Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование методом протонного магнитного резонанса вторичной структуры и физико-химических свойств бета-2-микроглобулина в растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование методом протонного магнитного резонанса вторичной структуры и физико-химических свойств бета-2-микроглобулина в растворе"

РГ6 од

- 1 ВИВ 1996

На правах рукописи УДК 577.322.7

Окон Марк Сергеевич

исследование методом протонного магнитного резонанса вторичной структуш И физико-химических свойств р2-микр0гл0булина в растворе

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущино - 1995

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики. БАН и в! Институте общей и физической химии, г. Белград, Югославия.

Научные руководители:

доктор физико-химических наук, профессор Д. Вучелич; доктор физико-математических наук Б. П. Кутышенко

Официальные оппонента:

доктор физико-математических наук Ю. А. Лазарев; доктор химических наук И. А. Василенко

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра Российской академии медицинских наук.

Защита состоится " $ " ¿иА^Л 1996 года в /Г часов на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино Московской области, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. /?2-Микроглобулин (/?2м), исследованию структуры и физико-химических свойств которого посвящена данная диссертация, участвует в образовании комплекса клеточной совместимости (МНС-комплекса) класса I, ответственного за процесс распознавания организмом "своих" и "чужих" клеток. Изучение механизма функционирования этого комплекса (который у человека носит название HLA-комплекс) позволило бы прояснить такие вопросы, как проблему совместимости при трансплантации органов, проблему рака, СПИДа и проблему автоиммунных (неадекватных) реакций, когда "гиперактивность" иммунной системы приводит к постепенному разрушению организма.

Проблема механизма функционирования комплекса МНС I непосредственным образом связана с проблемой его структурной организации и проблемой стабильности этого комплекса. К настоящему времени известна структура HLA-комллэкса в кристалле и исследованы некоторые физико-химические свойства этого комплекса в растворе. Однако физико-химические свойства /?2м (малой субъе-циницы этого комплекса, м.в. 11800), которые позволили бы понять эго роль в функционировании HLA-комплекса, исследованы явно аедостаточно. Неизвестна также структура изолированного /?гм.

Некоторые заболевания, связанные с нарушениями работы почек, з частности, балканская нефропатия, приводят к резкому росту зодержания /?2м в крови (и в урине). В связи с этим, а также с гем, что /?2м мог.хзт иметь и некоторые самостоятельные функции в эрганизме, представляется необходимым изучение особенностей товадения этого белка в растворе при различных условиях среда.

В настоящей диссертации определена вторичная структура /?2м з растворе и на внутримолекулярном уровне исследованы его

физико-химические свойства, позволяющие подойти к понимании некоторых аспектов механизма функционирования НЬА-комплэкса. I качестве метода исследования применен современный метод двумерного (20) протонного ядерного магнитного резонанса (*Н ЯМР), позволяющий с большой точностью отслеживать изменения структур* белка в растворе при различного рода воздействиях.

Цель работы. Изучение структуры /Згм и его физико-химически; свойств в растворе.

Основные задачи исследования. 1. Отнесение сигналов в 1] ЯМР-спактре /Згм. 2. Определение вторичной структуры /?2м в растворе. 3. Исследование поведения в2м при различных условиях сред и выявление характерных-особенностей его структуры. 4. Исследо ваниэ методом *Н ЯМР модифицированной (минорной) формы /?гм.

Научная новизна. Впервые получено отнесение сигналов в 1 ЯМР-спектре Д2м и определена его вторичная структура и элемент третичной структуры в растворе. На внутримолекулярном уровн исследована динамика структуры /?2м. Показано, что Ы-концвва область молекулы белка обладает повышенной конформационной ла бильностью и выдвинуто предположение о важности такой лабильное ти для функционирования /?2м в организме. Определены условия сре да, при которых /?ам сохраняет свою нативную структуру в раствор Выявлены условия долговременной стабильности Р2м в растворе показано, что /?гм склонен к агрегации. Показано, что необратт мость денатурации П2м связана с его агрегацией в денатурирова! ном состоянии. Спектрально (ЯМР) идентифицирована минорная форь /?2м с р1 5,2 (проделано отнесение линий в *Н ШР-сгоктре эте формы); обнаружено, что скорость образования этой формы завис! от концентрации белка и обосновано заключение, что образован! минорной формы Р2ы с р! 5,2 связано с дэзамидованием гдутамж

!, которое сопровождается изменениями в структуре N-концевой области молекулы бежа, ответственной за взаимодействие с тяжелой яэпыо HLA.

Практическая ценность. Подученное отнесенга линия в *Н ЯМР-:пектре /?2м позволяет, используя технику ЯМР, ставить и решать :аные разнообразные задачи по изучению особенностей поведения ¡того белка в растворе на внутримолекулярном уровне: от изучения взаимодействия ßzu с ионами и малыш молекулами до определения 'ретичной структуры этого белка в растворе и объяснения механизма его связывания в НЬА-комплвксе. *

Спектральная идентификация минорной формы 13 к позволяет как »гистрировать наличие этой формы в препаратах /?2м, так и решать ¡адачи по изучению особенностей поведения этой формы белка в застворе и роли, которую эта форма белка может играть в функцио-мровании HLA-комшюкса.

