Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов действия стимуляторов биосинтеза хлорофилла на фотоустойчивость фотосинтетического аппарата

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов действия стимуляторов биосинтеза хлорофилла на фотоустойчивость фотосинтетического аппарата"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

РГ6 ОД Биологический факультет

3 На правах рукописи

УДК 581.174.1 :577.355.2 + 577.344.3 : 632.954

НЕВЕРОВ Константин Викторович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ СТИМУЛЯТОРОВ БИОСИНТЕЗА ХЛОРОФИЛЛА НА ФОТОУСТОЙЧИВОСТЬ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО

АППАРАТА

03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва— 1994

Работа выполнена на кафедре физиологии растений (зав. кафедрой академик А. Т. Мокроносов) и кафедре физико-химической биологии (зав. кафедрой д. б. н., профессор Ф. Ф. Литвин) биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

доктор биологических наук, профессор Н. В. Карапетян,

доктор биологических наук, вед. науч. сотр.

Т. Е. Кренделева

Ведущая организация: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН, г. Пущино-на-Оке

Защита диссертации состоится » 1994 г.

в ^^^ас. на заседании специализированного совета К.053.05.14 в Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М. В. Ломоносова, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Научные руководители:

академик РАН |А А- Красновский,

доктор биологических наук, профессор А. А. Красновский, мл.

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан < ¿4

»

1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

О. Г. Полесская

Общая характеристика работы

I. Актуальность темы. ;

Продуктивность зеленых растений, как известно, во многом зависит от вффективнэсти работа их фотосинтетического аппарата (ФСА), которая определяется его способпостьа к эффективной утилизации солнечной энергии на всех этапах развития растительного организма, как в нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов. При • этом ФСА, поглощая и преобразуя солнечную энергию, одновременно подвергается- и поврэкдащему, деструктивному действию солнечного света. Замочено, что фотояовреадениэ пигментного аппарата фотосин-. теза усшвшается пря нарушении натавности его мембранных структур, ■ под воздействием патогенных вирусов и. грибов, ионов тяже^гх металлов, разйгх колзСёшй температура, гербицидов, некоторых генетичэс-ггпх ¡.*7ТЕЦзй п друпс: &гсторов. Развитие, п результате указанных ' воздействий, фотодоструктотных процессов в хлорепппстах приводит к подпвлвкжо фотоететвза е, в случае необратимых коврэцденкй, к габе-, ля растений. О'ахет с5ря"ом, устойчивость ФСА к ювреядгще'му действии еврта является Егянкм факторе« продуктивности растений и адаптация т. к пеблЁТОприягнш условиям среди." Очевидно, что изучение танэкуяярннх кэжЕяжгчов фотодаотрукцин ТСД при .действии факторов,

- ■ опюжеесп его ^отоуотойташость, шябвт ВБкное значение для дальнейших ксследовяккй ■ обО'5й£ностеЯ его функциокфовякия, а также для

: отбора уотоСчпгкх я продужгивзнх сортсз растение. ...

Особый ажзрэо для итзучшая мзхблизков фотодэструктйжых про-.цаееоз предстоБгявт класс ссэдпгоша, стамулирущах процесс биосин-здза.хюруфшш (Хп> гг щгазодапх к разковд сникению фото^стойчиво-отн <К31 яв очзт кавегогаяаж в' хлороплаотах избыточного йоличэства • штф^хасв-^ддас^танвжоз Хл. Этот класс соединений, Называемых 43отодагшаад<а1гмв ЕФрйщвдакя, в нветоадээ время активно Изучается. Црэдадчроптеч, что ншахдавст^зся в отеот па обработку фотогерби-пздсаа ргаадгзстюшяза 2л. ыгзззеет? фотопоьрзздзнжэ тгггаентпого ап-. ■ каратэ и ш'ЪСА пзшшдацди фотоокислптелышх реакций с утаожзй тсзсяоройз. Еггркйнтя гззслэскач ж спектральная гетерэгед-гость щгла пр»даопюЕаягов хлорофилла определяет необходимость аояовевяя гацашзма не учестия в фотодэструхтившпс реакциях, что и

- ЖИЛОСЬ 'йвдао ЕЗОТОИ^а работа. ••,.-'

2. Цоль и задачи исследования.

Проводившиеся ранее исследования показали, что важная роль в развитии повреждения ФСА под действием света, принадлежит молекулам Хл в возбужденном триплетом состоянии и синглегному молекулярному кислороду (1о2), которпе, наряду с другими активными формами кислорода - супероксид-анион-радикалом, гвдронсильным радикалом и перекисью водорода, инициируют фотодеструктивные процессы [Красновский мл., Лебедев, Ковалев, Егоров, Литвин, 1975-1986, Asada et al, 1977; Knox, Dodge, 1985, Мерзляк и др., 1986]. Основная цель работы состояла в изучении способности молекул порфиринов, накашашавдихся в хлоропласта! при воздействии стимуляторов биосинтеза Хл, образовывать триплетное состояние и генерировать синглетннй кислород. Методической основой для этого исследования послужила прямая регистрация тршхлэтних молекул порфиринов и Хл, а также синглетного кислорода путем измерения их собственной фосфоресценции [Красновский, мл. и др., 1971-1982]. Бри выполнении настоящей работы били поставлены следующие задачи:

I)Исслэдовать фосфоресценцию Хл "а" и его Оносинтетических предаествеиников в хлоропластах растений при обработка кх стньуля-торами биосинтеза Хл.

2 Остановить корреляцию между эффективностью образования три-плетного состояния молекул пигментов и снижением фотоустойчивости хлороплзстов растений в результате воздействия стимуляторов биосинтеза Хл или факторов, нарушающих нативность ФСА.

3)Исследовать фотосенсибилизацию люминесценции синглетного молекулярного кислорода хлорофиллом и его предшественниками с целью выяснения возможности образования 1о2 в хлорояластах обработанных фотогербицидами растений.

3. Научная новизна.

Путем измерения фосфоресценции установлено образование три-плетного состояния молекул предавственников Хл в листьях и хлоро-пластах растений, обработанных стимуляторами биосинтеза Хл: 5-Еминолевулиновой кислотой (АЛК), глутаминовой кислотой (ГлК) и хе-латорами металлов - 1,10-фенантролином (Ф) и 2,2'-дипиридилом (ДП). Сопоставление интенсивности фосфоресценции в листьях со степенью фотодинамичэского повреждения растений дало возможность оценить относительную эффективность порфириноБ и Хл "а" в развитии фотоде-структпшшх процессов, снижающих фотоусгойчивоогь ФСА.

Показано, что в листьях опытных растений спектры фосфоресценции и соотношения спектральных форм порфяринов и Хл, способных к эффективному'образованию триплетных молекул, сильно зависят от химической природа использованных фотогербицидов.

Обнаружено, что магний-протопорфирин, протохлорофиллид, хлорофилл "а" и, возможно, его безмагниевые аналоги наиболее эффективно образуют триплетное состояние в обработанных фотогербицидами растениях. Получешше данные свидетельствуют, что фотосонсибилизатора-ми фотоокислятелышх процессов в хлоропластах таких растений преимущественно являются коротковолновые, вероятно, мономэрныо состояния молекул пигментов.

Обнаружена и исследована фотосенсибилизированная порфиринамн и другими пигментами люминесценция колебательно-Еозбукденнпх и димэр-шх молекул синглетного кислорода в растворах. Сделано заключение о возможном участии этих молекул в фотодеструктивных процессах в клетке.

4. Практическое значение работы.

Улучшены технические характеристики установок для регистрации фосфоресценции пигментов, что позволило повысить чувствительность данного метода при изучении образования триплетных молекул пигментов в растворах и живых системах, а также генерации га синглетного кислорода.

Установлено, что фотодшамическое действие стимуляторов биосинтеза Хл на растения обусловлено накоплением в них большого количества предшественников Хл в тех формах, которые эффективно образуют триплетнвд состояния и способны к генерации синглетного кислорода. Это указывает на участие триплетных молекул пигментов и 1о2 в фэтоповреждении CECA и является ванным для целенаправленного подбора новых эффективных фотогербкцидов.

Показано, что метод измерения фосфоресценции может быть использован для экспресс-анализа ¡эффективности и механизма действия фотодинамических гербицидов, а такяэ диагностики снижения фотоустойчивости ССА при действии на растения стрэссосых факторов.

Получешше результаты по изучению фотофизических свойств растительных порфяринов и их аналогов могут быть использованы для разработки на их основе фармакологических препаратов для фото динамической терапии. Такое же значение может иметь и обнаружение свойства порфиринов инициировать образование димеров и колобатолыго-воз-

- v -4 - ■ • ' .• „;. .... ....,.......

букденных молекул синглетного кислорода. V,-',.

Б. Апробация работа. ';;' Л\■ •'* ''■/■>_

Результаты работы докладывались на заседаниях кафедры физиологии растений ЫГУ, на Всесоюзных конференциях: "Структурная динамика ; ' биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических к , реценторных процессов", 1988 г., г. Минск; "Преобразование'световой внергии в фотосиытезирукцих системах и их моделях", 1989 г., г. . Пущино; на XI Съезда BOSP, 1990 г., г. Минск; на международных конференциях: Советско-индийском симпозиуме по регуляции фотосинтеза, / 1990 г., г. Пущшю; IX Международном конгрессе по фотосинтезу, 1992 г., г. Нагойя, Япония и ХЗ Международном конгрессе по фотобиологии, 1992г., г.Киото, Япония. ;• ■ " •:."

6. Публикации. ,■'.}.-

Основные результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, ;

представлены в 14 публикациях. . .V .;'„•;. '.л/

7. Структура диссертации.'.

Диссертация состоит из "введения, обзора литературы,. экспери-. •• ментальной части из пяти глав (включая методы и объекты ирслвдова-';' ния), заключения, выводов и списка цитированной литературы. .■'. Я •'. -

Содержание диссертации •'".'.

Часть I. Литературный обзор. . , " • , • ' .

Б литературном обзоре охарактеризованы (физиологические мехвни-. змы фотоустойчивости ФСА растений, а таете фотодеструктивные процессы, развивающиеся при ее сшженни под воздействием стрессовнх факторов. Проанализирована роль возбувдашшх состояний хлорофилла и- , активных форм кислорода :в развитии фотоокислйтельных процессов в тканях растений. Описан класс, фотадинавтэских гербицидов, наруша- / вдих процесс биосинтеза Хл "а" в хлоропластах и вызывающих фотоди-; намическое повреадение ФСА и- гибель-растений.' - .-С

В заключение литературного обзора сформированы экспериментальные задачи и направления их решения. •" .'":.:.

Часть П. Экспериментальный результаты и обсуждение.

Глава I.' Объекты и метода исследования.

Объектами исследования служили листья и хлоропласта зеленых проростков гороха, фасоли и пшеницы, талломы морских зеленых водорослей Ulva rigida и Enteromorpha Intestinalis, экстракты пигментов, а также растворы Хл "а" и его производных, бактериофеофитина, растительных и синтетических порфиринов и других, пигментов.

Семена некоторых растений, культуры водорослей и грибов и некоторые пигменты были получены на кафедре физиологии растений МГУ и в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (РАН). Часть образцов была приготовлена в сотрудничестве с Институтом фотобиологии АН БССР (г. Минск). Очищенные растительные и синтетические порфирины и красители были получены из Московского института гонкой химической технологии, Института полупродуктов и красителей: и Текстильного института (г. Москва).

Обработка растений стимуляторами биосинтеза Хл производилась методом опрыскивания 14-15-даевных проростков аэрозолями, содержащими растворы фотогербицидов (30 мМ АЛК, 15 мМ ГлК и/или 5-30 мМ Ф и ДП) в смеси ацэтон-атвнол-О,1% Твин 80-вода (4,5:4,5:1:90). Доза обработки составляла 0,5 мл/проросток для гороха и 0,3 мл/проросток для пшеницы. После обработки проростки инкубировали в темноте при 25-27°С 17-20ч. Приготовление образцов для измерения фосфоресценции и выделение хлсропластов производили в темноте при слабом зеленом сЕетэ. В качестве контроля использовали растения, опрысканные указанной смесьп растворителей без фотогербицидов и инкубированных, в темноте (темповой контроль), а тагакэ не подвергавшиеся опрыскиванию и темновой инкубации растения (световой контроль).

Фосфорасцанцив Хл и порфиринов измеряли в образцах, фиксированных жидким азотом при 77К, используя установки о механическими фосфороскопами [Красновский мл. и др., 1975-1978], ксононовыми лвм-пвми в качестве источников возбуждающего света и охлаждаемыми фотоумножителями ФЭУ-83 в качестве детекторов. Установки позволяли регистрировать замедленную лшинэсценцию и фосфоресценцию пигментов о временем низки (tph) 2500 ккс и квантовым выходом (<Pph) И0~7-10~в и определять спектральные и кинетические нэраметры изучаемых послесвечений. Конструкция установок позволяла также измерять спектры излучения и возбувдения флуоресценции исследуемых образцов.

Фотосенсибилизирозашая люминесценция 1о2 изучалась при комнатной температура на тех же установках [Красновский, 1979], в растворителях, где ее время ккзни Хд>500 икс и квантовые выходы Фд^СГ6.

Фотоустойчивость пигментного аппарата растений изучали путем измерения скорости фотовыцветания Хл "а" в суспензии хлороштстов или в талломах зеленых водорослей. Относительные скорости фотовы-цветвния Хл в суспензиях хлоропластов и в талломах водорослей получали путем сравнения скорости фотоокислешя Хл в живых системах и в растворах Хл "а" в органических растворителях при нормировании скорости выцветания к общему количеству света, поглощенному Хл [Красновский мл., Ковалев, Фалуда-Даниэль, 1980; Егоров, Крарновс-кий мл., Кулековская, 1985]. Физиологическим тестом на степень фо-топовревдения ФСА служило полярографическое измерение скорости вы-, деления кислорода суспензиями хлоропластов.

В экспериментах использовали также метода абсорбционной спектроскопии и стандартные лабораторные методики культивирования растений, выделения хлоропластов,-хроматографической очистки пигментов и другие. • ; '

Глава 2. Изучение фотодеструкции ФСА растений под воздействием

фотодинамических гербицидов.

В согласии с литературными данными [Ребайц, 1934; Аверина и др., 1986-1989], быстрое развитие фотодеструктивных процессов, со-прововдавшееся выцветанием и обезвоживанием зеленых тканей,.наблюдалось при освещении светом 20000-30000 лк однодольных (пшеница) и двудольных (горох, фасоль) растений, подвергшихся воздействию стимуляторов биосинтеза Хл, являпцихся компонентами фотодинамических гербицидов: 5-аминолэвулипово" кислоты, глутаминовой кислоты и ме-таллхелатирунщих агентов (дишридила и. фенантролина), вызывающих темновое накопление в хлоропластах порфиринов г биосищатических предшественников Хл.

Было установлено, что при освещении красным светом (АгбОО нм) в суспензиях хлоропластов нормальных растений гороха или фасоли скорость фотовыцЕегания Хлиа" в 200-250 раз меньше, чем для Хл "а"' в ацетоне, что соответствует данным работы [Егоров и др'., 1985], а для хлоропластов, выделенных из растений, обработанных аэрозолем, содержащем 30 мМ АЛК - в 25 раз, то есть фотоустойчивость ФСА под

действием фотогербицидов снижается в 10 раз. Было также показано, что в хлоропласта* обработанных АЛК растеплй выделение кислорода при действии интенсивного света подавляется за 10-16 мин, когда фотоокислепия Хл почти не происходит. Это свидетельствует о большей чувствительности электрон-транспортной цепи фотосинтеза (возможно, на уровне переносчиков фотосистемы П) к действии сильного света.

Заметный фотодинамический эффект (ФДЭ) наблюдался также по фотошцветанив Хл в талломах зеленых водорослей под действием на них ионов тяжелых металлов. Можно предположить, что действие на растения тяжелых металлов (как и других стрессовых факторов) несет на себе признаки фотогербицидного действия и, возможно, имеет общие со стимуляторами биосинтеза Хл стадии в механизме развития фотоде-структЕпннх процессов.

. Измерение спектров действия фотовыцветашш Хл "а" в суспензиях хлоропластов показало, что в случае растений, обработанных АЛК, в длинноволновой области наиболее активен спектральный диапазоп 620540 ни; относительно небольшой активностью обладал диапазон 660-680 гол. ГГершД, вероятно, соответствует поглощению прздществешшков Хл, второй - Хл "а". При обработке растений хелаторачл максшлум спектра дэйстзия фооокиоления Хл смещался в область БЯ0-600 им, также, по-видимому, соответствующую поглощении порфиринов.

Доказательство участия разных спектральных форм Хл и его предшественников в сенсибилизации фотодаструкции пигментного аппарата было получено при исследовании НЕПкотешературной фосфоресценции в листьях растений, обработанных стягу литерами биосинтеза Хл.

Глава 3. Иослодовшио Фосйорпсцевдки Хл а его предшественников ври воадеЯствта фагоданамичаскшс гербвдядов на растения.

I. О&г.яя гарактержгтам спектров Естзкотемгературяоа фосфорссцвнцш! тсшзктсв <2СА.

. В согласии с ранее опубликованными допишет неезй лаборатории, намерения спектров излучения и возбуждения низкотемпературной (77К) фосфоре оцепции в листьях, и хлоре пластах растений выявили образование тришготяых молекул ряда пигментов. Для идентификации по спектрам послесвечения пигментов ®СА были использованы ранее полученные данше по, фосфоресценции индивидуальных порфиринов в растворах и модельных системах» а также по фосфоресценции Хл "а" и протохлоро-

- а -

филлида (ПХд) в зеленых, зеленеющих и этиолированных листьях растений [Красновский мл., Литвин, Лебедев, Ковалев, Егоров, 1975-1986].

Наиболее интенсивной, наблюдавшейся в листьях контрольных и обработанных фотогербицидами растений, была полоса послесвечения 735-740 нм (tpjj* 30 ыс). описанная ранее в работах нашей лаборатории [Красновский мл., Ковалев, 1978; Ковалев и др., 1981; Ковалев, 1986]. Ранее послесвечение в области 735-740 нм удавалось регистрировать при низких и комнатных температурах в листьях и хлоропластах высших растений [Tollin et al, 1958; Шувалов, Литвин, 1969; Sane et al, 1930]. Предполагалось, что послесвечение 740 нм является сенсибилизированной каротином люминесценцией хл "а" светособиращего комплекса (ССК) [Шувалов, Литвин, 1969]; имеются данные, что оно принадлежит фотосистеме I (ФС I) [см. Sane et al, 198O]. Наши измерения показали, что полоса послесвечения 740 нм соответствует по основному максимуму низкотемпературной флуоресценции данных объектов, а спектр возбуждения этой полосы имеет набор максимумов, нэ характерный для порфиринов и каротиноидов: 360, 470, 530 нм и плечо 590 нм. Максимумы в ближней ультрафиолетовой и синей области характерны для флавинов, поэтому свечение 740 нм может быть также интерпретировано как фотосенсибилизированная флавинами замедленная люминесценция Хл в ССК или ФС I.

При коротковолновом (X > 420 нм) возбуждении люминесценции полоса 740 нм в 20-40 раз превышала все остальные полосы, маскируя их. Интенсивность ее достоверно не возрастала при воздействии на растения АЛК, ГлК и хелагоров в концентрациях, приводящих к снижению фотоустойчивости ФСА (табл. I). Поэтому формы пигментов, связанные с появлением полосы 740 нм, не могут, очевидно, рассматриваться как сенсибилизаторы фотодеструктивных реакций в хлоропластах.

При длинноволновом (Л z 600 нм) возбуждении люминесценции были зарегистрированы полосы послесвечения, принадлежащие Хл "а" и его предшественникам. Было установлено, что обработка растений стимуляторами биосинтеза Хл во всех случаях приводит к возрастанию в листьях фосфоресценции порфиринов и Хл "а", спектральная картина которой зависит от используемых объектов и фотогербвдидов.

2. Влияние обработки растений АЖ.

Фосфоресценция порфиринов и ПХд. Действие 5-АЛК в концентрации 30 мМ на проростки гороха и пшеницы вызывало значительное, на 2

Таблица I. Соотношение интенсиЕностей полос фосфоресценции в листьях проростков гороха при обработке их 5-ЛЖ.

Образец Полскепиэ максимума фосфоресценции

737 нм (Хл из ПЕК) 875 нм (ПХД) 975 нм (Хл "а")

Световой контроль I I I

Темновой контроль 1,2±0,3 2,8±0,5 2,2±0,5

Опыт, 30 нМ АЛК горох 1,1±0,3 . 80±30 3,6±0,7

Примечание. Интенсивности всех полос фосфоресценции в листьях растений "енотового контроля" приняты за единицу.

порядка величины, возрастание в листьях фосфорэецэнщш с максимумом щи 875 нм (тр1*5 м8), которой соответствовал спектр возбуждения с максимумами при 450, 540 , 580 и 627-629 нм, харектврннй для коротковолновое, швитшшоЛ в фотобиосинтезэ формы протохлорофиллида "а" (Р62?) и соотвзтствущий спектру поглощения ПХд в растворах (рис. I, табл. I). Ранеэ фосфоресценция Р627 с максимумом при 870 ш была зарегистрирована в этиолированиях и зеленеющих листьях фасоли [Краетовгашй мл. и др„, 1975, 19ТГ, Игнатов п др., 1933].

Показанию ранее интенсивное твмновоо натопкешэ ПХд в тканях рестанзй, обработанных АШ [Тралак, 1963; зипс!ч*1 пЬ, 1969; ЕеЬе1и еЬ аЗ, 1334; Дверина, 19363, происходит, как следует из наших зке-порэлзнтов, в вида коротковолновой, слабо связанной с белком форма Бб27, ш-видасэду, из-за похватай "посадочных, ьмст" на молекулах го.тахрсыа, осу^ествлятцего фэтохЕмаческоэ превращении ГОЛ в хгоро-фяллэд "а" (Хед).

Спектр действия фотовыцветания Хл в суспензиях хпоропластов, щделоншх из обработанных АЛК растений, шкот, как указывалось, максимум а краской области около 630 км, что совпадает с красной полосой поглощая РКЗТ. Моягю поэтому заключать, что коротковолно-

вая форма ПХд, синтезируемая в темноте в хлоропластах из экзогенной АЛК и неактивная в фэтопревращении, играет роль основного фотосенсибилизатора, инициирующего эффективную фотодеструкцию ФСА:

ш тш!^ ^(РбЗ?) 1ПХд-* 3ЛХд

кислородзависимые фотоокислительные реакции

Обработка однодольных растений (пшеницы) высокими дозами АЛК (до 30 мМ) вызывает, как было показано, интенсивное накопление пор-фиринов в зеленых тканях, сопровождающееся выраженным снижением фотоустойчивости ФСА [Аверина и др., 1986, 1988, 1990]. Исследование спектров послесвечения в листьях обработанных АЛК растений пшеницы обнаружило резкое возрастание фосфоресценции не только коротковолнового ПХд, но более раннего предшественника Хл %-протопорфирина IX и/или его монометилового эфира (Ыз-ПП(Э)). Фосфоресценция Иё-ПП(Э) имеет максимум 800-820 нм, максимумы возбуждения 423 , 550 и 588 нм и время жизни т^ « 10 мс.

Было обнаружено, что в изолированных, с заведомо поврежденными наружными мембранами хлоропластах, фосфоресценция Р627 падает по крайней мере в 10 раз, что указывает на потерю ПХд при выделении. Фосфоресценция м§-Щ(Э) при этом остается практически на прежнем уровне, что говорит о более прочной связи этого предшественника с мембранными структурами ФСА. В суспензиях хлоропластов, выделенных из обработанных АПК проростков гороха, также удалось зарегистрировать фосфоресценцию Ме-ПП(Э), которая в листьях была полностью скрыта гораздо более интенсивной фосфоресценцией ПХд.

При изучении фосфоресценции %-ПП, ПХд и более раннего предшественника Хл протопорфирина IX (Ш) в растворах выяснилось, что по спектральным и кинетическим (трЬ) параметрам полосы послесвечения в листьях растений, обработанных АПК, соответствуют фосфоресценции мономерных форм пигментов, наблюдающейся в органических средах и водных растворах, содержащих мицеллы детергента Тритона Х-100, моделирующих липидное окружение мембран. Это подтверждается тем, что спектры возбувдения фосфоресценции и ПХд в листьях растений

совпадают со спектрами поглощения данных порфиринов в растворах (рис. I, 2).

Рис. I. Спектры низкотемпературной (77К) фосфоресценции пигментов в зеленых листьях гороха. 1,2- спектры излучения; 3 - спектр возбуждения фосфоресценции. 1,3- опыт, 30 мМ АЛК; 2 - световой контроль. 4 - спектр поглощения ПХд в этанола. Возбуждение люминесценции - через светофильтр КС-II (te6I0 нм); регистрация - через ИКС-7 (Лл 860 нм).

Досфоресцевция Хл "а". В согласил с ранее полученными данными [Ковалев, КрасЕовсккй мл., I978-1986] в зеленых листьях гороха, фасоли и пшеницы га нэблвдвли фосфоресценцию Хл "а" с главным мек-схмумом при 978±3 ем и временем жизни xp5las 2 мс. В спектре возбук-дония полоса 978 нм соответствовал главный максимум при 665-668 нм и плечо 680-685 га. Затекнешю растений на 17-20 ч приводило к небольшому (в 1,Б~2,Б раза) увеличению ее интенсивности (табл. I, 2). Тек кск подобное затемно нив но влияло на фотоустойчивость растений, а посттоквовая подсветка слабым светом (1500-2000 лк) снижала фосфоресценцию 978 нм-до прежнего уровня, можно заключить, что наблюдаемое) увеличение свечения 980 ем отражает обратимые адаптационные перестройки в шшавт-болковых комплексах (ШК) фотосистем или в центрах биосинтеза Хл "а", связанные о пространственным разобщением . его от карогановдов.

При тэмновой инкубации растений, обработанных аэрозолем с 30 мМ АЛК, фосфоресценция Хл "а" при Э7Б-Э80 нм усиливается в 2,5-4 раза (табл. I). Интенсивность этой фосфоресценции в результате посттемновой подсветки опытных растений (1500 лк, I ч) снижалась, как и у контрольных растений, практически до прежнего уровня, что также указывает на обратимые темновые перестройки в ФСА.

В растениях, обработанных АЛК, ш наблюдали дополнительный коротковолновый максимум фосфоресценции Хя "а" при 955 нм (в спектре возбуждения соответствовала полоса с 665-670 нм), которая в

контрольных растениях имела крайне низкую интенсивность. Обработка АЛК вызывала возрастание этой фосфоресценции в 4-7 раз, тогда как затемнение контрольных растений - 1,5-2,5 раза. При этом посттэмно-вая инкубация в течение I ч на свету 1Б00-2000 лк опытных растений несколько уменьшала полосу 955 нм. Предполагается, что полоса 955 нм принадлежит молодому Хл "аи в центрах биосинтеза, встраивающемуся в ПЕК фотосистем ва свету. Возможно, усиление фосфоресценции 955 нм в темноте также связано с адаптационными перестройками в ПБК фотосистем или центров биосинтеза. Не исключено, однако, что фосфоресцирующий Хл накапливается при обратимой темновой деградации ПБК.

Заметное усиление коротковолновой фосфоресценции Хл "а" при 955 нм в листьях опытных растений может, очевидно, объясняться повреждением нативности ПБК под действием экзогенной АЛК. Так, было установлено, что повреждение мембранных структур ФСА при прогрева^ нии, перемораживвнии листьев или выделении изолированных хлороплао-тов резко усиливает фосфоресценция 955 нм (Тр^ 1,6'мо), принадлежащую, по-видимому. Хл "а", отделенному от каротиноидов и белков в результате разрушения части ПБК.

Усиление фосфоресценции Хл в темноте может быть следствием темнового биосинтеза небольших количеств Хл "а" в хлоропластах; возможность этого процесса у покрытосеменных была показана ранее [Айашзоп е% а!,.1981, 1984г Рудой, Чканикова, 1988). В согласии с последним предположением, действие АЯК на культуру АпаЪаепа уаг!а-ЫИв вызывало резкое усиление фосфоресценции Хл при 955 нм, тогда как фосфоресценция предшественников на регистрировалась. Это указывает на полное темновое превращение синтезированного из экзогенной АПК пула предавствеников\в Хл, что согласуется о известным свойством цианобактерий синтезировать Хл в темноте [РевоПек et а1, 1939].

Таким образом, повышение концентрации фосфоресцирующего Хл "а"

в листьях обработанных АЛК растений, может свидетельствовать об участии его триплетных молекул в фотодеструкции ОСА, вызванной действием фотогербицидов. Это подтверядается наличием плеча в области поглощения Хл (665-67Б ш) в спектре действия фотовацватаняя Хл в суспензиях хлоропластов. По-видимому, вклад триплетного Хл в инициацию процессов фотодеструкции невелик по сравнению о ПХд, однако, при необратимом повреждении ЦБК, сопровождающемся выходом из них молекул кономерного Хл, он может резко возрасти.

3. Влияние обработки растений хедатораки металлов и ГдК.

Хелаторы металлов, как было показано, сами по себе вызывай* понижение фотоустойчивости ФСА растений путем стимуляции темнового накопления избыточных количеств порфиринов в хлоропластах в результате двух процессов: хелатирования ионов железа, в результате чего снижается содержание в хлоропластах гема, ингибирукщего АЛК-синтетазу, то есть стимуляции биосинтеза Хл, а также ингибирования фермента, превращавшего мономятиловый эфир М^-ПП в ПХд, то есть торможения биосинтеза на стадии и^-ПЛЭ [Пи^ап, оаввтап, 1974]. Известно также, что ДП и Ф способны удалять Ыё2+ из молекул Хл "а" о образованием феофитина "а" (Фн), или феофорбида "а" (Фд), в случав взаимодействия с Хлд. Согласно литературным данным, применение высоких концентраций ДП я Ф (20-30 мМ) вызывает темновое накопление ®н в значительных количествах - до 10 % от общего пула Хл "а" [Аверина, ШалыГс, 1989]. Предполагалось, что ПП IX, Мб-ПЩЭ) и Фа, накапливапциеся в хлоропластах, являются основными инициаторами фотодеструкции ФСА обработанных хелаторами растений.

<&сфоресценция предшественников Хл. Изучение , фосфоресценции (77К) в листьях обработанных Ф и ДП растений, открыло сложную спектральную картину. Наиболее интенсивной была фосфоресценция %-ПП(Э) (тр11 * 10 мс), возраставшая с увеличением концентрации хелатора; спектр возбуждения ее имел максимумы 423 , 550 и 588 нм и совпадал с полученным для и§-Ш1 в растворах (рис. 2). Максимум этой фосфоресценции по сравнению с наблюдавшимся в растворах М£-ПП был смещен в длинноволновую сторону: 820 нм вместо 750-760 нм. Так как спектр возбуждения полосы 820 нм свидетельствует о присутствии мономерной формы Ме-ПП(Э), то, по-видимому, имеет место перенос энергии возбуждения с Ые-ПП(Э) на агрегированный порфирин (например, Ш) или, что вероятнее, комплекс порфирина с белком. Это предооло-

Рис. 2. Спектры низкотемпературной (77К) фосфоресценции пигментов в золеных листьях фасоли при дэйсгвги холаторов. I, 3, 4, б - опыт, 20 мМ Ф; 2 - контроль. Возбуадбние послесвечения - через ОС-11 535 нм) - I, 2; через КС-И (Ад 610 км) - 3. Регистрация послесвечения -через ИКС-7 (Х> 860 нм) - 4; через интерференционный светофильтр (^ках= 818 ш) - 5. 6 - спектр поглощения %-ППЭ в этаноле.

женке подтверждается тем, что при раарувешш структур ФСА (фиксация листьев горячим парой, экстракция пютшнгов ацзтонсм) ' б опытных образцах полоса 820 н» ш Ееблодаэтся.. Установлено тшага, что интенсивность свечения в сйлзоти 820 им в опытных рлсгзхзиа; ш -срав-ненав о контрольными увеличивается по крг2нэа пэра в Б-6 раз.

Собственной фосфора ецекщги Ш Ев было обнаружено нк в одном образца, хотя уровень ого накопления под даВотшем хзлаторов сравним с цолучегаЕга для %-121(э) [¿Евргнз, 1930]. воешкяо, пул пп агрэгирован или находится в соцряздашгп с • гушггеляки тршглэтного состояния, резко сникагщиш квантовый выгод его фосфоресценции.

При изучении действия хе'латороь регистр^ювалась также фосфо-ресцзация коротковолновой форма ПХд - Р627. Параметр! свечетт соответствовали наблвдавшмся в опытах с АЛК (рис. I, 2). Иаксимуы этой полосы фосфоресценции расположен ера 875 ш, основные макевду-

мы возбуждения при 443-445 (регистрируется в виде плеча из-за суперпозиции о полосой Ы&-ПП(Э) при 423 нм) и 627-629 нм; т л* 4,5-5 мс. При втом содержание ПХд в листьях опытных растений оставалось практически таким кэ, как у не обработанных Ф растений.

Не исключено, что хелаторы вызывают переход ПХд из длинноволновых, активных в фогобиосинтезэ форм в фотона активную коротковолновую Р627, способную выступать в качестве фотосенсибилизатора. Эта форма обнаруживается по фосфоресценции при всех использованных концентрациях хелаторов (табл. 2), но, по сравнению со свечением к&-ПП(Э) в тех г,в образцах, фосфоресценция Р627 слабее в 3-6 раз.

Таблица 3. Зависимость интенсивности фосфоресценции пигментов в зеленых листьях фасоли от концентрации холатора и ГлК.

Сенсибилизатор и положение максимума фосфоресценции

Образец %-ПП, 820 нм ПХд, 875 нм Хл"а", 955 нм Хл"а*\ 980 им

Световой контроль 0 1,0* 1,0* 1,0

Темвовой 0 0,810,2 0,6±0,1 1,6±0,2

контроль

Опыт, 5 мМ ф 28±3 6,041,0 9,0±1,5 1,8±0,2

Опыт, 15 ММ Ф 60±5 8,5±1,0 П±2 2,3±0,2

Опыт, 20 ММ Ф 100 12±3 • 13±2 2,610,3

Опыт, 15 мМ ГлК + 5 мМ Ф 26±3 17±3 8,5+1,5 2,61:0,3

Примечание. Интенсивность полосы Кз-ПП(Э) в опыте с 20 мМ Ф была принята за 100?. Интенсивность фосфоресценции Хл "а" (930 нм) в контрольных образцах была принята за I.

*3а I принята разность мовду темновым и световым контролями. Относительные интенсивности для ПХд и Хл "а" (955 нм) рассчитывали по формуле: (опыт-свет, контр.):(теми, контр.-свет.контр.).

Интересно, что посттзшовал подсвотка (I5C3Q- 2000 ж) в течение I часа опытных растений вызывает резкое снижение интенсивности свечения 875 нм. Видимо, на свету Р627 постепенно претерпевает обратное превращение в фотоактивную форму, то есть хелаторы не повреждают -структуры голохрома, связыванцего ПХд и осуцествлязяцего его фотоконверсии. Было при этом установлено, что подсветка слабым светом нэ влияет на интенсивность фосфоресценции к^-Ш(Э).

Глуташшовая кислота, явдящаяся более ранним субстратом био-сштеза Хл у шваих .растений и водорослей [Casteifrsnoo et al, 1978; Béais, 1978], усиливает, как АЛК и хелаторы, накопление пор-фириноз в зеленых листьях растений [Авэрина и др., 1989]. При опрыскивании проростков фасоли смесью 15 Ш. ГлК. + 5 мМ Ф (доза, вызывавшая ioœt-й ФДЭ) было обнаружено резкое усиление фосфоресценции при 875 нм, принадлежащей, очевидно, ПХд - PS27, а также коротковолновой фосфоресценции Хл "а" при 955 нм (табл. 2). Спектральная картина послесвечения в а гон случае была очэкь сходна с полученной при действии ¿Ж. Наблюдалось также появление фосфоресценции Mg-ПЩЭ) с максимумам около 800 нм. Поскольку интенсивность фосфоресценции Mg-ffil(3) и Хл "а" (355 ш) соответствовала газ^злкяу, пэлученвым при действии: 5 ьй4 Ф (табл. 2), добавка ГлИ к хелатору характеризуется усшвпкем биосинтеза Шд, накаплнвагцэго в форме Р627, по-видимому, являвшейся здесь основным фотосенскбилиаатором фотодест-рукцет fi:OA.

Фосфорвсдошщ fet, Фж и Хл. Дойстаие на растения холпторов, как правило, сыйшаат глеЕина максимум фосфоресценции к 955-3S0 км, причем оказалось, что ста полоса является оушо£ несколько полос, глвание мзясивдмя кэгарвд рваголожеда при 9БО-9Б5 вм и &7Б-9Ш ш, к принадлежав, ао-видаксму, Хл "а". На это указизаат длишовоявдзке максимума в спектрах Еаябугдашш (668-670 шд), а такта характерное для Жл "a" iph, составляют в втах лодасшс 1,6-2 ш. ¡Восфорооцйн-кая Хл "в" в растаэрах сдает, как было установлено, саодао парзме-тра: Ь^» 940-980 ш ж грЬ* 1,7-2,5 ко. ■

Однако ршэе, пра шслвдованни скйсхров ©ауоросцонцвг ттиаш-шх зкстрактов, .тайучэншк ез листьев, обреботэнша холатйраш рас-югай, била обнаружат присутствие Сн и: Фд: пря етом средашшга-лось, что 05Ш шступают освашш фотоеашшЗашзетораш деструкции ССА. (Аверина и др., 1991]. с целы игявледоя обрвзоэдвдя триаьетоз 4я « 1д а листы» горноаачаяшо бало мровадзвз детальное ' шучэпш

фосфоресценции этих пигментов в органических сродах и водных растворах детергента. Исследования показали, что в этих условиях Фн и Фд, находясь в мономерной форма, эффективно образуют триплетше состояние; максимумы фосфоресценции располагаются при 930-940 км, а тр}1= I мс. В водных растворах, не содержащих детергента, происходит агрегация пигментов, приводящая к резкому, на 2 порядка, снижению <рр11, вероятно, вследствие резкого уменьшения квантового выхода образования триплетного состояния.

Таким образом, наблюдаемые в листьях полосы послесвечения не соответствуют фосфоресценции Фн и Фд в растворах, то есть, вклад фосфоресценции этих пигментов в наблюдаемое свечение, очевидно, невелик и, следовательно, Фн и Фд не могут играть заметной роли в инициации фотодеструкции ФСА обработанных хелатораш растений. По-видимому, молекулы Фн и Фд, так же, как и ПП-1Х, находятся в сопряжении с тушителями триплетного состояния,. резко снижающими квантовый выход фосфоресценции.

При действии па растения фасоли Ф или ДП интенсивность длинноволновой фосфоресценции Хл при 978 нм (в спектре возбуждения А^ах* 680 нм, 1,5 мс) возрастала, по сравнеип с контролем, не более

чем в 2,5 раза (табл. 2), а при подсветке слабым светом опытных растения после темновой инкубации падала до 70-80% от прежнего уровня. Это, очевидно, отражает, как и в случав с АЛК, изменение взаимодействия молекул Хл с белками в ПЕК фотосистем в результата не-специфнческого действия хелаторов на ФСА.

Коротковолновая фосфоресценция Хл "а" при 955 нм в растениях, обработанных Ф или ДП, возрастала примерно на порядок (табл. 2), что обнаруживает, по-видимому, повреждение хелаторами нативности ПБК, сопровождающееся накоплением слабо связанной с белком, коротковолновой формы Хл "а". Можно предположить, что данная форма Хл принимает активное участие в фотодеструкции ФСА, хотя вклад ее в этот процесс по сравнению с м^-ПЛ не очень велик: фосфоресценция 955 нм в них слабее фосфоресценции Ы§-Ш1 в 5-6 раз в тех же образцах. В подтверждение этого, спектры действия фотоокисления Хл "а" в суспензиях хлоропластов из обработанных хелаторами растений указывают на преимущественное участие в фотодеструкции Мд-ПП.

Данные экспериментов приводят к заключению, что коротковолновая форма Хл "а", накапливающаяся в хлоропластах при повреждении нативной структуры ПБК, может, наряду с порфиринами, участвовать в

фотосенсибилизации фотодеструкцик ОСА при обработко растений стимуляторами биосинтеза Хл.

Глава 4. ФотосенсиОилизироввнная генерация ^Ор порфиринами -

предшественниками Хл и друтиш птоненташ.

Роль триплетшх молекул пигментов (3Р) в развитии фото деструктивных процессов в ФСА растений определяется, наиболее вероятно, взаимодействием 3Р с молекулярным кислородом с переносом на него энергии электронного возбуждения и образованием синглотного кислорода 102 [?оо1;е, 13Гб, Крзсновский мл., 1979, 1986]:

Р----—п—*1о„ --- фотоокислителышв

; | 2 | реакции

фосфоре с- люминесценция цекция 1272 нм

О ц&лье енализа возможности данного шхашнмо фотоданампчеако-го действия, намучалось зарегистрировать появление лшинэсцегшдя 10„ в обработанных фотог'орбнцкдами растении.. Однако, лгг.кзэсценцяв о2 в живнх клетках пека небладмъ на удавалось, по-иадзмому, из-за очень низкого времени казни 1о2 (-сд), которое составляет скодо 10 не в СОЛ хлоропяастов [Краствсккй:, мл., 1986].

В согласии с ранее опубликованными даянши [Красяовский, мл., 1979; Егоров, Красновский, мл., 1286} кы наблюдали, что монодарныэ молекулы продазственников, ЗСл: Ш, ае-ГШ и 1Ед, а такие Фпг Фд ц Хк "а" аффективно фотосвшгбшшзииужг лшякоецэнци» 10? в растворах. Было по:ааано, что'еффзашшшеть втого процесса рогко саетсзгся при агрегации пишитаов [Кратаавокнй ия., Неверов, Егоров, 1258-1990]. Таким образом, вое исоледовашш иигшштк шгут выступать зф^ктив-шмп фтссакслбиллзьтсршя ФотодзотрукцЕя; ССА разтошй. '

При изучении сткЗЕаэсцэстных свойств 102 в шотаятанх растворах, крета основной полога его лшЕЖОсценцга при 1272 та, бкл айка-. ружэп максимум лилишиоценции ара 1073 зет, хцияадпвюг.ъй, как оказалась, . колобательно-вавбукдевному соотошш»' синглетного кислорода 102, которое заселяется при териомижгавда'основного состояния 102- ■ Одновременно с впы, при фотосонсиб-шпзироваяЕой гевзредии 1о2 в растворах природных и сштвтатесхвдс порфгршов к кругах нигмввтов была обнаружена лпашосценцзя,- обусловившая сбраоовшшш датой Форш синглатаого кислорода - ого даеров <1о8)а. Емо обнаружено,

что Фн, Фд, бактериофоофятин "а", а особенно - фталоциании и Б1-нафталоциагош способны резко активировать свечение (1о2)2 и селективно акцептировать их возбуздение, что делает возможной надежную регистрацию димеров в конденсированной фазе.

Ранее образование колебательно-возбужденных молекул синглетно-го кислорода и возбужденных димеров (10,)2 в фотосенсибилизирован-шх реакциях экспериментально никем нэ наблюдалось, поэтому обнаружение этого феномена указывает на возможность участия 1о2 и (102)2 в фотоокислптэлышх реакциях в живых системах, например, в согласии со следующими механизмами:

*

10о + субстрат --1

'ь? * - '

1о£ + субстрат -ох продукты окисления

к3 *

(1о2)2 + субстрат -—-'

Поскольку энергия 1о2 и (102)2 больше, чем у основного возбужденного состояния 102, нэ исключено, что колебательно-возбуздэнныв и димерныэ молекулы сингле тного кислорода могут вносить определенный вклад в фотодеструкцшэ ЗСА обработанных фотогербицидами растений. '

Заключение

Таким образом, проведенные исследования показывают, что важную роль в снижении фотоустойчивости ФСА при обработке растений стимуляторами биосинтеза Хл играют триплетные состояния накапливающихся в хлоропласта! фотосенсибилизаторов: порфиринов, Хл "а", а также, возможно, Фя "а" и Фд "а". Анализ спектральных и кинотичеких параметров послесвечения пигментов в листьях и хлоропластах растений дает основание заключить, что в результате изученных воздействий возрастает интенсивность фосфоресценции коротковолновых, вероятно, мономерных форм Хл и его предшественников, образующих долгоживущее тришютное состояние молекул с высоким квантовым выходом. Это подтверждается тем, что спектры возбуждения фосфоресценции пигментов в исследованных объектах совпадают с соответствующими спектрами, полученными для растворов индивидуальных порфиринов и Хл в органических, средах и в водных растворах, содержащих' мицеллы Тритона-Х100.

Тз и другие спектра возбуждения совпадают со спектрами поглощения этих пигментов в растворах, где их молекулы находятся в мономерном состоянии (рлс.1,2).

Получению результаты свидетельствуют о том, что понижение фотоустойчивости ФСА при обработке растений компонентами фотодинамических гербицидов коррелирует не с общим накоплением предшественников Хл в хлоропластах, а, главным образом, с образованием коротковолновых форм пигментов, способных к эффективной генерации три-плетных молекул.

Из результатов работы следует также, что, в зависимости от применяемых стимуляторов биосинтеза Хл и их концентрации, в хлоропластах наблюдается преимущественное накопление разных фотосенсибилизаторов; большую роль играет также таксономическая принадлежность изучаемых растений. Данные показывают, что обработка двудольных растений АЛК или смесью ГлК + Ф приводит к темновому накоплению большого количества ПХд е его коротковолновой форме Р627 и незначительных количеств Ие-ПП. При действии АЛК на однодольные растения %-ПП(Э) накапливается так ей интенсивно, как и Р627. Хелаторы металлов - ДП и Ф - вызывают интенозноа накопление в хлоропластах монсмэрного ы&-ПП(Э), а также Фн и Фд (в мономерноы либо в агрегированном виде). Накопление в хлоропластах ПП, наблюдаемое при действии хелаторов, не сопровождается появлением его собственной фосфоресценции, которая, по-видимому, тушится при агрегации ПП или взаимодействии с другими структурами ОСА (рис. 3).

Кроме этого, хелаторы, нэ усиливая синтез Щд в хлоропластах, вызывают появление фосфоресценции его коротковолновой фзрмд Р627. 1йжно предположить, что Щд под действием хелаторов переходит из фотоактивной (длинноволновой) в фотонеактивнув (коротковолновую) форму, способную к эффективному образованию тришгатннх молекул.

Обработка растений фотогербицвдами приводит тает» к усилзнию коротковолновой фосфоресценции Хл "а" (950-965 нм). по-видимому, из-за выхода мсномврного Хл из ШК фотосистем в результате но специфического повреждения ФСА.

Участие порачисленных фотосенсибилпзаторов в фотодеструкции ФСА подтверждается соответствием спектров . действия фотовыцвотания Хл "а" в суспензиях хлоропластов ьз обработанные растений и спектров поглощения данных пигментов в растворах. Во всех случаях возрастание фосфоресценции пигментов в листьях сопровождается усшшнзеы

фотодннэ-мический эффект

фотодгна-' млческий эф!ект

) - образует тршяетнне ■ молекулы ,

I не образует тгшплзтннх*

/. молекул.-ч-

коротковолновый Хл "а"

Рис. 3. Образование фотосонсибилизаторов фотодеструктивных реакций в хлоропласта! растений, обработанных стимуляторами биосинтеза Хл. * Имеются в виду долгоживущие-триплетные молекулы (тр11> 0,5 мс).

фотодинамического эффекта, -что подтверждает определяющую роль три-плэтных молекул пигментов в инициации фотодеструкции ФСА.

. Фотосенсибилизированныё реакции, приводящие к фото деградации ОСА обработанных фотогэрбицвдами растений, развиваются, по-видимому, .при участии, синглетного кислорода 102, который образуется при переносе энергии сз трщиётннх молекул пигментов на кислород. Моно-мерныэ молекулы порфиринов. Фн, Фд и Хл .'-"а"; являются эффективными

потенциальными фотосенсибшшзаторамя фотоговрекдения ФСА, так как они обладают шсокшш квантовыми выходами (Тд=50-80%) фотосенсиби-лизгрованной генерации 102- Обнаружение новых люминесцентных свойств 1о2 свидетельствует о возможности более сложного, чем предполагалось ранее, механизма его воздействия на пигментный аппарат растений.

Таким образом, фотосенсибилизированное триплэтими молекулами пигментов окисление структур ФСА, проходящее при участии сшглотно-го кислорода, является, по-видимому, основной причиной снижения фотоустойчивости пигментного аппарата растений при действии на них стимуляторов биосинтеза Хл.

Вывода

1. С целью изучения влияния стимуляторов биосинтеза хлорофилла на фотоустойчивость растений проведано исследование низкотемпературной фосфоресценции пигментов фотосинтетического апсратп растений, обработанных Б-ампнолэвулиновой кислотой, глутпминовой кислотой и хелаторами металлов. Обнаружено соотвеЪтвие концентрации тршштшх молекул пигментов, регистрируемых ш их фосфоресценции, с эффективностью фотодеструхции ФСА в листьях обработанных растений.

2. В результате спектрального и кинетического анализа фосфоресценция в листьях и хлоропластах обработанных фотогербицадаш растений идентифицированы накапливающиеся в темноте спектральные. Формы порфиринов - Мз-протопорфирина и протохлорофиллцда, аффективно образующие триплетные состояния. Установлено, что зарегнстриро-ваннал фосфоресценция принадлежит мояомерным, нэ агрегированным формам пигментов.

3. Показано, что обработка растений хелаторами металлов вызывает повышение концентрации триплзтных молекул накопленного протохлорофиллида путем перевода его в коротковолновую фосфоресцирувдуо форлу (РС2?). Хелаторы способствуют чвгсео образованию коротковолновой формы хлорофилла "а" и, - возможно, фэофорбида и фэофгпша "а" в результате пэврэадошш пигмент-белковых комплексов хлоропластов.

4. Скорость фогоокислания хлоро$илла "а" в хлоропластах обработанных фотогербицидаки растений прямо зависит от интенсивности фосфоресценции порфиршов и коротковолнового хлорсфииш, что указывает на участие их триплетных состояний в ишщиацця фотодэструктив-ных процессов.

5. Наряду с известной ранее фотосенсибилизировашюй генерацией порфиринпми синглетного кислорода, обнаружено образование его ди-мэрншс и колебательно-возбужденных молекул, возможно, также прюш-мащих участио в фотоокислительных процессах.

6. Показана возможность использования люминесцентного метода для исследования закономерностей фотодеструкции и разработки методов экспресс-скршшинга новых фотодинамячоских гербицидов.

7. Полученные результаты дают основание предположить, что в основе фотодинамического действия стимуляторов биосинтеза хлорофилла лежит фотосенсибилизированное окисление структур фогосинтетического аппарата при участки триплетных молекул консмэрных форм порфн-ринов и хлорофилла, а также синглетного молекулярного кислорода.

Список публикаций

1. Красновский A.A., мл., Неверов К.В. "Образование триплетных молекул хлорофилла и его предшественников в обработанных 5-амино-левулдповой кислотой листьях растений". Доклада АН СССР, 1988, т.302, №l, С.252-255.

2. Красновский A.A., мл., Неверов К.В., Егоров C.D., Редер Б. "Фотофизические параметры феофорбида а: фосфоресценция и генерация синглетного молекулярного кислорода". Оптика и спектроскопия, 1988, Т.64, в.4, с.790-795.

3. Красновский A.A., im., Неверов К.В. "Сенсибилизированная димор-ная люминесценция синглетного молекулярного кислорода в раство- . pax". Биофизика, 1983, т.33, в.5, с.884-886.

4. Неверов К.В, Красновский A.A., мл. "Образование триплетных молекул хлорофилла и его предаэствэнников в обработанных 5-АЛК листьях растений". Путинские чтения по фотосинтезу и Всесоюзная конференция "Преобразование световой энергии в фотосинтэзиру-ющих системах и их моделях". Путно, МПФС АН СССР, 26-30 июня 1989 г.

5. Неверов К.В, Красновский A.A., мл. "Первичные механизмы фотодеструкции фотосинтегического аппарата в обработанных 5-АЛК листьях растений". Ш Всесоюзная конференция "Биоантиоксвдант", Москва, Институт химической физики АН СССР, 27-29 июня 1939 г.

6. Krasnovsky A.A., Jr, Neverow K.V., Egorov S.Yu., Roeder Б. and Levald T. "Photophysical studies of pheophorbide a and pheophy-tin a - phosphorescence and photosensitized singlet oxygen

lumineooanoe'*. J. I-hotoohers- Photobiol. Bj Biology, 1930, v.5,' p.245-254. '-'V...// '•"■•.

7. IlraEiioTBky A .A., Jr, Neverov K.V. "PJiotoinduoed din»i limine в-оепов оf singlet moleoular oxygen. In eolutioiiD of pJietoosnsi-tisers." Chen. Hiys. Letters, 19S0, т. 167, №б, p.591-596.

8. Неверов К.В, Красновский А.А., мл. "Фотосенсибилазпрованная лшшесцонция колэбатбльно-возбувденных даюзкуд отнг^эхеого ' кислорода [1Л (V=1)J в растворах." Письма в ВЭТФ, 1991, т.53, , вып.Э, С.452-45Б.. . '.•■;.''■ ; '.,/, -

9. Неверов К.В,- Красновский А.А., мл. "йкоыбжшцйшная замодяен-' пая .шйшзсценщш в аэробных растворах - фотосзЕсибилизаторов.

. Участие дилеров синглатного молекулярного кислорода." йиггко и спектроскопия, 1991, т.71, в.1» C.I0S-II0. ,

10. Neveror K.Y., KraEnovoky д.А., Jr. "ABBigiMicat fo:? the hovel vifcronio banto in the врао^гшд of ilia pViitosenBitieisfl. oinglot oxygen luminQBoenoe". Chem. .Phys. battere,' 1592, v. 103, риаз-19э. ■ ■"-'..'••. •••.•.'•■'•..''

11. Kovei^ov K.V., Krasaovtjty A.A., Jr. JhoojihoMEoenao o£ pi^nenta in plant leaves treated wi. "Л the BtiHiJie-tors of chXoropiiyll bicsyathesie. Твзисц ix Мевдршродаогс конгрзсоа по фотосла-тезу, 30 ввг.- 4 септ. 1992 г.,.Кегойя, Яшыея. Ebotoeyatii. Research, 1992, ^.34, Ко.1, p.172.

12. Нотег-от K.Y., КгавпотаЬу A.A., Jr. FbotosenBitissii. luainoa-оепоъ of ainols of Bimglat Boleaular csjrgsn in. rolutlcma. Гезпса XI Кавдуизродаого контрясса по ^тебжетзгш, 7-12 .-.сояв. : 1992 г., Киото, Япония,'p'.26t. ;

13.. SojioTrxEia Е.Ю.,- £ож-ушша И.В./ Нэверов К.В. 'Вятам кзазв некоторых тяжелых ксг&клэв на СотоустоСлазаеть хдорофдиз '-."••"' корешах ввлоиш: «акровэдорссваЗ. Взата. SE-fa. Cap. 16: биология, 1953, » 1, с.64-71.-> . "'.. *

Sracno'vsky Д.А. t Jy, ifovoiav Г .Т. liovol iiata on iba' tqpaotse of photocemitlied. oiijglet oxygiua iunfcassooEea 1л ttia soluble» pliaoe.: Deteoii.ea of the ri^iratlorially e^oitui mcisoc--ol w aotivateS dlaol of ein&let csyg-Д- PFXE (Biocwloou-

lar SpeoiroBoopy Ш), 1993, V. 15390, p.56-6-1. ■ .. ..

Под писано а печать tig, 6Ц. IM^r. : '. , / ' "• - ..

Формат №Xa-i/l6 ' jj4* t - - :

Твра ¡«¿Л? ZiMiifJ /

' 1 МП сПЕТгГГ»