Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование первичной структуры митохондриального генома американской норки и анализ филогении семейства куницеобразных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование первичной структуры митохондриального генома американской норки и анализ филогении семейства куницеобразных"

всесоюзный научно-исследовательский институт

разведения и генетики сельскохозяйственных животных

На правах рукописи

КОВАЛЕНКО Сергей Александрович

УДК 575.113:576.316:599.742.4

ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ М ИГОХО НД Р ИАЛ Ь НО ГО ГЕНОМА АМЕРИКАНСКОЙ НОРКИ И АНАЛИЗ ФИЛОГЕНИИ СЕМЕЙСТВА КУНИЦЕОБРАЗНЫХ

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

с.-петербург—пушкин 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения и генетики сельскохозяйственных животных г. Пушкина.

Научные руководители — доктор биологических наук, профессор, лауреат премии Совета Министров СССР А. Ф. Яковлев; кандидат биологических наук В. П. Терлецкий.

Научный консультант — кандидат медицинских наук С. Н. Федоров.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Т. Б. Казакова; кандидат биологических наук, доцент Л. Н. Миронова.

Ведущая организация — Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова. АН СССР.

час. на заседании Специализированного совета Д 020.07.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения и генетики сельскохозяйственных животных.

Адрес института: 189620, С.-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55.

С диссертацией можно ппнякгшнтып и библиотеке ВНИИРГЖ.

Защита диссертации состоится « »

1991 г. в

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор с.-х. наук, профессор

Ж. Г. Логинов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ¿HXXâ№BQSIh Теш Все генетические детерминанты признаков и свойств высших организмов неразрывно связаны с Л®?, расположенной как в ядре, так и в других ДНК-содержаших структурах.

•л

Обнаружение у митохондрия собственного генетического материала - »игохопдриалъпоя ДНК явилось новым направлением в исследованиях по информационной организации клетки.

Несмотря на то, что в изучении структурной организации и функционирования митохондриального генома достигнуты значительный успехи, много« еще остается невыясненным. Это касается вопросов изучения структурной организации и экспрессии большего количества рээличшх мигохондриалышх геномов,изучения Филогенетических отношений между раличными монофилетичэскими группами организмов, на основе применения методов анализа митохондриэлъяоя ДНК.

В ходе развития молекулярно-геяотических методов, применительно к ускорении) селекционного процесса в звероводстве, становится необходимым изучение структурных характеристик митохондриального генома американской норки - вида, широко разводимого в промышленном звероводстве, а также эволюционных взаимоотношения в семоистве куницэобразных и вне его между различными монофилотичоскими группами позвоночных. "Зт данные, по нашему мнению, были бы полезны для прогнозирования результатов гибридологического анализа, осуществляемого между видами семейства mu-sl»iida®, а также для уточнения позиция монофилэти-ческих групп семейства в системе классической таксономии.

Основной целью нашей работы являлось изучение пэрвичяой структуры и Филогенетических отношения митохондриального генома американской норки м.Lutreoia vison и некоторых представителей семейства кунице ифазных.

Е лшггнш задали входило:

1.' Изучение первичной структуры мигохондриалыюй Д1Ш американской норки посредством методов рострикццоиного анализа, Физического картирования, секнеянрованля и Саузерн-Слочтиига.

2. Выярлаииэ возможного наличия копий мтДНК американской норки в ее ядерном геноме.

3. Анализ аволяционных взаимоотношении американской норки и различных груш позвоночных на основе опродэлонил прошита гомологии нуклаотидных и аминокислотных последовательностей митохондриальных тонов ци гохром-окгащазы 2 субъадиници и цитохрома С.

Изучение Филогенетических вэимоотношьний внутри семейства кушшэобраэных, посредством метода Саузерн-Олоттшга.

5. Выявление возможности использования олигонуклоотидаого зонда(САС>5 при получении Фингерпринтинга ДШС в изучении генома куницэобразнъи.

ИйМШШ шгшяа-Впервые определен размер и структура генома митохондрий и раработаны его Физическая и генетическая карш. У темео-коритаевол порода выявлено 2 тача китохондризлыюа Д!1К при обработке растриктазои ВапЛ I.

Впервые определена полная нукдеотидная последовательность генов цитохром-оксидазы и и цитохрома В американском норки, установлен размер и степень повторяемости повторов, псиошдромов и содержание ГЦ-пар.

01федалэяа гомология но этим генам, между различными видами позвоночных,а также внутри семейства куяицас'бразных на основе анализа нуклоотвдных и аминокислотных последовательностей, использования гибридизации с зондом митохондриальной ДНК американская норки. На основе определенного процента гомологии построены ряда дивергенции и еддитиышэ деравъя, показывающий эволюционные рззимоотношенмя рассмотренных видов.

Показано посредством метода гибридизации нуклеиновых кислот наличие копий мтДШС в ядерном гономе.

Выявлена возможность использования олигонуклеотидного зонда (CAC)g для получения Фингерпригпшга ДШ куницробрззных.

Полученные данные могут быть полезны при Гибридизации животных и при уточнении позиций в системе классической таксономии йрзошра и Шт иботы Диссертация состоит из трех частей разделенных на главы и параграфы, а тэюга введения, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы с 19(5 названий, из них .166 иностранных^. Общий объем работы 144 страницы, включая 14 таблиц и 34 рисунка.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом исследований служила миггохоняриэдьная и тотальная Д}!К, выделенная из животных, принадлежащих к одному га под-сомоиств куницообрэзных Mu4t,*i 1па-»:оврогюйскал норка Must<.i»cLut.

riólas luir e-ola L. /зМорИКЭНСКаЯ НОрКЭ M. CLutreoJaD vison,ЧерНЫЙ хорек M. CPutorl usJputorlui L. .КОЛОНОК M. CKolenocus^slblr 1 ca p. СОЛОИГОЯ M. CHust-<«liO<?rmjn~a L. ,ПвреВЯЗКЗ Vormela pi?regusna G. ,

ласка m. с mus t«-i лэ nivalis l. Все животные, кроме американской порки и ласки, получены из экспериментальной базы Биологического института СО АН СССР. Пробы печени американской норки доставлены из совхоза "Юглэ" Зяеропрома Латвии, а пробы крови лэски га Вотского и Ленинградского зоопарков.Средний возраст животных составляет 10-18 месяцев.

Еьщ&шша митохондриальяои ДЩ проводили по методу Зиммерма

на CZlmmorman »t. al. ,19803 С Н9К0Т0рЫМИ МОДИФИКЗЦИЯМИ.РЭЗМвр ДНК

оценивали по подвижности при электрофорезе в 1« агэрозном геле относительно ПОДВИЖНОСТИ ДНК «rara X CFangman,1978 5,

ЙШй ДНК выделяли по методу cvmu et.ai. 1988 ;>.

Ш132МИШШ2 ДЩ по методик© щелочного ЛИЭИСЭСВ1 rnbol m,DoJ 11, 19793

Мдчеявд ДШ применяя 32Р проводили по методу ник-чрансляции ск^аьу ,1977 ) и с помощью олигонуклаотидноа эатрапки.

ШЦЩЧШЖ Фрагментов митохондриальной ДНК осуществляли в плаамидном векторе рвкэаг стандартным методомсМаниэтио и дрЛ975э . Ш/ЖШ*ШЗЩШШШЯ выполнена по методу Саузерна г&эиъьет,197£> Олигонуклоотидаыя зонд (САС)^ используемый в финг ерлринтинге МЭТИЛСЯ ПО методу СЬагзэоп et.nl. . 198£Р .

Фигогенетичвскде лареш построено по методу Хвнниягас ».а* п

•С. «1. ,10835 на основе признаков, отобранных ш принципу совместимости с ЕэтЫсок, »с На, г1 я, 1980, , ОМЭЛЬЯЯЧуК.КОЛГаНОВ, 1865 Э СхйЙ&ГйНйЫШ! обработка данных сенвенировании, рестрикции и ГиЙридиэзции проводилась с использованием компьютера си 1 »»».и, м-Еэо и пакета программ по анализу первичной структуры ДНК.

3. РЕЗУЛЬШЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Изучение трвичнон структуры мтДНК норки 3.1.1. Физическое картирование Поставленная нами задача исследования первично» структуры

митох ондриального генома американской норки требовала прежде всего провести Физическое картирование мтДНК. После необходимой оптимизации условии выделения мтДНК и рестрикции для каждой из 15 используемых ростриктаз, проведан гидролиз, в результате которого было определено число сайтов рестрикции и размеры полученных Фрагментов (табл.1>. Общая длина молекулы мтДНК американс-скои норки оказалась равной примерно 16402 пар оснований.

