Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование некоторых свойств триптофанпирролазы печени белых крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование некоторых свойств триптофанпирролазы печени белых крыс"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ТУРКМЕНИСТАНА ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

Р г Б ОД

На правах рукописи

'"('и

БЯШИМОВ Ахмед

УДК 012.351.11

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ ТРИПТОФЛНПИРРОЛАЗЫ ПЕЧЕНИ БЕЛЫХ КРЫС

Специальность 03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ашгабат — 1994

Работа выполнена на кафедре биохимии (заведующий профессор X. Курбанов) Туркменского ордена Дружбы народов государственного медицинского института (ректор — член-корр. АН Туркменистана А. А. Аннаев).

Научные руководители:

член-корр. АН Туркменистана, доктор биологических паук, профессор X. Курбанов.

Официальные оппоненты:

член АН Туркменистана, . академик АСХНТ им. Ниязова Куллыев П. К.

кандидат биологических наук Маненкова И. Д. »

Ведущая организация:

Туркменский государственный сельскохозяйственный институт имени Ниязова С. А.

Защита диссертации состоится « » года в часов

на заседании Специализированного совета в Институте физиологии Академии медицинских наук Туркменистана по адресу: 744011, ш. Ашгабат, ул. Островского, 30. V

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии.

Автореферат разослан « « 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

КАРАДЖАЕВА Г. Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ЛИ^УЗ^ЫШСЗ^-ППЗ^Л^И' Триптофлнпирролаза, осуществлявшая оксиге-назнуп реакцию окисления триптофана с разрыве?* пкррольного кольца и превращением его в формилкинуршшн, является ключевкм ферментом, в метаболизме отой аминокислота. Данный фермент катализирует начальную стадию кинуреникового пути метаболизма триптофана, однако, как скорость превращения этой аминокислоту в последующие метаболит» по указанному пути распада триптофана, так и, в целом, сбалансированность его метаболизма по кнкуреютшвому, серотошшогсму, трйпта-мияовочу и другим путям обмена изучаемой аминокислота определяется скоростью реакции, катализируемой триптофанпирролазоЯ( 5" с£а ухгу et п£ -13№. СЬе> 1 а£'/ЗЯг }.'Кроме того, тр;:птофзнпирролазг является адаптивннм ферментом в организме млекопитжцих, быстро реагирующим изменением своей пктипностн на действие различите факторов окружающей среды, так как от уровня активности этого фермента зависит интенсивность многих физиологических процессов в организме, в том числе' и серо'тонинэрпгческих процессов в Ц!'С или процессов, осуществляемых при участии кинуренина, кинуреновоП, антраниловоЯ и З-сксиантряниловой кислот и других метаболитов триптофана ( ¿/«¿¿/г с1 <х(?-1910* /Za.Ko.ixx Из«гст!!0, что триптофанпирролеза изучается давно, однако, структура этого фермента, его распространение по отдельным субклеточны?! фракциям печени и других органов и тканей животного орглниз-г.?й йзучены недостаточно, п разнообразие методик выделения и очист- . пи триптофагтирролязу сг:'Д5тельстэу»т об относительном несовершенстве методов изолирования триптсфанпирролази, Также недостаточт изучен ряд физико-^ииичесяих свойств этого фермента,. следствием

чзго является- отсутствие общепринятых стандартных условия определения активности триптофанпирролазы, в частности, условии температурного режима инкубации. Нет сведений о терыоустоПчивос-ти фермента' и влияния природы буферньяс расворов и их ионной силы. рН и других.факторов на активность этого фермента, а также о возможны* механизмах усиления активности триптофанпирролазы под действизм •различных индукторов.

Цель и задачиисследования. В связи с вышеизложенным, нам представлялось вакцш изучением ряда свойств триптсфанпирролязи печени и ее'распределения по субклеточным фракциям последней. Согльс-но целям.исследования были поставлены следующие задачи: прежде всего было необходимо выделить фермент из печени; для этого, в свою ачередь, пуню било, подобрать оптимальные ко1щентрации го-цргената. г. такка растворителя для максимального извлечения фермента, из. печени; изучить в последующем слияние рН и природы буферных растворов на активность данного фермента; определить температурный режим, инкубации и тердоустойчиЕосп» исследуемого фермента.

С целью .изучения механизма индуцированного образования триптофанпирролазы была поставлена задача исследовать влияние гидрокортизона и триптофана в условиях солнечно-теплового воздействия' нв активность различных форм.(общую, ходофориентцу»' и апоферментнуга) данного фермента, а также определить кинетические параметры для триптофанпирролазы печени крыс,

Впервые изучено распределение триптофанпирролазы по субклеточным фракциям печени крыс. Показано, что фермент в основном сосредоточен в постмитохондркальной фракции и является цитоплазыатическим ферментом. . - ,

Изучено влияние рН и природы буферных растворов, а также температурного режима- инкубации на активность триптофанпирролазы.'