Изученные особенности долговременной стабильности /?гм в застворе позволяют дать рекомендации об оптимальных условиях фанения препаратов этого белка и оптимальных условиях зкспери-»ента при работе с этим белком.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, ;еми глав {включающих литературный обзор, экспериментальную [асть и обсуждение результатов), выводов и списка литературы, «сличающего 143 наименования. Текст изложен на 157 страницах ма-шнописного текста, включает 7 таблиц и иллюстрирован 48 рисун-сами. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Материалы диссертации апробированы на XI Международном биофизическом конгрессе в г. Будапеште (Венгрия, 1993 г.) и на 1ервом балканском конгрессе по иммунологии в г. Белграде (Юго-;лавия, 1995 г.}.

МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ Ргт выделялся из урина пациентов с диагнозом "Балканска; нефропатия" с'использованием методики, предложенной Бергтардом ъ Берном (Berggard, 19683, с модификациями. Чистота полученные препаратов проверялась электрофорезом в полиакриламидао» геле в присутствии SDS (SDS-электрофорез) и в отсутствии SD5 (нативный электрофорез), а также изоэлекгрофокусированием (IEF), Образцу дяя получения двумерных ЯМР-спектров растворялись i 99,8Х dao или в смеси 95Х Н20/5* D20 и содержали 0,25 - 1 мМ ßj

50-150 мМ NaCl и 50 мИ фосфатного буфера. Значение pH образцо]

*

устанавливалось путем добавления в небольших количествах НС] (DC1) или NaOH (NaOD). Образцы для измерения времен релаксациз содержали 1 мМ ЭДТА.

ЯМР-спектры растворов вги были получены на спектрометр фирмы "Braker" AM 600 в импульсном режиме с последующим Фурье преобразованием сигнала свободной индукщии.

Фэзо-чувствительные 2D COSY-эксперименты выполнялись с по мощью стандартной последовательности импульсов, модифицирование дяя уменьшения сигнала вода. Импульсная последовательность дл получения фаза-чувствительных 2D NOESY-спектров включала в ка Ч8СТВ8 третьего импульса 1-Г импульс. Время смешивания (т^) в 2 NOESY-экспвриментзх составляло 50, 100 и 200 мс, а в 2D REC0S (RELAY)-экспериментах - 30 мс. тм в "чистых" TOCSY-эксперимента (Griesinger, 1988) составляло 60 мс, а параметр г=2,5. Во все экспериментах в Н20 (кроме 2D NOESY с 1-Г импульсом) сигнал вод: насыщался в промежутках между импульсными последовательностями.

При измерении времен релаксации использовалась метода» "inversion recovery", а при измерении Т2 - метод Меабума-Гилла. Значения скоростей обмена амидных протонов были получены г

изменению со временем интенсивности COSY-кроссов сразу после растворения лиофилизованного препарата белка в DzO.

ОТНЕСЕНИЕ СИГНАЛОВ В *Н ЯМР-СПЕКТРЕ Ржк.

Отнесение сигналов в ЯМР-сгоктре белка является необходимым условием как для определения его структуры в растворе, так и для изучения его физико-химических свойств методом ЯМР. Отнесение сигналов в протонном спектре /?2м было проделано нами следующим образом: сначала были отнесены сигнала в "спиновых системах" отдельных аминокислот белка, растворенного в D20, а затем эти сигналы были приписаны к определенному остатку в аминокислотной последовательности белка методом (Billeter,1982; Wuethrich, 1986) "последовательного отнесения" в спектре П2т в НгО.

Используя COSY-спектры, были отнесены сигналы от кольцевых протонов ароматических остатков /3 м, растворенного в D2Q (рис.1 >, а также от протонов алифатических аминокислот с короткой боковой цепью: аланина, треонина и валина. Связи между сигналами от кольцевых протонов и сигналами от аСН и /?СН2 внутри спиновых систем ароматических остатков были установлены с помощью NOESY-спекгров. Отнесение сигналов от остатков лейцина и изолейцина потребовало использования, наряду с COSY-спектрами, также еще и RECOSY и TOCSY-спектров, позволяющих связать между собой сигналы от протонов внутри спиновой системы одного остатка, разделенных четырьмя и более связями. Таким образом были отнесены сигналы от спиновых систем 43-х аминокислотных остатков. Отнесение остальных сигналов и привязка уже отнесенных сигналов к определенному остатку в аминокислотной последовательности было сделано в процессе "последовательного отнесения" сигналов в спектре /? м, растворенного в Н20.

№0 Н60

F30 F22 Y66 Y63 НЭ1

Y66 Y63 Y26

FSS H51 Y78

HU WSS

Y67

H31 H13

F30 K60 F62 F62 F62

N60

F56 W60 I

F30 Y10

i

8.4 е.г В.О 7.В 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 6.0 5.8

PPM

Рис. 1. Общий вид ароматической части ID-спектра ßj* и результат проделанного отнесения сигналов в этой части спектра (D20, 1 мг/мл, pH* 7,0, 2S °С).

