Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование in vitro биологического действия малых доз ионизирующего излучения на разные популяции иммунокомпетентных клеток мыши

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование in vitro биологического действия малых доз ионизирующего излучения на разные популяции иммунокомпетентных клеток мыши"

, ...

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РШОЖЩ Я ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ РОСУДЛРСТВЕННЫИ УНИВЕРСИТЕТ ¡3!. М.0..ЛОМОНОСОВА БЙОЛОГХ-ШШ ФАНУ ЛЫ'ЗТ

На правах руколзс::

Мянегшпа Сземена Львовна

ИССЛЕДОР^ШСЕ I» VI тао ШаТОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МАЛЫХ ДОЗ ИОЙКЗИРШЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РАЗНЫЕ ПОПУЛЯЦИЙ ШШОКОШШТЕНТНЫХ КЛЕТОК ШЛИ

(03.СО.25. Клеточная бяшогкя

АВТОРЕФЕРАТ дасер?ациа на соискавгв ученой стэнгш кавдвдзтя биологических наук

¡ША - 1592

Работа вшолнана на кгфедрэ клеточной физиологии п юыунологии биологического факультета Уосковского Государственного

Университета ии.Ц,В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологически наук, профессор

Гусев 11.В.

Официальные оппоненты: акадеиик РАЕН, профессор

Бабаева А.Г.., доктор иэдищнскп наук Ваньхо Д.В.

Еедаее учреждение: Научно-Исследовательский Институт

Эшдашологии и ¡¿икробиологии ииени ' ■Н.Ф.Гаиалеи АШ Российской Федерации

Защита состоится "/г" 199 »8- г. в ч на

заседании спешализированного совета Д 053.05.63 при Московском Государственной 'Университете им.М.В.Лсионхова по адрзсуХ 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический ф-т, аудитория

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке ° биологического ф-та ЯГУ им.М.В.Лошюсова.

Авторефзрат разослан

"/3- ¡-соЯГ/ъЛг

Ученый секретарь специализированного совета: кандидат биологически наук Кадистратоаа Б.Ы. .

ьЬи—. ... - : .'-••.!

СЫПЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ лщ/алъносяь проблемы. Как известно, ионизирующее излучение является сильным повреждающим фактором, оказывающим мощное плейотрогоюе воздействие как на отдельные клеточные системы, тан и на организм в целом. Несмотря на многочисленные работы, вопросы воздействия ионизирующей радиации на лшвотные клетки и организм в целом остаются, в большинства своем, мало изученными, а полученные з различных экспериментальных моделях результаты исследований зачастую противоречивы.

Так, вплоть до настоящего времени а литературе нет убедительной теории, объясняющей помимо депрессивного, канцерогенного и мутагенного действия ионизирующей радиация, ее стимулирующие эффекты на живые организмы, впервые описанные еще в пятидесятые годы как эффекты "радиационного гормезиса", и линь в последние годы считающиеся доказанными.

Бешенне проблемы настоятельно требует разработки и использования модельных систем с повышенной радиационной чувствительностью, максимально чутко реагирующих на малейше изменения радиационного окружения, с целью выявления минимальных эффектов воздействия ионизирующих излучений на кивсй организм как повревдащего, так и стимулирующего характера.

Перспективным в этом направлении является использование для исследований линий мышей таких, как зл^о. сва/н. сзн/к. сггвь'а, ъвл/г. лх-л, отличаиигхся высокой чувствительностью к действию ионизирующей радиации, проявляющейся в появлении с высокой частотой радиационно-индуцированных опухолей, в том числе,

.чаолоздюго лейкоза и .тифом тимуса, что связано,по данным литературы, с наличием особых генетических факторов, в частности, с делециэй 2-ой хромосома.

Как известно, иммунная система является вагшейшэЁ регуляторной системой организма, основные клетки которой - лимфоциты представляют собой наиболее радиочувствительные клотки иммунной системы. При этом, важно отметить, что реакция лимфоцитов на действие ионизирующей радиации независимо от его конечного эффекта, от гибели до усиления функции клеток, носит активный характер, что дэлает их удобной моделью для исследования действия ионизирующих излучений на структуру и функции живой клетки.

Исследование щхшь'£оративнсго ответа облученных лимфоцитов на поликлональиые активаторы является важным показателем функциональной актовноста иммунокомпетентши клеток и функциональной мэры радиационного поражения.

Цель исследования. Указанные предпосылки определили цель настоящей работы - выявление к изучение биологического действия малых доз ионизирующего излучения в модельной системе in vitro на лимфоциты мышей различавшихся по радиационной чувствительности линий.

Экспериментальные задачи исследования:

I. В ряду сублетальных доз рентгеновского излучения ттг.тлл^тъ тэ, которые обладают биологической активностью и изучить их влияние на.-

а) жизнеспособность разных популяций иммуяокомпетентных клеток МЫШИ;

j, прохкфэративнкй отеэт лимфоцитов порвичшх и зторлчнкх лтфоидных органов кыши, индуцирогашшй поликлональкшш активаторами.

Z. Сравнить действие облученных лимфоцитов линий мышей с различной радаацаэтшой ' чувствительность^) на культуру антантных лимфоцитов кшп.

3. Изучить механизм действия облученных лизфцитоз на интактные клетки, их функциональную активность, продукцшо гуморальных медиаторов,участие в пострадиационном восстановлении организма.

Научная новизна работ. Б настоящей работе представлена общая характеристика радиационного ответа лимфоцитов милей радиочувствительной линш cs7bi /в по сравнению с другими известными радаорезлстентнкми и радиочувствительны},ш линиям» мышей в диапазоне доз 0.1-4 Гр рентгеновского и t со60) 7-излучения.

В используемой экспериментальной модели обнаружено существование двух основных уровней действия яояиззрундей радиации на организм: герметического уровня с иммуностимулирующим эффектом и поражающего уровня, вызывакдого начальные стадии радиационного поражения и радиационной яммунодепрессш облученного организма, проявлявшейся в общем уменьшении числа иммунокошетентных клеток в лимфоидных органах и снияении их функциональней активности.

В результате настоящей работы впервые на фоне стойкой амуводепрессии, индуцируемой общим рентгеновским излучением в

кгмш дозах, выявлена способность облученных лимфоцитов сиьуулнров.чть пролиферативную активность тмунокэшатентных клеток иатэктного ¡азотного. Таким образом, показана параллельная индукция процессов радиационного повреждения а радиационной стимуляции в пределах одного организма. Обнаружено, что облученные лимфоциты опосредуют свое действие посредством гуморальных медиаторов, определена их функциональная активность, участие в пострадиационном восстановлении организма.

Теоретическое и практическое значение ройоти. В результате проведенных. исследований разработана высокочувствительная модельная система на основе смешанной культуры лжзфоцитов и шшзй радиочувствительной линии сыт , позволившая всесторонне охарактеризовать особенности функционального поведения айвой клетки в условиях минимального радиационного повреждения, с одной стороны, и радиационной стимуляции, с другой стороны.

Полученные результаты могут бить использованы при разработке новых схем радиационной индукции опухолей у мышей, в том числе, радаащюьно-индуцируемых лейкозов. Кроме этого, возможно практическое использование факторов, продуцируемых облученными ■клетками, как с интерлейкин-2-подобной активностью для иммунотерапии, так и уча ству лига • в • пострадиационном восстановлении организма, Результата рзоога ~тося? назад и понимание изменения функционального состояния иммунной системы .при действии малых доз иовизирукщей радиации.

Основные результаты диссертационной работа включены е курс лекций для студентов-иммунологов кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Апробация работа. Материалы диссертации были представлены на I съезде иммунологов России ( Новосибирск, 23-25 июня 1ЭЭ2 г. ), на семинаре кафздры физиологии человека и гивотных Биологического факультета МГУ, на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ.

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Структура и объел диссерпаиин. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта, включающей материалы и метода исследования, результата и обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы (165 ссылок). Работа изложена за 126 страницах машинописного текста, содеркнт 18 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ Й МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные

. ' МЫШ ЛИНИЙ С57В1УВ, СВА, С С57Е1/бхСВАЭП . ВйЦЬ/С. ШЛ/2;

самки, возраст 1.5-2 месяца, вес 18-20 г, . были получены из питомника "Столбовая" Московской области.-

Облучение

Общее рентгеновское облучение гивотных 'Проводили на установке -РУМ-П биологического факультета ИГУ ( характеристики источника: 200 КБ, 15 шА. Al 1 яга. Си 0.5 етаЗ,° [Со^а-^-ОбЛуЧвЕЕе ПРОВОДИЛИ

-Q-

на установке 31 ti'-5О института Бшдешологш! и шкробиологш та.Н.Ф.Гакаяэа; даапазон доз 0.1-4.0 Гр. ?ea¿snuúu

Используемые в работа реактивн была получены от фирм sisma.

üi>A И StTTvn, GiK-usny.

РохоглОинантаай штарлеагаш-2 был любезно предоставлен Г.И.Чшевсон ( ' Институт органическог-о синтеза» г.Рига, АН

Л8ТВИ2 ).

Усдобия иу.шшвироба?и.!я кдеио.ч

Для культивирования клэтск использовали среду культивирования на основе rphi хедо с добавлением. и-глутамина, hepes, й-мэркаптоэтанола, ' гентачщина, 5% " инактивированной СПК. . КультЕшрованяэ клеток проводили при 37°С ео главной ай-юсферэ, содержащей 5% С02- '

Раокцли бласттрападормации и смешанной культуры лжзфоцитов проводили какроыетодом в SS-луночных планшетах а объеме 200 мкл с чеслсм повторов в каждом вксгаршенте не менее трех.

ПролисозратнЕкый ответ ¿¡гмфоцитов оценивали по включения в ДНК радеюакишноыэчеыюго предав ственника - 3Я-тишдана.

Интенсивность прсльйэрацви лзмфоцитов в ответ на Кон-Д выражали кодексом стимуляции ( КС ). НС = еря ( нш/шн ) сиатулированной культуры - cm. ( ¡вш/шн ) не стимулированной культуры.Г

Оаелаонкая щлъщра ¿игфоиряюб.

йспоЕьгсвлксь в кодафзкацги Шага1 X. с азштаяшаш ( Шштт X., IS37 ). Едаактнне шкфощп-ы помещали в ячейки 96-луеочного

планшета в количестве 50000, 100300 и 200000 плеток па лупку. Лимфошит-' облученных животных обрабатывали што?гацЕНС?л С ( 2Ъ мхг/мл ) в водяной бекэ при 37°С в тэчешю £0 мен с целью нодазлбНЕЯ их собственной пролифератизной активности, отшзали триады центрифугированием з регамэ 1500 об/шн, 7 изи в срэдо IS9 при +4°с и добавляла к культурам штактных лвфщитов разной плотеости в количестве 50000 и 100000 клеток на лунку. Культуры инкубирогали в среде культзвирозання в присутствии Ксн-А < 0.5 мкг/мл ) в течение 75 ч.

Ibiöymiuo синтеза иняерлзИшна 2 в культуре проводила согласно

КеТОДУ Егйэу д.

Ссдерпяшя ингерлеОюма 2 д хулызуралыгыз супэ-рнссг^мггах определяли, как описано ( Хаглблкн А. и О'Гарра А,, IS90 .). Для зэдунцви Ксн-А бласкшх клеток гяши сшвюцгян мнет линии в.аьус в количества 5xI0ö клеток/мл помещали в пластиковые флакона л инкубировали з среде культивирования в присутствии КонД ( 2 мкг/мл ) в течение 48 ч. Через 48 ч клетки отьлваж тркццк центрифугированием в реаиме IEOO об/мин, 7 ьзе при +4°С.

Тестирование супернатантов от •сблупенннх клеток проводили микрсметодом, как описано. Индуцированные Коы-А бдастные клетки маши в количестве 50000 клеток/лунку культивировал! в присутствия 50% тестируемых супернатантов или без них в тзчевзе 24 ч. Среда культивирования содержала 100 им а-метипяаннозвда для блокирования пролЕфератизкого ответа Властных клеток на остаточное количество Кон-А. В последние 4 ч хулътазкравянЕя в ячэЗки планшета вяосши ^-тимвдпн ( Z цмулунку ) и оиэзивадз

-ъ-

^еакалв то включению в ДНК радиоактивномэченного тимидина.

'¡фракционирование лигфоидных клеток на нейлоновых волокнах.

Метод использовался в модификации р. а. & иозепаьгехсь

э, и.. Чистоту разделения ( 90-95% ) оценивали с использованием непрямого ишунофлуоресцентного анализа.

Удаление адгезивных клеток сорбцией на црлистромэвых чашах Петри проводили по методу Ханта С.

Реакция непрялой шиунафлуоресцещци использовалась в модификации Форни Л.

Сшяискическая обработка данных.

При обработке полученных данных были использованы такие показатели биологической статистики как среднее арифметическое, стандартное отклонение и ошибка среднего ( стандартная ошибка ). Для оценки достоверности различий средних величин применяли критерий Стъюдента. В работе был принят уровень значимости, равный 0.05. т

Все расчеты были проведены на персональном компьютере системы i вм/рс/ат с использованием программ ггатсжарнусз,, етпля-а и

блк'уаео сзйарнусб.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Р£ЗУЛЬТ4Т0В Многочисленные экспериментальные и эпидемиологические данные, полученные в последнее ' время, подчеркивают важность и неоднозначность действия малых доз ионизируицей радиации на организм животных и человека. Выдвинутая в 1982 г. ьискеу т.о.

-s-

теория радиационного гормезиса предполагает существование ряда заветно-адаптивных механизмов, актзвируегшх ЩЩР, с псследущкм благотворным ( ropv6T!i4oraa£M ) эффектом да организм в целом. Стимуляция МДИР иммунной системы рассматривается сегодня в качество одного из возможгх ■механизмов, опосредующих гормезис..

В данной работе были изучены биологическое действие сублетальных доз рентгеновского я гама-излучения в модельной системе in vitro нз лк*£сцдтн '.шлей различающихся по радиационной чувствительность» линий, функциональная активность облученных лй.:2юиднкх клеток, их действие на интактные лимфоциты, продукция гуморальных медиаторов, участие в пострадиационном восстяпсзлэшш организма.

Исследование клеточной заселенности пыуса, селезенки и-регионарных , лимфатических узлов облученных животных показало, что общее рентгеновское облучение з диапазоне доз 0.5-3 Гр вызывает опустотение основных лнлфоядных органов мыши, проявляющееся в дсзозависпмом уменьшении числа иммунокомпетентных клеток в тимусе, селезенке и регионарных лимфатических узлах на 4-S03S, при чем оно сильнее было зыракено в регионарных лимфатических узлах, где 'гасло клеток составило 23.5-25% от уровня контроля, ■ против 60-623 в селезенке и 63-71% в тимусе при дозе облучения I - Гр (табл.1).

Этот факт корралдпрует с литературными даннкми. о подавлении радиацией миграция лимфоцитов и нарушении

процесса улавливания лиийоцятов в регионарных лимфатических узлах после облучения, в результате чего подавление иммунного ответа в разных органах после облучения оказывается неравномерным: оно проявляется сильнее в лимфатических узлах, чем в селезенке и тимусе, в которых процессы улавливания и специфической миграции не играют роли.

Облучение меньшими дозами радиации, от 0.1 до 0.5 Гр, не влияло' значительно на число клеток в лимфоидных органах.

Как показатель функциональной ективеости лимфоцитов, выделенных из облученных кивотных, в работе исследовали пролж^еративную способность клеток под действием поликлонального активатора - лектина растительного происхождения конканавалина А ( Кон-А ), выявляемую в реакции бласттрансформации лимфоцитов в культуре. Тест ставился дифференцированно, в зависимости .от плотности клеток в культуре.

Спленоциты от облученных Х-лучами мыией линии сь/нц /б обнаруживали снижение функциональной активности, проявляющееся в подавлении митогокного ответа на Кон-А в реакции бласттрансформации лимфоцитов в культуре равномерно по всей кривой плотности, начиная с дозы I Гр, и далее с увеличением дозы облучения наблюдали дальнейшее снижение ответа на митогеы ( рис.1 ).

Сдвиг исследуемого диапазона доз в область малой радиации был обусловлен поиском возможных гормэтических уровней, на

ТДЕЛ.1

-1Ь

Доза Казнеспособность облученных клеток,%

облучения,Гр тккус селезенка регионарн.л/у

О 100 100 100

0.5 80-88 90-96 58-70

1.0 68-71 60-62 23.5-25

2.0 45-46 37-49 10-12

3.0 19-31 . . 20-22.5 7-10

РИС.1.

ао г.. , —3

ИС, имп/мин х 10

£5

со

1й

1с

кснтооль

100000 200000 гООСОО • «ИООО 500000

Плотность лимфоцит об, клет./лунку _

которых выявлялось бы стимулирующее действие МДИР на иммунную систему. Действительно, при обработке спленоцитов мыши линии С57В1/6 дозаш 0.1-0.5 Гр рентгеновского излучения в эксперименте наблюдали усиление пролиферативного ответа на митоген на 87-4С0Ж ( рис.2 ), причем, стимуляция выявлялась, главным образом, при субоптим'альной плотности культивирования, что указывает на правильность выбранной экспериментальной модели с использованием дифференцированной клеточной концентрации.

Таким образом, для данной экспериментальной модели и для данного животного можно выявить существойание двух.основных уровней действия ионизирующей радиации на организм: герметического уровня с иммуностимулирующем эффектом, включающего, по полученным данным, диапазон 0.1-0.5 Гр, и поражающего уровня, включавшего дозы 0.5-3 Гр, вызывающего начальные стадии радиационного поранения и радиационной иммунодецрессии облученного организма, проявляющейся в общем уменьшении* числа иммунокомпетентных клеток в лимБоидных органах и снинении их функциональной активности.

В последние года большой интерес исследователей привлекает проблема межклеточных взаимодействий при радаациенно-индуцированном канцерогенезе.

По литературным данным, на этапе промоции переход предопухолевой клетки в злокачественную определяется не только процессами, происходящими в этой' клетке, но и воздействием клеточного окружения. Сущность этого

-3 .

[ИС, имп/мин X 10

J_i_i—.—i_i_i__i_i_i_i'

lOGOOQ sooüoo «30009 «0000 woe

Плотность лимфецит'ой, клет/лунку

РИС.'З.

воздействия может заключаться в создании дополнительных сигналов, стимулирупцах процессы. пролиферации и дифференвдровки, нэобходадае для трансформации предопухолевых клеток в злокачественные.

Исходя из указанных предпосылок и принимая во внимание, что а) в качестве объекта исследования была выбрана линия мышей С57В1^6, отличающаяся высокой чувствительностью к действию ионизирующей радиации;и б) фракционированное облучение в. дозе I Гр используется' как экспериментальная модель радиационной индукции лейкозов у мышей, в работе было предпринято исследование характера, влияния облученных лимфоцитов на пролиферации других клеток, рассматривая .однократное облучение в исследуемом диапазоне доз как экспериментальную модель ранних этапов

радиационно-индуцкрованного лейкозогенеза у мышей..

Для изучения влияния облученных клеток на пролиферацию кнтактных лт.«фоцатоЕ в культуре была разработана модельная система, которая вклэчала:

1). Смешанную культуру лимфоцитов. Лимфоциты а облученных животных обрабатывали митомицином С с целью подавления их собственной, пролиферации -и добавляли к культуре интактных лимфоцитов.

2). Культивирование интактных лимроцитов при субоптималькой концентрации ( 50000 клеток/лунку ), что, по-видимому, повышает • общую чувствительность системы к различного рода внешним и внутренним воздействиям.

-153;. Использование субоптамальной концентрации митогена -0.5 мкг/мл конканавалина А, что такие увеличивает восприимчивость лимфоцитов к ростовым факторен иной природы и межклеточным взаимодействиям, оптимизируя чувствительность используемого теста в целом.

Постановка реакция в разработанной модельной системе показала, что спленоцзтн облученных в диапазоне доз 0.1-1 Гр мышей стимулировали пролиферацию интэктных лимфоцитов, причем максимум стимуляции ( 70-903 ) был сдвинут в область I Гр ( рис.3 ), когда у облученного газетного уга начались процессы радиационного поракевня и пимунодепреенн, выраяенной в сникэнии числа клеток в-лимфокданх органах и их пролиферативного ответа на митоген.

Эффект был специфичен для мышей линии' cstbi /в ' а нэ воспроизводится У ЛИНИЙ СВЛ, За!Ь/С, ГИбрИДОВ ПврВОГО поколения ficcbaxC57si/^3, D3A/2. Так как исследуемая линия С57В1УВ отличается от других прежде всего по своей

чувствительности к радиационно-индуцированному лейкозу.- а

©

доза радиации I Гр при фракционированном облучении .вызывает лейкоз у данной линии с вероятностью до 93%, , то нельзя однозначно утверадать, но мокно предполагать, что начально измененные под действием радиации лимфоциты путем стимуляции пролиферации штактных клеток могут способствовать развитию радиационко-индуцированных опухолей, о чем также косвенно свидетельствуют данные, полученные Troeko j.

Исследование динамики появления стимулируищэй активности

облучонных спленоцитов мши лпаш сывх/ъ показало, что максимальный ее уровень достигается через 43 ч. и она снижается до контрольного уровня к 10-м суткам после обручения.

Изучение распределения клеток, обладевщих стимулирующее активностью по отношению к интактнш лимфоцитам., по основный лимфоидным органам облученного швоуного, показ?ло, чтс максимальная стимулирующая активность лимфоцитов выявляете? лз селезенке и тимусе облученных дозой I Тр рентгеновского излучения мышей и не выявляется в клетках периферически лимфатических узлов ( рис.4 ). По данным литературы, имекне в этих органах выявляется популяция супрессорных клеток I избирательно высокой радиочувствительностью, по сравнению ( другими эффехторныш и регуляторными клетками.

Таким образом, имеет место феномен следушего характера облученные лимфоциты обладает сниженными потенциями ] отношении чсобственной пролиферации и функционально] активности, но способны стимулировать к таковой друга 1:летки, в частности, интактные лимфоциты.

Обнаруженное явление представляет '.собой новый та активности, присущий лимфоцитам, и дополняющий ряд уж известных функциональных активностей лифэцитов в отношена процессов, напрямую яз связанных с иммунитетом, как-то способность передавать "регенерьционну» инфорлашпо'] интактным реципиентач, переносить функциональную гипертрофа органа, гиперпластическую '• реакцию на фармакологически

. норм, облуч.

30- . -3

ИС. имп/мин х 10

23-

20-

13-

101

К

Норм.

Облуч

СреСа з 24 48 72

Время посла облучения, ч

агент.

С целью изучения механизма стимулкрушцего действия лш&эцатов от: облученных ынаей на интактине клеткабыла предпринята попытка заменить действие целых клеток добавлением среда,, коЕдашющрованной облученными в дозэ 1\ Гр лимфоцит ада», культуре интактшх жмфоцитов.

Эксперименты показали, что в среде, кондиционированной облученными сяленоцитами, присутствовал растворимый фактор - или групцэ факторов, усиливающих пролигоератквный ответ спленоцитов мыши на Кон-А ( рис.5 ). Аналогичные данные булк получены для облученных -тимоцитов. Максимальная Тфодущия факторов происходила в первые 24 ч после облучения

хиеотных.

Учитывая- гетерогенный клеточный состав селезенки, на еле,сущем, втапэ работы было проведено разделение ллмфоЕДНЫх клеток селезенки на субпопулящш.

Эксперименты показали, что ростовые факторы, усиливающие пролиферацию интактных клеток ' в ответ на Кон-А, продуцировались популяцией, обогащенной ^ Т-клетками облученных кизотных, и ни выявлялись в супернатаятах от культур В-лимлоцитов и популяции адгезивных клеток (рис.6 ).

Рисунок 7 показывает, что растворимые факторы в кондиционированной среде от облученных сплэноцитов были, в оезовном, чувствительны к воздействию температуры, хотя некоторая доля активности была устойчива. Нагревание до 5S°C в тэчекиэ. 30 мин разрушало большую часть митогэеной

ак^нвносгл ксадшрогсрсвааноа' среди, кроне 18%, которые быля Устойчиен. Тормостабальная фракция не разрушалась при дальнейшем прогревании при 75СС в течение 15 мин и прг 1СЮ°С в течение 3 ьяш.

Для исследования природа растаориглых факторов, ^црабативаешх облученными клеткши, и принимая во внимание их Т-клэточну» продукцию, бил поставлен биологический тест на присутствие в среде фактора роста Т-клеток, иле .иктарлейккна 2, на индуцированных Кон-Д- бластных клетках маш.

11а рис.& представлены результаты, демонстрирующие наличие Ш-2 в концентрации 5.75 ед/мл в супернатантах от облученных спленоцитов по сравнения с 2.5 ед/мл в супернатантах от нэоблучэнных спленоцитов, что определялось по стандартной' калибровочной кривой зависимости пролифэративного ответа индуцированных Кон-А бластных клеток ьши от _ концентрации стандартизованного препарата р-зкоубинактного ИЛ-2 з культуре.

Таким образом, эксперименты показала усиление продукции Ш~2 в среде, ковдяцнонирозанной облученными спленоцитами, в 2.1 раза по сравнению с нэоблученшми .спленоцитами. При нагревании до 56°, 75° и 100°С структура ростового фактора разрушалась. Тимошин не обнарукизали усиления продукции ИЛ-2 после облучения.

Так как, по последам данным, ИЛ-2 и ИЛ-I оказывают радиозащатноэ действие на лжфоциты ч естественные киллерные

клетки, усиление продукции ИЛ-2 какется вполне ожидаемым' результатом облучения, хотя ранее были показаны иш-э, более жесткие условия индукции этого лш.фжянэ: 10-20 Гр при облучении in vivo ж in vitro, чем показанные в данной работе (I Гр ).

необходао отметить, что жоцкти си облучениях шжй не обнаруживали усиления продукции ИЛ-2 посла облучешш ( рис.8 ), хотя они такае обладали способностью стимулировать пролиферацию антактных клеток в сингенной смешанной культуре лимфоцитоЕ ( рис.4 ). Объяснение этого факта может сводиться к двум основнкм причинам: I) как спленсциты, так и тимоцитц облученных кашей опосредует сеоэ стимулирующее действие на интактенэ клетки на через продукции ИЛ-2, а иным способом, посредством других иммуномедиаторов, либо через контактные взагаодейстЕия; • 2) гуморальный фактор, продуцируемый облученными тдаоцитами, отличен от ИЛ-2.

Для исследования функциональной активности среды, кондиционированной облученными тимоштагы, было исследовано ее влияние на процесс пострадиационного восстановления организма облученного животного in vivo.

Из литературных данных известно» что трансформированные клетки линий внутритимусных предшественников 'Г-лимфоцитов продуцируют аутокркннай фактор, играюций роль в восстановлении тимуса посла его обработки. раздичиигз поврездаишми агентами. На основании этих данных было

видшзнуто оредполоазнпе, что фактор, продуцируема нормальными кдеткаш тимуса после действия радиации, также может играть роль в восстановлении тимуса после облучения.

Результаты проведенных вкспершентов суммированы б табл.2. Оказалось, что при 3-кратном введении среда, кондвдиошрованной облученнъш дозой I Гр тамоцитаж, мышам, облученным дозой 4 Гр, общее число тамоцятов увеличилось с 2.7 млн до 5.6 млн, т.е. в 2.1 раза. Одновременно с этим прэлпфератиЕныа ответ на Кон-А уменьшился с 22125 до 15618 ( средние значения ) шп/мин, т.е., ка 30%.

На основании литературных и полученных вкспериментальных данных можно предполошть, что фактор, продуцируемый облученными тиуоциуамз, стимулирует пролиферацию предшественников Т-лимфоцитов, за счет чего увеличивается общее число тимоцигов. Но так как известно, что ответ на Кон-А характерен, в основном, для зрелых тшоцитов , то, по-видимому, введение облученным животным исследуемого Фактора вызывает эмиграцию наиболее зрелых форм тимоцитов, в том числе, их активированных форм, в периферические лимфоидняе органы, чем реализуется программа общего восстановления иммунной систем после дд^отвйй поврсгдапцего агентакаковым является ионизирующая радиация.

ВЫВОДЫ

I). У мышей ликин С57н1/е общее рентгеновское и с Со60! 7-облучение в интервале доз О.Б-3 Гр вызыэеот ооотонна©

ТАБЛ.2.

Характер Число Пролиферативный ответ тимоцитов

воздействия клеток в ( индекс стимуляции ± ошибка

тимусе,млн среднего) на конканавалин А

Облучение + 2.7 22125 ± 1058

среда

Облучение + 5.6 15618 ± 1756

зреда, конд.

эблученнши

пшоцитаки

РИС.8. 35

30

25

20

15

10

срт 1000

1 2 3 СГ 56 75 100 К онтроли Облученные Норм. Обл.

спленоциты тимоциты

радиационной ижунодепресски, проявляэдоазя в уменыаев численности лшфоцмов в основных ламЗ&оидных органах скижен.а. их пролнфэратквного ответа на митоген.

2). Диапазон доз 0.1-0.5 Гр рентгеновского [Со60]-^-излучения является герметическим для мьшзей лин С57В1/6 и стимулирует пролиферацию лимфоцитов in vitro ответ ка 'конканавалин А при субоптимальной плотное культивирования клеток.

3). На фоне радиационной иммунодепресски в разработаны модельной системе, включающей: - смешанную культу лимфоцитов; субоптимальнув концентрацию клеток 500 клеток/лунку; субоптимальнув концентрацию митогена О мкг/мл; лимфоциты облученных дозами 0.1-1 Гр мыш стимулируют пролиферацию интактнах клеток в ответ конканавалин А. Эффект специфичен для мышей линии С57В1/ высоко чувствительной к действию ионизирующей радиации.

4). Максимальная стимулирующая активность выявляется селезенке и тимусе облученных дозой I Гр мышей через 43 после облучения и не выявляется в регионарных лимфатическ узлах.

5). Лимфоциты облученных мышей опосредуют сво стимулирующее действие на культуру иптактных клет-посредством гуморальных медиаторов.

в). Максимальная продукция факторов происходит в перв] 24 ч после облучения преимущественно популяци! Т-лим$оцитоз. Факторы различаются по своей чувствительное'

аиратуре.

). Спленоцнты от облученных дозой I Гр мышей линии l/6 обнаруживают усиление продукции интерлейкина 2 в зционированной среде.

). Тшгацитн от облученных дозой i Гр мышей линии c57b1/g обнаруживают усиления синтеза интерлейкина 2 в щионированной среде и продуцируют фактор, участвующий в эадиационнсм восстановлении тимуса и периферических щдных органов . посредством увеличения общего числа датов и эмиграции их зрелых форм из тимуса.

список работ, опубликованных: по теме диссертации i. Запшаева С.Л., Киркин А.Ф., Гусев М.В. Появление 'лзругацей активности в популяции лимфоцитов мышей линии /в при общем 7-облученни в шзких дозах: // Вестщк некого университета. Серия 16. Биология. 1992. Т.2. 7-21.

. Вашлаева С.Л., Киркин а.ф., ГусевМ.В. Увеличение

ности клеток-стимуляторов в популяции лимфоцитов мышей

C57B1/S посл97-облучения // Тезисы докладов, I съезд

ологов России - Новосибирск, 23-25 июня 1992 г.

. Манекина С.Л. Киркин А.Ф., Гусев lá.B. Оценка

иональной активности лимфоцитов перн@ериче ской крови

ых меланомой и здоровых доноров in vitro // Тезисы цов, научная конференция молодых ученьп Россий эвье и болезни человека на рубеже XXI века" - Mockes, ь- 1993 г. / в печати /