печени крие, Показано, что ф-зрглент проявляет нвдоималькуп ахтиз-Hocïfc з 0,05-0,2 M ïpjrc-KCÏ Зуф&рс лрч pli 8,0-9,0, а при температуре mrao f55°C триптофакпирролаза подвзргаетег тррмичсской инактивации. Ге-м оказывает коферлептнуя завиту феске: ггд от термической инактивации.

Лпсргыс установлено, что усиление активности трипто}анпнрро- • лазы пол глиянием гидрс.чортиэ'-нп или триптофана э условиях солнеч» нс-теплевого воздействия оО'сспечсваетея па счет усиления синтеза Ферментного белка, и возиеяю, за счет образования агрегированной фергч фермента путем иоинли'зацй;; :мскгихсл резервного ?пофер-$ентя и гема. Определены также кинетические показателя для траптофмткрро-хпяи печени крь'с.

vS^li^SESiiïHÏÏËSÏî'LDS'iliSIII!; • полученные результата значительно' рас гиря?* океденте о .ферменте триптофгяяирролаэе, кмех^ем- первостепенное 3!!&че'!1 в метлСочиам* триптофана^ Практическое 'значат« работ»; зг.ккючо.ется s том, что разработан ряд условий по температурному г.с-жиму инкубации, по г!.:Сору буфер: ■л-'х частвояов, рН среди и другие, соблюдение которих значительно расширит »щ^осуатиЕттость пси изучении данного Лермемта.

Агтобацяя работа. Фрагмент«: работ« были дололени па научноЯ конференции лрифессорскс-препсдег-атедьскогс состава Туркменского ордена Дру.»бм народов государственного медицинского института (гчАихабед, 1989), на научной конференций молода:-: учен:« ТОЛП"1.'.';'. (г.Асхлбад, 1990). на У—сП конференции биохимиков республик Сродней Азии-к Казахстана (г,Таикект, 1991}.

Публикация рззультатрв.исследований. По материалам диссерт';:'-':: опубликована 9 работ. --

. Диссертация изложена на 131 страницах машшол.истно'го текста и состоит из введения и 7 глав, включая обзор'литературы (I глава), материалы и мето (П глава) и результаты-собственных исследований (Ш,1У,У,У1 главы), обсуждения и вы-воды.(УП глава).

Работа включает 13 таблиц и 14 рисунков.

Список литературы состоит из 14 отечественных и 95 источников иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на взрослых беспородных белых крысах-самцах массой 100-180 г. Животных подбирали, в основном, одного возраста и все они находились в обычных условиях вивария. Учитывая, что ряд ферментов характеризуется суточным ритмом изменения активности (Ти^и^ак ?Ио1~1$7/г. ), опыты проводили в одно и то же-время.суток, как правило^ между 12-ю'и 15-ю часами. Всего в работе было'использовано..около 1500 крыс.

Солнечно-тепловое воздействие .на животных проводили на открытой солнцеплбцадке в течении 20 мин в летние месяцы (июль-август), как правило, в 12-15 ч дня. Ректальную температуру у животных измеряли как до начала солнечно-теплового воздействия, так и в процессе всей экспозиции с перерывами в 5-6 мин. Гидрокортизон вводили животным внутрибрюшинно из расчета 5 мг на 100 г веса животного. ^-триптофан в виде слабощелочного раствора вводили животным внутрь через металлический зонд из расчета .20 мг на.100 г веса кивотного.

Из постмитохондриального супернатанта печени в. зависимости от задачи исследований осаждали фракции б.елков сульфатом аммония. Ионнообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводили согласно описанию Л.М.Гинодмана (1964). Гель-хроматографию белков проводили на колонках с сефадексом (3-200, согласно описаниям Л.М.Гинодмана'

(1964)"и Г.Детермгна (1970).

Активность Дертскте тркптофанпирролагн определяли по методу КПОХ (1555). Уровень белка в исследуй«»: ртробах определяли по методу ЬОч^Ху (1951). При изучая:;!! кинетики триптофанпкрролазы (определении Км и Умах) использовали методы Лайнуисерг-Еерка и Корнии-Боуден.

РЕЗУЛЬТАТЫ'ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ СБСУВДЙПЕ.

Исследование влияния концентрации? тклни и природы буерных' рзетгораз на активность трнлтофанпирралазы печени крыс,

Для этой цели были приготовлега 2,5», 5,0%» 7,55!, 10,05, 12.5%, 15:0%, 20,0% и 25,0% гомогенаты печени как 0,14 М.растворе КС1 рН 7,4, так и в 0,2 М тр:'с-ПС1 • (гН 7,0) и.0,2 М Ра-фосфатном буферном растворе. Б гсыогенато определял;? обгуп активность фермента, п такте активной хго рФе г V е 1 гг;г/а и апофер»--ентнуз формы триптс?лкпиррол«ь:. Результаты исследования показали, что самая «ксскагт с~т::г.гость фер-.-ента определяется В 10% гомагеилтЗг,. приготовленном в .0,14 М КПТ р! 7,0. 3 гскогевато приготовление?» в буферных растворах нло'лчдпстс'я несколько низкая активность фермента, чем- о 0,14 М растаорс НС! рН.7,0.

* *

Из различных форм триптйфанпирролазу,' самус вмеокуэ екткгноеть составил;» общая зктигнссть фермента, й самую низку» - активность апсфер'.ентз. Зти пек^атедк хжааглись бодэе дифференцяроваикк?<н в гомогекатс, приготовленном з 0,14 М КС1 рН 7,0, чей з гомоггчг-тах на буферных растворах.

■ Исследование триптофангтирролази печени крыс методом солевого фракционирования.

Изучения характера распределит активности тркптофанпирро.-п-зм по субклеточным фракциям печени-показали, что фермент к сстт'.-ч

■ с

сосредоточен в постиатохондриапьлоц супернатвнте, где обнаруживается 94,3л активности от.Есего количества триптофанпирролазы, находящегося в цельной гомогснато* Выход белка » этой фракции составил всего-42$.от общего количества его в гоиогеньте и степень очистки фериента при. этой било равно 2,3 раза. В ударной фракции и фракции, (эс&ядаемой из гсмогената при получении посткитохоццриального супернатанта, активность триптофанпирролазы обнаруживается в виде следовых количествах.

Таким .образом, триптофшширролаза является цитоплазматически:,; ферментом и наиболее оптимальные условия для осаждения данного фермента из* постиитохсндриалыюго супернатанта является высаливание фермента сульфатом аммония при концентрации соли от 18 до 32% насыщения. При этоы достигалась 8-10 кратная очистка фермента.

'. ' Исследование триптофанпирролазы печени методой .гель-фильтрации на. колонке с сефадексом С-200

Исследования триптофанпирролазы печгии методом гель-фильтрации показали (рис.Г)» что при хронатогрефии белков постиитохондп-ального супернатанта печени крыс на сефадексе С-200 появляются три белковые зоны. Первая зона злюируется сразу же после выхода свободного объема колонки, она наиболее сишетрична и компактна по сравнению с другими белковыми зонами, в количественном отношении зта зона более спжчитедьна. Она выходит из колонки в узких пределах (70-110 мл) олвациоиного объема. Вторая белковая зона злюируется в пределах от 100-120 до 200-220 «я здсационного объема. Это зона не'имеет характерных пиков».. Третья зона выходит, из колонки в объему от 230 до 290 мл, Указанная зона в количественном отношении наименызан цз ьрех. белковых зон. ' . ■ . •' ;

Изучение распределения ферментативной активности по белкой®

Рис<5. ХртмэтографцчсскпП профиль болкоп

ностмитохш'щриальното суперкатанта пвчепи крис при гельфильтрагдин на колонке с сефадексом а- 200.

I. выход белка: 2. пькод гринтофанпирролазн: Колонка размером 7^,13 х 2,2 см, У - 70 мл. Волок эляиропали 0,02 М ТРПС/НСГ буфер р!1 7,-1 'со скоростью 30 мл/час.

о

зонам показало, что триптофазширролаза элаируется из колонки в .составе первой белковой зоны о эляациокныы объемом 80-120 мл я виде-одного компактного, достаточно симметричного пика; В составе. других белковых зон активность триптофангшррояаэы не обкаруке-. на. Таким образом, постмнтохондриальный супернатант печени крыс ,"киеет: сложный белковый состав..Триптофакпирролаза элюируется из колонки с сефадексом C-20G.B виде одного, достаточно скиметрично-го'пика в составе иасокодисперстной фракции белков данного супер-натанте

: ' Исследование триптофанпирролазы печени методом хроматографии на ДЭАЭ-целлюлоэе.

Ионнообменнув.хроматографию проводили согласно описаниям Л.М.Гинодеан (1964) на колонке с ДЭЛЭ-целлюлозой. Результаты исследований показали, что во фракции белков, осаждаемой из пост-ыитсхокдриального супернатанта печени крыс сульфатом аммония в пределах' концентраций срди Ш-32% насыщения обнаруживается на хроиатограмме три белковые зоны. Из них, 'основную массу составляет фракция белков, не'сорбирующихся на иошшобменнике, и выходит эта фракция из колонки, одним симметричным пиком в узком элюируемом ойъеме (в интервале 15-45 ил). Две другие СелкоЕые зоны алюнрувт-ся при подаче линейного градиента KCl. Из них одна'зона злвирует-ся из колонки в интервале концентрации KCl от 0,16 до 0,48 !Д,- а другая зона от 0,25 до 0,86 М KCl. Белковые зоны, олюирущиеся из колонки после подачи градиента KCl, значительно растянуты, пики не симметричнц и, видимо, "имеют сложный состав. ■

Исследование активности тргттсфанпирролаэи в элюируеыых фракциях белков показало, что ферментативная активность обнаруживается в составе несорбирущихея с исннообменникамп фракций белков и

Рис.б;' Выход'белка (I тршгго^гшпирролазм при • ' ¡'.оипообмешюЯ хроматографии пл. колонке с ДОАЭ - целлюлозой фракций белков, осажденных нз поетпитохоцчризлмюго суперкатснта печенп сульфатом аг.тит в прелелся 10-32 % наседёмил.

I) активность гоиптофантфролазн; ^2) фракция Озлкоп, ко сорбирувдихсл' по нонпообмешшкэ;

3) Фракции белкоп, свлзапщаясл с поинообиеннпхом;

4) лпнеПннЯ градиент 1СС1.

выходит иа колонки одним узким, достаточно симметричным пиком ,(рис.2). Таким образом,при хроматографии ф]акции белков, осаждаемый 1!3 постмитохондриального супернатанта печеми сульфатом аммония (18-32»' насицен) на ДЗАЭ-целлюлозе триптофанпирролаза выходит из колонку; одним достаточно симметричным пиком, что, видимо, являет-,ся'одним из возможных показателей, исключающих гетерогенность молекула.фермента.

л.

Исследование влияния рН и ионной силы различных буферных растворов на активность триптофанпирролази печени крыс.

Б 'данном разделе представлены результаты исследования влияния и состава буферных растворов на активность триптофанпирролази печени белых крыс.

• Были изучены активность триптофанпирролази в интервале рН от 5у0 до 11,0 с использованием различных буферных.растворов и на оснований полученных данных составлен интегральный график зависимости активности фермента от рН (рнс.З). Как видно из отих данных, триптофанпирролаза имеет широкий интервал рН для проявления активности - от 5,5 до 10,0. Более высокая активность фермента наблюдается при рН 8,8-9,0. Оказалось; триптофанпирролаза более устойчивая при .смещении рН в кислуй сторону, чем в"шелочную.

Изучение влияния концентрации буферных растворов на активность триптофанпирролази показали, что для трис-НС1 буфера оптимальная концентрация составляет 0,05Л),20 моль. Увеличение концентрации буферных растворов'.сопровождается снижением активности, фермента! Более выраженным оказалось оно для трис-Ш1. '-'-'•

я

п

а

В

о «—

•4* «Я О о

н s И Л

а я и к

я

л о f« «

2 § 3 н s о

H

« ъг о

р

»3

Ч • а

£

юо

00

60

40

20

.ТРИС/liGI

, .Карб.буф.,

ii

УН

Рис.7. Интегральный график зависимостл удольиоП активности триптофан-пирролаэы от pli Cyiopmix растворов

Ирииочашуз: За 100 % принята активность трипто-фангтррдлазк п '1РИС/1Ю1 буфере tipi pif 0,0

Х2 1

Исследование влияния температуры на актиьность •триптофанпирролазы печени крьс.

Изучение влияния температуры пя активность триптофа'нпиррола-зы показали, что при температуре ниже 15°С активность фермента практически равна нули, а при температуре выше 60°С фермент полНостью подвергается термической инактивации. Начиная с 15°С активность фермента возрастает и более резкое увеличение активности с ростом температура наблюдается для апсферментной формы трипто-фанпирр.олазы и общей активности. Максимальная пктивность для апо-фермент'а проявляется в пределах. температуры 30-35°С, для холофермен та и общей активности составляет 45°С. Более быстрому инактивирова-нис-из указанных форм триптофанпирролазы подвергается апоферментная фори'а фермента и при 45-50°С активность этой формы фермента, не правыаает 15-175» от максимальной активности, тогда как холофорыен-тная форма при указанной температуре проявляет максимальную активность! Эти результаты показывают, что триптофанпирролаза в. форме холеферыента достаточно.устойчива к высокой температуре. Для общей активности температурный оптимум находится в пределах 30-45°С (рис.4).

Выяснилось также, что коферментнай защита триптофанпирролазы от термической денатурации более эффективно проявляется в трис-НС1 буферной системе, в Ка-фосфатном буфере активность хо-лофермента при +45-+С0°С иа.23,4%-ЛЬ,6% ниже; чем активность зтоП формы триптофаншфролази г- трпс-НС1 буферном растворе, однако общая активность фермента в этих'буферных растворах при указанных температурах остается на одинаково высокой уровне. Видимо,, в Га-фосфатном буфере создаются условия, для более аффективного использования имеющегося в среде гема'и формирования активной формы

триптофанпирролазы и сноской общей активности фермента. Таким образом, трис-НС1 буферный раствор обеспечивает более эффективную защиту фермента от тегмэтеской инактивации, а Га-фосфатный буфер, возможно, способствует мобилизации апофзрмснта в холофермент трипто фанпирролазы. Не исключено существование других механизмов обеспечения активности этих буферных растворов.

Изучения термоустоПчивоеть триптофанпирролазы при сравнительно высокой температуре (50-55°С), показали, что обработка фермента при +50°С в течении 5 мин вызывает снижение активности на 15% от исходного уровня. 15-минутная обработка при этой температуре сникает активность наполовину, а 30-минутная- на 3/4 активности фермента. Прогревание фермента при +55°С в течении 5 мин вызывает полную инактивацию фермента..

Исследование влияния ионов натрия и калия на активность триптсфаипирролазьт печени крыс.

Исследование влияния одновалентных ионов на акгивность триптофанпирролазы показало, что присутствие ионов натрия вызывает заметное снижение активности тр;ттофанпирролагы печени крыс, а присутствие ионов Кт, особенно в малых концентрациях (до 0,1-0,15 мМ), вмзь'пает небольшое повшение активности триптофанпирролазы, однако, при дальнейшем повышении концентрации этого иона активность триптофанпирролазы несколько снит.ается. Оказалось, что ноны натрия оказывают более заметное ингибирувщее влияние на хлорофермектную форму триптофанпирролазы. Снижение активности фермента в присутствии в среде больших концентраций ионов К+обус-ловлено, за счет снижения активности апсферментной формы триптофанпирролазы. ''

Исследование индукции триптофанпиртолазы печени крыс.

Для исследования индукции триптофанпирролазы были проведены две серии экспериментов с введением животным гидрокортизона и с нагрузкой их Ь-триптофаном.

Как показали результаты исследований (табл.1,2) гидрокортизон вызывает увеличение общей активности триптофанпирролазы печени в 4-5 раз. Усиление активности фермента начинается в первые часы после введения гормона и остается на высоком уровне в течении 18 часов. Некоторое снижение наблюдается к 24 часам, хотя активность фермента и к этому времени остается достаточно высокой. Изучение активности холоферментиой и апоферментной форм триптофанпирролазы показало, что в первые часу после введения гормона усиление активности фермента достигается за счет холофермента триптофанпирролазы. К 8-12 часу после введения гидрокортизона животным увеличение активности фермента достигается за счет усиления синтеза ферментного белка. Так как к указанному сроку при приросте общей активности триптофанпирролазы в 4-5 раз по отноиениы к интяктным животным, активность апофермекта увеличивается во столько же раз. Нагрузка животных'гидрокортизоном в условиях солнечно-теплового воздействия вызывает более резкое увеличение активности фермента в первые часы (более чем в 10_раз) с резким снижениям к 12-18 -му часу после Евсденкя гор.тона. Усиление лктивкости триптофанпирролазы в первые часы в данной сер:«: сопровождается резких приростом апофермеитной формы фермента. Начиная с 8-го часа после введения гидрокортизона в условиях гипертермии уровень этой формы фермента почти не увеличивается, а даже несколько - снижается по сравнению с' исходным уровнем /т&бл Л/.

Результаты исследования с нагрузкой - триптофаном показа*

ли /табл.2/, что общая активность триптофанпирролазы-в постмито--хондриальном супернатяне печени у интвктных крыс в 2,8-4,3 раза

" Табл.1.

Изменение активности различных фош триптофанпирролазы печени кркг после нагрузки их гидрокоптиэоном и солнечно-теплового воздействия (в процентах по отношения к интяктнкм кивотим/)

типы ! форм» 1_2Е^я_по£Л£.возлеПстви2_(2_Н2£ДХ}._.

воздействия ! фермента ! ^ д т^ 2Л

§ §• общая активность 347,4 | холофермент 380,3 Ён апофермент 74,4 389,9 388,9 116,3 420,0 371,8 255,8 486.5 386,0 418.6 374,5 326,5 239,5 289.6 245.7 203,5

° й общая я § ~ 5 «Л активность 463,3 11« 1111 холофермент 238,3 » £ Г. о £ 2 Ё апофермент 500,0 983,4 1081,?. 165,0 689.2 754.3 23,2 350,9 392,7 244,4 240,2 81,4 210,4 216,6 44,2

Гидрокортизон вьеден во внутрь по 5 ш'/ЮОг веса животного. Солнечному воздействию кгиги' подвергались в течении 20 минут при' температуре 44-48 С.

Табл.2.

Изменение активности различных фосм трипто<Т анпирролязм печени крыс после нагрузки их -триптофаном и солнечно-теплового воздействия (в процентах по отношению к интактшлд яивотньм)

типы форм»

воздействия фермента

ж*» &> о

тт---

; З1 о I 1) I щ к о а к о я ! о в н I н о а | «к

ООО

обшая

активность

холофермент

апофермент

295,3 450,0 156,6

общая активность

холофермент

апофермент

294,1 398,4 100,6

388.4

484.5 101,2

341,5 430,4 192,7

74,7 88,1 50,0

41,5 74,7 3,0

175,: 190 Л 119,:

251,С 176,£ 283,

49.8

са,8

28.9

121,2 151, С 60,2

77.8

31.9 6,6

293,0 241,2 292,7

43,0 44,8 »32 ,5

1|-триптофан вводили во внутрь по 20 мг/ЮОг веса животного. Солнечно-тепловому воздействию крысы подвергались в течении 20 минут при температуре 44-48 С.

выше, чем в цельном гомогенате печени, причем около двух тререй из этой активности представлено в виде агрегированной формы- хо-лофермента. Солнечно-тепловое воздействие вызывает увеличение активности триптофанпирролазы печени в 1,5-2,0 раза. Более резкое увеличение в 8,4 раза активности триптофанпирролазы наблюдается поело нагрузки животным - триптофаном. Увеличение активности фермента при этом носит кратковременный характер и через 6 часов после введения субстрата активности резко снижается. Однако, к исходу первых суток наблюдается повторный подъем ферментативной активности и этот подъем связан с-увеличением активности апоферментной формой триптофанпирролазы.

Изучение кинетических свойств триптофанпирролазы печени крыс.

Результаты изучения кинетических параметров /Км и Умах/ триптофанпирролазы печени крыс, показали, что кинетики триптофан-пирролазной реакции описывается уравнением М:псаэлиса-Ментен. Рас--читанкое значение Км для фермента по триптофану находится, в пределах 1,0гЮ~^ М-2,0хЮ~3М и Умах составил б,г5х10-1- 6,65x10"1 усл.ед. Результаты исследований зависимости начальной скорости реакции катализируемой исследуемым ферментом, от концентрации геми-натакже показали, что она подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Расчитанная Км по ко-фдктору составила 0,3x10 !.!-1,27x10 М и Умах составил 1,9хЮ"^-2,0x10"^ усл./ед../ мин.низкое- значение Км ■ для триптофанпирролазы печени крыс по гемину свидетельствуют-с * высоком сродстве фермента с кофактором.

ВЫВОДЫ ' •

I. Изучено распределение триптофанпирролазы-по субклеточным фракциям печени крыс. Показано, что основная масса 'фермента /более 92-9455/ находится в.постмитоховдриальной фракции и яйляется

цнтоплазматическим ферментом.

'?.. Псказвно, что изпсстмитохсндрдольного супгриатанта триптофанпирролаза ссаздастся еульфптсн «ммони.-; а пдодеха* концентрации от 10 до 32 % насг ¡¡ценности. При этом вгаод ф»смента составляет более 80 % к достигается 8-10 кратное его о«иг;зние. При гель-фильтрации на сефадексе C-P.00 и хроматографии на ДЭАЭ целлюлозе фермент ыгходит одним пиком.

3. Установлено, что триптофанпирролаза проявляет активность в питоном интервал« рН с некотором смешением в слабощелочную лену; фермент проявляет более высокую и устойчизуа активность в 0,05-0,20 М трис-HCI буфере, по сравнению с.'.'а-фосфатисй пли кэрбонатной буфернгаи системами. Зона максимальной активности соответствует рН 0,8-9,0

<!. Показано, что триптофанпирролазп максимально активна при температуре +45°С. Еыие температури ¡55°С фермент полностью подвергается термической.инактивация. Гем обеспечивает ксфермент-нув эагднту фермента от термической инактивации, и особенно это свойство гема проявляется а трис-HCI буфере. Ионы натрия • и калия оказывают снижавшее влияние на активность триптофлн-гтирролазп.

5. Введение п организм гидрокортизона nL - триптофана, а также солнечко-тепловпе воздействие на «ивотных вызывает увеличение активности трпптофанпнрролазн. Сделаны предложения в отношении механизма усиления 'активности фермента. Прежде acero ото достигается.:путеы усиления синтеза ферментного белка; возможен и другой механизм - за счет образования агрегированной формы фермента, путем мобилизации имеющегося возможно резервного апофер-иента и гема.

6. Определены кинетические показатели триптс.рнпирролгпи печени

о о

крыс. Получено: Км - 1,0x10 М-2,OxI 0~°f,! по триптофану и 0,8x10-^-12.УхМ"^.! ло гемину; Умах - б^бхЮ^усл.ед. по триптофану 1,9xI0~^M-2,0x10"^ усл.ед. по гемину.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВА1ШЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Бяиимов А.К., Курбанов Ы.Х., Опезов Б.Л., "Гормональная и субстратная индукция триптофанпирролазы при гипертермии" Тезисы 49-11 научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Туркменского ордена Дружбы народов государственного медицинского института, посвященной 119-летия со дня рождения В.И.Ленина, 1989 г., стр.36-37.

2. Курбанов Х.К., Бяиимов А.К., Курбанов М. >'., Овезов Б.А., "Индукция триптофанпирролазы печени гидрокортизоном в условиях гипертермии."// "Известия AH ТССР" f 3, 1990 г., стр. 73-75.

3. Курбанов Х.К., Блшимов А.К., Курбанов М.Х., Овезов Б.Д., "Елияние триптофана на активность триптофанпирролазы ночени белых крыс в условиях гипертермии" //'Здравоохранения ТССТ ?? G, 1990 г., стр. 30-33.

4. Блшимов А.К., Курбанов Х.К., "Влияние ионов одновалент-. них металлов на активность триптофанпирролазы" // Здравоохранения ТССР, У' И, 1990 г., стр; 28-30.

5...Блшимов А.К., "Влияние концентраций различ(сых буферов на активность триптофанпирролазы печени крыс" // Тезисы докладов У научной конференции молодых ученых Туркменского ордена Дружбы народов государственного медицинского института , 1990 г., стр. 8-9.

6. Блшимов А.К., Курбанов Х.К., Курбанов М.Х., "Влияние pH буферных растворов на активность'триптофанпирролазы п£чени крыс" Известия АН ТССР, »I, 1991 г., стр,47-50.

7. Бявимов A.K., Курбанов М.Х., Курбанов Х.К., "Выделение и изучение кинетических свойств триптофанпирролаэы" // Здравоохранения ТССР, J? 2, 1991 г., стр.30-44.

8. Бяшимов А.К., Курбанов Х.К., "Свойства триптофанпирролаэы печени белых крыс" // 1У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Ташкент, 12-15 ноября 1991 г., стр.28.

9. Курбанов Х.К., Бяшимов А.К., Кусбанов М.Х., "Влияние

в

температуры »¿¡активность триптофанпирролаэы печени крыс" // "Известия А!; ТССР" Р I, 1992 г., стр.63-65.

" Лк алькаларьш багршши грипгофанпирролазасы-

нын кэбир хэсивглериииц барлсгы " >

Пу нале трппюфанпирролазашм фкзако-хииики хсн-дс .бполо-гик хг.скоглсришш бирночесишш еврвнилмегкнкн ивги^слэр;; горкозилеидир,фаравнт ак алаваларын багрындан бвлунип.чыкарнл-ды.Гомогвнатдан фсрг.енти хае коп «вчберде алиак учин дурли эргиилорик учуси /О,К М КС1 рН 7,0 ; 0,2 М - фосфат буфер рН 7,0 ев 0,2 Н ТРНС - НС1 буфер рК 7,0/ ве горквзилен эрпиь лорде гоаогенвтын дурли концентрвциплары уланылды.Нетй£,оде 0,14 М КС1 рН 7,0-да та^ярланан Ю/0 гомогенагын фвраэнг бодуп чыкарцая учин ин а«аглн срода болуп дуряидигц алшик.Фврментин субклаткалы фракцинлар боянча болуниини барлап , 91 - 3>1 Ь

акгивлигин посими!охондриал фракцвяда йузо чыкявдкгы аяыпды. Помиигохондриал фракциядан форыеш а^цокг.я суяьфагк Силен дг&-буне чэкдурплди во Ю-3^6 дойгуилц дуз концвнхрациясц кахалнн-да эргиндоп £0^ гркпгойаипирролазадак кэпрэги дуййуна. чог.йэр» ЗоИлвликде опун 8-Ю гозек ирассала;шагы газзкиляр.Гель есфа-двкс - 200 во ДЭАЭ-целвлозз арквяы хроаоЕСгрБфкк анализ фор-ивнгин стилей бир сниивгрпк ёкары гегорнлкв Силен геркезди.

рН-пн ¿буфер зрпшлерияка юбитагцым во инкубоцкг.пцл '■ •х-омперагура рехкиинкн,пойле хеа оир ввле.чулк цегалларин моила-ринык болиагыкцн фериенгае акгивлигкке гэсирвван барлыгцнын нвтифлери грпптофанпирролазакьа 0,05-0,20 И 2РИС-НС1 буфердв рН 8,8-9,0 - две ёкары акгивлиглнка йузв чыкяндыгыны горкездп. Ин аиатлы текперагура форавкгап дурли. фрраалары тчви дгрли--дурлилрипюфввпирродазонаи епофврцвнщ.учив 80-35°С,холофвр-ыенг фориаеы учйз болса болуп чыкды.Тешзерагура 55°С-дзи

(Зкарц Сслпнда формант тариики яиаг.швапил дучар боляр.Геи тршло^аипкрролаза ёилмлих деиатурацйьдаа i-ofspuсну горагы vn;.\YH здйэр.Бз гсраг ТРЛС-11С1 бу^ердв хас иеицмди аиала аац-рштр.Средада К 30 .юплзринцл бар болиага форшлшш аотив-лигаш ингибирлей^и юсир эдйэр.Лайнуйвери-Бёрки:1 xeu-дв Кор-наа-Баудепин усуллары йосича Су фериепган каьзгяк парам егрло-р»цш оврениегин неги^елзр;'. ярцпю.Ъпнпкрролаза рзакцияньш Y4Yc:¡-пан Чихаэлис-йангонии дзклэиеса зркали ^анланандыгынц горказди. Фэрнен? Учи« Ки-нн "'i¿u бэ Унах-ыи эхмиста триптофан бовпча хеи,г8шш бопнча хаи хаоапланылды.

Триптофанпирролазанцн ивдуцирлеиек оркалц эиедэ уалиаги-нин ивханизишн овреиаек иаксади билеи гидрокаргаэон трипго-Фаяли нагрузкзнин хеи-да гун-йилилшс га сир клан фериенгин ак-тавлигина эдйэн гэсира барланцлди.Бу денешдирие барлаглар гер-казилен индукаюрларын sacapu астында фериентин акшвлигмнин аргяидагшш горкезди.Фериеигин шстивлигана пгйчлендириегии механизма барасында гидрокартизои фвриеат бзлогынын сангвзики гтгйчлвндирнек ёли билвн грашофанпарролазанин акгавлигини арт- • дыр яр диен чаклаиалар эдШщи.Шол бар ваиын oaYHfle гриптофаилц нагрузка хеи-до гун-гйылылык уэсари.ивгорец.рвзервде бар болан кофариенги ве апофвриенти цобилизл'емек аркалы uyukuii болса га-рек.

AIIKOEATIOH

The investigation results of a seri^j of the physical--cheaical and biochemical V/hite Hat liver Tryptophan lyrrolese characteristics to be obtained ore given in the present paper. Tho optimum medium to extract the enzyme ia determined to be XO% hoaogenatc prepared in 0,14 K KC1 pi! 7,0. She distribution of the enzyme to the subcellular fractions io investigated to discover the enzyme activity in the pontraitochondrial fraction to be equal to 92-94£. In this fraction the enzyme ia precipitated by (ini,)2S0^ within the concentration of to be equal to I0-32JS of the saturation. The gel chroaotography cnaly-sis to be node through sephadex G-200 and DSAE-cellulosc shows that the enzyme goes out of the column in the form of the symmetric peak. Investigating the White Ilai liver Tryptophan J^rro-lase characteristics, the enzyme in found to reveal the maximum activity in 0,05-0,20 K Tris IIC1 buffer ?pH 0,8-9,0. Ihe optimum temperature seemed to bo different for the various forms of the enzyme: the optimum temperature for tho s?oenzyme form of Tryptophan Pyrrol one io 30-35°C, but fox1 the holoenzyae for:: it is 45°C. The enzyme is subjected to tho thermal iaactivatior. under the temperature to be.over 55°C, Her. provides tho oo-en-zyme protection for Tryptophaja Pyrrolase agsinai; tn<2 thermal denaturetion. Tris HOI buffer mokes this protection to bo more effective. The enzyme activity is inhibited by the presence of ions K+ and lia+ in the medium. The investigation of the cinetic parameters of this enzyme 3hons that the reaction of Tryptophan Pyrrolade in described by the equation of Liichaelis-llenten. K^, and V^^ for tho enzyme are calculated for Tryptophan as well as for Hemin. The increase of the activity of VTnite Kafc Liver Tryptophan ryrrolase is caused by ¡iydrocartizon and tryptophan to be administered to the animals and by the solar thermal influence. As for the mechanism of increasing enzyme activity hydrocortizon io supposed to increase th.0 exxivity of tryptophan pyrrola3o by moons of increasing tho enzyma alb'-ision synthesis. Keantrhilo the administration to tho animals Tryptophan Pyrrolcse and tho eolur thermal influence ceea to increase^ the activity of the enzyme by the mobilization of tho co-enzyme vrhich ic likely to bo in reserve end by the mobilization of,the epoenzyne.