В процессе "последовательного отнесения" сигналов в спектре ßzK, растворенного в НгО, мы использовали комбинацию COSY/NOESY-спектров. При этом было использовано то обстоятельство, что амидаый протон пептидной связи (NH) аминокислотного остатка связан через спин-спиновое взаимодействие (aJHNa) с аСН спиновой системы своего (1-го) остатка {наблюдаются кроссы aCH/NH в COSY-спектре, рис. 2), а через ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) - с aCH спиновой системы предыдущего <1-1-го) остатка (в NOESY-сшктре наблюдаются кроссы aCHCi-lJ/NHCi), или d^-контакты). В первую очередь были отнесены сигналы от остатков в сегментах 8-12, 37-41, 46-51, 62-71 и 91-95, каждай из которых содержит от одной до шести спиновых систем аминокислот, отнесенных в DzO-экспвриментах. Сигналы от остальных остатков были отнесены в следующей последовательности: 96-99, 42-45, 13-16, 18-19, 34-36, 73-74, 6-7, 29-30, 85-87, 52-56, 88-89, 3-4, 58-61 и 17. Сигналы от остатков Pro С5, 14, 32, 72, 90), Ser С57, 33), Gin 2 и Не 1 были отнесены последними.

-3.4

- 3.6

- 3.8 -4.0

- 4.2

- 4.4

-4.6 g. a.

-4.8 -5.0

• S.2 •5.4

• 5.6

• 5.8 6.0

Рис. 2. Область кроссов аСН/NH в COSY -спектре /? м в Н20.

При отнесении сигналов от боковых цепей аминокислот /?2м использовались комбинации TOCSY, NOESY и COSY-спектров растворов <?2м как в Н20, так и в D20. Особенно эффективным оказалось использование TOCSY-спектров растворов /3,м в Н20, что связано с 5ольшой дисперсией химических сдвигов сигналов от NH-протонов. В 5олышнстве случаев TOCSY-спектры давали полную картину алифати-геской части спектра остатка, что решало проблему перекрывания зигналов в этой части спектра /?гм. TOCSY-спектры непосредственно 5ыли использованы только при отнесении сигналов от /ÎCH, Ser 57 и 51, уСНг и óCH2 остатков Lis (кроме К41), всех уСН2 остатков Glu t Gin и при переходе от ПСНг к уСН в спектрах Leu и от ÛCH к СНг в спектрах Не. Все остальные индивидуальные контакты были

U ОАЭ £74 g S«« '

f» CTÍ £« «*J ■

.. v« &3s

, 096 096 £Jb

% J5 î

И E7?

N24

щ Я

RM ï"

-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-]-1-f—

102 10.0 9.8 9.6 S .4 9.2 9.0 8.6 В.6 8 4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2

PPM

*э о* • <»•••••••• •• •

5 10 15 20 25 30

1 ort pk i qvy srhpaengksnf l ncy vsgf hps

nh 4«

□ □

▲ ▲AAA

=□ □

□ □

□

CD □

V« ОЭИШ1» •09Э*«»* • •• •

35 40 ¿5 50 55 60 65

dievdllkngeri ekvehsdlsfskdwsfylly nh А а ад а а__aaa

И....... * МММ^^МЯМ МММммММММММЯ** я Ml^fc > I1 Л > I I1

EZD I ИИ I I ■ i □ □ tZU CUD С

'J« 99Э9» вОЭО«в»*в»*ЭООООЭ •••ОввОЭО

70 75 80 85 90 95

v т ef tp те kde у acr v nhvt l 5qp к i v kwdr dm

nh aaa aaaaa aaa

3 (ZZ3 I 1 I HD □ m HD

dan dm

Рис. 3. Аминокислотная последовательность и суммарная информация, полученная в процессе последовательного отнесения сигналов от /Згм. ЯЭО-контакты обозначены прямоугольниками между последовательными остатками. Последовательные ЯЭ0 с <5СН2 Pro обозначены заштрихованными прямоугольниками. Черные, наполовину черные и светлые кружки соответствуют большим <>8 Гц), промежуточным и малым (<6 Гц) значениям константы aJHNii- Треугольники указывают на малую скорость обмена амидных (NH) протонов.

найдены в COSY-спектрах, в том числе ¿СН2/гШ остатков Arg.

NOESY-спвкгры использовались при переходе от /ХН2 к кольцевым

протонам в спектрах ароматических остатков и при переходе от

ßCU к 6NH в остатках Asn и от уСН к гЩ в остатках Gin. На

рис. 3 показана суммарная информация, полученная в процессе отнесения; отнесение сигналов в ароматической части спектра ft м приведено на рис. 1, отнесение сигналов в области aCH/NH-кроссов COSY-спектра показано на рис. 2, а полное отнесение сигналов в спектре ft м приведено в табл. I текста диссертации.

ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА ft м В РАСТВОРЕ.

