Исследование протективного и лечебного действия креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс

Муровец, Владимир Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование протективного и лечебного действия креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование протективного и лечебного действия креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им ИП ПАВЛОВА

На правах рукописи

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕКТИВНОГО И ЛЕЧЕБНОГО ДЕЙСТВИЯ КРЕАТИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ НА СЕНСОМОТОРНЫЕ И КОГНИТИВНЫЕ НАРУШЕНИЯ ПРИ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ У КРЫС

03 00 13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003060755

Работа выполнена в лаборатории физиологии пищеварения Института физиологии им И П Павлова РАН

Научный руководитель

доктор медицинских наук Поленов Сергей Александрович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук

Дудкин Кирилл Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Клименко Виктор Матвеевич

Ведущая организация

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится 25 июня 2007 года в 13 ч 00 мин на заседании Диссертационного Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 002 020 01) при Институте физиологии им И П Павлова РАН (199034, г Санкт-Петербург, наб Макарова, б)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им И П Павлова

РАН

Автореферат разослан МОЯ 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

НЭ Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Широкая распространенность ишемического поражения головного мозга и инсультов (Block, 1999), высокая смертность и инвалидюация людей, обуславливающие тяжелые социальные и экономические последствия данных патологий (Жулев и др, 2002), а также практически полное отсутствие патогенетически обоснованных средств их лечения (Broderick, Hacke, 2002, Danton, Dietrich, 2004), определяют неослабевающий интерес к поиску новых подходов в профилактике и лечении указанных острых нарушений мозгового кровообращения, что представляет собой одну из актуальных проблем современной медицины (Гусев, Скворцова, 2001, Danton, Dietrich, 2004)

Известно, что развитие необратимого поражения нервной ткани при ишемии в значительной степени связано с падением уровня высокоэнергетических фосфатов (АТФ и крсатинфосфата) (Самойлов, 1999) Кроме того, происходящее при ишемии снижение внутриклеточного pH дополнительно отягощает положение, ускоряя неферметативное необратимое превращение креатина в креагинин, что резко ограничивает возможность ресинтеза креатинфосфата Известно также, что креатинфосфат способен поддерживать ресинтез АТФ из АДФ даже в отсутствие кислорода и глюкозы На основании этого была выдвинута рабочая гипотеза, согласно которой креатин может выполнять роль эффективного нейропротектора Действительно, в опытах от vitro на переживающих срезах мозга уже было показано, что креатин увеличивает уровень креатинфосфата в нервной ткани и существенно снижает степень аноксического и ишемического поражения нейронов (Balestrino et al, 2002, Balestrmo, 2005) В нашей лаборатории впервые в опытах да vivo на модели глобальной ишемии головного мозга было установлено, что интрацеребровентрикулярное введение креатина значительно уменьшает степень нейрональных повреждений у крыс (Polenov et al, 2005) В связи с тем, mo гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) препятствует проникновению экзогенного креатина в мозг (Perasso et al, 2003), а его интрацеребровентрикулярное введение непригодно для использования в клинике, в содружестве с химиками ИВС РАН были разработаны и синтезированы производные креатина, обладающие способностью проникать через ГЭБ В опытах m vitro, а, в дальнейшем, и в m vrvo исследованиях нашей лаборатории были получены приоритеные данные, свидетельствующие о высокой нейропротекторной эффективности одного из них - бензилового эфира креатина (Ba'estrmo et al, 2004, Balestrino, 2005) Результаты этих исследований открывают перспективу для разработки принципиально нового подхода к профилактике и лечению ишемического поражения мозга Дальнейшая разработка этого направления невозможна без детального исследования влияния креатина и его новых аналогов

на когнитивные функции и неврологический статус животных при ишемии головного мозга, чему и посвящена данная работа

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования являлось определение эффективности креатина при его интрацеребровентрикулярном введении и новых синтетических производных креатина (глицеринового и бензилового эфиров креатина) при их внутрибрюшинном введении для профилактики и лечения неврологических и когнитивных нарушений, вызванных глобальной и фокальной ишемией головного мозга у крыс

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Выявить неврологические и когнитивные нарушения, возникающие при глобальной и хронической фокальной ишемии головного мозга у крыс

2 Исследовать эффекты интрацеребровентрикулярной инфузии физиологического раствора и раствора креатина рег ле на неврологический статус и когнитивные функции крыс

3 Оценить профилактическое и лечебное действие интрацеребровентрикулярного введения креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс Установить роль осмолярности в эффектах креатина

4 Оценить профилактическое действие глицеринового и бензилового эфиров креатина при их внутрибрюшинном введении на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные глобальной и фокальной ишемией головного мозга у крыс

5 Оценить лечебное действие глицсрилового и бензилового эфиров креатина при их внутрибрюшинном введении на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией головного мозга у крыс

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые получены экспериментальные доказательства возможности защиты или улучшения функционального состояния (неврологического статуса) и когнитивных способностей у крыс после глобальной (ГИМ) и при хронической фокальной (ФИМ) ишемии головного мозга за счет интрацеребровентрикулярного (и ц в) введения креатина (Кр), а также внутрибрюшинного (в/б) введения новых синтетических производных Кр (его бензилового и глицерилового эфиров)

Впервые установлено, что профилактическое и ц.в введение 50 мМ (но не 100 мМ) раствора Кр, значительно снижает выраженность когнитивных нарушений и эффективно предупреждает развитие неврологических нарушений у крыс после ГИМ, при этом показано, что данный благоприятный эффект 50 мМ Кр не связан с высокой осмолярностью его раствора Впервые установлено, что новое синтетическое производное Кр - глицериновый эфир Кр, значительно (на 50% через 48 ч после ГИМ) снижает степень неврологических расстройств, вызванных ГИМ, при его предварительном (профилактическом) в/б введении При ФИМ в/б

введение глицерилового эфира Кр обладает ограниченной профилактической и терапевтической эффективностью в отношении неврологических нарушений и выраженной терапевтической эффективностью в отношении когнитивных нарушений

Также впервые установлено, что новое синтетическое производное Кр - бензиловый эфир Кр высокоэффективно в отношении неврологических и когнитивных нарушений, вызванных ФИМ у крыс при его в/б введении как в профилактической, так и терапевтической парадигмах ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Теоретическая значимость работы заключается в доказательстве того, что повышение мозгового уровня высокоэнергетических фосфатов с помощью и ц в введения Кр способно ослаблять степень неврологических и когнитивных нарушений, вызванных ишемией головного мозга Практическая значимость связана с экспериментальным доказательством высокой эффективности новых синтетических производных Кр при их парентеральном введении в отношении ослабления неврологических и когнитивных нарушений в двух моделях ишемии головного мозга, что позволяет рекомендовать их для дальнейшей разработки в качестве перспективных противоишемических препаратов нового класса

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы исследований докладывались на Юбилейной конференции Института физиологии HAH Беларуси (Минск, 2003 г), XIX Съезде Физиологического общества им И П Павлова (Екатеринбург, 2004 г) Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина 2005» (Санкт-Петербург 2005 г), Humboldt-Kolleg conference "Technologies of the 21st Century" (St Petersburg, 2005), Третьей международной научно-практической конференция Медбиотек «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине» (Москва, 2006 г), симпозиуме «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006 г), семинаре «Новые технологии - инновационному бизнесу» (Москва, 2007 г) ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 2 журнальные статьи и 7 работ в сборниках трудов конференций, поданы 2 заявки на российский патент

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, иллюстрирована 1 таблицей и 33 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 24 отечественных и 253 иностранных источника

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены в хронических опытах на 253 самцах крыс линии Спрэг-Доули массой 290-340 г (Колтуши) Животные содержались в клетках типа 14 по 4-5 при регулируемом световом (12/12 часов) и температурном режиме, имели доступ к стандартной пище (гранулированный корм, комбинат «Волосово») и воде ad libitum

Хирургические операции производились совместно с сотрудниками лаборатории физиологии пищеварения ИФ РАН н с MB Ленцманом и ст н с А И Артемьевой Гистологический анализ материала проводился в НИИЭМ РАМН (чл -корр РАМН В А Отсллин)

Воспроизведение ГИМ осуществлялась по методу Smith et al (1984) с модификацией, заключавшейся в 12 минутной окклюзии обеих общих сонных артерий при одновременном контролируемом снижении среднего артериального давления до 50 мм рт ст Операция производилась под пентобарбиталовым наркозом (50 мг/кг, в/б)

ФИМ воспроизводилась по методу Tamura et al (1981) в модификации Bederson et al (1986) под комбинированным наркозом (кетамин/домитор, в/б 50 мг/кг и 0,2 мг/кг, соответственно) посредством биполярной коагуляции проксимального участка средней мозговой артерии на протяжении 2-3 мм

Последующее морфологическое исследование подтвердило адекватность выбора моделей ГИМ и ФИМ ГИМ вызывала у крыс значительные нейроморфологические нарушения, локализованные в гиппокампе (секторы СА1, СА2, САЗ), зубчатой извилине, п caudatus/putamen и неокортексе (Отеллин и др 2002, 2003), ФИМ вызывала поражение п caudatus/putamen и гибель значительных участков неокортекса, локализованных в бассейне кровоснабжения левой СМА с образованием рубца (Balestrino, 2005) Выявленные нарушения хорошо согласукяся с приводимыми в литературе для ГИМ (Smith et а!, 1984, Warner et al, 1990) и ФИМ (Bederson et al, 1986, Garsia et al, 1995)

Для и ц в инфузии крысам под кетаминовым наркозом (125 мг/кг, в/б) в левый латеральный желудочек головного мозга в соответствии с координатами стереотаксического атпаса (Pellegrmo, Cushman, 1967) имплантировалась канюля из нержавеющей стали Для непрерывной инфузии растворов использовались осмотические мини-насосы (Alzet osmotic mini-pump, Alzet Corp, USA, модель 1002, объемная скорость инфузии 0,25 мкл/ч), которые размещались подкожно между лопаток Исследуемые растворы вводились непрерывно в трех парадигмах (а) - начиная за 4 дня до и далее в течение 7 дней после ГИМ («предварительное» введение/«профилак1ическое» применение), (б) - начиная через 30-40 мин после ГИМ и далее в течение 7 дней («лечебное» применение), (в) - в течение 12 дней (контроль эффектов инфузии

растворов per se) Для и ц в инфузии использовались стандартный физиологический раствор (контроль), 50 мМ и 100 мМ (мМ/л) растворы креатина (Кр) и раствор глицерина, с осмолярностью, соответствующей 50 мМ Кр (контроль осмотических эффектов Кр)

Производные Кр, разработанные и синтезированные в рамках совместных исследований с ИВС РАН - глицериловый (ГЭКр) и бензиловый (БЭКр) эфиры Кр (заявки на Росс патент МПК7 А61К 31/661/1 Приоритет 02 04 06, МПК7 А61К 31/661/2 Приоритет 02 04 06, соответственно) потенциально способны проникать через ГЭБ и достаточно стабильны, чтобы допускать в/б введение Их введение производилось троекратно за 180, 120 и 60 мин до (профилактическое применение) ГИМ или ФИМ, или через 60, 120 и 180 мин (лечебное применение) после ФИМ при разовой дозе 200 мг/кг

Эвтаназия животных осуществлялась через семь дней после ГИМ/ФИМ методом декапитирования Мозг извлекался из черепной коробки, помещался в бюкс с фиксирующей смесью (формалин со спиртом) и передавался для гистологического анализа материала

Поведенческое тестирование

Для исследования когнитивных нарушений применялась пространственная версия водного теста Морриса (ВТМ) (Morris, 1981, 1984) - стандартный тест на исследование процессов обучения и памяти и последствий ишемии головного мозга (Shenk, 1996, Block, 1999, DeVries et al, 2001) Использованная установка ВТМ представляла собой круглый бассейн диаметром 145 см с жесткими стенками высотой 50 см, заполненный на 25 см теплой водой (t = 24±1°С), которая замутнялась добавлением небольшого количества мела Бассейн располагался в отдельном помещении с искусственным рассеянным освещением Обучение в ВТМ начиналось через два дня (48 ч) после ишемии В течение последующих 6 дней крыса осуществляла поиск скрытой «фиксированной» (расположенной в центре «целевого» 90" сектора/квадранта бассейна) платформы (диаметр 12 см, заглубление 1 см) Ежедневно давалось по 4 попытки на поиск платформы из 4 диаметрально расположенных стартовых точек (выбранных в псевдослучайной последовательности), время поиска ограничивалось 120 с, в течение 30 с между попытками крыса оставалась на платформе Данные по времени поиска в блоке из 4-х последовательных попыток одного дня усреднялись, формируя обобщенный показатель «навигационных» способностей этого дня На 6-ой день обучения, через 40-50 мин после последней попытки проводилось 2-х минутное тестирование с видеорегистрацией, оценивающее эффективность когнитивных процессов пространственного обучения и памяти на стадии обучения в тесте - «пробная попытка», перед этим платформа изымалась из бассейна С помощью программы анализа видеоизображения (создана в приложении IMAQ Vision в среде Lab VIEW 7 (National Instruments, USA) совместно с сотрудником ИФ РАН А А Савохиным)

вычислялось время, проведённое животным у стенок бассейна (в пределах внешних 20% диаметра бассейна) и в целевом квадранте (в котором располагалась платформа), а также общая длина поискового пути (характеристика средней скорости плавания) Отдельно подсчитывало«, количество пересечений окружности («аннулюс»), отмечающей бывшее положение платформы

- характеристика точности («аккуратности») поиска

Для оценки неврологических нарушений, вызванных ГИМ, использовалась 9-бальная шкала Combs and D'Alecy (1987), в модификации Wright et al (1999) Итоговый балл в ней формируется как сумма баллов в 3-х тестах, оценивающих мышечную силу, хватательный рефлекс и равновесие При этом 0 баллов свидетельствует о максимальной выраженности нарушений, а 9 баллов - об их отсутствии Тестирование проводилось трижды за 1 день, через 2 и 7 дней после ГИМ Для оценки неврологических нарушений при ФИМ использовались шкала Garcia et а! (1995) и модифицированная шкала оценки тяжести неврологических нарушений (ОТНН) Chen et al (2001) В шкале Гарсии итоговый балл формируется как сумма баллов за каждый из 6 тестов шкалы на латеральную асимметрию В шкале ОТНН итоговый балл формируется как сумма баллов за каждый из 4 групп тестов на моторику, сенсорику балансирование на приподнятом горизонтальном стержне и оценку наличия определенных рефлексов, припадков, судорог и тп Обе шкалы 18-ти балльные, однако, в случае шкапы Гарсии максимальной выраженности нарушений соответствует минимальный балл данной шкалы (3), а для ОТНН, наоборот - максимальный балл - 18 Тестирование проводилось четырежды за 1 день до, через 1, 3 (72 ч) и 7 дней после индуцирования ФИМ, в обеих шкалах последовательно

Статистическая обработка и представление данных

Для построения графиков использовался Excel® 2002 (Microsoft Corporation®, USA) Все результаты представлены в виде средней арифметической и стандартной ошибки средней Статистический анализ данных проводился с помощью пакета программ Statistica® 6 0 (StatSoft Inc, Tulsa, USA) Статистическая обработка неврологических данных проводилась с применением непараметрических критериев U критерия Манна-Уитни для межгрупповых и парного критерия Вилкоксона для внутригрупповых сравнений Анализ данных по ВТМ проводился с использованием двухфакторного (для времени поиска, факторы внутригрупповой

- «день обучения», межгрупповой - «воздействие») и однофакторного (для пробных попыток, один межгрупповой фактор - «воздействие») дисперсионного анализа ANOVA с последующим post-hoc анализом Фишера Во всех случаях был принят уровень значимости р < 0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Неврологические и когнитивные нарушения, вызываемые глобальной и фокальной ишемией головного мозга у крыс

Использование шкалы Комбса-Д Алеси позволило выявить динамику неврологических способностей у крыс после ГИМ значительные неврологические нарушения через 2 дня (резкое, на 80%, падение балла неврологического статуса) и восстановление исходного уровня способностей через 7 дней, полученные данные хорошо согласуюгся с литературными (Combs, D'Alecy, 1987, Mackensen et al, 2001a) ФИМ продуцировала у крыс уже более стойкие нарушения шкалы Гарсии и ОТНН выявляли их как через 24 ч (ухудшение неврологического статуса на 17% и 32%, соответственно), так и через 3 и 7 дней, что также хорошо согласуется с литературными данными (Garcia et al, 1995, Chen et al, 2001)

ГИМ замедляла обучение в водном тесте Морриса (ВТМ) крысы с ГИМ демонстрировали увеличенное время поиска, начиная со второго (при сравнении с ложнооперированными) или первого (при сравнении с интакными) дня обучения (р < 0,05 и ниже) В пробную попытку средняя скорость плавания у них была снижена (р < 0,004), что отражает определённое негативное влияние вызванных ишемией неврологических нарушений Однако то, что крысы с ГИМ при этом ещё и значительно реже пересекали границы бывшего участка локализации платформы (р < 0,026), свидетельствует о нарушении у них механизмов пространственной памяти и ориентации, те о когнитивных нарушениях Сопоставление полученных данных с литературными (Pazos et al, 1999, Hartman et al, 20051 позволяет с определенностью заключить, что выявленные нарушения обучения в ВТМ, вызванные ГИМ, в наибольшей степени связаны именно с хогнитивными нарушениями

ФИМ также замедляла обучение ВТМ крысы с ФИМ демонстрировали увеличенное время поиска платформы по сравнению с ложнооперированным и интакными конгролями (р < 0,001) В пробную попытку у крыс с ФИМ наблюдалось увеличенное (р < 0 001) время поиска на периферии бассейна (тигмотаксис), сниженные точность локализации платформы (р < 0,02) и предпочтение целевох о квадранта (р < 0,01), при этом по скорости плавания данная группа не отличалась от контрольных Это подтверждает идею, что ФИМ вызывала нарушения когнитивных процессов, полученные данные хорошо согласуются с литературными (Markgraf et al, 1992, Roof et al, 2001)

Таким образом, использование выбранных неврологических тестов и пространственного водного теста Морриса было адекватно задаче исследования

Влияние вживления и.ц.в. канюли и инфузии физраствора и креатина рег ¡е на неврологический статус и когнитивные способности крыс

Операция имплантирования и ц в канюли сама по себе негативно сказывалась на неврологических способностях крыс даже через 72 ч (8,05з=0,22 против 8,56±0,10 балла у интактных, р < 0,05) Инфузия р-ров дополнительно снижала неврологический статус группы с инфузией физраствора (до 7,44±0,40) и 50 мМ р-ра Кр (6,70±0,50) статистически значимо отличались от интактных (р < 0,01 и р < 0,001, соответственно), но при этом не отличались друг от друга При этом группа с Кр демонстрировала более высокий уровень нарушений, чем контроль с и ц в канюлей без инфузии (р < 0,05) Это свидетельствует о некотором негативном эффекте Кр при его ицв инфузии, факт, по нашим сведениям, ранее не отмеченный в литературе Некоторый негативный эффект ицв инфузии физраствора и р-ра Кр, отмеченный через три дня после её начала, значительно уменьшался с течением времени ослабевал через 7 и практически исчезал через 12 дней Вместе с тем, продолжительная ицв инфузия физраствора или 50 мМ Кр не оказывала выраженного влияния на обучение крыс в ВТМ

Влияние креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс

Профилактическая эффективность креатина

Профилактическая ицв инфузия 50 мМ Кр полностью предохраняла от неврологических нарушений, вызванных ГИМ (рис 1) В то время, как у контроля с инфузией физраствора через 48 ч после ГИМ наблюдалось резкое ухудшение неврологических способностей (на 68%, с 7,44±0,40 до 2,38±0,88, р < 0,05), способности крыс с инфузией 50 мМ Кр (5,67±0,46 балла) были практически на том же уровне, что и до ишемии, т е значительно выше, чем у контроля (р < 0 05) Через семь дней после ГИМ возможный позитивный эффект инфузии 50 мМ Кр был замаскирован естественными процессами функционального восстановления В то же время, профилактическое введение 100 мМ р-ра Кр, хотя несколько и снижало уровень неврологических нарушений через два дня после ГИМ (33% снижение балла, р > 0,37), но при этом замедляло восстановление на больших (через 7 дней) сроках (отличия между группами значимы, р < 0,02)

При обучении в ВТМ после ГИМ, крысы с предварительной инфузией 50 мМ р-ра Кр тратили статистически значимо меньшее время на поиск платформы, чем крысы с инфузией физраствора (р < 0,029, рис 2) и демонстрировали большую точность локализации платформы в пробной попытке (р < 0,04) Такой положительный профилактический эффект ицв инфузии Кр на когнитивные способности после ГИМ был показан впервые В то же время,

профилактическое ицв введение вдвое большей дозы Кр - 100 мМ уже не оказывало такого положительного действия, а напротив, имело тенденцию замедлять процессы пространственного обучения Контроль осмотических эффектов креатина

Предварительное ицв введение раствора глицерина не сказывалось на неврологических способностях крыс до ГИМ (8,33±0,71 балла, те уровень интакных), но резко ухудшало их состояние через 48 ч после ГИМ (0,67±0,41 балла) и приводило к гибели большинства (88%) животных через 7 дней после ГИМ Глицерин фактически блокировал обучение в ВТМ после ГИМ (рис 2) Таким образом, ицв инфузия р-ра глицерина эквиосомолярного 50 мМ Кр оказывала разрушительное действие на неврологические и когнитивные способности крыс после ГИМ Даже увеличение вдвое концентрации Кр оказывало значительно меньшее негативное влияние на обучение Можно заключить поэтому, что выраженный позитивный эффект 50 мМ Кр не связан с его осмолярностью и, напротив, проявляется даже вопреки этому свойству И, возможно, именно осмолярность растаора Кр ограничивает его профилактическую эффективность при ГИМ

Показанная высокая эффективность Кр при предварительном введении в отношении неврологических и когнитивных способностей после ГИМ, хорошо согласуется с морфологическими данными, свидетельствующими о значительном снижении у этих же животных некротических изменений в зонах CAI, СА2, САЗ гиппокампа, зубчатой извилине, п caudatus/putamen и неокортексе через 7 дней после ГИМ (Отеллин и др, 2002, Поленов и др, 2004, Balestnno et al, 2003, Lensman et al, 2006) Таким образом, Кр обладает высокой нейропротекторной эффективностью в отношении структур мозга, критических как для сенсомоторной координации, так и обучения и памяти Терапевтическая эффективность креатина

Ицв инфузия 50 мМ Кр, инициированная через 30 мин после ГИМ, не оказывала выраженных позитивных эффектов в отношении неврологических нарушений и не облегчала когнитивные процессы Более гого, в группах с терапевтической парадигмой ицв инфузии был отмечен повышенный уровень послеоперационной гибели животных (62% и 78% крыс, соответственно с инфузией физраствора и 50 мМ Кр, через 7 дней после ГИМ), превышающий обычный 30-40% уровень Представляется вероятным, что отсутствие четких эффектов Кр связано с негативным эффектом начала ицв инфузии, совпадающим в данном случае по времени с острой фазой развития ишемического поражения мозга, когда мозговые механизмы регуляции не могут справится с дополнительной нагрузкой объёмом, либо, в случае Кр, еще и с высокой осмолярностью его раствора

а а х

100

-О-креатин п=10 -О-физраствор п-18

Рис 1 Влияние предварительной интрацеребровенгрикулярной (и ц в) инфузии 50 мМ креатина на неврологический статус крыс после глобальной ишемии головного мозга (ГИМ) На горизонтальной оси отмечены номера тестирований 1- за 1 день до ГИМ, 2 - через 2 дня и 3 - через 7 дней после ГИМ Отличия между группами (ANOVA, тест Фишера) обозначены **-р<0,01

** *** ***

« 120

| 100

f 80

1 60

| 40

§ 20 ф

& О

-глицерин п=3

-о-физраствор п=9

• -«-креатин п«в

2 3 4 день обучения

Рис 2 Влияние предварительной (профилактической) интрацеребровенгрикулярной (и ц в ) инфузии физраствора, 50мМ раствора креатина и эквиосмолярного ему раствора глицерина на обучение крыс в водном тесте Морриса после глобальной ишемии головного мозга Отмечены статистически значимые отличия (АЫОУА, тест Фишера) между группами глицерин и креатин ** - р < 0,01 и *** - р < 0,001, и между группами физраствор и креатин # - р < 0,05

Влияние профилактического внутрибрюшиниого введения синтетических производных креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс

Новые производные Кр - БЭКр и ГЭКр оказались неспособны снизить негативный эффект ГИМ на обучение в ВТМ Более того, ГЭКр отчасти усугублял последствия ГИМ С другой стороны, ГЭКр, в отличие от БЭКр, обладал выраженным профилактическим эффектом в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ более чем на 50% снижал их выраженность (через 2 дня после ГИМ) Однако такое его действие было всё же несколько менее выраженным, чем профилактическое действие 50 мМ Кр, полностью устранявшее негативное влияние глобальной ишемии

Результаты гистологической оценки степени нейрональных поражений мозга этих же крыс, свидетельствуют о выраженном профилактическом нейропротекторном эффекте БЭКр, но не ГЭКр в отношении ГИМ (Baiestnno, 2005) Такая ситуация несоответствия результатов неврологического и морфологического исследования неоднократно отмечалась в литературе (например, Mackensen et al, 2001) Учитывая результаты морфологического исследования и относительную нейтральность БЭКр (в отличие от негативных эффектов ГЭКр) в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ, можно предположить, что, прежде всего, БЭКр может рассматриваться как перспективный фармакологический агент для дальнейших исследований

Профилактические и лечебные эффекты синтетических производных креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией головного мозга у крыс

Глицериновый эфир креатина

В тестах шкалы ОТНН крысы с предварительным введением ГЭКр демонстрировали меньшую степень нарушений, чем контроль без инъекций в течение всех дней тестирования после индуцирования ФИМ (на 24% и 39% ниже через 1 и 7 дней) Некоторый лечебный эффект ГЭКр наблюдался уже по данным обеих шкал После индуцирования ФИМ крысы с ГЭКр демонстрировали меньшие нарушения, чем контроль в каждом тестировании по шкале Гарсии (на 30, 60 и 40%) и через 3 и 7 дней (на 30 и 60%) после ФИМ в шкале ОТНН Предварительное введение ГЭКр не влияло на обучение в ВТМ при ФИМ Однако введение ГЭКр после ФИМ благоприятно сказывалось на когнитивных процессах, связанных с обработкой пространственной информации при хронической ФИМ Так, данные животные демонстрировали большую степень предпочтения целевого квадранта, значительно меньшее время проводили на периферии бассейна (рис ЗА) и чаще пересекали границы бывшего участка локализации платформы (рис ЗБ) Бензиловый эфир креатина

Предварительное введение БЭКр практически полностью предотвращало развитие неврологических нарушений у крыс при хронической ФИМ (рис 4), после ФИМ их неврологический статус был на уровне ложнооперированных (р > 0,22) или интактных крыс Терапевтическое введение БЭКр также обладало выраженным благоприятным действием хотя хроническая ФИМ и вызывала некоторое ухудшение неврологических способностей у крыс с БЭКр, уровень нарушений у них был значительно меньшим, чем у контроля, а восстановление происходило быстрее Через 1 и 3 дня крысы с БЭКр демонстрировали иа 50% меньшее снижение неврологического статуса в тестах шкалы Гарсии (р > 0,18) и через 7 дней полностью

восстановили пред-ищсмический уровень Способностей, в отличие от контроля (р < 0,05 ) По Шкале ОТПН данные эффекты ЮКр были менее очевидны В течение «сего периода обучения в ВТМ крысы с предварительным введением ЕЭКр демонстрировали чёткую тенденцию тратить меньшее время на поиск платформы, чем контрольные животные. В пробную попытку они. в сравнении с контролем значительно меньшее время проводили на периферии бассейна (рис ЗА) и точнее локализовали бывший участок расположения платформы (рис ЗБ). Хотя введение БЭКр после ФИМ не оказало заметного влияния на стадии обучения в ВТМ, анализ пробных попыток выявил у крыс данной группы сниженное, по сравнению с контролем, время поиска на периферии бассейна (рис.ЗА) и увеличенную точность поиска (рие.ЗЬ).

>j-;: >*r>*Г - % нременн ' > на периферии

ЧЛГДЩ /WfMC^V&Wit I,- I I /1Л Пформы

О HV. Г1К:1 КПКр b'j'vn

мч >■<, 11 ■: : f - с Л,'

! >К;> КЭКр j. >Kj .'ГЁЧЕби. |рр4фк.1. ,t\dV

Рис 3 Влияние внутрибркннянного (в/6) введения бензинового и глицерилового ^фиров к реагина (ГЭТСр и БЭКр) на показателе поискового поведения крыс в пробкой попытке (характеристики эффективности пространственного обучения в водном тесте Морриса) при хронической фокальной ишемии головного мозга (ФИМ). Статистически значимые ошичия групп с профилактическим или лечебным введением препаратов от контроля с ФИМ но без введения препаратов (ЛМСЛ'Л. тест Фишера} отмечены: * - р < 0,05: *** - р< 0,001.

Шкала ОГНИ

-»-ФИМ IBZ1

-С- БЭКр в/6 до ФИМ п=11

Рис. 4. тулиянНС предварительного внутрнбрютпииного (в/6) введений бензилового эфира креатина (БЭКр) на неврологические нарушения, п р оду л ир у<?м ые хронической фокальной ишемией головного мозга (ФИМ) у крыс Неврологический статуе крыс определялся в соответствии с: А.) шкалой Гарсии (чем выше балл - тем лучше состояние). Б.) - шкалой ОТПН (чем ниже бала сем лучше состояние) На горизонтальной осп отмечены номера тестирований" I- за I день до ГИМ, 2 - через ] день, 3 - через 3 и 4 ■■■ через 7 дней после ГИМ. Обозначения:1 р < 0,05. *** ■ р й 0,001 для межру готовых отличий (и-тест); Щ— р< 0.01: ### - р к 0,00) для вмугригрупповы^ отличий ог исходного урояня группы ФИМ ( критерии Вилкпксона).

Таким образом, БЭКр обладает выраженной профилактической и некоторой терапевтической эффективностью в отношении когнитивных способностей при ФИМ, что и позволяет рекомендовать его для дальнейшей разработки в качестве перспективного противоишемического препарата нового класса

ВЫВОДЫ

1 Разработанные модификации моделей глобальной и фокальной ишемии головного мозга вызывают у крыс значительные и воспроизводимые неврологические и когнитивные нарушения

2 Вживление интрацеребровентрикулярной канюли, а также интрацеребровентрикулярная инфузия растворов per se оказывают неблагоприятное влияние на неврологический статус, хотя и не влияют на когнитивные функции крыс

3 Интрацеребровентрикулярное введение 50 мМ креатина, обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении неврологических и когнитивных нарушений, вызванных у крыс глобальной ишемией головного мозга Данные эффекты креатина не связаны с его высокой осмолярностью

4 Новое синтетическое производное креатина — глицериловый эфир креатина при внутрибрюшинном введении обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении неврологических расстройств, вызванных глобальной ишемией мозга При хронической фокальной ишемии внутрибрюшинное введение глицеринового эфира креатина обладает ограниченной профилактической и терапевтической эффективностью в отношении неврологических нарушений и выраженной терапевтической эффективностью в отношении когнитивных нарушений

5 Новое синтетическое производное креатина - бензиновый эфир креатина при внутрибрюшинном введении высокоэффективно в отношении неврологических и когнитивных нарушений при хронической фокальной ишемии мозга у крыс Его профилактическое введение эффективно предупреждает развитие неврологических нарушений и ослабчяет когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией мозга Терапевтическое введение, снижая выраженность неврологических нарушений, значимо ускоряет восстановление нормального уровня неврологических способностей и улучшает когнитивные способности при хронической фокальной ишемии мозга

6 Результаты данного исследования позволяют рекомендовать бензиновый эфир креатина для дальнейшей разработки в качестве перспективного противоишемического препарата нового класса

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Муровец В О Исследование протективного действия креатина на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс II Тез докл Юбилейной конф посвященной 50-летию со дня основания Института физиологии Национальной академии наук Беларуси - Минск -2003 -С 112-113

2) Муровец В О. Ленцман М В , Артемьева А И , Золотарев В А, Поленов С А Влияние креатина на сенсомоторные и когнитивные нарушения при ишемии головного мозга у крыс // Тез докл XIX съезда физиол общ им И П Павлова, ч 1 Рос Физиол Журн им И М Сеченова - СПб -2004 Т 90,№ 8, Часть 1 -С 360-361

3) Муровец В О Влияние креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при ишемии головного мозга у крыс // Сборник материалов Всероссийской конф молодых исследователей «Физиология и медицина 2005» Вестник молодых учёных (серия «Науки о жизни») Приложение СПб - 2005 - С 79

4) Mourovets V О. Lensman М V, Artemieva АI, Zolotarev V А, Polenov S A Effect of creatine treatment on behavioral consequences of global cerebral ischemia in rats // Alexander von Humboldt Foundation Conference «Technologies of the 21st century biological, physical, informational and social aspects» Saint-Petersburg -2005 P 63-64

5) Polenov S A, Lensman M V, Balestrino M , Burov S V, Otellm V A , Yakutseni P P, Artemieva AI, Mourovets V О. Izvarina N L Development of novel approach for prophylaxis and treatment of brain ischemia and stroke Alexander von Humboldt Foundation Conference «Technologies of the 21st century biological, physical, informational and social aspects» Saint-Petersburg - 2005 P 72-73

6) Муровец В О . Ленцман, М В , Артемьева, А И, Балестрино, М, Поленов, С А Креатин эффективен для профилактики неврологических и когнитивных нарушений, вызванных глобальной ишемией головного мозга у крыс //Нейронауки -2006 — № 1(3) — С 20-23

7) Lensman М, Korzhevsku D, Mourovets V . Kostkin V, Izvarina N , Perasso L, Gandolfo С , Otellm V , Polenov S , Balestrino M Intracerebroventricular administration of creatine protects against damage by global cerebral ischemia m rat // Brain Res -2006 - Vol 1114 -P 187-194

8) Ленцман M В , Коржевский Д Э, Муровец В О. Артемьева А И, Изварина Н Л , Отеллин В А, Якуцени П П, Буров С В , Балестрино М, Поленов С А Оригинально-разработанные препараты на основе креатина, способные предотвращать истощение запасов высокоэнергетических фосфатов в клетках при нарушениях кровоснабжения новый патогенетический подход к профилактике и лечению ишемии мозга и инсультов // Тез докл Третьей международной научно-практической школы-конференции Медбиотек «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине» - Москва - 2006 - С 56-58

9) Муровец В О . Ленцман М В , Артемьева А И , Похвощева А В , Буров С В , Савохин А А , Изварина Н Л, Балестрино М, Поленов С А Бензиловый эфир креатина эффективен для профилактики и лечения неврологических и когнитивных нарушений при фокальной ишемии головного мозга у крыс // Тез докл Политехнического симпозиума «Молодые учёные -промышленности Северо-Западного региона» - Санкт-Петербург -2006 -С 171

Отпечатано в ООО «ПЦ «Синтез» ИНН 7826028027 СПб, ул Рузовская, д 16, тел 316-07-56 Формат 60x84/16 1 печ л Заказ № 73, тираж 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Муровец, Владимир Олегович

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна.

Практическое значение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ишемия головного мозга: модели и механизмы.

1.1.1. Типы ишемии головного мозга.

1.1.2. Механизмы повреждения нервной ткани при глобальной и фокальной ишемии головного мозга.

1.1.3. Экспериментальные модели ишемии головного мозга.

1.2. Креатин. Его свойства, функции и применение.

1.2.1. Биосинтез и распределение креатина в организме.

1.2.2.Функции креатина и креатинфосфата в организме.

1.2.3. Исследования нейропротекторных свойств креатина в условиях ишемии/гипоксии головного мозга.

1.2.3.1. Теоретически предпосылки применения креатина при ишемии и гипоксии головного мозга.

1.2.3.2. Исследования нейропротекторных свойств креатина in vitro.

1.2.3.3. Исследования нейропротекторных свойств креатина in vivo.

1.3. Неврологические и когнитивные нарушения при глобальной ишемии и инсультах головного мозга.

1.3.1. Необходимость использования животных моделей и поведенческих тестов.

1.3.2. Неврологические тесты для оценки последствий глобальной и фокальной ишемии мозга.

1.3.2.1. Неврологические расстройства у людей, перенесших инсульт или глобальную ишемию головного мозга.

1.3.2.2. Оценка функциональных нарушений с использованием неврологических шкал в клинике у людей и в эксперименте у животных.

1.3.2.3. Неврологические последствия глобальной ишемии мозга у животных.

1.3.2.4. Неврологические последствия фокальной ишемии мозга у животных.

1.3.3. Исследование когнитивных нарушений, вызванных глобальной и фокальной ишемией мозга.

1.3.3.1. Когнитивные нарушения, вызываемые ишемией и инсультом

1.3.3.2. Исследование обучения и памяти у животных в водном тесте Морриса.

1.3.3.3. Влияние глобальной ишемии мозга на обучение животных в водном тесте Морриса.

1.3.3.4. Влияние фокальной ишемии мозга на обучение животных в водном тесте Морриса.

Глава 2. МЕТОДИКА.

2.1. Животные.

2.2. Хирургические процедуры.

2.2.1. Маркировка животных.

2.2.2. Индуцирование глобальной и фокальной ишемии головного мозга.

2.2.2.1. Индуцирование глобальной ишемии головного мозга.

2.2.2.2. Индуцирование фокальной ишемии головного мозга.

2.2.3. Процедура введения исследуемых растворов.

2.2.2.1. Имплантация интрацеребровентрикулярной канюли и интрацебровентрикулярная инфузия исследуемых растворов.

2.2.2.2. Внутрибрюшинная инъекция производных креатина.

2.2.3. Эвтаназия животных.

2.3. Поведенческое тестирование.

2.3.1. Выбор схемы поведенческого исследования.

2.3.2. Исследование когнитивных нарушений в пространственной версии водного теста Морриса.

2.3.3. Неврологическое тестирование.

2.3.3.1. Оценка последствий глобальной ишемии головного мозга с использованием девятибалльной неврологической шкалы Комбса и Д'Алеси.

2.3.3.2. Оценка последствий фокальной ишемии с использованием специализированных неврологических шкал.

2.3.4. Статистическая обработка и представление данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние креатина на неврологические нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс.

3.1.1. Базовый уровень неврологических способностей у крыс.

3.1.2. Неврологические нарушения, вызываемые ГИМ у крыс.

3.1.3. Влияние процедур и.ц.в. канюлирования и и.ц.в. инфузии per se на неврологический статус животных.

3.1.4. Профилактическая эффективность креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ.

3.1.4.1. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии 50 мМ раствора креатина.

3.1.4.2. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии 100 мМ раствора креатина.

3.1.4.3. Влияние глицерина на неврологический статус животных до и после ГИМ - контроль осмотических эффектов креатина.

3.1.5. Терапевтическая эффективность креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ.

3.2. Влияние креатина на когнитивные нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс.

3.2.1. Нарушения обучения в водном тесте Морриса, вызываемые

ГИМ у крыс.

3.2.2. Влияние длительной и.ц.в. инфузии исследуемых растворов per se на когнитивные функции у крыс.

3.2.3. Профилактическая эффективность креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ.

3.2.3.1. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии 50 мМ раствора креатина на обучение крыс в водном тесте Морриса после ГИМ.

3.2.3.2. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии 100 мМ раствора креатина на обучение крыс в водном тесте Морриса после ГИМ.

3.2.3.3. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии раствора глицерина на обучение крыс в водном тесте Морриса после ГИМ - контроль возможных осмотических эффектов креатина.

3.2.4. Терапевтическая эффективность креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ.

3.3. Влияние новых синтетических производных креатина на неврологические и когнтивные нарушения, вызванные глобальной ишемией мозга у крыс.

3.3.1. Профилактическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ

3.3.2. Профилактическая эффективность бензилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ.

3.3.3. Профилактическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ.

3.3.4. Профилактическая эффективность бензилового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ.

3.3.5. Сравнение профилактической эффективности глицерилового и бензилового эфиров креатина в отношении неврологических и когнитивных нарушений, вызванных ГИМ.

3.4. Влияние производных креатина на неврологические нарушения, вызванные фокальной ишемией головного мозга у крыс.

3.4.1. Неврологические нарушения, вызываемые хронической ФИМ.

3.4.2. Профилактическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных хронической ФИМ.

3.4.3. Терапевтическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных хронической ФИМ.

3.4.4. Профилактическая эффективность бензинового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных хронической ФИМ.

3.4.5. Терапевтическая эффективность бензинового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных хронической

3.5. Влияние производных креатина на когнитивные нарушения, вызванные хронической фокальной ишемией головного мозга у крыс.

3.5.1.Когнитивные нарушения, вызываемые хронической

3.5.2. Профилактическая эффективность глицеринового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных хронической ФИМ.

3.5.3. Терапевтическая эффективность глицеринового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных хронической

3.5.4. Профилактическая эффективность бензилового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных хронической

3.5.5. Терапевтическая эффективность бензилового эфира Кр в отношении когнитивных нарушений, вызванных ФИМ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование протективного и лечебного действия креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс"

Актуальность

В промышленно развитых странах ежегодная частота инсультов (фокальной ишемии головного мозга, ФИМ) достигает 400 случаев на 100 ООО жителей, при этом смертность составляет 30% (Block, 1999). Глобальная ишемия головного мозга (ГИМ) представляет особую проблему в связи с широкой распространённостью атеросклероза сосудов головного мозга и является довольно частым осложнением при операциях на сердце (Johansson et al., 1995; Hindman, Todd, 1999; B6ttiger et al., 2001; Stamou, 2006).

Вызванные ГИМ и ФИМ разнообразные когнитивные, эмоциональные и функциональные нарушения ведут к инвалидизации людей и ложатся тяжелым социальным и экономическим бременем на общество. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения, средняя стоимость прямых и непрямых расходов на одного больного с инсультом составляет 55 000-73 000 американских долл. в год, и общие затраты только США, связанные с проблемой инсульта, должны составлять от 16,5 до 22 млрд. долл. в год (Жулев и др., 2002). Несмотря на широкую распространённость данных заболеваний и многолетние многомиллиардные вложения в поисковые исследования, на сегодняшний день единственным одобренным регуляторными инстанциями многих стран методом лечения инсульта с подтвержденной эффективностью является внутривенное введение рекомбинантного активатора плазминогена (Brown, 2004). Средства эффективной нейропротекции, несмотря на огромное число исследований, так и не найдены (Broderick, Hacke, 2002а, 2002b; Danton, Dietrich 2004). Всё это определяет неослабевающий интерес к поиску новых подходов к профилактике и лечению данных острых нарушений мозгового кровообращения и является одной из актуальных проблем современной медицины (Гусев, Скворцова, 2001; Herczeg et al., 1996; Shaaban et al., 2000; Danton, Dietrich 2004).

Установлено, что развитие необратимого поражения нервной ткани при ишемии связано с резким снижением уровня высокоэнергетических фосфатов (АТФ и креатинфосфата) в ишемизированных тканях и ограниченной возможностью их ресинтеза ввиду дефицита кислорода и глюкозы (Самойлов, 1985, 1999). Кроме того, происходящее при ишемии снижение рН дополнительно отягощает положение, ускоряя неферментативное необратимое превращение креатина в креатинин, что дополнительно ограничивает возможность ресинтеза креатинфосфата. В нервной ткани, как и других тканях организма с высокими энергетическими запросами (например, мышечной), в норме ресинтез АТФ из АДФ в клетке связан с дефосфорилированием креатинфосфата, и процесс этот может происходить при отсутствии кислорода и глюкозы. На основании этого была выдвинута рабочая гипотеза: введение креатина может способствовать увеличению синтеза и восполнению мозговых запасов креатинфосфата, тем самым снижая степень нейрональных повреждений при ишемии мозга.

Действительно, справедливость этой гипотезы подтверждена в опытах in vitro и in vivo. Непродолжительная инкубация переживающих срезов мозга с креатином увеличивает уровень креатинфосфата в ткани и существенно снижает степень аноксического и ишемического поражения нейронов (Carter et al., 1995; Balestrino et al., 2002, Balestrino, 2005). Рядом исследователей также была показана возможность увеличения уровня мозгового креатинфосфата при продолжительном приёме креатина с пищей или системном введении; отмечен нейропротекторный эффект данной добавки (Dechent et al., 1999; Adcock et al., 2002). Однако эти данные спорны, поскольку в норме проницаемость ГЭБ для креатина чрезвычайно мала (Perasso et al., 2003).

В нашей лаборатории впервые в опытах in vivo было установлено, что интрацеребровентрикулярное (и.ц.в.) введение креатина значительно уменьшает степень нейрональных повреждений в модели глобальной ишемии головного мозга у крыс (Polenov et al., 2005). Однако поскольку ГЭБ препятствует проникновению экзогенного креатина в мозг (Perasso et al., 2003), а и.ц.в. введение препарата непригодно для использования в клинике, в содружестве с химиками ИВС РАН были разработаны и синтезированы производные креатина, обладающие способностью проникать через ГЭБ. В опытах in vitro и, в дальнейшем, in vivo, в нашей лаборатории были получены приоритеные данные, свидетельствующие о высокой нейропротекторной эффективности одного из них - бензилового эфира креатина (Balestrino et al., 2004; Balestrino, 2005). Результаты этих исследований открывают перспективу разработки принципиально нового подхода к профилактике и лечению ишемического поражения мозга. Дальнейшая разработка этого направления невозможна без детального исследования влияния креатина и его новых аналогов на когнитивные функции и неврологический статус животных при ишемии головного мозга, чему и посвящена данная работа.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является определение эффективности креатина при интрацеребровентрикулярном (и.ц.в.) введении и новых синтетических производных креатина - глицерилового и бензилового эфиров креатина - при внутрибрюшинном введении (в/б) для профилактики и лечения неврологических и когнитивных нарушений, вызванных глобальной и хронической фокальной ишемией головного мозга (ГИМ и ФИМ) у крыс.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить неврологические и когнитивные нарушения, возникающие при ГИМ и хронической ФИМ у крыс.

2. Исследовать эффекты и.ц.в. инфузии физиологического раствора и раствора креатина per se на неврологический статус и когнитивные функции крыс.

3. Оценить профилактическое и лечебное действие и.ц.в. введения креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные ГИМ у крыс. Установить роль осмолярности в эффектах креатина.

4. Оценить профилактическое действие глицерилового и бензилового эфиров креатина при их в/б введении на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные ГИМ и ФИМ у крыс.

5. Оценить лечебное действие глицерилового и бензилового эфиров креатина при их в/б введении на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные ФИМ у крыс.

Научная новизна

Впервые получены экспериментальные доказательства возможности защиты или улучшения функционального состояния (неврологического статуса) и когнитивных способностей у крыс после ГИМ и при хронической ФИМ за счёт и.ц.в. введения креатина, а также в/б введения новых синтетических производных креатина (его бензилового и глицерилового эфиров).

Впервые установлено, что профилактическое и.ц.в. введение 50 мМ (но не 100 мМ) раствора креатина, значительно снижает выраженность когнитивных нарушений и эффективно предупреждает развитие неврологических нарушений у крыс после ГИМ; и показано, что данный благоприятный эффект 50 мМ Кр не связан с высокой осмолярностью его раствора.

Впервые установлено, что новое синтетическое производное креатина -глицериновый эфир креатина значительно (на 50% через 48 ч после ГИМ) снижает степень неврологических расстройств, вызванных ГИМ, при его предварительном (профилактическом) в/б его введении. При хронической ФИМ в/б введение глицерилового эфира креатина обладает ограниченной профилактической и терапевтической эффективностью в отношении неврологических нарушений и выраженной терапевтической эффективностью в отношении когнитивных нарушений.

Также впервые установлено, что новое синтетическое производное креатина - бензиновый эфир креатина высокоэффективно в отношении неврологических и когнитивных последствий хронической ФИМ у крыс при его в/б введении как в профилактической, так и терапевтической парадигмах.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в доказательстве того, что повышение мозгового уровня высокоэнергетических фосфатов с помощью и.ц.в. введения Кр способно ослаблять степень неврологических и когнитивных нарушений, вызванных ишемией головного мозга. Практическая значимость связана с экспериментальным доказательством высокой эффективности новых синтетических производных Кр при их парентеральном введении в отношении ослабления неврологических и когнитивных нарушений в двух моделях ишемии головного мозга, что позволяет рекомендовать их для дальнейшей разработки в качестве перспективных противоишемических препаратов нового класса.

Представляемая работа является частью комплекса проводившихся ранее в рамках совместной Российско-Итальянской исследовательской программы и европейского гранта INTAS-2000-0441 исследований протективного и лечебного действия креатина в отношении последствий экспериментальной ишемии головного мозга у крыс и продолжающегося исследования «Разработка, синтез и доклиническое тестирование новых препаратов на основе креатина, способных проникать через гематоэнцефалический барьер и увеличивать мозговое содержание высокоэнергетических фосфатов с конечной целью реализации нового подхода к профилактике и лечению инсультов и ишемических поражений мозга» (грант РФФИ-Ориентированные фундаментальные исследования № 05-04-08072), которые в настоящее время ведутся в лаборатории физиологии пищеварения Института физиологии им. И.П.Павлова РАН.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Муровец, Владимир Олегович

ВЫВОДЫ

1. Разработанные модификации моделей глобальной и фокальной ишемии головного мозга вызывают у крыс значительные и воспроизводимые неврологические и когнитивные нарушения.

2. Вживление интрацеребровентрикулярной канюли, а также интрацеребровентрикулярная инфузия растворов per se оказывают неблагоприятное влияние на неврологический статус, хотя и не влияют на когнитивные функции крыс.

3. Интрацеребровентрикулярное введение 50 мМ креатина, обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении неврологических и когнитивных нарушений, вызванных у крыс глобальной ишемией головного мозга. Данные эффекты креатина не связаны с его высокой осмолярностью.

4. Новое синтетическое производное креатина — глицериновый эфир креатина при внутрибрюшинном введении обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении неврологических расстройств, вызванных глобальной ишемией мозга. При хронической фокальной ишемии внутрибрюшинное введение глицерилового эфира креатина обладает ограниченной профилактической и терапевтической эффективностью в отношении неврологических нарушений и выраженной терапевтической эффективностью в отношении когнитивных нарушений.

5. Новое синтетическое производное креатина - бензиновый эфир креатина при внутрибрюшинном введении высокоэффективно в отношении неврологических и когнитивных нарушений при хронической фокальной ишемии мозга у крыс. Его профилактическое введение эффективно предупреждает развитие неврологических нарушений и ослабляет когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией мозга. Терапевтическое введение, снижая выраженность неврологических нарушений, значимо ускоряет восстановление нормального уровня неврологических способностей и улучшает когнитивные способности при хронической фокальной ишемии мозга.

6. Результаты данного исследования позволяют рекомендовать бензиловый эфир креатина для дальнейшей разработки в качестве перспективного противоишемического препарата нового класса.

Работа выполнена при поддержке грантов: РФФИ-Ориентированные фундаментальные исследования № 05-04-08072; СПбНЦ РАН; INTAS-2000-0441.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа является частью совместного комплексного исследования, проводимого рядом отечественных и зарубежных научных коллективов. Объединенные усилия нескольких рабочих групп направлены на разработку нового подхода к профилактике и лечению ишемических поражений мозга, основанного на искусственном увеличении мозговых запасов высокоэнергетических фосфатов с помощью креатина и его новых синтетических производных. В основе этой идеи лежат известные данные о том, что в ишемизированном мозге резко снижается уровень макроэргов - АТФ и креатинфосфата. При этом возможность их ресинтеза ограничена ввиду дефицита кислорода и глюкозы, что и является одной из основных причин поражения нервной ткани. Кроме того, происходящее при ишемии снижение рН дополнительно отягощает положение, резко ограничивая возможность ресинтеза креатинфосфата из-за ускорения неферментативного необратимого превращения креатина в креатинин. Было высказано предположение, что введение креатина может снижать степень нейрональных повреждений при ишемии мозга за счет увеличения интенсивности синтеза и восполнения запасов креатинфосфата, восстанавливающего АТФ из АДФ даже в отсутствие кислорода и глюкозы. Справедливость этой рабочей гипотезы подтвердили эксперименты in vitro на переживающих срезах мозга, проведенные в том числе и с нашим участием (Balestrino et al., 1999; Parodi et al., 2003; Zapara et al., 2004), а также впервые поставленные в нашей лаборатории эксперименты in vivo (Отеллин и др., 2002,2003; Balestrino et al., 2004; Balestrino, 2005; Lensman et al., 2005,2006).

Полученные данные привели к возникновению ряда новых вопросов. Во-первых, в литературе периодически поднимается вопрос о возможности токсического действия креатина, особенно в больших дозах, в частности, на мозговые функции (Parodi et al., 2003). Первая часть данной диссертационной работы была посвящена рассмотрению ряда аспектов этой проблемы.

Предварительно были разработаны такие модификации методов воспроизведения временной глобальной ишемии мозга (п. 2.2.1.1.) и хронической фокальной ишемии у крыс (п. 2.2.1.2.), которые при хорошей воспроизводимости характеризующих данные типы ишемии нейрональных нарушений обеспечивали бы приемлемый для исследования уровень послеоперационной смертности животных. Кроме того, на основе анализа современной литературы были выбраны и отработаны адекватные методы исследования неврологических (п. 2.3.3.) и когнитивных нарушений (п. 2.3.2.) при глобальной и фокальной ишемии мозга.

Действительно, оказалось, что интрацеребровентрикулярная (и.ц.в.) инфузия креатина (50 и 100 мМ) per se сопровождается некоторым угнетением неврологических способностей у крыс (пп. З.1.З., 3.1.4.2. рис. 8, 9, 11); однако при этом не наблюдалось негативного влияния креатина на когнитивные функции (п. 3.2.2., рис. 15). Далее нами было проведено детальное исследование эффектов и.ц.в. канюлирования и инфузии физраствора per se. Следует отметить, что в настоящей работе для и.ц.в. инфузии использовались осмотические мининасосы с минимальной объёмной скоростью инфузии - 0,25 мкл/ч. Показано, что эти процедуры, широко используемые в экспериментальной практике, сами по себе также оказывают выраженное негативное влияние на неврологический статус животных (п. З.1.З., рис. 8 и 9), но при этом не влияют на когнитивные способности (п. 3.2.2., рис. 15). К сожалению, влияние данных процедур не всегда учитывается исследователями, что влияет на адекватность анализа центрального действия тестируемых веществ.

Во-вторых, был исследован вопрос о влиянии креатина на функции мозга при глобальной ишемии. Наиболее важным выводом данной части работы является впервые полученное экспериментальное доказательство мощного профилактического эффекта креатина (50 мМ) при его и.ц.в. введении в отношении как неврологических (п. 3.1.4.1., рис. 10), так и когнитивных расстройств, вызванных глобальной ишемией мозга у крыс (п. З.2.З.1., рис. 16).

Показанная высокая эффективность предварительного введения креатина в отношении неврологических и когнитивных способностей у крыс после глобальной ишемии мозга хорошо согласуется с полученными совместно с сотрудниками ИЭФ РАМН морфологическими данными, свидетельствующими о значительном снижении у этих же животных некротических изменений в зонах СА1, СА2, САЗ гиппокампа, зубчатой извилине, п. caudatus/putamen и неокортексе через 7 дней после ГИМ (Отеллин и др., 2002; Поленов и др., 2004; Balestrino et al., 2003; Lensman et al., 2006). Таким образом, креатин обладает высокой нейропротекторной эффективностью в отношении структур мозга, критических как для сенсомоторной координации, так и обучения и памяти (Дудкин и др., 2000; Суворов, Шуваев, 2002; Squire, 1996).

В-третьих, возникает вопрос о механизмах профилактических эффектов креатина. Вполне возможно, что они связаны с его осмотическими свойствами. В этом случае решающим фактором, определяющим положительные эффекты и.ц.в. инфузии креатина при ишемии, могла быть высокая осмолярность его раствора, а не креатин per se. Теоретически введение гиперомолярного раствора могло способствовать снижению обводнения нейронов и, таким образом, устранению одной из важнейших причин гибели нервной ткани. С другой стороны, избыточное накопление креатина в клетках само по себе должно приводить к гипергидратации. Для ответа на этот вопрос производилась предварительная и.ц.в. инфузия нейтрального вещества - глицерина, в концентрации, эквиосмолярной 50 мМ раствору креатина. Выяснилось, что при глобальной ишемии предварительное введение высокоосмолярных растворов не только не оказывает нейропротективного эффекта (по морфологическим данным усиливалось поражение мозговых структур), но и значительно ухудшает функциональное состояние животных (увеличивает процент гибели), усугубляет неврологические нарушения (п. З.1.4.З., рис. 12) и вызывает явные когнитивные нарушения, полностью блокируя пространственное обучение (п. 3.2.3.3., рис. 18). Следовательно, положительное влияние креатина на неврологический статус и когнитивные способности у крыс после глобальной ишемии мозга обусловлен физиологическими свойствами инфузируемого раствора, а не его осмолярностью; более того, можно сказать, что наблюдаемый положительный эффект креатина «перебивает» вынужденное негативное действие гиперосмолярного раствора.

Возможно, что именно высокая осмолярность раствора креатина ограничивает его профилактическую эффективность при глобальной ишемии. Так, предварительное и.ц.в. введение 100 мМ раствора креатина уже имело весьма ограниченную эффективность в отношении предотвращения неврологических нарушений (п. 3.1.4.2., рис. 11), и замедляло обучение (но в значительно меньшей степени, чем глицерин, эквиосмолярный 50 мМ креатину; пп. 3.2.3.2.-3.2.3.3., рис. 17,18). Выявленные негативные эффекты инфузии 50 мМ раствора креатина и физраствора (п. 3.1.3.) per se на неврологический статус, особенно на небольших сроках после начала инфузии, также позволяют предположить, что неэффективность терапевтического применения креатина связана с негативным эффектом начала и.ц.в. инфузии препаратов, которая в данном случае совпадает во времени с острой фазой развития ишемического поражения, когда мозговые механизмы регуляции не могут справиться с дополнительной нагрузкой объёмом, либо, в случае креатина, ещё и с высокой осмолярностью его раствора (п. 3.1.4.3.).

Полученные на предыдущем этапе данные имеют фундаментальное значение и служат обоснованием для дальнейших разработок. Использованный путь введения креатина непригоден для клиники, а его парентеральное введение или добавление в диету оказывается малоэффективным ввиду чрезвычайно низкой проницаемости ГЭБ. Эту проблему может разрешить направленный поиск и синтез производных креатина, способных проникать через ГЭБ при сохранении всех биологических качеств, то есть обладающих лучшей биодоступностью и допускающих парентеральное введение. В рамках совместного проекта целый ряд таких производных креатина был разработан и синтезирован в Институте высокомолекулярных соединений (ИВС) РАН. В предварительных экспериментах два из них, а именно бензиловый и глицериловый эфиры креатина, продемонстрировали достаточно высокий уровень проникновения через ГЭБ при внутрибрюшинном введении. Бензиловый эфир креатина показал очень хорошие нейропротекторные свойства в in vitro (электрофизиологические данные) и предварительных in vivo экспериментах при внутрибрюшинном введении (по морфологическим данным) (Balestrino, 2005). При этом его in vivo эффективность была сопоставима с эффективностью нативного креатина. Исследованию влияния этих производных креатина при их внутрибрюшинном введении на сенсомоторные (неврологические) и когнитивные нарушения, вызванные глобальной и хронической фокальной ишемией головного мозга у крыс, что является необходимым условием для перехода к первой фазе клинических испытаний, и была посвящена дальнейшая часть работы. Данные препараты вводились внутрибрюшинно, трижды за 3, 2 и 1 час до индуцирования глобальной или фокальной ишемии (профилактическое введение) или соответственно через 1, 2 и 3 часа после индуцирования фокальной ишемии (для исследования лечебного действия) при разовой дозе 200 мг/кг.

Профилактическое внутрибрюшинное введение бензилового и глицерилового эфиров креатина не снижало негативный эффект глобальной ишемии на когнитивные способности; более того, глицериловый эфир креатина (п. 3.3.3., рис. 22) отчасти усугублял последствия ишемии. Однако глицериловый эфир креатина, в отличие от бензилового, обладал выраженным профилактическим эффектом в отношении неврологических нарушений при глобальной ишемии (п. З.З.1., рис. 20), хотя и в меньшей степени, чем показанное ранее действие предварительного и.ц.в. введения 50 мМ креатина, полностью устранявшего негативное влияние глобальной ишемии (п. З.1.4.1., рис. 10). При этом результаты гистологической оценки степени нейрональных поражений мозга этих же крыс, проведённой в ИЭМ РАМН, свидетельствовали о выраженном профилактическом нейропротекторном эффекте именно бензилового, но не глицерилового эфира креатина в отношении глобальной ишемии мозга (Balestrino, 2005). Учитывая результаты морфологического исследования и относительную нейтральность бензилового эфира (в отличие от негативных эффектов глицерилового эфира) креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных глобальной ишемии мозга у крыс, можно предположить, что, прежде всего, бензиловый эфир креатина может рассматриваться как перспективный фармакологический агент для дальнейших исследований.

В заключительной части настоящей работы впервые исследовалась профилактическая и лечебная эффективность новых производных креатина при их внутрибрюшинном введении в отношении неврологических и когнитивных нарушений, наблюдающихся у крыс при хронической фокальной ишемии -экспериментальной модели инсультов.

Бензиловый эфир креатина при профилактическом внутрибрюшинном введении продемонстрировал практически такую же высокую эффективность в отношении неврологических нарушений при хронической фокальной ишемии (п. 3.4.4., рис. 27), как и креатин при и.ц.в. введении в отношении данных нарушений при глобальной ишемии - он практически полностью предотвращал их проявление. Также впервые было показано, что бензиловый эфир креатина обладает выраженным лечебным действием - снижает неврологические нарушения при хронической фокальной ишемии и ускоряет восстановление неврологического статуса (п, 3.4.5., рис. 28). Глицериловый эфир креатина также оказался не лишён некоторой профилактической (п. 3.4.2., рис. 25), и лечебной эффективности (п. 3.4.2., рис. 26) в отношении неврологических нарушений, однако такая его эффективность была всё же ниже, чем показанная для бензилового эфира креатина.

В отношении эффектов внутрибрюшинного введения препаратов на нарушения когнитивной деятельности, наблюдающиеся у крыс при хронической фокальной ишемии, было обнаружено, что бензиловый эфир креатина обладал выраженной профилактической (п. 3.5.4., рис. 32) и, в несколько меньшей степени, лечебной (п. 3.5.5.) эффективностью. Некоторое лечебное действие в отношении когнитивных способностей при фокальной ишемии (п. 3.5.3.) было также выявлено и для глицерилового эфира креатина.

Таким образом, протестированные производные креатина, в особенности его бензиновый эфир, показали высокую профилактическую и лечебную эффективность в отношении как неврологических, так и когнитивных расстройств, а также хорошие нейропротекторные свойства (по данным гистологического исследования; Balestrino, 2005) именно при хронической фокальной ишемии мозга. Бензиловый эфир в данном его качестве может быть рекомендован для проведения первой фазы клинических испытаний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Муровец, Владимир Олегович, Санкт-Петербург

1. Артюхина Н.И., Саркисова К.Ю. Межполушарная асимметрия повреждений гиппокампа после двусторонней перевязки общих сонных артерий // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2004. - Т. 90 № 2. - С. 146-156.

2. Беспалов А.Ю., Звартау Э.Э. Нейропсихофармакология антагонистов NMDA-рецепторов. СПб.: Невский Диалект, 2000. - 297 с.

3. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения/Под ред. Батуева А.С. М.: Высш. шк., 1991.-399 с.

4. Буреш Я., Королёва В.И., Королёв О.С., Мареш В. Сдвиги постоянного потенциала в структурах головного мозга крыс при фокальной ишемии и системной гипоксии // ЖВНД. 1998. - Т. 48 № 4. - С. 640-653.

5. Виноградова О.С. Гиппокамп и память. М.: Наука, 1975. - 335 с.

6. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М. Медицина, 2001 -328 с.

7. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика: Пер. с англ. -М.: Мир, 1991.-544 с.

8. Дудкин К.Н., Чуева И.В., Макаров Ф.Н. Роль префронтальной и теменной областей коры в процессах обучения и памяти у обезьян // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2000. - Т. 86 № 11. - С. 1458-1470.

9. Ю.Жулев Н.М., Пустозеров В.Г., Жулев С.Н. Цереброваскулярные заболевания.

10. Профилактика и лечение инсультов. СПб.: Невский Диалект, 2002. - 384 с. 11 .Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 1. Пер. с англ. - М.: Мир, 1993. - 384 с.

11. Ноздрачев А.Д., Поляков E.JI. Анатомия крысы. СПб.: Лань, 2001. - 464 с.

12. Самойлов М.О. Реакции нейронов мозга на гипоксию. Л.: Наука, 1985. -190 с.

13. Самойлов М.О. Мозг и адаптация: молекулярно-клеточные механизмы. -СПб.: Ин-т физиологии им. И.П. Павлова РАН, 1999. 272 с.

14. Симонов П.В. Избранные труды: В 2 т. / П.В. Симонов; Отв. Ред. И.А. Шевелев; Ин-т высшей нервной деятельности и нейрофизиологии. М.: Наука, 2004. - Т. 1: Мозг: эмоции, потребности, поведение. - 2004. - 437 с.

15. Суворов Н.Ф. Стриарная система и поведение. Л.: Наука, 1980. - 280 с.

16. Суворов Н.Ф., Шуваев В.Т. Участие базальных ганглиев в организации поведения Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2002. Т. 88 № 10. - С. 100-112.

17. Шуваев В.Т. Амигдало-каудатная система и поведение // Успехи физиол. наук. 1993. - Т. 24 № 2 - С. 84-108.

18. Aberg М.А., Aberg N.D., Hedbacker Н., Oscarsson J., Eriksson P.S. Peripheral infusion of IGF-I selectively induces neurogenesis in the adult rat hippocampus // J. Neurosci. 2000. - Vol. 20. - P. 2896-2903.

19. Adcock K.H., Nedelcu J., Loenneker Т., Martin E., Wallimann Т., Wagner B.P. Neuroprotection of creatine supplementation in neonatal rats with transient cerebral hypoxia-ischemia // Dev. Neurosci. 2002. - Vol. 24. - P. 382-388.

20. Astrup J., Symon L., Branston N.M., Lassen N.A. Cortical evoked potential and extracellular K+ and H+ at critical levels of brain ischemia // Stroke. 1977- Vol. 8.-P. 51-57.

21. Astrup J., Symon L., SiesjO B.K. Thresholds in cerebral ischemia: the ischemic penumbra // Stroke -1981. Vol. 12. - P.723-725.

22. Auer R.N., Jensen M.L., Whishaw I.Q. Neurobehavioural deficit due to ischemic brain damage limited to half of the CA1 sector of the hippocampus // J. Neurosci. -1989.-Vol. 9.-P. 1641-1647.

23. Balestrino M. Pathophysiology of anoxic depolarization: new findings and a working hypothesis // J. Neurosci. Meth. 1995. - Vol. 59. - P. 99-103.

24. Balestrino M., Lensman M., Parodi M., Perasso L., Rebaudo R., Melani R., Polenov S., Cupello A. Role of creatine and phosphocreatine in neuronal protection from anoxic and ischemic damage // Amino Acids. 2002. - Vol. 23. -P. 221-229.

25. Balestrino M., Rebaudo R., Lunardi G. Exogenous creatine delays anoxic depolarization and protects from hypoxic damage: dose-effect relationship // Brain Res. -1999. Vol. 816 № 1. - P. 124-130.

26. Bannerman D.M., Good M.A., Butcher S.P., Ramsay M., Morris R.G.M. Distinct components of spatial learning revealed by prior testing and NMDA receptor blockade // Nature. 1995. - Vol. 378. - P. 182-186.

27. Bardutzky J., Shen Q., Henninger N., Bouley J., Duong T.Q., Fisher M. Differences in ischemic lesion evolution in different rat strains using diffusion and perfusion imaging // Stroke. 2005. - Vol. 36. - P. 2000-2005.

28. Bederson J.B., Pitts L.H., Tsuji M. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination // Stroke. -1986.-Vol. 17.-P. 472-476.

29. Belayev L., Alonso O.F., Busto R., Zhao W., Ginsberg M.D. Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture. Neurological and pathological evaluation of an improved model // Stroke. -1996. Vol. 27. - P. 1616-1623.

30. Berg K., Wood-Dauphinee S., Williams J.I., Gayton D. Measuring balance in the elderly: Preliminary development of an instrument // Physiotherapy Canada. -1989.-Vol. 41.-P.304-311.

31. Berger C., Sakowitz O.W., Kiening K.L., Schwab S. Neurochemical monitoring of glycerol therapy in patients with ischemic brain edema // Stroke. 2005. - Vol. 36. - P. e4-e6.

32. Berneis K., Ninnis R., Haussinger D., Keller U. Effects of hyper- and hypoosmolality on whole body protein and glucose kinetics in humans // Am. J. Physiol. 1999. - Vol. 276. - P. 188-195.

33. Blessed G., Tomlinson B.E., Roth M. The association between quantitative measures of dementia and of senile change in the cerebral grey matter of elderly subjects // Br. J. Psychiatry. 1968. - Vol. 114. - P. 797-811.

34. Block F., Kunkel M., Schwarz M. Quinolinic acid lesion of the striatum induces impairment in spatial learning and motor performance in rats // Neurosci. Lett. 1993.-Vol. 149.-P. 126-128.

35. Block F. Global ischemia and behavioural deficits // Progress in Neurobiology -1999.-Vol. 58.-P. 279-295.

36. Block F., Schwarz M. Global ischemic neuronal damage relates to behavioural deficits: a pharmacological approach // Neuroscience. 1998. - Vol. 82. - P. 791803.

37. Bonita R, Beaglehole R. "Modification of Rankin Scale: Recovery of motor function after stroke // Stroke. -1988. Vol. 19 №12. - P. 1497-1500.

38. Braissant O., Heniy H., Loup M., Eilers В., Bachmann C. Endogenous synthesis and transport of creatine in the rat brain: An in situ hybridization study // Mol. Brain Res. 2001. - Vol. 86. - P. 193-201.

39. Brewer G.J., Wallimann T.W. Protective effect of the energy precursor creatine against toxicity of glutamate and p-amyloid in rat hippocampal neurons // J. Neurochemistry. 2000. - Vol. 74 Iss. 5. - P. 1968-1978.

40. Broderick J.P., Hacke W. Treatment of acute ischemic stroke part I: Recanalization strategies // Circulation. 2002a. Vol. 106. - P. 1563-1569.

41. Broderick J.P., Hacke W. Treatment of acute ischemic stroke part II: Neuroprotection and medical management // Circulation. 2002b. - Vol. 106. - P. 1736-1740.

42. Brott Т., Adams H.P. (Jr.), Olinger C.P., Marler J.R., Barsan W.G., Biller J., Spilker J., Holleran R., Eberle R., Hertzberg V. Measurements of acute cerebral infarction: a clinical examination scale // Stroke. -1989. Vol. 20. - P. 864-870.

43. Brown D.L., Johnston K.C., Wagner D.P., Haley C. (Jr.) Predicting major neurological improvement with intravenous recombinant tissue plasminogen activator treatment of stroke // Stroke. 2004. - Vol. 35. - P. 147-150.

44. Brustovetsky N., Brustovetsky Т., Dubinsky J.M. On the mechanisms of neuroprotection by creatine and phosphocreatine // J. Neurochem. 2001. - Vol. 76Iss. 2.-P. 425-434.

45. Brzezinska Z., Nazar K., Kaciuba Uscilko H., Falecka Wieczorek I., Wojcik Ziolkowska E. Effect of a short-term dietary creatine supplementation on high-energy phosphates in the rat myocardium // J. Physiol. Pharmacol. 1998. - Vol. 49-P. 591-595.

46. Cain D.P., Boon F. Detailed behavioral analysis reveals both task strategies and spatial memory impairments in rats given bilateral middle cerebral artery stroke // Brain Res. 2003. - Vol. 972. - P. 64-74.

47. Сатегоп H.A., Hazel T.G., McKay R.D. Regulation of neurogenesis by growth factors and neurotransmitters // J. Neurobiol. 1998. - Vol. 36. - P. 287-306.

48. Capdeville C., Pruneau O., Allix M., Plotkine M„ Baulu R.G. Model of global forebrain ischemia in the unanesthetized rat // J. Pharmacol. 1986. - Vol. 17 - P. 553-560.

49. Carli M., Evenden J.L., Robbins T.W. Depletion of unilateral striatal dopamine impairs initiation of contralateal actions and not sensory attention // Nature. -1985. Vol. 313.-P. 679-682.

50. Carroll D. A quantitative test of upper extremity function // J. Chron. Dis. 1965. -Vol. 18.-P. 479-491.

51. Carter A.J., Muller R.E., Pschorn U., Stransky W. Preincubation with creatine enhances levels of creatine phosphate and prevents anoxic damage in rat hippocampal slices // J. Neurochem. 1995. - Vol. 64 №6. - P. 2691-2699.

52. Chen Y., Constantini S., Trembovler V., Weinstock M., Shohami E. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits // J. Neurotrauma. 1996. - Vol. 10. - P. 557-568.

53. Chen J., Li Y., Wang L., Zhang Z., Lu D., Lu M., Chopp M. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats // Stroke. 2001a. - Vol. 32. - P. 1005-1011.

54. Chen J., Sanberg P.R., Li Y., Wang L., Lu M., Willing A.E., Sanchez-Ramos J., Chopp M. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats // Stroke. 2001b. - Vol. 32. - P. 26822688.

55. Chen S.T., Hsu C.Y., Hogan E.L., Maricq H., Balentine J.D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction // Stroke. -1986.-Vol. 17.-P. 738-743.

56. Combs D.J., D'Alecy L.G. Motor performance in rats exposed to severe forebrain ischemia: effect of fasting and 1, 3-butanediol // Stroke. 1987. - Vol. 18. - P. 503-511.

57. Corbett D., Evans S.J., Nurse S.M. Impaired acquisition of the Morris water maze following global ischemic damage in the gerbil // Neuroreport. 1992. - Vol. 3 № 2.-P. 204-206.

58. Cote R., Hachinski V.C., Shurvell B.L., Norris J.W., Wolfson C. The Canadian Neurological Scale: a preliminary study in acute stroke // Stroke. 1986. - Vol. 17.-P. 731-737.

59. Cote R, Battista RN, Wolfson C, Boucher J, Adam J, and Hachinski VC. The Canadian Neurological Scale: validation and reliability assessment // Neurology. -1989.-Vol. 39.-P. 638-643.

60. Cummings J.L., Tomiyasu U., Read S., Benson D.F. Amnesia with hippocampal lesions after cardiopulmonary arrest // Neurology. 1984. - Vol. 34. - P. 679-681.

61. D'Alecy L.G., Lundy E.F., Barton K.J., Zelenock G.B. Dextrose-containing intravenous fluid impairs outcome and increases death after eight minutes of cardiac arrest and resuscitation in dogs // Surgery. 1986. - Vol. 100. - P. 505511.

62. Danton G.H., Dietrich W.D. The search for neuroprotective strategies in stroke // Am. J. Neuroradiol. 2004. - Vol. 25. - P. 181-194.

63. Deldicque L., Louis M., Theisen D., Nielens H., Dehoux M., Thiesen J.-P., Rennie M.J., Francaux M. Increased IGF mRNA in human skeletal muscle after creatine supplementation // Med. Sci. Sports Exerc. 2005. - Vol. 37 № 5. - P. 731-736.

64. Dechent P., Pouwels P.J.W., Wilken В., Hanefeld F., Frahm J. Increase of total creatine in human brain after oral supplementation of creatinemonohydrate // Am. J. Physiol. 1999. - Vol. 46. - P. 698-704.

65. DeVries A.C., Nelson R.J., Traystman R.J., Hum P.D. Cognitive and behavioral assessment in experimental stroke research: will it prove useful? // Neurosci. Biobeh. Rev. 2001. - Vol. 25. - P. 325-342.

66. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M.A. Pathobiology of ischemic stroke: an integrated view // TINS 1999. - Vol. 22. - P. 391-397.

67. D,Hooge R., De Deyn P.P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory // Brain Res. Rev. 2001. - Vol. 36. - P. 60-90.

68. Dodd J.R., Zheng Т., Christie D.L. Creatine accumulation and exchange by HEK293 cells stably expressing high levels of creatine transporter // Biochim. Biophys. Acta. -1999. Vol. 1472. - P. 128-136.

69. Dzeja P.P., Terzic A. Phosphotransfer networks and cellular energetics // J. Exp. Biology. 2003. - Vol. 206. - P. 2039-2047.

70. Eichenbaum H., Stewart C., Morris R.G.M. Hippocampal representation in place learning//J. Neurosci.- 1990.-Vol. 10№ 11.-P. 3531-3542.

71. Farkas E., Luiten P.G.M. Cerebral microvascular pathology in aging and Alzheimer's disease // Progress in Neurobiology. 2001. - Vol. 64. - P. 575-611.

72. Fiske C.H., Subbarow Y. The nature of the "inorganic phosphate" in voluntary muscle // Science. 1927. - Vol. 65. - P. 401-403.

73. Folstein M.F., Folstein S.E., McHugh P.R. Mini-mental state. A practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician // J. Psychiatr. Res. -1975. Vol. 12 №3.-P. 189-98.

74. Gallyas F., Hsu M., Buzsaki G. Delayed degeneration of the optic tract and neurons in the superior colliculus after forebrain ischemia // Neurosci. Lett. -1992.-Vol. 144.-P. 177-179.

75. Garcia J.H. Experimental ischemic stroke: A review // Stroke. 1984. - Vol. 15. -P. 5-14.

76. Garcia J.H., Wagner S., Liu К., Ни X. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical Validation // Stroke. 1995. - Vol. 26. - P. 627-635.

77. Gerriets Т., Li F„ Silva M.D., Meng X., Brevard M., Sotak C.H., Fisher M. The macrosphere model. Evaluation of a new stroke model for permanent middle cerebral artery occlusion in rats // J. Neurosci. Methods. 2003. - Vol. 122. - P. 201-211.

78. Ginsberg M.D., Busto R. Rodent Models of Cerebral Ishemia // Stroke. 1989. -Vol. 20.-P. 1627-1642.

79. Gionet T.X., Thomas J.D., Warner D.S., Goodlett C.R., Wasserman E.A., West J.R. Forebrain ischemia induces selective behavioral impairments associated with hippocampal injury in rats // Stroke. -1991. Vol. 22. - P.1040-1047.

80. Gionet T.X., Warner D.S., Verhaegen M., Thomas J.D., Todd M.M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat // Brain Res. 1992. - Vol. 586 № 2. - P. 188-194.

81. G6rgulu A., Kin§ Т., Cobanoglu S., Unal F., fzgi N., Yanik В., Kucuk M. Reduction of edema and infarction by memantine and MK-801 after focal cerebral ischaemia and reperfusion in rat // Acta Neurochir. (Wien) 2000. - Vol. 142. -P. 1287-1292.

82. Grabowski M., Nordborg C., Brundin P., Johansson B.B. Middle cerebral artery occlusion in the hypertensive and normotensive rat: a study of histopathology and behaviour // J. Hypertens. 1988. - Vol. 6. - P. 405-411.

83. Grabowski M., Brundin P., Johansson B.B. Paw-reaching, sensorimotor, and rotational behavior after brain infarction in rats // Stroke. 1993. - Vol. 24. - P. 889-895.

84. Harris R.C., Soderlund K., Hultman E. Elevation of creatine in resting and exercised muscle of normal subjects by creatine supplementation // Clin. Sci. -1992.-Vol. 83.-P. 367-374.

85. Hartman R.E., Lee J.M., Zipfel G.J., Wozniak D.F. Characterizing learning deficits and hippocampal neuron loss following transient global cerebral ischemia in rats // Brain Res. 2005. - Vol. 1043. - P. 48-56.

86. Hattori K., Lee H., Hum P.D., Crain B.J., Traystman R.J., DeVries A.C. Cognitive deficits after focal cerebral ischemia in mice // Stroke. 2000. - Vol. 31.-P. 1939-1944.

87. Haussinger D., Lang F., Gerok W. Regulation of cell function by the cellular hydration state // Am. J. Physiol. 1994. - Vol. 267. - P. 343-355.

88. Herczeg L., Gorombey S., Vaszily M. Morphological damage to the central nervous system (CNS) following open heart surgery // Forensic Sci. Int. 1996. -Vol. 79№2.-P. 103-111.

89. Hiel H., Happe H.K., Warr W.B., Morley B.J. Regional distribution of a creatine transporter in rat auditory brainstem: An in-situ hybridization study // Hear. Res. -1996.-Vol. 98.-P. 29-37.

90. Hindman В., Todd M. Improving neurologic outcome after cardiac surgery // Anesthesiology. -1999. Vol. 90 №5. - P. 1243-1247.

91. Hirakawa M., Manaka S., Tamura A., Kirino Т., Oka H., Nagashima H., Tahira Y., Sano K. Behavioral changes following focal cerebral ischemia in the rat // Brain Hypoxia. - 1989. - Vol. 3. - P. 11-17.

92. Hsieh C.-L., Hsueh I-P., Chiang F.-M., Lin P.-H. Inter-rater reliability and validity of the Action Research arm test in stroke patients // Age and Ageing. -1998.-Vol. 27. P. 107-113.

93. Hunter A.J., Mackay K.B., Rogers D.C. To what extent have functional studies of ischaemia in animals been useful in the assessment of potential neuroprotective agents? // Trends Pharm. Sci. 1998. - Vol. 19 № 2. - P. 59-66.

94. Ipsiroglu O.S., Stromberger C., Has J., H6ger H., Miihl A., Stockler-Ipsiroglu S. Changes of tissue creatine concentrations upon oral supplementation of creatine-monohydrate in various animal species // Life Sci. 2001. - Vol. 69 № 15. - P. 1805-1815.

95. Ishibashi S., Kuroiwa Т., Endo S., Okeda R., Mizusawa H. Neurological dysfunctions versus regional infarction volume after focal ischemia in mongolian gerbils // Stroke. 2003. - Vol. 34. - P. 1501-1506.

96. Johansson Т., Aren C., Fransson S.G., Uhre P. Intra- and postoperative cerebral complications of open-heart surgery // Scand. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1995. -Vol. 29 №1,-P. 17-22.

97. Kamber M., Koster M., Kreis R., Walker G., Boesch C., Hoppeler H. Creatine supplementation part I: performance, clinical chemistry, and muscle volume // Med. Sci. Sports Exerc. - 1999. - Vol. 31. - P. 1763-1769.

98. Kase C.S., Wolf P.A., Kelly-Hayes M., Kannel W.B., Beiser A., D'Agostino R.B. Intellectual decline after stroke: The Framingham Study // Stroke. 1998. -Vol. 29.-P. 805-812.

99. Kass I.R., Upton P. Mechanisms involved in irreversible anoxic damage to the in vitro rat hippocampal slice // J. Physiol. (L.) 1982. - Vol. 332. - P. 459-472.

100. Katzman R., Brown Т., Fuld P., Peck A., Schechter R, Schimmel H. Validation of a short Orientation-Memory-Concentration Test of cognitive impairment // Am. J. Psychiatry. 1983. - Vol. 140. - P. 734-739.

101. Kekelidze Т., Khait I., Togliatti A., Holtzman D. Brain creatine kinase and creatine transporter proteins in normal and creatine-treated rabbit pups // Dev. Neurosci. 2000. - Vol. 22. - P. 437-443.

102. Kinloch R.A., Trecherne J.M., Furness L.M., Hajimochamadreza I. The pharmacology of apoptosis // TiPS 1999. - Vol. 20. - P. 35-42.

103. Kiyota Y., Miyamoto M., Nagaoka A. Relationship between brain damage and memory impairment in rats exposed to transient forebrain ischemia // Brain Res. -1991.-Vol. 538.-P. 295-302.

104. Krippeit-Drews P., Backer M., Dufer M., Drews G. Phosphocreatine as a determinant of KATP channel activity in pancreatic b-cells // Pflugers Arch./Eur. J. Physiol. 2003. - Vol. 445. - P. 556-562.

105. Kristian Т., Siesjd B.K. Calcium in ischemic cell death // Stroke. 1998. - Vol. 29.-P. 705-718.

106. Laidley D.T., Colbourne F., Corbett, D. Increased behavioral and histological variability arising from changes in cerebrovascular anatomy of the mongolian gerbil // Current Neurovascular Res. 2005. - Vol. 2. - P. 1-7.

107. Lee J.-M., Grabb M.C., Zipfel G.J., Choi D.W. Brain tissue response to ischemia // J. Clin. Invest. 2000. - Vol. 106 № 6. - P. 723-731.

108. LeMay D.R., Gehua L., Zelenock G.B., D'Alecy L.G. Insulin administration protects neurologic function in cerebral ischemia in rats // Stroke. 1988. - Vol. 19. - P. 1411-1419.

109. Liebeskind D.S. Collateral Circulation // Stroke. 2003. - Vol. 34. - P. 22792284.

110. Lichtenwalner R.J., Parent J.M. Adult neurogenesis and the ischemic forebrain // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2006. - Vol. 26. - P. 1-20.

111. Lyle R.C. A performance test for assessment of upper limb function in physical rehabilitation treatment and research // Int. J. Rehabil. Res. 1981. - Vol. 4. - P. 483-492.

112. Lipton P., Whittingham T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus // J. Physiol. 1982.-Vol. 325.-P. 51-65.

113. Loike J.D., Zalutsky D.L., Kaback E., Miranda A.F., Silverstein S.C. Extracellular creatine regulates creatine transport in rat and human muscle cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P. 807-811.

114. Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S., Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats // Stroke. 1989. - Vol. 20. - P. 8491.

115. Lowe T. The role of creatine supplementation in short term exercise and medicine // Nutrition Bytes. -1999. Vol. 5 № 1. - Article 4. / Доступно для скачивания с:http://repositories.cdlib.org/uclabiolchem/nutritionbvtes/vol5/issl/art4.

116. Lynch J.C., Mountcastle V.B., Talbot W.H., Yin T.C.T. Parietal lobe mechanisms for directed visual attention. // J. Neurophys. 1977. - Vol. 40 № 2. -P. 362-389

117. Mackensen G.B., Sato Y., Nellg&rd В., Pineda J., Newman M.F, Warner D.S., Grocott H.P., Cardiopulmonary bypass induces neurologic and neurocognitive dysfunction in the rat // Anesthesiology. 2001b. - Vol. 95. - P. 1485-1491.

118. Mahoney F.I., Barthel D. Functional evaluation: The Barthel Index // Maryland State Medical J. -1965. Vol. 14. - P.: 56-61.

119. Mandel R.J., Gage F.H., Thai L.J. Enhanced detection of nucleus basalis magnocellularis lesion induced spatial learning deficit in rats by modification of training regimen // Behav. Brain Res. 1989. - Vol. 31. - P. 221-229.

120. Marescau В., De Deyn P., Wiechert P., Van Gorp L., Lowenthal A. Comparative study of guanidino compounds in serum and brain of mouse, rat, rabbit, and man // J. Neurochem. -1986. Vol. 46. - P. 717-720.

121. Markgraf C.G., Green E.J., Hurwitz B.E., Morikawa E., Dietrich W.D., McCabe P.M., Ginsberg M.D., Schneiderman N. Sensorimotor and cognitive consequences of middle cerebral artery occlusion in rats // Brain Res. 1992. - Vol. 575. - P. 238-246.

122. Markgraf C.G., Green E.J., Watson В., McCabe P.M., Schneiderman N., Dietrich W.D., Ginsberg M.D. Recovery of sensorimotor function after distal middle cerebral artery photothrombotic occlusion in rats // Stroke. 1994. - Vol. 25.-P. 153-159.

123. Matthews R.T., Yang L., Jenkins B.G., Ferrante R.J., Rosen B.R., Kaddurah-Daouk R., Beal M.F. Neuroprotective effects of creatine and cyclocreatine in animal models of Huntington's disease // J. Neurosci. 1998. - Vol. 18. - P. 156163.

124. Meyer R.A., Sweeney H.L., Kushmerick M.J. A simple analysis of the "phosphocreatine shuttle" // Am. J. Physiol. -1984. Vol. 246. - P. 365-377.

125. Miyake K., Takeo, S., Kajihara H. Sustained decrease in brain regional blood flow after microsphere embolism in rats // Stroke. 1993. - Vol. 24. - P. 415-420.

126. Mogensen J., Pedersen Т.К., Holm S., Bang L.E. Prefrontal cortical mediation of rats' place learning in a modified water maze // Brain Res. Bull. 1995. - Vol. 38.-P. 425-434.

127. M611er A., Hamprecht B. Creatine transport in cultured cells of rat and mouse brain // J. Neurochem. 1989. - Vol.52. - P. 544-550.

128. Morris R.G.M. Spatial localization does not require the presence of local cues // Learning and Motivation 1981. - Vol. 12. - P. 239-260.

129. Morris R.G.M., Garrud P., Rawlins J.N.P., O'Keefe J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions // Nature. 1982. - Vol. 297. - P. 681-683.

130. Morris R. Developments of a water-maze for studying spatial learning memory in the rat // J. Neurosci. Methods. 1984. - Vol. 11. - P.47-60.

131. Morris R.G.M. Synaptic plasticity and learning: Selective impairment of learning in rats and blocade of long-term potentiation in vivo by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist AP-5 // J. Neurosci. 1989. - Vol. 9 №.9. - P. 3040-3057.

132. Morris R.G.M., Anderson E., Lynch G.S., Baudry M. Selective impairment of learning and blockade of long-term potentiation by an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist, AP-5 // Nature. -1986. Vol. 319. - P. 774-776.

133. Mountcastle V.B., Lynch J.C., Georgopoulos A., Sakata H., Acuna C. Posterior parietal association cortex of the monkey: command functions for operations within extrapersonal space. // J. Neurophys. 1975. - Vol. 38 № 4. - P. 871-908

134. Nakashima Т., Tomi M., Katayama K., Tachikawa M., Watanabe M., Terasaki Т., Hosoya K.-i. Blood-to-retina transport of creatine via creatine transporter (CRT) at the rat inner blood-retinal barrier // J. Neurochem. 2004. - Vol. 89. -P. 1454-1461.

135. Nallet H., MacKenzie E.T., Roussel S. The nature of penumbral depolarizations following focal cerebral ischemia in the rat // Brain Res. 1999. - Vol. 842. - P. 148-158.

136. Nicotera P., Leist P., Manzo L. Neuronal cell death: a demise with different shapes // TiPS. 1999. - Vol. 20. - P. 46-51.

137. Numagami Y., Ohnishi S.T. S-allylcysteine inhibits free radical production, lipid peroxidation and neuronal damage in rat brain ischemia // J. Nutr. 2001. - Vol. 131.-P. 1100-1105.

138. Nunn J.A., LePeillet E., Netto C.A., Hodges H., Gray J.A., Meldrum BS. Global ischaemia: hippocampal pathology and spatial deficits in the water maze // Behav. Brain Res. 1994. Vol. 62 № 1. - P. 41-54.

139. Olsen M., Scheel-Kruger J., Moller A., Jensen L.H. Relation of spatial learning of rats in the Morris water maze task to the number of viable CA1 neurons following four-vessel occlusion // Behav. Neurosci. 1994. - Vol. 108. - P. 681690.

140. Orgogozo J.M., Capildeo R. Development of a neurological score for clinical evaluation of infarctions in the Sylvian territory // Presse Med. 1983. - Vol. 12 №48-P. 3039-3044.

141. Pantoni L., Bartolini L., Pracucci G., Inzitari D. Interrater agreement on a simple neurological score in rats // Stroke. 1998. - Vol. 29. - P. 871-872.

142. Paradiso S., Chemerinski E., Yazici K.M., Tartaro A., Robinson R.G. Frontal lobe syndrome reassessed: comparison of patients with lateral or medial frontal brain damage // J. Neurol Neurosurg. Psychiatry. 1999. - Vol. 67 - P. 664-667.

143. Pardridge W.M. Blood-brain barrier drug targeting: the future of brain drug development // Molecular Interventions. 2003. - Vol. 3 Iss. 2. - P. 90-105.

144. Parodi M., Rebaudo R., Perasso L., Gandolfo C., Cupello A., Balestrino M. Effects of exogenous creatine on population spike amplitude and on postanoxic hyperexcitability in brain slices // Brain Res. 2003. - Vol. 963. - P. 197-202.

145. Pellegrino L.G., Cushman A.J. A stereotaxic atlas of the rat brain // N.-Y.: Appleton-Century-Crofts, 1967. p. XX.

146. Perasso L., Cupello A., Lunardi G.L., Principato C., Gandolfo C., Balestrino M. Kinetics of creatine in blood and brain after intraperitoneal injection in the rat // Brain Res. 2003. - Vol. 974 № 1-2. - P. 37-42.

147. Persky A.M., Brazeau G.A. Clinical pharmacology of the dietary supplement creatine monohydrate // Pharm. Rev. 2001. - Vol. 53. № 2. - P. 161-176.

148. Pulsinelly W.A., Brierley J.B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat // Stroke. 1979. - Vol. 10. - P. 267-272.

149. Pulsinelli W.S., Waldman S., Rawlinson D., Plum F. Moderate hyperglycemia augments ischemic brain damage: A neuropathologic study in the rat // Neurology (NY). 1982. - Vol. 32. - P. 1239-1246.

150. Pulsinelli W.A., Duffy Т.Е. Regional energy balance in rat brain after transient forebrain ischemia // J. Neurochem. 1983. - Vol. 40 № 5. - P. 1500-1503.

151. Rankin J. Cerebral vascular accidents in patients over the age of 60 // Scott. Med. J. 1957. - Vol. 2. - P. 200-15.

152. Rauchova H., Koudelova J., Drahota Z., Mourek J. Hypoxia-induced lipid peroxidation in rat brain and protective effect of carnitine and phosphocreatine // Neurochem. Res. 2002. - Vol. 27 № 9. - P. 899-904.

153. Ren J.M., Semenkovich C.F., Holloszy J.O. Adaptation of muscle to creatine depletion: effect on GLUT-4 glucose transporter expression // Am. J. Physiol. -1993.-Vol. 264.-P. 146-150.

154. Righetti E., Celani M.G., Cantisani T.A., Sterzi R., Boysen G., Ricci S. Glycerol for acute stroke // Stroke. 2004. - Vol. 36. - P. 171-172.

155. Roof R.L., Schielke G.P., Ren X., Hall E.D. A comparison of long-term functional outcome after 2 middle cerebral artery occlusion models in rats // Stroke. 2001. - Vol. 32. - P. 2648-2657.

156. Rooney K.B., Bryson J.M., Digney A.L., Rae C.D., Thompson C.H. Creatine supplementation affects glucose homeostasis but not insulin secretion in humans // Ann. Nutr. Metab. 2003. - Vol. 47. - P. 11-15.

157. Saks V.A., Rosenshtraukh L.V., Smirnov V.N., Chazov E.I. Role of creatine phosphokinase in cellular function and metabolism // Can. J. Physiol. Pharmacol. -1978.-Vol. 56.-P. 691-706.

158. Save E., Moghaddam M. Effects of lesions of the associative parietal cortex on the acquisition and use of spatial memory in egocentric and allocentric navigation tasks in the rat // Beh. Neurosci. -1996. Vol. 110 № 1. - P. 74-85.

159. Schenk F. The Morris water maze (is not a maze) // A handbook of spatial research paradigms and methodologies. Vol. 2. Clinical and Comparative Studies / Eds. Foreman N., Gillett R. East Sussex: Psychology Press, 1998. - P. 145-188.

160. Schloss P., Mayser W., Betz H. The putative rat choline transporter CHOT1 transports creatine and is highly expressed in neural and muscle-rich tissues // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol. 198. - P. 637-645.

161. Shaaban A.M., Harmer M., Vaughan R.S., Dunne J., Latto I.P. Early release pattern of SI00 protein as a marker of brain damage after warm cardiopulmonary bypass // Anaesthesia. 2000. - Vol. 55 № 8. - P. 802-806.

162. Scandinavian Stroke Study Group. Multicenter trial of hemodilution in ischemic stroke background and study protocol // Stroke. - 1985. - Vol. 16 № 5. - P. 885890.

163. Scheff S.W., Dhillon H.S. Creatine-enhanced diet alters levels of lactate and free fatty acids after experimental brain injury // Neurochemical Res. 2004. - Vol. 29 №2.-P. 469-479.

164. Schmidt-Kastner R., Paschen W., Grosse Ophoff В., Hossmann K.-A. A modified four-vessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in rats // Stroke. 1989. - Vol. 20. - P. 938-946.

165. Semenza G.L. Tissue ischemia: pathophisiology and therapeurics // J. Clin. Invest 2000. - Vol. 106 №5. - P. 613-614.

166. Smith M.-L., Auer R.N., Siesjo E. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia // Acta Neuropathol. -1984a.-Vol. 64.-P. 319-332.

167. Smith M.-L., Bendek G., Dahlgren N„ Rosen I., Wieloch Т., Siesjo B.K. Models for studying long-term recovery following forebrain ischemia in the rat. 2. A 2-vessel occlusion model // Acta Neurol. Scand. 1984b. - Vol. 69. - P. 385-401.

168. Snow R.J., McKenna M.J., Selig S.E., Kemp J., Stathis C.G., Zhao S. Effect of creatine supplementation on sprint exercise performance and muscle metabolism // J. Appl. Physiol. 1998. - Vol. 84. - P. 1667-1673.

169. Snow R.J., Murphy R.M. Creatine and the creatine transporter: A review // Molecular and Cellular Biochemistry.-2001.-Vol. 224.-P. 169-181.

170. Speer O., Neukomm L.J., Murphy R.M., Zanolla E., Schlattner U., Henry H., Snow R.J., Wallimann T. Creatine transporters: a reappraisal // Mol. Cell. Biochem. 2004. - Vol. 256-257. - P. 407-424.

171. Speiser Z., Mayk A., Eliash S., Cohen S. Studies with rasagiline, a MAO-B inhibitor, in experimental focal ischemia in the rat // J. Neural Transm. 1999. Vol. 106. - P. 593-606.

172. Squire L.R., Zola-Morgan S. The medial temporal lobe memory system // Science 1991. - Vol. 253. - P. 1381-1387.

173. Squire L.R. Memory and the hippocampus: A synthesis from findings with rats, monkey, and humans // Psychol. Rev. 1992. - Vol. 99 № 2. - P. 195-231.

174. Squire L.R., Zola S.M. Structure and function of declarative and nondeclarative memory systems // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 1351513522.

175. Stamou S.C. Stroke and encephalopathy after cardiac surgery: the search for the holy grail // Stroke. 2006. - Vol. 37. - P. 284-285.

176. Stevens W.D., Fortin Т., Pappas B.A. Retinal and optic nerve degeneration after chronic carotid ligation. Time course and role of light exposure // Stroke. 2002. -Vol. 33.-P. 1107-1112.

177. Stroemer R.P., Kent T.A., Hulsebosch C.E. Enhanced neocortical neural sprouting, synaptogenesis, and behavioral recovery with D-amphetamine therapy after neocortical infarction in rats // Stroke. 1998. - Vol. 29. - P. 2381-2395.

178. Stroke therapy academic industry roundtable (STAIR) / Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development // Stroke. 1999. - Vol. 30. - P. 2752-2758.

179. Sundt T.M., Grant W.C., Garcia J.H. Restoration of middle cerebral artery flow in experimental infarction // J. Neurosurg. 1969 - Vol. 31. -P. 311-322.

180. Tachikawa M., Fukaya M., Terasaki Т., Ohtsuki S., Watanabe M. Distinct cellular expressions of creatine synthetic enzyme GAMT and creatine kinazes

181. UCK-MI and CK-B suggest a novel neuron-glial relationship for brain energy homeostasis // Eur. J. Neurosci. 2004. - Vol. 20. - P. 144-160.

182. Tolman E.C. Cognitive maps in rats and men // Psychol. Rev. 1948. - Vol. 55 №6.-P. 189-209.

183. Tominaga Т., Ohnishi S.T. Interrelationship of brain edema, motor deficits, and memory impairment in rats exposed to focal ischemia // Stroke. 1989. - Vol. 20. -P. 513-518.

184. Traystman R. J. Animal models of focal and global cerebral ischemia // ILAR Journal. 2003. - Vol. 44 № 2. - P. 85-95.

185. Vallar G., Bottini G., Sterzi R. Anosognosia for left-sided motor and sensory deficits, motor neglect, and sensory hemiinattention: is there a relationship? // Progr. Brain Res. 2003. - Vol. 142. - P. 289-301.

186. Van Leemputte M., Vandenberghe K., Hespel P. Shortening of muscle relaxation time after creatine loading // J. Appl. Physiol. 1999. - Vol. 86. - P. 840-844.

187. Voll C.L., Whishaw I.Q., Auer R.N. Postischemic insulin reduces spatial learning deficit following transient forebrain ischemia in rats // Stroke. 1989. -Vol. 20.-P. 646-651.

188. Volpe B.T., Hirst W. The characterization of an amnesic syndrome following hypoxic ischemic injury // Arch. Neurol. 1983. - Vol. 40. - P. 436-440.

189. Volpe B.T., Pulsinelli W.A., Tribuna J., Davis H.P. Behavioral performance of rats following transient forebrain ischemia // Stroke. 1984. - Vol. 15 № 3. - P. 558-562.

190. Vuilleumier P. Anosognosia: the neurology of beliefs and uncertainties // Cortex. 2004. - Vol. 40. - P. 9-17.

191. Walker J. Creatine: Biosynthesis, regulation, and function // Adv. Enzym. -1979.-Vol. 50.-P. 117-242.

192. Wallimann Т., Schlattner U., Guerrero L., Dolder M. The phosphocreatine circuit and creatine supplementation, both come of age! // Mori A., Ishida M., Clark J.F. (eds.) Guanidino compounds. Australia: Blackwell Science Asia, 1994. -P. 117-129.

193. Ward N., Brown V., Sharkey J. Assessment of sensorimotor neglect after occlusion of the middle cerebral arteiy in the rat // Behav. Neurosci. 1997. -111.-P. 1133-1145.

194. Warner D.S., Reasoner D.K., Todd M.M., McAllister A. Secondaiy hypotensive insults in a rat forebrain ischemia model // Brain Res. 1990. - Vol. 36. - P. 176182.

195. Warner D.S., Todd M.M., Dexter F., Paula Ludwig P., McAllister A.M. Temporal thresholds for hyperglycemia-augmented ischemic brain damage in rats // Stroke. 1995. - Vol. 26. - P. 655-660.

196. Watson B.D., Dietrich W.D., Busto R., Wachtel M.S., Ginsberg M.D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis // Ann. Neurol. -1985. Vol. 17. - P. 497-504.

197. Weinstein P.R., Anderson G.G., Telles D.A. Neurological deficit and cerebral infarction after temporary middle cerebral artery occlusion in unanesthetized cats // Stroke. 1986. - Vol. 17. - P. 318-324.

198. Whishaw I.Q., Mittleman G., Bunch S.T., Dunnett S.B. Impairments in the acquisition, retention and selection of spatial navigation strategies after medial caudate-putamen lesions in rats // Behav. Brain Res. 1987. - Vol. 24. - P. 125138.

199. Wilken В., Ramirez J.M., Probst I., Richter D.W., Hanefeld F. Creatine protects the central respiratory network of mammals under anoxic conditions // Pediatr. Res. -1998. Vol. 43 № 1. - P. 8-14.

200. Wilken В., Ramirez J.M., Probst I., Richter D.W., Hanefeld F. Anoxic ATP depletion in neonatal mice brainstem is prevented by creatine supplementation // Arch. Dis. Child Fetal Neonatal. Ed. 2000. - Vol. 82. - P. 224-227.

201. Willott C.A., Young M.E., Leighton В., Kemp G.J., Boehm E.A., Radda G.K., Clarke K. Creatine uptake in isolated soleus muscle: Kinetics and dependence on sodium, but not on insulin // Acta Physiol. Scand. -1999. Vol. 166. - P. 99-104.

202. Wright J.W., Masino A.J., Reichert J.R., Turner G.D., Meighan S.E., Meighan P.C., Harding J.W. Ethanol-induced impairment of spatial memory and brain matrix metalloproteinases // Brain Research. 2003. - Vol. 963. - P. 252-261.

203. Wright J.W., Stubley L.A., Pederson E.S., Кгаша E.A., Hanesworth J.M., Harding, J.W. Contributions of the brain angiotensin IV-AT4 receptor subtype system to spatial learning // J. Neurosci. -1999. Vol. 19 № 10. - P. 3952-3961.

204. Wyss M., Kaddurah-Daouk R. Creatine and creatinine metabolism // Physiol. Rev. 2000. - Vol. 80 - P. 1107-1112.

205. Wyss M., Schulze A. Health implications of creatine: can oral craetine supplemintation protect against neurological and atherosclerotic disease // Neuroscience. 2002. - Vol. 112 № 2. - P. 243-260.

206. Xu J., Culman J., Blume A., Brecht S., Gohlke P. Chronic treatment with a low dose of lithium protects the brain against ischemic injury by reducing apoptotic death // Stroke. 2003. - Vol. 34. - P. 1287-1292.

207. Xu C.J., Klunk W.E., Kanfer J.N., Xiong Q., Miller G., Pettegrew J.W. Phosphocreatine-dependent glutamate uptake by synaptic vesicles. A comparison with ATP-dependent glutamate uptake // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271 - P. 13435-13440.

208. Yager J.Y., Kala G., Hertz L., Juurlink B.H.J. Correlation between content of high-energy phosphates and hypoxic-ischemic damage in immature and mature astrocytes // Brain Res. Dev. Brain Res. 1994. - Vol. 82. - P. 62-68.

209. Yonemori F., Yamada H., Yamaguchi Т., Uemura A., Tamura A. Spatial memory disturbance after focal cerebral ischemia in rats // J. Cereb. Blood Flow Metab. -1996. Vol. 16. - P. 973-980.

210. Yonemori F., Yamaguchi Т., Yamada H., Tamura A. Spatial cognitive performance after chronic focal cerebral ischemia in rats // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1999. - Vol. 19 № 5. - P. 483-494.

211. Zhang L., Schallert Т., Zhang Z.G., Jiang Q., Arniego P., Li Q., Lu M., Chopp M. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia // J. Neurosci. Meth. 2002. - Vol. 117. - P. 207-214.

212. Ziegenfuss T.N., Lowery L.M., Lemon P.W.R. Acute fluid volume changes in men during three days of creatine supplementation // J. Exerc. Physiol. 1998. -Vol. l.-P. 1-14.

213. Zola-Morgan S., Squire L.R., Amaral D.G. Human amnesia and the medial temporal region: Enduring memory impairment following a bilateral lesion limited to field CA1 of the hippocampus // J. Neurosci. 1986. - Vol. 6. - P. 2950-2967.

Информация о работе

Муровец, Владимир Олегович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Исследование протективного и лечебного действия креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы