинома молочной железы мыши Са755 не образует метастазов.

Статистическая обработка данных проводилась с применением непараметрического критерия Wilcoxon на программном обеспечении Statistica 6.0™ («StatSoft», Россия). Выбранный уровень значимости составлял р < 0,05. Противоопухолевое действие вакцин оценили по следующим параметрам:

- изменение размеров опухоли;

- выживаемость экспериментальных животных;

- гистологическое исследование опухолевой ткани;

- дополнительные показатели (аппетит/отказ от корма, двигательная активность, морфология внутренних органов, общий внешний вид, топография внутренних органов).

При исследовании изменения размеров опухоли нами использовались угловые коэффициенты для оценки скорости роста опухолевой ткани. В последние дни эксперимента наибольшая скорость роста наблюдалась в положительном контроле (угловой коэффициент 2517). Скорости опухолевого роста в группах, получавших только аутологичную вакцину или только внешний стрессовый фактор (угловые коэффициенты 1760 и 1694, соответственно), была одинаковой. При этом значительно меньшая скорость роста (угловой коэффициент 1108) наблюдалась в группе, получавшей комбинированную терапию (HSP+59Fe). Следует отметить, что к окончанию эксперимента наименьший размер опухолей наблюдался в группе, получавшей

радиоактивное железо. Таким образом, использование 59Ре привело к временной остановке роста опухоли, однако не повлияло на темпы ее роста. Сочетание же 59Бе с аутологичной вакциной позволило получить заметное замедление темпов роста опухолевой ткани, что особенно видно в период между 20 и 22 днями эксперимента (Рис. 8).

Рис. 8. Динамика роста опухоли в контрольной и опытных группах.

При статистической обработке данных по динамике роста опухоли было показано, что статистически значимые различия в размерах опухоли появляются 4 дня спустя после начала лечения в группах, получавших 59Ре и комбинированную терапию, и наблюдаются во всех группах с 8 дня лечения.

В ходе гистологического исследования было показано, что в положительном контроле на 22 день эксперимента наблюдались крупные опухолевые клетки, образовывавшие солидно-тубулярные структуры. У

опухолей наблюдалась четко организованная структура, формирование которой было особенно заметно при сравнении с состоянием опухолевой ткани на 12 день эксперимента перед началом лечения (Рис. 9).

В группе, получавшей иммунотерапию пептидными комплексами на основе ШР, в опухолевой ткани отмечалась тенденция к относительному уменьшению объема паренхимы по сравнению со стромой. Клетки опухолей были часто атрофичными, строили тонкие трабекулярные структуры. Кроме того, в опухолях наблюдалось большое количество апоптотических телец, свидетельствующих о цитотоксическом действии иммунной системы на опухоль (Рис. 9).

В группе, получавшей лечение радиоактивным железом, наблюдались обширные очаги некроза и лейкоцитарный инфильтрат, а также отмечался тромбоз сосудов, что соответствовало механизму действия препарата Онкофер™ (Рис. 9).

В группе, получавшей комбинированную терапию, наблюдались обширнейшие очаги некроза, лейкоцитарный инфильтрат, а также наличие апоптотических телец, что свидетельствовало о совместном действии 39Ре и противоопухолевой вакцины и о наибольшей эффективности данной комбинации (Рис. 9).

Контроль+ (24 день) НБР (24 день)

Опухоль (12 день)

59Ре (24 день) НЗР+59Ре (24 день)

Рис. 9. Результаты гистологического исследования отрицательного контроля (Норма), опухолевой ткани до лечения (12 день эксперимента) (Опухоль), положительного контроля к окончанию эксперимента (24 день) (Контроль+), опухолевых тканей групп, получавших аутологичную иммунотерапию к окончанию эксперимента (24 день) (НБР), радиоактивное железо к окончанию эксперимента (24 день) (59Ре), комбинированную терапию к окончанию эксперимента (24 день) (ШР+59Ре). Окрашивание гематоксилин-эозином.

•Л-}.*«

Оценка дополнительных показателей эффективности лечения у экспериментальных животных во всех группах была проведена во всех группах. К окончанию эксперимента в каждой группе были зафиксированы значительные объемы опухолей при сравнении с общими размерами животного (Рис. 10).

А Б

Рис. 10. Внешний вид экспериментальных животных в начале (А) и в конце (Б) эксперимента.

При оценке двигательной активности была очевидна прямая связь ее с объемом опухоли. Так, в положительном контроле и группе, получавшей монотерапию аутологичной вакциной, наблюдался наибольший размер опухоли, двигательная активность животных была самой низкой, особенно с 16 дня эксперимента. С 20 дня эксперимента двигательная активность начала резко снижаться в'группе, получавшей Онкофер™, одновременно с ускорением темпов роста опухолей. Это свидетельствовало об ухудшении общего состояния животных в данной группе. При этом в группе, получавшей комбинированную терапию, активность животных была близка к отрицательному контролю. Это свидетельствовало о наибольшем положительном влиянии именно комбинированной противоопухолевой терапии на качество жизни животных.

Вывод был также подтвержден при сравнении общего внешнего вида животных в группах. На 17-20 дни эксперимента некоторые опухоли в каждой из групп стали изъязвляться, при этом массивные кровотечения наблюдались только у положительного контроля. В группе, получавшей комбинированную

терапию, наблюдалось активное рубцевание опухолей, что по предварительным данным свидетельствовало об активно протекающих в организме мышей иммунных реакциях.

При оценке целостности кожного покрова было показано, что в положительном контроле на 20-22 дни эксперимента наблюдалось нарушение его целостности. При этом в группе, получавшей комбинированную терапию, шерстный покров был гладким, у мышей в положительном контроле и группе, получавшей монотерапию радиоактивным железом, шерстный покров был сильно взъерошенным. Это также доказывало, что лучше всего переносилось сочетание пептидных комплексов на основе ШР с 59Ре.

К окончанию эксперимента у животных отмечалось снижение аппетита, а в случае положительного контроля и группы, получавшей аутологичную иммунотерапию, - полный отказ от корма.

При вскрытии было показано, что большой объем опухолей во всех группах к 20-22 дням эксперимента, значительно смещал внутренние органы. В частности, это приводило к сдавливанию пищевода и желудка и, как следствие, отказу от корма.

Стоит отметить, что при оценке морфологии внутренних органов наблюдалось выраженное увеличение размеров селезенки у животных, получавших монотерапию вакциной, и комбинированную терапию, т.е. групп, получавших иммунотерапевтическое лечение. Поскольку селезенка является кроветворным органом, производящим лимфоциты и моноциты, ее увеличение свидетельствовало об индукции стимуляции кроветворения введением противоопухолевых вакцин.

Таким образом, полученные дополнительные показатели эффективности противоопухолевой терапии в различных группах подтвердили иммуностимулирующие свойства противоопухолевых вакцин на основе «НБР-пептидных комплексов», а также показали, что наиболее положительное влияние на качество жизни животных оказывает комбинированное введение

вакцины с 59Fe, данная комбинация обладает наибольшей противоопухолевой эффективностью.

Выводы

1. Разработана методика единовременного выделения и очистки аутологичной вакцины на основе трех белков теплового шока. Конечный продукт характеризуется высокой степенью очистки (60%) и низким содержанием эндотоксина (менее 0,06 ЕЭ/мл).

2. Аутологичные белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами не обладают цитотоксической активностью по отношению к клеткам линии MCF7. Доказано, что статистически достоверных отличий от контроля по выживаемости клеток, а также изменений пролиферации (по включению 14С-тимидина) нет.

3. Полученный продукт дозо- и время зависимо увеличивает продукцию TNF-а в крови больных животных, то есть обладает способностью к активации неспецифического иммунного ответа.

4. При определении содержания белка hsp70 в опухолевой ткани молочной железы методом иммуногистохимического исследования показано, что применение 59Fe, как внешнего стрессового фактора, позволяет добиться повышения уровня эндогенных белков теплового шока - материала для аутологичных вакцин.

5. Проведена сравнительная оценка противоопухолевой активности аутологичных комплексов на основе HSP (монопрепарат), внешнего стрессового фактора, а также их сочетания. В результате показано, что наибольшей противоопухолевой активностью обладает их комбинированное применение. Он о п риводило к появлению апоптотических телец в опухоли, снижению темпов роста опухоли и улучшению качества жизни экспериментальных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Коваленко H.A., Обухова В.В., Кешелава В.В., Косенков Д.А. и др. Методика выделения и очистки комплексов «белок теплового шока + пептид»

из опухолевой ткани молочной железы человека // Материалы II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии. - Аллергология и иммунология.-2005.-Т. 6,№2.-С. 183-184.

2. Коваленко H.A., Обухова В.В., Косенков Д.А. и др. Очистка белков теплового шока из опухолевой ткани молочной железы человека в присутствии амикацина сульфата // Материалы II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». -М., 2005. - С. 160.

3. Савватеева М.В., Кузнецова Е.М., Косенков Д.А. и др. Определение уровня продукции TNF-a лимфоцитами периферической крови под действием обогащенной фракции белков теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами, выделенной из опухоли молочной железы человека // Матер1али DceyKpaiTCbKoi науково-практично1 конференцн. - Киев, 2006. - С. 51.

4. Коваленко И.А., Обухова В.В., Косенков Д.А. и др. Выделение и очистка белков теплового шока из опухолевой ткани молочной железы человека // Иммунология, 2007; Т.28, N 2. - С. 86-90.

5. Руденко Е.Д., Косенков Д.А. Противоопухолевые вакцины XXI века // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007; N 1. -С. 44-48.

6. Обухов A.A., Зыкова Е.С., Косенков Д.А. Белки теплового шока и апоптоз // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007; N 2. -С. 52-56.

7. Косенков Д.А.. Ляшенко A.A., Кешелава В.В. и др. Основные виды противоопухолевых вакцин // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007; N 3. - С. 3-9.

8. Sawateeva М., Kuznetsova Е., Zhdanov D., Kosenkov Р. et al. Activation of non-specific immunity by autologous HSP-peptide complexes from breast adenocarcinoma in human macrophages // The FEBS Journal. - 2007. - Vol. 274, Suppl. l.-P. 159.

Косенков Дмитрий Александрович (Россия)

Исследование противоопухолевой активности аутологичных вакцин на основе белков теплового шока in vivo

Одним из наиболее перспективных подходов, направленным на решение проблем современной противоопухолевой иммунотерапии, является использование аутологичных вакцин. В данной работе изучено влияние радиоактивного железа (59Fe) на содержание белков теплового шока в опухолевой ткани молочной железы. Кроме того, в работе предложен способ получения вакцины, путем единовременного выделения и очистки трех белков теплового шока: hsp70, hsp90 и grp94. Изучены также цитотоксичность и влияние полученной аутологичной вакцины на неспецифический и специфический иммунитет. Результаты представленной работы позволяют повысить эффективность использования аутологичных противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока.

Dmitriy A. Kosenkov (Russia) The study of antitumor activity of autologous heat shock protein-based

vaccines in vivo

One of the most promising ways, that can solve the problems of the present-day antitumor immunotherapy, is the use of autologous vaccines. In the current study, the influence of radioactive iron (59Fe) to the quantity of heat shock proteins in breast cancer tissue is studied. Besides, in the study the way to produce a vaccine by simultaneous purification of three heat shock proteins: hsp70, hsp90 and grp94 is introduced. Also cytotoxicity and the influence of autologous vaccine to produce non-specific and specific immunity are studied. The results of the work allow to raise the effectiveness of the use of autologous antitumor heat shock protein-based vaccines.

Подписано в печать 15.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 960 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Косенков, Дмитрий Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Белки теплового шока. Открытие семейства.

1.2. Характеристика семейства белков теплового шока.

1.3. Индукция синтеза белков теплового шока.

1.4. Структура основных белков теплового шока.

1.5. Функции белков теплового шока.:.

1.6. Особенности биологических активностей белков теплового шока в опухолевой и неопухолевой клетках.

1.7. Участие белков теплового шока в регуляции иммунного ответа.

1.7.1. Стимуляция HSP неспецифического иммунного ответа.

1.7.2. Стимуляция HSP специфического иммунного ответа.

1.8. Методы лечения онкологических заболеваний.

1.8.1. Основные виды противоопухолевых вакцин.

1.9. Белки теплового шока как объекты , для иммунотерапии онкологических заболеваний.

1.10. Использование вакцин на основе белков теплового шока в клинической практике.•.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование противоопухолевой активности аутологичных вакцин на основе белков теплового шока in vivo"

Современная медицинская наука располагает широким арсеналом средств лечения опухолевых заболеваний. Наиболее традиционным подходом к 1 противоопухолевой терапии является сочетание хирургического и терапевтического методов лечения. Однако при удалении материнской опухоли риск развития метастазов многократно увеличивается, особенно у пациентов со слабым иммунным статусом. Поэтому стимуляция как общего, так и специфического иммунного ответа должна быть неотъемлемой частью лечения опухолей. Стоит отметить, что опухолевые клетки, являющиеся частью организма пациента, не распознаются иммунной системой человека. Это результат их слабой иммуногенности. В этой связи наиболее рациональным подходом к решению данной проблемы является разработка вакцин, вызывающих специфический иммунитет против конкретного вида опухоли.

В настоящее время существует множество разработок противоопухолевых вакцин на основе самых разнообразных подходов. Однако все они обладают рядом недостатков, наиболее проблемным из которых является необходимость в индукции иммунного специфического ответа достаточной силы. Наиболее перспективным подходом к решению данной проблемы является использование аутологичных вакцин, материалом для изготовления которых является опухолевая ткань пациента. Согласно литературным данным, наибольшую противоопухолевую эффективность проявляют аутологичные вакцины на основе белков теплового шока (HSP, от англ. heat shock protein). Шаперонная функция, которую они выполняют по отношению к множеству опухолевых антигенов, позволяет выделять комплексы, состоящие из белков теплового шока с этими антигенами.

Однако до сих пор остается нерешенным вопрос о том, как, при наличии специфического иммунологического стимулятора, повысить иммуногенность опухоли (либо ее метастазов). Другим важным недостатком является ограниченное количество сырья, т.е. того количества опухоли, из которой готовится вакцина. Следовательно, необходимо искать подходы как для 8 повышения иммуногенности опухоли (и ее метастазов), так и для повышения количества антигенного материала, составляющего основу данной вакцины.

В данной работе предложена попытка решить указанные проблемы с целью повышения противоопухолевой эффективности аутологичных вакцин. Эта задача решалась двумя способами. Во-первых, основу получаемой вакцины составляют не один, как в оригинальных исследованиях, а три HSP: hsp70, hsp90 и grp94 (далее hsp96). Это позволяет существенно увеличить набор антигенного материала и расширить его спектр, поскольку указанные белки функционируют в различных компартментах клетки. Во-вторых, до хирургического удаления опухоли пациенту проводилась терапия препаратом «Онкофер™», радиоактивное железо 59Fe (0,8 fiKu), которое избирательно накапливается в опухолевой ткани за счет транспортных систем железа и трансферриновых рецепторов и вызывает образование тромбозов в микроциркуляторном русле. Это, в свою очередь, вызывает гипоксический стресс в опухолевой ткани, что способствует усилению экспрессии HSP, - стрессовых антиапоптотических белков, пополняющих пул объектов, составляющих основу вакцины. Цель и задачи исследования

Цель исследования: изучение противоопухолевой активности продукта на основе антиапоптотических аутологичных HSP в комплексе с опухолевыми антигенами, а также их комбинации с внешним стрессовым фактором in vivo. Задачи исследования:

1. Разработать методику выделения и очистки комплексов «HSP+опухолевый антиген» из опухолевой ткани.

2. Оценить цитотоксичность полученного продукта in vitro.

3. Изучить влияние полученного продукта на неспецифический иммунный ответ ex vivo.

4. Оценить возможность использования внешнего стрессового фактора для повышения продукции HSP, как источника иммуногенного материала.

5. Провести сравнительную оценку противоопухолевой активности аутологичных HSP (монопрепарат), внешнего стрессового фактора, а также их сочетания.

Научная новизна

Впервые разработана методика единовременного выделения и очистки пептидных комплексов на основе трех белков теплового шока, показана цитотоксическая безопасность данных комплексов in vitro. Продемонстрирована способность полученного продукта активировать неспецифический иммунный ответ ex vivo в зависимости от используемой дозы и времени. Впервые исследована возможность применения Fe59, как внешнего стрессового фактора, с целью повышения содержания белков теплового шока в опухолевой ткани, и впервые доказано, что эффективность комбинации полученного продукта с исследуемым стрессовым фактором in vivo является более высокой по сравнению с использованием монопрепаратов. Практическая значимость работы

Результаты представленной работы позволяют повысить эффективность использования аутологичных противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока за счет одновременного увеличения количества иммуногенного материала в вакцине и повышения иммуногенности самой опухолевой ткани. Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложена методика единовременного выделения и очистки аутологичной вакцины на основе трех белков теплового шока.

2. Аутологичные белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами не обладают цитотоксической активностью по отношению к клеткам линии MCF7.

3. Полученный продукт дозо- и времязависимо увеличивает продукцию TNF-a в крови больных животных, то есть обладает способностью к активации неспецифического иммунного ответа.

4. Применение 59Fe, как внешнего стрессового фактора, позволяет добиться повышения уровня эндогенных белков теплового шока - материала для аутологичных вакцин.

5. Сравнительная оценка противоопухолевой активности аутологичных комплексов на основе HSP (монопрепарат), 59Fe,a также их сочетания показала, что наибольшей противоопухолевой активностью обладает комбинированное применение.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Косенков, Дмитрий Александрович

выводы

1. Разработана методика единовременного выделения и очистки аутологичной вакцины на основе трех белков теплового шока. Конечный продукт характеризуется высокой степенью очистки (согласно электрофоретическому исследованию и вестерн-блоту) и низким содержанием эндотоксина

2. Аутологичные белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами не обладают цитотоксичностью по отношению к клеткам иммунной системы, а также нормальным клеткам. При проведении МТТ-теста показано, что статистически достоверных отличий от контроля по гибели клеток нет. Согласно тесту на стимуляцию синтеза ДНК, включение 14С-тимидина статистически достоверно не отличается от контроля

3. Полученный продукт обладает способностью активации неспецифического иммунного ответа. В эксперименте ex vivo показано, что данный продукт дозо-и времязависимо увеличивает продукцию TNF-a в крови больных животных

4. Применение внешнего стрессового фактора позволяет добиться повышения уровня эндогенных белков теплового шока - материала для аутологичных вакцин, что доказано методом иммуногистохимического определения содержания белка hsp70 в опухолевой ткани молочной железы

5. Использование внешнего стрессового фактора вносит дополнительный вклад в цитотоксическую и противоопухолевую активность аутологичных вакцин на основе белков теплового шока. В ходе эксперимента in vivo на экспериментальных животных (мышах линии C57B16/J) доказано, что комбинация аутологичной вакцины с внешним стрессовым фактором (радиоактивным железом 59Fe) обладает наибольшей противоопухолевой активностью и при этом намного меньше влияет на качество жизни экспериментальных животных

Благодарности

В первую очередь хочу выразить искреннюю благодарность доктору медицинских наук, Кешелаве Виктору Владимировичу; Обуховой Варваре Владимировне и Коваленко Наталье Аркадьевне за помощь в освоении и разработке методик выделения и очистки белков. Выражаю глубокую признательность Савватеевой Марии Владимировне, Розову Федору Николаевичу и Кузнецовой Екатерине Михайловне за терпение, моральную поддержку и помощь в освоении методик проведения экспериментов in vivo и in vitro; Абакумовой Ольге Юрьевне за помощь в работе с клеточными культурами; Барсегяну Геворку Гайковичу за предоставление вивария и возможность проведения эксперимента in vivo. Хочу поблагодарить за обучение работе с лабораторными животными Каршиеву Сайду, а также за неоценимый вклад в работу профессора кафедры патологической анатомии ММА им. И.М.Сеченова Коган Евгению Александровну.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе проведения исследования на основе данных из литературных источников и проведенных экспериментов нам удалось разработать методику получения продукта, обогащенного «HSP-пептидными» комплексами на основе одновременно трех антиапоптотических HSP. Полученная вакцина содержала низкое количество эндотоксина, то есть была апирогенной, и при этом содержала высокую концентрацию целевых белков.

Цитотоксические свойства выделенных белковых фракций оценивались in vitro на линиях опухолевых клеток. В ходе исследования было доказано отсутствие цитотоксичности получаемой вакцины в отношении как опухолевых, так и нормальных клеток. Параллельно было показано отсутствие влияния «HSP-пептидных» комплексов на стимуляцию пролиферации клеток, т.к. синтеза ДНК не отличался от контроля.

Для исследования иммунологических свойств вакцины на основе HSP был проведен эксперимент по оценке влияния выделенных белков на неспецифический иммунный ответ. В качестве показателя индукции неспецифического иммунного ответа был выбран один из основных цитокинов, играющих ключевую роль в данном иммунном ответе, - TNF-a. Было показано, что вакцина вызывает более значительную активацию синтеза TNF-a, чем известный иммуномодулятор и активатор неспецифического иммунного ответа Полиоксидоний™. Более того, была доказана зависимость данного эффекта вакцины от времени и используемой дозы белков при прочих равных условиях.

Для повышения иммуногенности опухолевой ткани и, как следствие, для усиления эффективности воздействия аутологичных вакцин на опухолевые клетки, был проведен эксперимент по исследованию радиоактивного железа 59Fe, как внешнего стрессового фактора, способного повысить содержание индуцибельных форм HSP в клетках опухоли. Было показано, что воздействие радиоактивного железа 59Fe в виде химиотерапевтического препарата Онкофер™ на опухолевую ткань вызывает значительную активацию синтеза HSP. Это, в свою очередь, должно способствовать увеличению представления опухолевых антигенов на поверхности клеток и приводить к повышению иммуногенности опухолей.

Поскольку реализованный подход позволяет получить аутологичную вакцину, являющуюся безопасной и апирогенной, это дает основания для использования ее в оценке противоопухолевой активности in vivo. В связи с этим был поставлен эксперимент по исследованию эффективности комбинации аутологичной вакцины с внешним стрессовым фактором, повышающим уровни HSP в опухоли, и, как следствие, - ее иммуногенность.

Эксперимент проводился на лабораторных животных в соответствии с требованиями Руководства по проведению доклинических исследований [Хабриев Р.У., 2005] и правил Надлежащей Лабораторной Практики GLP. В ходе исследования экспериментальных животных делили на 5 групп: отрицательный контроль (норма), положительный контроль (нелеченые животные), группа, получавшая монопрепарат вакцину (HSP), группа, получавшая монопрепарат Онкофер™ (59Fe) и группа, получавшая комбинированную терапию (HSP+59Fe).

В ходе исследования было показано, что наиболее эффективной противоопухолевой комбинацией является аутологичная вакцина на основе HSP, используемая совместно с внешним стрессовым фактором, повышавшим уровень HSP в опухолевой ткани. Показано, что в данной группе к окончанию эксперимента наблюдались самые низкие темпы роста опухоли (Рис. 3.15), в течение эксперимента смертность в группе была низкой, - такой же, как в группе, получавшей только 59Fe. Кроме того, максимальная противоопухолевая активность комбинации вакцины с Онкофером™ также была подтверждена как при гистологическом исследовании образцов опухолевой ткани, так и при исследовании дополнительных показателей противоопухолевой активности (Табл. 16).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Косенков, Дмитрий Александрович, Москва

1. Авцын А.П., Кондакова Л.И., Халанский А.С. и др. Новая клеточная линия невриномы гассерова узла крысы НГУК-1 // Цитология.-1989.-Т.31, №1.-С. 97-101.

2. Бейум А. Выделение лимфоцитов, гранулоцитов и макрофагов. В кн. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика. Под ред. Дж. Б. Натвига, П. Перлманна, X. Вигзелля: пер. с англ. М.: Медицина, 1980, С. 9-19.

3. Беляков И.М. Основы ветеринарии. М.: Издательство «КолосС». -2004. 560 с.

4. Вербенко В.Н., Калинин В.Л. Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат усиления экспрессии стрессовых систем клетки-хозяина // Генетика.- 1995.-Т. 32, № 12.-С. 1636-1630.

5. Кешелава В.В. Новые аспекты применения 59Fe в уроонкологии // Материалы научной конференции «Хирургия 2000». 2000. - С. 436438.

6. Кешелава В.В. Новые лечебно-диагностические средства в онкологии// Int. Med. J. 2000. - Vol. 5. - P.457-459.

7. Кешелава B.B. Патент 2053776 РФ 1994 г.

8. Кешелава В.В. Рак молочной железы: новые аспекты диагностики // Материалы I все российской научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы маммологии». 2001. - С. 3.

9. Коваленко Н.А., Обухова В.В., Косенков Д.А. и др. Выделение и очистка белков теплового шока из опухолевой ткани молочной железы человека // Иммунология. 2007. - Т. 28, №2. - С. 86-89.

10. Косенков Д.А., Ляшенко А.А., Кешелава В.В., Северин Е.С. Основные виды противоопухолевых вакцин // Вопр.биол.,мед.и фармацевт.химии. -2007. — N. З.-С. 3-9.

11. Моисеенко В.М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи // Практ. онкол. -2001. -№ 4 (8). С. 58-64.110

12. Обухов А.А., Зыкова Е.С., Косенков Д.А. Белки теплового шока и апоптоз // Вопр.биол.,мед.и фармацевт.химии. 2007. - N. 2. - С. 52-56.

13. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.- 536 с.

14. Руденко Е.Д., Косенков Д.А. Противоопухолевые вакцины XXI века // Вопр.биол.,мед.и фармацевт.химии. -2007. -N. 1. С. 44-48.

15. Ситникова А.Г. и др. JIAJI-тест. Современные подходы к определению пирогенности / Ситникова А.Г., Глазова Н.В., Травина Л.А., Багирова В.Л.-СПб, 1994.- 105 с.

16. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина. - 2005. -832 с.

17. Abakumova O.Yu., Podobed O.V., Tsvetkova Т.A. et al. Modulation of glutamate neurotoxicity in the transformed cell culture by monoamine oxidase inhibitors, clorgyline and deprenyl // J. Neural. Transm.-1998.-Vol.52.-C. 8791.

18. Abravaya K., Myers M.P., Murphy S.P. et al. The human heat shock protein hsp70 interacts with HSF, the transcription factor that regulates heat shock gene expression // Genes Dev. 1992. - Vol. 6. - P. 1153-1164.

19. Akalin A., Elmore L.W., Forsythe H.L. et al. A novel mechanism for chaperone-mediated telomerase during prostate cancer progression // Cancer Res. 2001. - Vol. 61. - P. 4791-4796.

20. Ali A., Bharadwaj S., O'Carroll R. et al. HSP90 interacts with and regulates the activity of heat shock factor 1 in Xenopus oocytes // Mol. Cell. Biol. -1998. Vol. 18. - P. 4949-4960.

21. Arnold D., Faath S., Rammensee И. et al. Cross-priming of minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T cells upon immunization with the heat shock protein gp96 // J. Exp. Med. 1995. - Vol. 182. - P. 885-889.

22. Acsadi G., Dickson G., Love D.R. et al. Human dystrophin expression in mdx mice after intramuscular injection of DNA constructs // Nature. 1991. -Vol. 352.-P. 815-818.

23. Asea A., Kraeft S.K., Kurt-Jones E.A. et al. Hsp70 stimulates cytokine production through a CD-14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine // Nat. Med. 2000. - Vol. 6. - P. 435-442.

24. Asea A., Rehli M., Kabingu E. et al. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular hsp70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 15028-15034.

25. Bardwell J.C.A., Craig E.A. Major heat shock gene of drosophila and Escherichia coli heat-inducible DNA gene are homologous // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984.-Vol. 81.-P. 848-852.

26. Basu S., Srivastava P.K. Calreticulin, a peptide-binding chaperone of the endoplasmic reticulum, elicits tumor- and peptide-specific immunity // J. Exp. Med.-1999.-Vol. 189, № 5.-C. 797-802.

27. Bayerl C., Dorfner В., Rzany B. et al. Heat shock protein HSP 27 is expressed in all types of basal cell carcinoma in low and high risk UV exposure groups // Eur. J. Dermatol. 1999. - Vol. 9, N. 4. - P. 281-284.

28. Beere H.M., Green D.R. Stress management-heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis // Trends Cell. Biol. -2001,- Vol. 11. P. 6-10.

29. Bevan M.J. Minor H antigens introduced on H-2 different stimulating cells cross-react at the cytotoxic T cell level during in vivo priming // J. Immunol. -1976. Vol. 117. - P. 2233-2238.

30. Bharadwaj S., Ali A., Ovsenek N. Multiple components of the HSP90 chaperone complex function in regulation of heat shock factor 1 in vivo // Mol. Cell. Biol. 1999.-Vol. 19.-P. 8033-8041.

31. Blachere N.E., Srivastava P.K. Heat shock protein-based cancer vaccines and related thoughts on immunogenicity of human tumors // Semin. Cancer Biol. 1995. - Vol. 6 (6). - P. 349-355.

32. Borges L., Miller R.E., Jones J. et al. Synergistic action of fms-like tyrosine kinase 3 ligand and CD40 ligand in the induction of dendritic cells and generation of antitumor immunity in vivo // J. Immunol. 1999. - Vol. 163. -P. 1289-1297.

33. Bork P., Sander C., Valencia A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp 70 heat shock proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89. - P. 7290-7294.

34. Bulut Y., Faure E., Thomas L. et al. Chlamydial heat shock protein 60 activates macrophages and endothelial cells through Toll-like receptor 4 and MD2 in a MyD88-dependent pathway // J. Immunol. 2002. - Vol. 168. - P. 1435-1440.

35. Cala S.E., Jones L.R. GRP94 resides within cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles and is phosphorylated by casein kinase II // J. Biol. Chem. 1994. -Vol. 269.-P. 5926-5931.

36. Cancer Vaccine Antigenics // Biodrugs. - 2002. - Vol. 16, N. 1. - P. 7274.

37. Caplan A.J., Cyr D.M., Douglas M.G. Eukaryotic homologues of Escherichia coli dnaj: a diverse protein family that functions with hsp70 stress proteins // Mol. Biol. Cell. 1993. - Vol. 4. - P. 555-563.

38. Chen H.C., Guh J.Y., Tsai J.H. et al. Induction of heat shock protein 70 protects mesangial cells against oxidative injury // Kidney Int. 1999. - Vol. 56, N. 4. -P. 1270-1273.

39. Cheung R.K., Dosch H.M. The growth transformation of human В cells involves super induction of hsp 70 and hsp 90 // Virology. 1993. - Vol. 193. -P. 700.

40. Chiosis G., Vilenchik M., Kim J. et al. Hsp90: the vulnerable chaperone // Drug Discov. Today. 2004. - Vol. 9, N. 20. - P. 881 -888.

41. Collins P.L., Hightower L.E. Newcastle disease virus stimulates the cellular accumulation of stress (heat shock) mRNAs and proteins // J. Virol. 1982. -Vol. 44.-P. 703.

42. Craig E.A., Weissman J.S., Horwich A.L. Heat shock proteins: mediators of protein conformation and turnover in the cell // Cell. 1994. - Vol. 78. - P. 375.

43. Csermeley P., Schnaider Т., Soti C. et al. The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review // Pharmacol. Ther. 1998. - Vol. 79. - P. 129-168.

44. Del Giudice G. Hsp70: a carrier molecule with built-in adjuvanticity // Experientia. 1994. -Vol. 50 (11-12).-P. 1061-1066.

45. Delpino A., Falcioni R., Ferrini U. Modulation of heat shock protein synthesis in two human melanoma cell lines // Tumori. 1984. - Vol. 70, N. 5.-P. 393-398.

46. Denisenko O., Yarchuk O. Heat shock translational control in cell-free system // Antonie van Leeuwenhoek. — 1990. — Vol. 58. — P. 163-168.

47. Donnelly J.J., Ulmer J.B., Shiver J.W. et al. DNA Vaccines // Annu. Rev. Immunol. 1997. - Vol. 15. - P. 617-648.

48. Dyakonova V.A., Dambaeva S.V., Pinegin B.V. et al. Study of interaction between the polyoxidonium immunomodulator and the human immune system cells // International Immunopharmacology. 2004. - Vol. 4. - P. 1615-1623.

49. Dybdahl В., Wahba A., Lien E. et al. Inflammatory response after open heart surgery: release of heat shock protein 70 and signaling through Toll-like receptor-4 // Circulation. 2002. - Vol. 105. - P. 685-690.

50. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. - Vol. 8 (9).-P. 871-874.

51. Facciponte J.G., Wang X.Y., MacDonald I.J. et al. Heat shock proteins HSP70 and GP96: structural insights // Cancer Immunol. Immunother. -2006. Vol. 55 (3). - P. 339-346.

52. Feige U., van Eden W. Infection, autoimmunity and autoimmune disease // EXS. 1996. - Vol. 77. - P. 359-373.

53. Flaherty K.M., Deluca-Flaherty C., McKay D.B. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70kDa heat-shock cognate protein // Nature. 1990. - Vol. 346. - P. 623-628.

54. Fujita J. Cold shock response in mammalian cells // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 1, N. 2. - P. 243-255.

55. Furlini G., Vignoli M., Re M.C. et al. Human immunodeficiency virus type 1 interaction with the membrane of CD4+ cells induces the synthesis and nuclear translocation of 70K heat shock protein // J. Gen. Virol. 1994. -Vol. 75.-P. 193.

56. Garrido C., Gurbuxani S., Ravagnan L. et al. Heat shock proteins: Endogenous modulators of Apoptotic Cell Death // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - Vol. 286 (3). - P. 433-442.

57. Garry R.F., Ulug E.T., Bose H.R. Jr. Induction of stress proteins in Sindbis virus- and vescicular stomatitis virus-infected cells // Virology. 1983. - Vol. 129.-P. 319.

58. Gibbons N.B., Watson R.W., Coffey R.N. et al. Heat-shock proteins inhibit induction of prostate cancer cell apoptosis // Prostate. 2000. - Vol. 45, N. 1. -P. 58-65.

59. Grenert J.P., Sullivan W.P., Fadden P. et al. The amino-terminal domain of heat shock protein 90 (hsp90) that binds geldanamycin is an ATP/ADP switch domain that regulates hsp90 conformation // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272.-P. 23843-23850.

60. Hall T.J. Role of hsp70 in cytokine production // Experientia. 1994. - Vol. 50 (11-12).-P. 1048-1053.

61. Harada M., Kimura G., Nomoto K. Heat shock proteins and the antitumor T cell response // Biotherapy. 1998. - Vol. 10, N. 3. - P. 229-235.

62. Hettinga J.V., Lemstra W., Meijer C. et al. Heat-shock protein expression in cisplatin-sensitive and -resistant human tumor cells // Int. J. Cancer. 1996. -Vol. 67, N. 6.-P. 800-807.

63. Hightower L.E., Sadis S.E., Takenaka I.M. Interactions of vertebrate hsc70 and hsp70 with unfolded proteins and peptides / The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones. 1994, Plainview. - P. 179-207.

64. Hilf N., Singh-Jasuja H., Schild H. The heat shock protein Gp96 links innate and specific immunity // Int. J. Hyperthermia. 2002. - Vol. 18, N. 6. - P. 521-533.

65. Hoos A., Levey D.L. Vaccination with heat shock protein-peptide complexes: from basic science to clinical applications // Expert Rev. Vaccines. 2003. - Vol. 2 (3). - P. 369-379.

66. Ishii T. Isolation of MHC class I-restricted tumor antigen peptide and its precursors associated with heat shock proteins hsp70, hsp90 and hsp96 // J. of Immunology.-1999.-Vol. 162, №3.-C. 1303-1309.

67. Janetzki S., Palla D., Rosenhauer V. et al. Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat shock protein gp96 preparations: a pilot study // Int. J. Cancer. 2000. - Vol. 88. - P. 232-238.

68. Janeway С.A., Medzhitov R. Innate immune recognition // Annu Rev. Immunol. 2002. - Vol. 20. - P. 197-216.

69. Kiang J.G., Tsokos G.C. Heat shock protein 70 kDa: Molecular biology, biochemistry and physiology // Pharmacol. Ther. 1998. - Vol. 80, N. 2. - P. 183-201.

70. Kim D., Kim S.H., Li G.C. Proteasome inhibitors MG132 and lactacystin hyperphosphorylate HSF1 and induce hsp70 and hsp27 expression // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - Vol. 254. - P. 264-268.

71. Kim D., Li G.C. Proteasome inhibitors lactacystin and MG132 inhibit the dephosphorylation of HSF1 after heat shock and suppress thermal induction of heat shock gene expression // Biochem. Biophys. Res. 1999. - Vol. 264. -P. 352-358.

72. Koch G., Smith M., Macer D. Et al. Endoplasmic reticulum contains a common, abundant calcium-binding glycoprotein, endoplasmin // J. Cell. Sci. 1986. - Vol. 86. - P. 217-232.

73. Kopnin B.P. Targets of oncogenes and tumor suppressors: key for understanding basic mechanisms of carcinogenesis // Biochemistry (Mosc). -2000.-Vol. 65 (l).-P. 2-27.

74. Kroeger P.E., Sarge K.D., Morimoto R.I. Mouse heat shock transcription factors 1 and 2 prefer a trimeric binding site but interact differently with the HSP70 heat shock element // Mol. Cell. Biol. 1993. - Vol. 13. - P. 33703383.

75. Kuznetsov G., Chen L.B., Nigam S.K. Multiple molecular chaperones complex with misfolded large oligomeric glycoproteins in the endoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 3057-3063.

76. La Thangue N.B., Shriver K., Dawson C. et al. Herpes simplex virus infection causes the accumulation of a heat shock protein // EMBO J. 1984. -Vol. 3.-P. 267.

77. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

78. Lee A.S., Bell J., Ting J. Biochemical characterization of the 94- and 78-kilodalton glucose-regulated proteins in hamster fibroblasts // J. Biol. Chem. -1984. Vol. 259. - P. 4616-4621.

79. Lee H.-J., Lee Y.-J., Kwon H.-C. et al. Radioprotective effect of heat shock protein 25 on submandibular glands of rats // Am. J. of Pathol. 2006. - Vol. 169,N. 5.-P. 1601-1611.

80. Leung S.-M., Hightower L.E. Mammalian Hsc70 and Hsp70 proteins / Guidebook to Molecular Chaperones and Protein Folding Catalysts. 1997, Oxford.-P. 52-58.

81. Li G.C., Yang S.-H., Kim D. et al. Suppression of heat-induced hsp 70 expression by the 70-kDa subunit of the human Ku autoantigen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 4512-4516.

82. Li W.X., Chen C.H., Ling C.C. et al. Apoptosis in heat-induced cell killing: the protective role of hsp-70 and the sensitization effect of the c-myc gene // Radiat. Res. 1996. - Vol. 145, N. 3. - P. 324-330.

83. Liu F.F., Miller N., Levin W. et al. The potential role of HSP70 as an indicator of response to radiation and hyperthermia treatments for recurrent breast cancer // Int. J. Hyperthermia. 1996. - Vol. 12, N. 2. - P. 197-208.

84. Lynch D.H., Andreasen A., Maraskovsky E. et al. Flt3 ligand induces tumor regression and antitumor immune responses in vivo // Nat. Med. 1997. -Vol. 3.-P. 625-631.

85. Mackey M.F., Gunn J.R., Maliszewsky C. et al. Dendritic cells require maturation via CD40 to generate protective antitumor immunity // J. Immunol. 1998. - Vol. 161. - P. 2094-2098.

86. Melcher A., Todryk S., Hardwick N. et al. Tumor immunogenicity is determined by the mechanism of cell death via induction of heat shock protein expression//Nat. Med. 1998. - Vol. 4 (5). - P. 581-587.

87. Melnick J., Aviel S., Argon Y. The endoplasmic reticulum stress protein GRP94, in addition to BiP, associates with unassembled immunoglobulin chains // J. Biol. Chern. 1992. - Vol. 267. - P. 21303-21306.

88. Meng S.-D., Song J., Rao Z. et al. Three-step purification of gp96 from human liver tumor tissues suitable for isolation of gp96-bound peptides // Journal of Immunological Methods.-2002.-Vol. 264.-C. 29-35.

89. Menoret A., Bell G. Purification of multiple heat shock proteins from a single tumor sample // Journal of Immunological Methods.-2000.-Vol. 237.-C.l 19-130.

90. Morales A., Eidinger D., Bruce A.W., Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors // J. Urol. 1976. - Vol. 116.-P. 180-183.

91. Morshauser R.C., Wang H., Flynn G.C. et al. The peptide-binding domain of the chaperone protein hsc70 has an unusual secondary structure topology // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 6261-6266.

92. Morton D.L., Barth A. Local therapy with biologic agents. In: DeVita V.T. Jr, Hellman S., Rosenberg S.A., editors. Biologic therapy of cancer. 2nd ed. Philadelphia: Lippincott. 1995. - P. 691-704.

93. Mossman T. Rapid colorimetric, assay for cellular growth and cytotoxity assays // J. Immunol. Meth. 1983! - Vol. 65. - C. 55-63.

94. Nabel E.G., Plautz G., Nabel G.J. Site-specific gene expression in vivo by direct gene transfer into the arterial wall // Science. 1990. - Vol. 249. - P. 1285-1288.

95. Nicchitta C.V. Re-evaluating the role of heat-shock protein-peptide interactions in tumor immunity // Nat. Rev. Immunol. 2003. - Vol. 3. - P. 427-432.

96. Noessner E., Gastpar R., Milani V. et al. Tumor-derived heat shock proteins 70 peptide complexes are cross-presented by human dendritic cells // J. of Immunology.-2002.-Vol. 169, №10.-C. 5424-5432.

97. Nylandsted J., Rohde M., Brand K. et al. Selective depletion of heat shock protein 70 (Hsp70) activates a tumor-specific death program that is independent of caspases and bypasses Bcl-2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. Vol. 97. - P. 7871-7876.

98. Panaretou В., Prodromou C., Roe S.M. et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - P. 4829-4836.

99. Pearl L.H., Prodromou C. Structure and in vivo function of Hsp90 // Curr. Opin. Struct. Biol.-2000.-Vol. 10, N. l.-P. 46-51.

100. Peng P., Menoret A., Srivastava P.K. Purification of immunogenic heat shock protein 70-peptide complexes by ADP-affinity chromatography // J. of Immunol. Methods. 1997.-Vol. 204.-C. 13-21.

101. Poola I., Lucas J.J. Purification and characterization of an estrogen-inducible membrane glycoprotein. Evidence that it is a transferring receptor // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263. - P. 19137-19146.

102. Price B.D., Calderwood S.K. Ca is essential for multistep activation of the heat shock factor in permeabilized cells // Mol. Cell. Biol. 1991. - Vol. 11. -P. 3365-3368.

103. Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R. et al. Identification and structural characterization of the ATP/ADP binding site in the Hsp90 molecular chaperone // Cell. 1997. - Vol. 90. - P. 65-75.

104. Prohaszka Z., Fust G. Immunological aspects of heat shock proteins the optimum stress of life // Mol. Immunol. - 2004. - Vol. 41 (1). - P. 29-44.

105. Prohaszka Z., Singh M., Nagy K. et al. Heat shock protein 70 is a potent activator of the human complement system // Cell Stress & Chaperones. — 2002.-Vol. 7, N. 1. P. 17-22.

106. Pulendran В., Banchereau J., Burkeholder S. et al. Flt3 ligand and granulocyte colony-stimulating factor mobilize distinct human dendritic cell subsets in vivo // J. Immunol. 2000. - Vol. 165. - P. 566-572.

107. Pulendran В., Smith J.L., Jenkins M. et al. Prevention of peripheral tolerance by a dendritic cell growth factor: flt3 ligand as an adjuvant // J. Exp. Med. 1998. - Vol. 188. - P. 2075-2082.

108. Qu D., Mazzarella R.A., Green M. Analysis of the structure and synthesis of GRP94, an abundant stress protein of the endoplasmic reticulum // DNA Cell. Biol. 1994.-Vol. 13.-P. 117-124.

109. Ritossa F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila//Experientia. 1962. -Vol. 18.-P. 571-573.

110. Robert J. Evolution of heat shock protein and immunity // Developmental and Comparative Immunology. 2003. - Vol. 27. - P. 449-464.

111. Samali A., Cotter T.G. Heat shock proteins increase resistance to apoptosis //Exp. Cell Res.- 1996.-Vol. 223, N. l.-P. 163-170.

112. Sato K., Torimoto Y., Tamura Y. et al. Immunotherapy using heat shock protein preparations of leukemia cells after syngeneic bone marrow transplantation in mice // Immunobiology.-2001.-Vol. 98 (6).-C. 1852-1857.

113. Schlesinger M.J. Heat shock proteins // J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265. -P.12111-12114.

114. Schlesinger MJ. How the cell copes with stress and the function of heat shock proteins // Pediatr. Res. 1994. - Vol. 36. - P. 1-6.

115. Soti C., Racz A., Csermely P. A nucleotide-dependent molecular switch controls ATP binding at the C-terminal domain of Hsp90. N-terminal nucleotide binding unmasks a C-terminal binding pocket // J. Biol. Chem. -2002. Vol. 277. - P. 7066-7075.

116. Soti C., Sreedhar A.S., Csermely P. Apoptosis, necrosis and cellular senescence: chaperone occupancy as a potential switch // Aging Cell. 2003. -Vol. 2.-P. 39-45.

117. Srivastava P.K. Heat shock proteins in immune response to cancer: the Fourth Paradigm // Experientia. 1994. - Vol. 50 (11-12). - P. 1054-1060.

118. Srivastava P.K., Menoret A., Basu S. et al. Heat shock protein come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world // Immunity. -1998.-Vol. 8.-P. 657-665.

119. Srivastava P.K., Udono H. Heat shock protein-peptide complexes in cancer immunotherapy // Curr. Opin. Immunol. 1994. - Vol. 6 (5). - P. 728-732.

120. Tatu U., Helenius A. Interactions between newly synthesized glycoproteins, calnexin and a network of resident chaperones in the endoplasmic reticulum // J. Cell. Biol. 1997. - Vol. 136. - P. 555-565.

121. Teshima S., Rokutan K., Takahashi M. et al. Induction of heat shock proteins and their possible roles in macrophages during activation by macrophage colony-stimulating factor // Biochem. J. 1996. - Vol. 315. - P. 497-504.

122. Tissieres A., Mitchell H.K., Tracy U. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs // J. Mol. Biol. -1974.-Vol. 84.-P. 389-398.

123. Todryk S.M., Gough M.J., Pockley A.G. Facets of heat shock protein 70 show immunotherapeutic potential // Immunology.-2003.-Vol.110.-C. 1-9.

124. Trautinger F., Kindas-Mugge I., Knobler R.M. et al. Stress proteins in the cellular response to ultraviolet radiation // J. Photochem. Photobiol. B. 1996. -Vol. 35 (3).-P. 141-148.

125. Tsan M.-F., Gao B. Cytokine function of heat shock proteins // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2004. - Vol. 286. - P. C739-C744.

126. Udono H., Levey D.L., Srivastava P.K. Cellular requirement for tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins: tumor rejection antigen gp96 primes CD8+ T cells in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -Vol. 91.-P. 3077-3081.

127. Udono H., Srivastava P.K. Heat shock protein 70-associated peptides elicit specific cancer immunity // J. Exp. Med. 1993.-Vol. 178.-P. 1391-1395.

128. Vabulas R.M., Ahmad-Nejad P., Ghose S. et al. HSP70 as endogenous stimulus of the Toll/Interleukin-1 receptor signal pathway // J. Biol. Chem.2002.-Vol. 277, N. 17.-P. 15107-15112.

129. Wallin R.P., Lundqvist A., More S.H. et al. Heat-shock proteins as activators of the innate immune system // Trends Immunol. 2002. - Vol. 23. -P. 130-135.

130. Wang X.-Y., Manjili M.H., Park J., Chen X., Repasky E., Subjeck J.R. Development of cancer vaccines using autologous and recombinant high molecular weight stress proteins // Methods. 2004. - Vol.32. - C. 13-20.

131. Wang H.H., Mao C.Y., Teng L.S. et al. Recent advances in heat shock protein-based cancer vaccines // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 2006. -Vol. 5 (l).-P. 22-27.

132. Wearsch P.A., Nicchitta C.V. Endoplasmic reticulum chaperone GRP94 subunit assembly is regulated through a defined oligomerization domain // Biochemistry. 1996.-Vol. 35.-P. 16760-16769.

133. Wei Y.Q., Zhao X., Kariya Y. et al. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by abrogation of heat-shock protein (HSP) 70 expression in tumor cells // Cancer Immunol. Immunother. 1995. - Vol. 40, N. 2. - P. 7378.

134. Welch W.J., Garrels J.I., Thomas G.P. et al. Biochemical characterization of the mammalian stress proteins and identification of two stress proteins as glucose- and Ca21-ionophore-regulated proteins // J. Biol. Chem. 1983. -Vol. 258.-P. 7102-7111.

135. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P. et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science. 1990. - Vol. 247. - P. 1465-1468.

136. Yu Z., Theoret M.R., Touloukian C.E. et al. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance // J. Clin. Invest. 2004. - Vol. 114 (4). - P. 551-559.

137. Zou J., Guo Y., Guettouche T. et al. Repression of heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90 complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 // Cell. 1998. - Vol. 94. - P. 471-480.