В процэсса исследования оказалось, что при обработке мтДНК серебристо-голубой порода рестрикгазой Ватш, выявлялось только два Фрагмента длиной 8,86 и 7,44 тыс.п.н., т.е. это обозначенный нами тип А мтДНК. В аналогичном случав с темно-коричневои породой выявлялось два типа мтДНК - вышеуказанный тип А и тип В, в котором выявлялось 3 Фрагмента длиной 8,9; 5,42; 2,05 т.п.о,

т

Причем из 20 животных сорэбристо-голубай порода все

тот тип А, а в случае с темно-коричнев.:« породой из 20

шшотных 15 имели тип В, а остальные Б - тип А.

Выявленное в результате анализа существование двух типов мт л-

ДШ{ Указывает на наличие полиморфизма внутри вида Lutreoia vison.

Таблица 1

Количество сайтов рестрикции и дмнэ Фрагментов иггДНК американской иорки

Рестрикционлые эндонуклеазы Число сайтов рестрикции Длина 4-рзгментов, т.п.н.

BamHI (ТИП А) 2 8,95 7,44

(ТИП В) 3 ' 8,00 5,42 2.05

EeoRI 3 8.25 4,01 3,44

EcoRV . a . 8,74 7,65

Hindi 11 3 10,05 3,55 2,87

PvuII 2 8,89 7,50

Avail 4 8,45 3,02 2,68 2,25

BstEII Э 8,69 ß,58 1,18

ilpal 6 8,13 3,4ß 2,23 1,43 0,57 0,52

Sael 2 12,98 3.44

Ha »II 3 7,59 6,94 1,95

HincII 6 4,10 3,85 3,47 2,29 1,58 1,08

PslI.Sail.Smal.Xbal 0

По данным других исследователей 3 типа выявлено у мтДНН коров CWatanah* »l.al. , 19893 ПО рвСТрИКТаЗв »ind III И ДОЭ ТИПЭ ПО рестриктазе BamH I,Bgl II, Pst I И Seal, а у мтДНК свиней было обнаружено доэ типа молекул по рестриктазе agi n.saci и stui

С Watanabe, . i

Проанализировав полученные результаты и принимая во вниманий то, что Tim А мтДНК выявлен у обоих исследуемых пород норок, была поставлена задача проклонироьать митохондриалъиую ДНК типа А с целью накопления-ее в препаративных количествах для дальнейшего рестрикционного анализа, а также для последующих процедур секвенирования.

В качестве вектора была выбрана плазмида рвкзгг, при этом учитывало«, наличие уникального сайта рестрикции для рестриктазы ватш в геноме плазмида, локализованного в области гена.чувствительности к тетрациклину , что позволило провести скрининг клонов со вставками на средах,содержащих соответствующий антибиотик.

При построении Физической карги использовали метод двойного расщепления с последующей статистической обработкой результатов, используя метод совместимости.

Физические карты мтДНК построены практически для всех видов животных, в том числе и для человека. При сравнении построенной нами Физической vcapra с литературными данными было отмечено частичное совпадение в разных сочетаниях ¡»стрюстаз и локализациях сайтов рестрикции. Так обнаружено неполное совпадение по Z рестриктазам карты норки с картой мтДНК свиньи и мыши, одно совпадение по 3 рестриктазам с Физической картов митохондриаль-ного генома коровы. Эти данные были использовании нами для выяснения Филогенетических отношения мевду этими видами,т.к. известно, что посредством анализа карт рестрикции моишо исследовать ОБОЛЗОЦИОННУЮ близость ГОНОМОВ с Tel.,pie ton, 1S83, Waterman, 1S84 . Hal m-Oychowski , Wi 1 son, 1986 5 .

3.1.2. Секвйыираваниэ мтДНК порки Дальнейшим этаном изучения первичной структуры мтДНК норки „был процесс определения нуклеотидпои последовательности мтДПК и локализации ренов на уже построенной Физической карте, учитывая Т

структурную консервативность митохйндршлъного генома позвоночных, применение двух методов секвепировэшя позволило значительно дополнить свои данные по первичной структуре мтДНК норгоь В результате, были просеклонировэлы два гена сои и сут в размером 283 п.о. и п.о.соответственно.Определенные в результате сек-вонировзния и дальнейшего статистического анализа рострикционные сайты для большинства из 32 ростриктаз совпадают с ранее установленными посредством Физического картирования.

Следовательно,знал место расположения сайтов рестрикции для ватн i в генах сои и сут в .порядок расположения гонов в геноме млекопитающих и учитывая их структурную консервативность можно с большой степенью достоверности определить локализацию остальных генов.Это было нами сделано и выразилось в виде генетической кар ты мтДНК американской норки.сРис.1 з

Рис.1 Генетическая карта мтДНК американской норки Проведя работу по Физическому картированию, сектенированию

и локализации генов стало возможным более детально исследовать первичную структуру мтДНК американской норки. Кигохондриальная ДНК позвоночных относится к АТ-типу. Наименьшее содериание ГЦ-пар имеет мтДНК дрозофилы(около 20%), наибольшее - мтДНК костистых рыб и птиц около 50%).

Нашими исследованиями было определено, что для гена сои . содержание ГЦ-пар составляет 38,23!, а для гена cytB мтДНК порки он равен 44,6Í.

Сравнивая процент содержания ГЦ-пар у различных животных надо отметить,что у американской норки процент содержания совпадает по гену сои с мышью и крысой, а по гену cytu со шпорцэвов лягушкой и быком.

В настоящей работе мы исследовали гены сои и cyte на наличие в них повторяющихся последовательностей. Было выявлено: по гену сои - всего 187 повторов длиной от 3 до 7 нуклеотидов и с разной степенью повторяемости от 2 до 10 раз; по гену cyte - всего 141 повтор длиной от 3 до 7 нуклеотидов и с повторяемостью от 2 до 11 раз.

В ходе исследования были выявлены полиндромные последовательности, о существовании которых упоминал в своих работах Кобаяши (Kobayasi, м i seo). Было обнаружено в гене coi i всего 59 полиндрома дайной от З до 9 нуклеотидов, а в гене cyto всего 44 полиндрома длиной от 3 до 11 нуклеотидов.

Учитывая своеобразие аппарата трансляции митохондрий при изучении аминокислотных последовательностей ■ генов сои и cytb мтДНК норки, мы вычислили пропэнты использования кодонов в этих генах,показали локализацию кодонов инициации и термшшции трансляции и молекулярный вес, образующихся при этом Фрагментов,при „анализе последовательностей учитывался сдвиг рамки считывания.

Оказалось,что .в о'елко сои наибольший процент занимает амино-

кислота азп 9.6Ж, кодируемая кодовом сси, а в белке су1ь - ти-ронин - 6,8? кодируемой кодовом ас.с. Совсем не присутствует в обеих полипептадах аминокислота вэлин и глицин.Кроме того, выявилось, что синтез белковой молекулы генов сои и су1в осуществления посредством образования предварительно трех промежуточных продукта, но первой и третьей рамки считывания. Если оцэнивать результаты по второй рамке, то количество промежуточных продуктов различалось у этих генов. В случае . с геном сои их было двенадцать, а у гена оу1 в только четыре.

Детальный анализ секвенированных нами последовательностей митохондриалъных генов сои и сую американской норки позволил рассчитать молекулярные массы соответствующих полиполтидов. Они оказались равными 24,3 и 20,8 кД соответственно. Исследованиями многих авторов определены молекулярные массы этих политптидов методом электрофореза в лоллэкриламидном геле с додедалсульфатом-натрия (Kj.tahara.i9e3) Оказалось, что полученные при этом величины имеют значительно меньшие значения примерно на 10 и 1556 от данных, полученных на основании секвенированил нуклеотидяьгх последовательностей и последующем переводе в аминокислотные.

Существует много объяснений по поводу этих различий. В основном авторы, публикаций сходятся на необычности вторично» структуры этих полипептидов,вследствие чего их подвижность при электроФоретическом разделении в геле в денатурирующих условиях усиливается и молекулярные массы оказываются высокими.

Исходя из исключительной роли анализа мтДДО для эволюционных исследований мы попытались изучить эволюционные вэзимо-отаошения различных видов позвоночных основе анализа первичной и вторичной структуры митохондриалышх генов цитохром -оксидазы 2 субъедгашцы и штгохрома В.

В кода апалиэа ны сопоставит« пугслэ отнят» последоввтелъно-

-д-

ста исследуемых генов у шести видов позвоночных: американской ( норки, чвлоьэка, коровы, мши, крысы и шпорцевой лягушки.

Полученные резул>таты мы вывели в таблице 2 в виде процента гомологии нуклеотидных последовательностей генов цитохрома В и 2 субъединицы цитохром-оксидазы. Тщательно проанализировав данные таблицы, мы построили ряды дивергенции в порядке убьгоания процента гомологии. Аналогичная процедура была проведена и с аминокислотными последовательностями этих видов, предполагаемых на основ© секвенированных генов сои и cyte.

Учитывая отличия генетического кода митохондрий от универсального вычислен процент гомологии между рассматриваемыми вида-'ми,и построены ряда дивергенций. Надо отметить,что процент гомологии,вычисленный на основе сравнения аминокислотных последова-бтельностей оказался выше, чем рассчитанный по нуклеотицным последовательностям. Это можно объяснить вырожденностью генетического кода,в большинстве случаев замены оснований в третьем положении кодонов не отражаются на аминокислотной последовательности.

Таблица 2

Процент гомологии пуклеотидных последовательностей генов COÎI И CYTB У различных ВИДОВ ПОЗВОНОЧНЫХ L- Lutreol» vison. H- Homo sapiens, В- Bos taurus. M- Mus musculus, R- Rattus norveglcus, X- Xenopus laevi*.

цитохром В

L il В ' M R X

L as.ei 01 ,09 es, 32 63, ,oe 57,21

H B0.78 B1 .54 71 ,37 73, ,23 BS, 32

В 73,27 BB.90 64,23 ев,oe 56,11

M 74,91 72,79 77,39 80, ,вэ 67,37

R 7B, 33 71 ,02 82,09 84,81 ..... 07,12

X eo, ce 87, ÁO 71 ,ЭВ 7Э.Н 71 , ,7Э

цитохром-оксидазы 2

Таблица 3

Процент гомологии аминокислотных последовательностей генов СОИ и CYTB у различных ВИДОВ ПОЗВОНОЧНЫХ L- Lutreola vison, H- Homo sapiens. В- Bos taurus, M- Mus musculus, R- Rattus norvegicus, X~ Xenopus laevis.

цитохром В

L H В M R X

L 78,13 SO, 71 70,34 79,34 67,17

H 71 ,га ей, 65 77, ва 04. вг 69, SO

В ээ.ег 7Э, Ю 73,07 73, ВО 60,21

H SI , 4S 70,31 02. S3 91 .67 76,бО '

R S1 , 48 74,47 ез. вг ss.ei 70.7Е5

X 73, ЭЗ еэ,15 70, во 76, 40 73, S3

цитохро~оксвдаза2

Анализируя ряда дивергенций. построенные на основе обеих анализов, можно отметить некоторое различие в местоположениях некоторых видов.

Так при детальном сравнении рядов дивергенций, построенных на основе сравнения нунлеотидаых последовательностей генов сои и су<.Б. выявилось, что если судить по гену сои, то норка ближе всего к крысе, • а затем уже к корове и мыши и дальше всего человек. А во втором случае, т.е. по гену суьв, норка ближе к. мши затем к крысе, человеку и корове, хотя надо отметить, что грызуны держатся особой монофклэтичоской группой.

Анализируя положение этих видов на основе сравнения аминокислотных последовательностей, следует отметить, что в этом случай норка ближе всего к корове, а потом ух® к группе грызунов и к ксенонусу.

Расхождение результатов Филогении генов сои и суъэ в

ТУ

пределах одного рода анализов, например, на основе нуклеотидаых , последовательностей, можно объяснить, видимо, разной скоростью нуклеотидных замечаний, а отличил м«жду разными видами объясняются вырожденностью генетического кода.

Обращает на себя внимание тот Факт, что по анализу нуклео-тащных аминокислотных последовательностей »человек и корова имеют такую гомологию и во всех позициях эта вида расположены полярно.

Хотя по данным некоторых авторов(ОмельянчукЛ985; bishop and Friday, 1SOQ3 картина взаимоотношении этих видов несколько иная, однако, они находятся на более близком расстоянии друг от друга.

Проанализировав результаты сравнения нуклеотидных последовательностей митохондриэльных генов con и cyte мы определили причины различия в гомологиях рассматриваемых видов позвоночных Были рассмотрены два вида замещении: транзиции и трансверсии в парных отношениях норки с'друхими видами. По гену сои наибольшее количество транзиции оказалось в соотношении норка/ксенопус, а наименьшое - норка/человек по тону cytB, наибольшее - опять таки норка/ксонопус и норка/мышь, а наибольшее - норка/бык.

По трансворсилм наибольшее их число обнаружено по гвщ сои в соотношении норка/человек,а накменывое-норка/бмк.по гену cyta нэибольшее-норкэ/ксенопус¡наименьшее - норка/бык и норка/мышь.

Анализ общего количества замощении показал, что по гону сои наибольшее их количество в соотношении норка/ксенопус и норка/человек: наимоныгое - норка/бык.

Эти донные показывают обшую картину нуклеотидных эамеэдэпий, обуславливающих разную гомологию, по которой можно судить о самом продассе Филогенеза между рассматриваемыми видами.

Подводя общий итог исследования Филогении .позиции американской норки, как вида, в обшей системе видов на основ© анализа нуклеотиднои и аминокислотной струиггуры генов сои и . 12

cytB. можно отметить, что американская норка находится в системе Филогенеза между коровой и крысой, ближе к крысе, затем идет мишъ, человек и ксенонус. Причем позиции ветвей аддитивного древа коровы и группы грызунов (крыса и мышь) находятся по разные стороны позиции ветви норки.

До 1383 года существовало много противоречивых сообщений, касающихся наличия копии мтДНК в ядерном геноме. Однако, применение в последние годы чувствительных методов молекулярной, биологии лозьолило принта к выводу, что имело место перемещение генов из митохондрий в ядро, но не наоборот. В последнее время в ядре кроме Функционируших генов, кодирующих синтез белков для митохондрии, выявлены последовательности комплементарные мтДНК

С Fox, 1SB3; Lewin. 1Э8Э; Corral, 19893.

В связи с этим нам представлялось интересным изучить наличие копий мтДНК в ядерном геноме норки. Проведенные эксперименты показали присутствие этого явления на модели мтДНК и яДНК норки.

Из литературных источников известно,что имеются значительные расхождения в систематике видов семейства куницеобразных. Поэтому этим мы попытались исследовать Филогенетические взаимоотношения внутри семейства куяицеобразных. Мы исследовали тотальную ДНК европейской норки, хорька, колонка, ласки, горностая, солонгоя, перевязки и американской норки. ДНК была расщеплена четырьмя рестриктазэми и гийридаэованэ с зондом мтДНК американской норки.

Применяя метод Хеннинга- и метод совместимости , мы проанализировали количество нумеотидных замещений, посредством рестрикционного анализа и на основании полученных результатов было сконструировано предположительное аддитивное древо.

Рис.1 Филогенетические отнояюния в семействе куницообразпых Е - европейская поркаi X - хорек; К - колонок; Л - ласка; Г - горностай; С - солонгой; II - перевязка; А - американская норка.

Детальный анализ полученных автографов позволил нам сделать предположение, тго ласка блиио всего к горностаю, через , горностая ласка связана с солонгоем. В полом это тесная группа заметно отдалена от болоо крупных видов. Солонгой м.altaica принято сближать с колонком м.sibirica, однако из анализа элоктроФореграмм вытекает, что солонгой ближе к горностаю, что подтверждается исследованиями некоторых зоологов ( Флинт В,19^0). Оба вида схожи по внешним признакам и рядом краниологических особенностей. Таким образом солонгой ближе к горностаю, чем к колонку, .и как утверждает Г.Покок различия между солонгоем и колонком д'жо больше, чем между колонком и европейской норкой. Европейская норка, хорек и колонок по нашим данным составляют единую монофилотическую группу и отдалена от этой группы перевязка Vormela peiegusna И ЭМЭрИКаНСКЗЯ Норка И. Luir »ola vison.

В целом., построенная нами аддитивное дерево совпадаот с данными, полученными на основе анализа Ватш-повторов (Лушникова, 1989) и но противоречили оцонке родства видоа семейства куницаобразных осуществленной с помощью гибридологичоских, цитологических и иммунологических исследований. А наглядным подтверждением этих положении является-получение Д.В.Терновским (1088) двойных и тройных гибридов между европейской норкой, хорьком черпым и колонком. Отдаленность 14

американской и европейской норки подтверждается резорбцией эмбрионов при скашивании этих видов.

Следует добавить, что полученные нами данные по Филогенезу куницеобразных является предварилельными и требующими детального изучения и проверки. Однако уже' гарвыв полученные нами результаты дают новый импульс к продолжению начатой работы.

Полученные нами данные могут стать основой для проведения дальнейших более детальных исследований митохондриального генома семейства кунидеобразных, которые в свою очередь в совокупности с уже имевшимися данными позволит изучить закономерности • строения,функции и эволюции митохондрмальных геномов млекопитаищя.

выводы

.1. Снцйделен размер ( 16402 пар нуклеотидов ) и структура генома митохондрии американской норки. У темно-коричневой порода выявлено 3 типа митохондриальлой ДЖ. при обработке рест-риктазои Ватш тип А,с длиной Фрагментов 8,95 и 7,,44 т.п.и., и ТИП В - 8.90, Б,42 И 2,05 т.П.Н.

2. Разработана Физическая и генетическая карты гена митохондрия американской норки см. i.utreoia visoni.

3. Оцтелелеяа полная последовательность нуклеотидов гена цигохром-окевдаон ни гена ютохрома В.

4. В юно цитохром-оксидазы н выявлено 187 повторов длиной от 3 до 7 нуклеотидов и с повторяемостью 2-10 раз; в гене цитохрома В обнаружено 141 повтор длиной 3-7 нуклеотидов с повторяемостью Я-11 раз. Определена локализация и нуклеотадный состав наибольших по дгане повторов.

5. В гене цитохром-оксидазы п обнаружено 59 полиндромов длиной 3-9 нуклеотидов, в гене цитохрома В - 44 по.синдрома ладной 3-И нуклеотидов. Определена локализация полиндромов.

6. Ген цитохром-оксидазы н содержит 38,2« ГЦ-пар, ген

"15

щггохрома В - 44,6%.

7. Показано наличие копия митохондриальноя ДНК в ядерном геноме американской норки.

8. На основе анализа нуклеотадных и аминокислотных последовательностей генов цитохром-оксвдэзы и и цитохром В определен процент гомологии но этим генам с другими видами позвоночных, построены ряда дивергенция и сконструированы аддитивные деревья, позволяющие судагь о Филогенетических отношениях анализируемых видов.

9. На оспове гибридизации митохсядрналыюй ДНК животных семейства кунице образ шх с зондом митохондриальноя Ш1 норки

' определены Филогенетические отношения в семейство кунидообрззных.

10. Выявлена возможность использования олигонуклеотидното зонда (CAC)g для получения Фингерпринтингэ ДНК кунидаобразных и оптимизировании условия. •

Вракшаскиа ЩШШНШШа Рекомендуется технология выделения,гиб-ридизации мтДНК и применение олигонуклиотицного зонда, (САС)г, при Фингерпринтинге ДНК для выявления генетических MapiœpoB в целях диагностики наследственных заболевания, опрэделения степо1Ш старония организма,а также при планировании и анализе скрещиваний животных.

СПИСОК ГАВОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.С.А.Коваленко,А.Ф.Яковлев.Определение полиморфизма длинны рестрикцирнных Фрагментов митохондриальноя ДНК норок Бел. ВНИИРТЖ.-Л.,1889.-ВЫП.112.-С.12-14.

2.С.А.Коваленко Изучение полиморфизма митохондриальноя ДНК животных ✓✓ Методические рекомендации.-Л.1990.-0.28-33.

3.С.А.Коваленко, В.П.Терлецкия, В.Г.Бавин. Рестрикционная карга мтхяондриального генома норки БЮЛ.ВНИИРПК.-Л.,Ш1. -Вып.124.-0.32-36.

16