2

Полученное отнесение линий в спектре /?2м позволило нам определить вторичную структуры /?2м в растворе, т.е. способ упаковки полипептидной цепи белка.

При построении вторичной структуры белка мы учитывали нзли-

РРМ

Рис. 4. аСН-область NOESY-спектра Пгм в DzO. Показаны дальние d Ci,j> и один последовательный d СН31,Р32) ЯЭО-контакггы.

ч

vi

v

11

Рис.5. Схематическое представление вторичной структуры Агм. Наблюдаемые ЯЭО-контакты обозначены стрелками. Остатки с медленно обменивающимися НН-протонами выделены толстыми кружками. Заштрихованы остатки, входящие в /3-структуру по рентгеновским данным.

чие как ближних где так и дальних С1,р, где

ЯЭО-контактов между остатками в полипепгидной цепи, а также значения величин константы З3„ыа <#ие1Ьг1еЬ, 1986). Непосредственное представление о способе укладки полипепгидной цзпи было нами получено на основе анализа дальних ЯЭО-контактов

и *на Рис* 4 обозначены дальние С1,р-кон-

такгы, наблюдающиеся в МОЕБУ-спектре /32м). На рис. 5 эти контакты представлены схематически. При таком представлении становятся очевидными следующие свойства вторичной структуры /?2м:

а) Структура /?2м образована двумя антипараллельными Глистами, один из которых (А) состоит из четырех /?-цзпей (3,6-12; 20-28,31| 50-52,55-57; 61-71), а другой (В) из трех длинных в-

цепей (36-41; 77-83; 90-95) и одной короткой С44-45).

б) В образование двух антипараллэльных tf-листов вовлечено более чем 58 остатков из 99, и ешэ 5-7 остатков, входящих в состав /?-выступов и /?-зигзагов, могут быть отнесены к /?-структуре.

в) Оба ft-листа формируются вокруг остатков Cys (С25 и С80) и связаны друг с другом дисульфидной связью, о чем (косвенно) свидетельствует наличие ЯЭО между /?СН2 С25 и i>CH2 С80.

г) Большинство остатков в соседних ft-цвпях связаны водородными связями, о чем говорят наши данные по протонному обмену и контакты dNbjCi, j) между остатками в соседних цепях /î-листа.

Наличие ЯЭО-контакта daaCН31,Р32) (рис. 4) свидетельствует о цис-конфигурации пептидной связи Н31-Р32.

Наши результаты указывают на наличие двух петель 13-19 и 72-76, включающих остатки Pro. Так, наблюдаемые интенсивные контакты dNN(12,13) и dNNC18,19), сопровождающиеся уменьшением соответствующих последовательных контактов daN (рис. 3), как и наличие Pro 14 и Gly 18, указывают на изгибы в этих участках цепи, в то время как интенсивные последовательные контакта daff указывают на вытянутый характер сегмента 15-17.

В сегменте 41-44, включавшем Gly 43 в положении Ci+2), наблюдаются средней величины контакт dNNC41,44) (рис. 5) и заметный контакт dNNC42,44), что характерно для /?-зигзагов типа II (Wagner, 1986); однако, противоречивый набор величин последовательных контактов d . d„„ и значений 3Jf л не позволил отнести

NN (XN HNCt

этот зигзаг к какому-либо классическому типу. Сегмент 84-87, где наблюдаются заметные контакты daNC85,87) и dNNC84,87), а также малое значение величины 3JHNÛt V85 (<6 Гц), больше всего напоминает /?-зигзаг типа I, однако величина 3JHNa Т86 {7 Гц) несколько меньше значения (9 Гц), характерного для зигзагов этого типа.

Наши результаты указывают на наличие и других зигзагов или петель (из четырех или из пяти остатков) в локальных сегментах полипептиноа цепи: 32-35, 46-49, 57-61 и 87-90, два из которых (32-35 и 87-90) включают остатки пролина.

Другая заметная особенность вторичной структуры Пгм -наличие трех /?-выступов, что характерно для антипараллельных ft-листов (Richardson, 1978). Один из /?-выступов мы классифицировали как классический или типа G1 С G29,F30;F62), где два остатка G29 и F30 в Л-цепи II расположены между водородными связями остатка F62 в цепи VI (рис. 5 и рис. 6).

При этом NH остатков G29 и F30 пространственно близки (что

подтверждается интенсивным последовательным контактом dNNC29,303) и образуют водородную связь с С=0 центрального остатка F62, что подтверждается наличием кон такта dNNC30,62). Два других /3-выступа - СТ4, P5;F30) и С D53, L54; L643 - это /?-выступы "широкого" Cwide) типа, где NH и С=0 цэнтралышх остатков (F30 и L64) образуют водородные связи с одним из остатков противоположной /3-цэпи (F30 с F62, a L64 с V27, рис. 5).

физико-химические свойства пи.

Мы исследовали поведение /?2м в водном растворе при различных значениях рН, температуры и концентрации белка. При этом были получены следующие результаты.

н<->н

i к i

Л jt \ л л ф

н<->.'н

я к

с к—с i i

н н но н

i

Рис. 6. /?-выступ CG29,F30;F62) ,

При изменении величины рН раствора в диапазоне 4,5<рН*<11,4 титруются остатки гистидина (в даапзоне 4,5<рН*<10,0) и тирозина (при рН*>9,0), Были построены кривые титрования остатков гистидина и определены значения их рК*: His 13 - рК* 6,0, His 31 - рК* 4,6, His 51 - рК* 8,0. His 84 в диапазоне значений 4,5<рН*<11,4 не титруется. Остатки тирозина начинают титроваться при pH*2ll,О за исключением Туг 63, сигналы которого начинают монотонно сдвигаться в область высокого шля уже при рН*>9,0.

Сигнал от С2Н Тгр 60 сдвигается в низкое поле на 0,04 ррт при изменении значения рН* в ту или другую сторону от рН* 7,5. Такой же слабо выраженный экстремум в области значений рН* 7,08,0 дают сигналы от СЗ,5Н Туг 67 и от С4Н His 84, которые сдвигаются в сторону высокого поля.

Увеличение концентрации белка в диапазоне 3-12 мг/мл сопровождается небольшим высокопольным сдвигом сигналов от кольцевых протонов Тгр 60, а увеличение концентрации /?2м в растворе свыше 10-12 мг/мл привода* к резкому увеличению ширины всех линий спектра, что, по-видимому, связано со склонностью /?2м к агрегации.

При увеличении температуры раствора от 25 °С до 57 °С сигнал от С2,6Н Phj 56, сдвигаясь в сторону низкого поля, становится существенно уже изменяется от 50 Гц при 25 °С до 10 Гц при 50 °С>.

Замена Н,0 на Р„0 не вызывает сдвига сигналов в спектре Л2м (в пределах ±0,02 ррт).

Кислотная денатурация Р2и наблюдается при значениях рН*<5,0. Одновременное сосуществование денатурированного и нативного спектров позволило нам сделать вывод о достаточно медленном в шкале ЯМР обмене между денатурированным и нативным состояниями /32м.

К

Значение рН полуперехода ,в кислой области около 4,5. Значитель-

нов уширенмэ линий в сгоктре денатурированного состояния, сопровождающееся уменьшением полной интегральной интенсивности сигналов спектра, указывает на процесс агрегации денатурированных молекул белка, сопровождающийся значительным уменьшением их подвижности. Поскольку при ренатурации белка, т.е. при переходе от денатурированного состояния к нативному, интегральная интенсивность спектра не изменяется, был сделан вывод, что ренатури-рует только та часть молекул, которая в денатурированном состоянии дает вклад в спектр ЯМР, т.е. агрегировавшая в процессе кислотной денатурации часть молекул /?2м денатурирует (и агрегирует) необратимо.

Тепловая денатурация /?2м наблюдается при значениях температуры раствора Т>57 °с. Процесс тепловой денатурации, также как и кислотной, сопровождается процессом агрегации. Температура денатурации <т ) зависит от значения рН раствора и типа растворителя при рНк 7,0 белок более устойчив к тепловой денатурации <ТД=67 °С), по сравнению с рН* 6,0 (Тд=64 °С). При рН 7,0 /?гм более устойчив к тепловой денатурации в растворе Б20: ТДС ^0)=67 °С >

Т^СН 05=61 °С.

Д г

Ренатурирует только та часть белка, которая на агрегировала в процессе тепловой денатурации. Ренатурация после неполной тепловой денатурации сопровождается уменьшением интенсивности сигналов от Ь23, У67, Г70 и МЭ9 и появлением дополнительных сигналов, компенсирующих это уменьшение. На основании этого был сделан вывод, что часть молекул белка (1054) при ренатурации переходит в новое конформационное состояние, которое отличается от нативного в области нахождения остатков Ь23, У67 и Р70.

Скорость обмена амидных протонов белка с протонами растворителя является важной характеристикой, отражающей плотность

упаковки остатков в молекуле белка. Исследование динамики протонного обмена позволяет выявить области структуры белка, стабилизированные водородными связями (Wuethrich, 1986).

Используя метод дейтериевого обмена {Wagner, 1982), мы выявили 26 медленно обменивающихся с водой амидных (NH) протонов. Для 14-ти из них были измерены константа скорости обмена lcm. Диапазон измеренных значений Ijl'lO'^le^l^-lO^MHH"1. Локализация остатков, МН-протоны которых медленно обмениваются с водой, показанз на рис. 3 и 5. Все они включены в /9-структуру и проявляют дальние ЯЭО-контакты dNfjC i, j3 с соседними в структуре остатками, что характерно для остатков, образующих водородные связи.

Информация о межпротонных расстояниях, которую можно получить из NOESY-спектров, требует независимого определения времени корреляции (тс) молекулы. При определении т= мы воспользовались тем, что отношение неселекггивного (Т .) и селективного (Т"1)

Il 11

времен релаксации протона {1) в молекуле белка не зависит от межпротонных расстояний г , а зависит только от значения

Т 2«те)*-5Ц14 «О ^

♦ --2----—- , С13

V*1 3^5+8 (шт

где ы = 2гту, V - частота спектрометра.

Для выявления факта конформационной подвижности молекул белка мы воспользовались тем, что отношение времен селективной поперечной (Т°®1) и продольной <Т21) релаксации

5 + -9- + -6-

Т , 14(65Т )г 14(2ыт )2

I -5-С 23

Т21 2 1 + _3 А 6

14 {ОТ >2 14{2«Т )г

не зависит от г и (при отсутствии процессов обмена) не выходит за пределы 1< Т®е1/Т2<2,5 для всех возможных значений мтс.

В табл. I приведены как результаты измерений времен релаксации Т , Т2 и Т®"1 для некоторых протонов, так и вычисленные на основании этих значений по формуле С1) времена корреляции тс.

Табл. I. Измеренные значения времен релаксации протонов Рм Т1, Т2 и Т"1 (в секундах) и вычисленные по ф-ле С1) времена корреляции т (в 10~"с) .

Остаток Протон т 1 Та j9 » V у а « t yj, 1 2 J mSe l 1 1 T

Y67 аСН 5,5 0,046 0,16 3,5 34,3 3,8

Н84 2Н 4Н 5,6 5,4 0,082 0,064 0,25 0,19 3,0 3,0 22,4 28,3 2,9 3,4

W95 4Н 2Н 4,0 3,6 0,046 0,068 0,17 0,25 3,7 3,7 22,9 14,4 3,0 2,4

то 2Н 4,0 0,091 0,58 6,4 6,4 1,5

F56 сг,ен 3,8 0,016 0,35 22,0 11,0 2,1

За те для молекулы /?2м мы приняли измеренное для aCH Y67 значение т =3,8±0, S'lO'^c. Меньшее значение тс для боковых цепей аминокислот мы объяснили их повышенной локальной подвижностью, а разницу в тс для протонов боковой цепи одного остатка - влиянием спиновой диффузии (Kalk, 1976). То, что все измеренные отношения Т"1/Тг>3,0, мы интерпретировали как результат конформационной подвижности молекулы Д2м, в результате которой линии спвктра уширяются за счет процессов обмена между двумя шги несколькими конформационными состояниями молекулы /?2м.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИНОРНОЙ ФОРМЫ Пг м.

Идентификация минорной формы /?2м заключалась как в отнесении сигналов этой формы в *Н ЯМР-спектре белка, так и в использовании результатов биохимического анализа для интерпретации спектральных результатов.

Отнесение сигналов в спектре минорной формы было проделано на основании анализа COSY и NOESY-спектров образца /?2м с начальным содержанием минорной формы около ЗОЯ. Со временем содержание минорной формы росло и достигло 75-80%. На рис. 7 показана часть COSY-спектра этого образца /?2м с соотношением интенсивностей сигналов от основной и минорной форм 1:4. Процесс отнесения в большой степени облегчался близким совпадением ЯМР-cneicrpoB основной и минорной форм. Отнесение сигналов минорной формы приведено в табл. IV текста диссертации. Спектры ЯМР двух форм

8.3 е.г S.1 8.0 7.9 7.В 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2

РРМ

Рис. 7. Фрагмент области aCH/NH COSY-спектра /?2м. Соотношение интенсивностей сигналов от основной формы и изоформы 1:4.

fiVi различаются положениями сигналов от 18-ти остатков <13 такт остатков локализованы в /1-листе А, рис.8) и отсутствием сигнало! от Ile 1 и от сШ1г Gin 2 в спектре минорной формы /?гм.

Изоэлектрофокусирование образца Пгм, спектр которого приведен на рис. 7, показало, что соотношение основной формы с pi 5,7 и изоформы с pi 5,2 изменилось от 3:1 до 1:4, что дало нам основание заключить, что наблюдаемая нами в спектре ЯМР новая форма /?2м есть изоформа с pi 5,2. Поскольку в спектре вгм с pi 5,2 отсутствует сигнал от Gin 2, мы заключили, что основная форма ft к с pi 5,7 отличается от формы с pi 5,2 заменой Gin 2 на Glu 2, т.е. со временем происходит дезамадование глутамина в положении 2. Скорость этого процесса растет с ростом концентрации /32м в растворе. То, что при этом сдвигаются (в диапазоне ±0,15 ррт) сигналы от большого числа остатков в N-концевой области молекулы |?2м, причем главным образом от с»СН и NH-протояов, позволило нам заключить, что конформация изоформы fizm с pi 5,2 в этой области отличается от конформации основной формы бежа.

С53)

©-©-©-©-©-©-©-©-©-е-©-©-

V

VI

-©-©-Ш©-©-©-©-©-©-©-©-©- и

©-©-([уэ-©-©-©-©-©-©-©-

Рис.8. Локализация остатков в -листе А {отмечены толстыми кружками), положение сигналов от которых различно в двух формах /?гм.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Полученные наш экспериментальные результаты позволяют дать сарактеристику как поведению ß^m в целом, так и на внутримолекулярном уровне.

Так, несмотря на то, что этот белок сохраняет свою нативную структуру в широком диапазоне значений pH (5,0-11,0), максимум долговременной стабильности приходится на pH 7,0, что соответст-5ует физиологическим условиям pH крови.

Этот белок склонен к агрегации: увеличение концентрации 5елка свыше 10 мг/мл приводит к прогрессивному уширению линий ¡пвктра, что указывает на образование агрегатов, а при меньшей :онцентрации он, вероятно, образует димеры, на что указывает мсокопольный сдвиг сигналов от кольцевых протонов триптофана 60 [ри увеличении концентрации ßzn в растворе от 3 до 12 мг/мл.

Очень похоже, что изменение заряда кольца His 31 является ешающим фактором, запускающим "механизм" кислотной денатурации,

Ж *

юскольку значение его рК 4,6 совпадает со значением pH 4,5 юлуперехода белка из нативного в денатурированное состояние.

То, что в спектре вгм в Н20 наблюдаются сигналы от N3H is 84 и от }'ОН Thr 86 и то, что боковая цепь His 84 не титрует-я и его С2Н практически не обменивается на дейтерий в растворах 20, позволяет заключить, что полярные боковые цеш остатков His 4 и Thr 86 находятся внутри структуры белка, образуя водородные вязи с другими полярными группами бежа (возможно, друг с ругом). Такое защищенное от растворителя положение боковых впей His 84 и Thr 86, возможно, играет важную роль для функцио-ирования белка, поскольку во всех известных гомологах /?2м is 84 инвариантен, в то время как Thr 86 только в одном случае, ßn из мыши (Michaelson, 1980), замещается на остаток серина,

так что ^ОН-группа остатка 86 также консервируется.

Нижний предел измеренных значений константы скорости km обмена пегтпцщых NH-протонов с растворителем порядка 1-10~э мин-1 показывает, что остатки в структуре /?2м в целом не так плотно упакованы, как зто имеет место в глобулярных белках, для которых характерно значение 1ст порядка 1 •10~в мин"1 (Wagner, 1982). На это указывает и довольно низкая температура денатурации /?2м.

Наши данные указывают на повышенную конформационную подвижность структуры /?2м в N-концевой области (левее воображаемой линии, проходящей через /3-выступы, рис. 5) молекулы белка, что подтверждается следующими фактами: а) эта часть молекулы не содержит остатков, амвдные протоны которых медленно обмениваются с растворителем; б) сигналы от протонов основной цепи (NH и аСН) остатков, входящих в петлю 56-62 (кроме К58 и D59), сигналы от Gly 29 и Pro 32, а также сигнал от С2,6Н Phe 56 существенно шире остальных сигналов спектра; г) тирозин 63 более чувствителен к значению рН раствора, чем остальные остатки тирозина; д) изменения в спектре минорной формы ft к касаются именно ,этого участка молекулы белка.

Полученные нами методом ЯМР данные о структуре Пгм в растворе находятся в хорошем согласии с рентгеновскими данными о структуре /?2м, находящемся в составе HLA-комплекса. Сравнение элементов структуры Р2м человека, полученных из анализа наших данных для ft2M в растворе (Окоп, 1992) и из анализа рентгеновских данных для Я,м в составе комплекса HLA (кристалл) (Bjorkman, 1987; Garrett, 1991), приведено в табл. II.

Можно видеть, что практически все остатки белка, входящие в состав /?~структуры по ретгеновским данным, по нашим данным также входят в состав /^-структуры. Некоторые различия, в делом незна-

Табл.11. Структура ftaм в HLA (рентген) и в растворе (ЯМР).

HLA-A2.1 HLA-Aw68.1 !?2м (ЯМР)

/?-лист А

6-11 3, 6-11 3, 6-12

21-30 21-31 20-28, 31

62-70 62-70 61-71

50-51, 55-56 50-51, 55-56 50-52, 55-57

ft-тст В

44-45 44-45 44-45

35-41 36-41 36-41

78-84 78-83 77-83

91 -94 91-95 90-95

Зигзаги

16-19 С16-19)

41-44 41-44

57-60 57-61

84-87

читальные, в основной касаются концов /?-пепочэк и могут отражать различие в критериях принадлежности остатка к Д-струкгуре с точки зрения двух разных методов. Однако нельзя исключить, что отмеченные различия отражают тот факт, что структура ft и в растворе и структура Ргн в составе,комплекса HLA несколько различны.

Изученные наш свойства /?2м в растворе помогают подойти к пониманию некоторых особенностей, характерных для HLA-комплекса.

Так, совпадение (с точностью до поправки на изотопный эффект) полученного нами значения рК* 4,6 для боковой цепи His 31 и значения рКа 4,5 диссоциации HLA-комплекса (Revilla, 1986) позволяет предположить, что именно изменение заряда боковой цепи His 31, контактирущэго в НЬА-комшгексе с доменом а2 тяжелой цепи HLA, приводит к распаду HLA-комплекса в кислой области значений рН (во всех известных гомологах /5ам His 31, как и His 84, инвариантен). Предполагается, что такой распад происходит в

кислой среде эндосом после интернализации HLA-комплекса с поверхности клетки (Machy, 1987; Dasgupla, 1988).

Обнаруженная наш повышенная конформационная подвижность N-концевой области молекулы /?2м, по-видимому, является свойством, необходимым для функционирования молекулы /?2м. На это указывает как сам факт такой подвижности, так и то, что почти половина остатков, относящихся к этой области молекулы белка, в HLA-комплексе находится в контакте с тяжелой цепью. Скорее всего как это предполагают и другие исследователи (Parker, 1985), в HLA-комплексе /?2м принимает более стабильную конформацию.

Возможно также, что наблюдавшееся Паркером и Стромингером различив в скоростях распада HLA-комплекса (Parker, 1985) обусловлено наличием изоформы /?2м с pi 5,2, отличающейся; по нашим данным, от основной формы белка как зарядом, так и конформацией в N-концэвой области молекулы /52м и, вследствие этого, по-другому взаимодействующей с тяжелой цепью HLA.

вывода.

В результате проведенного исследования /?2м получены следующие результаты:

1. Проделано отнесение сигналов в *Н-НИР-спектре 02м (всего отнесено 588 сигналов), что позволило использовать технику ЯМР для изучения структуры /?2м в растворе и его физико-химических свойств на внутримолекулярном уровне.

2. Определена вторичная структура Пгм в растворе и некоторые элементы третичной структуры. Показано, что вторичная структура 0ям в растворе в основном совпадает со структурой /?2м в составе HLA-комплекса в кристалле.

3. Показано, что часть молекулы /?2м около N-конца, взаимо-

действующая с тяжелой цепью НЬЛ, обладает повышенной нонформаци-онной подвижностью и сделано предположение о важной роли такой подвижности для функционирования /?2м.

4. Показано, что боковые цэпи гистидина 84 и треонина 86 находятся внутри структуры пгм и защищены от растворителя.

5. Показано, что изотопный состав растворителя не влияет на структуру /32м в растворе.

6. Определено время вращательной корреляции молекулы /?2м в растворе.

7. Подтверждено, что в положении 42 аминокислотной последовательности /?2м человека находится аспарагин.

8. Проделано отнесение сигналов в 'Н ЯМР-спектре минорной формы /1м с р1 5,2. Показано, что основная форма белка с р! 5,7 в растворе постепенно переходит в изоформу с р1 5,2. Обосновано заключение, что форма Р^м с р1 5,2 представляет собой дезамидо-ванную основную форму /? м с р! 5,7, в которой глутамин в положении 2 замещен на глутаминовую кислоту и конформация молекулы которой в Ы-концевой области, ответственной за взаимодействие с тяжелой цепью НЬА, отличается от конформации основной формы белка.

9. Обосновано предположение о важности зарядового состояния гистидина 31 как для сохранения нативной структуры /32м в растворе, так и для стабильности и функционирования ША-комплекса.

10. Показано, что необратимость денатурации /?2м связана с агрегацией молекул /?2м в денатурированном состоянии.

И. Обнаружена промежуточная форма /?2м, которая образуется в процессе "мягкой" тешовой денатурации /?2м и структура молекулы которой отличается от структуры нативного состояния в области нахождения остатков лейцина 23, тирозина 67 и фенилаланина 70.

По теме диссертации опубликованы печатные работы:

1. Okon M.S., Bray P., Vucelie D. м1Н ЫМЕ assignments and secondary structure of human /^-microglobulin in solution". Biochemistry, 1992, 31C37), pp. 8908-8915.

2. Окоп M.S., Bray P., Vucelic D. "Secondary structure of human /^-microglobulin in solution". В кн.: "11th International biophysical congress, July 25-30, 1993, Budapest, Hungary, Abstracts". A5.29, p. 89.

3. Bray P., Окоп M., Vucic H., Vucelic D. "pH titration of human /^-microglobulin". В кн.J "11th International biophysical congress, July 25-30, 1993, Budapest, Hungary, Abstracts". A3.60, p. 68.

4. Bray P., Vucic M., Okon M.S., Vukovic D., Vucelic D. "Thermal unfolding of /^-microglobulin". В кн.: "11th International biophysical congress, July 25-30, 1993, Budapest, Hungary, Abstracts". A3.61, p. 69.

5. Vucic M., Okon M.S., Bray P., Vukovic D., Vucelic D. "Tyrosine interactions and titration in human /З-microglobulin." В кн.: "11th International biophysical congress, July 25-30, 1993, Budapest, Hungary, Abstracts". A3.71, p. 70.

6. Okon M.S., Okon E.В., Hranisavljevic J., Vucelic D. "NMR identification of isoform of ^-microglobulin." В кн.: "First Balkan Immunology Conference. November 29-December 2, 1995, Belgrade, Yugoslavia, Abstracts."

23.11.95 r. 3aK.6783P. Тир.100 экз. Усл.печ.л. Г.5

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН