Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование глюкозо -6- фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49) плодов яблони и её роль в процессе их созревания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование глюкозо -6- фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49) плодов яблони и её роль в процессе их созревания"

АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

ИНСТИТУТ БОТАНИКИ ^ --=-----

^ На правах рукописи

Я

Я> УДК 581.19:577.158

ГЮЛЬАХМЕДОВ САИБ ГУРБАН оглы

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛЮКОЗО —6— ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (КФ 1.1.1.49) ПЛОДОВ ЯБЛОНИ И ЕЕ РОЛЬ В ПРОЦЕССЕ ИХ СОЗРЕВАНИЯ

03.00.04 — Биологическая химия 03.00.12 — Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

БАКУ - 1995

Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений ордена Ленина Института биохимии им. А. Н. Баха РАН и на кафедре биохимии и биотехнологии Бакинского Государственного Университета им. М. А. Расул-заде.

Научные руководители:

— доктор биологических наук, профессор Кулиев А. А.

— кандидат биологических паук, доцент Мамедов 3. М.

Официальные оппоненты:

/ I ,

—- доктор биологических наук Кулиев Н. М.

— доктор биологических наук Ализаде В. М.

Ведущая организация — Институт Генетики и Селекции АН Азербайджанской Республики.

Защра состоится „ /X * __199^_г.

в „ /3 час. з седании Специализированного совета Д.004.12.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте ботаники АН Азербайджанско'н Республики по адресу: 370073, Баку, Патамдартское шоссе, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Ботаники АН Азербайджанской Республики.

Автореферат разослан „ __"_199 г.

Ученый секретарь Специализированного СО]

кандидат биологических

ДЖАВАДОВА

' ОБПЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема биохимической природа процессов созревакия плодов является одной из актуальных в современной биохимии. Она помогает познанию молекулярных механизмов созревания плодов, способствует созданию научно-обоснованных методов, регуляции созревания, а также сохранения качества плодов в послеуборочный период.

Изучение особенностей функционирования различных ферментативных систем и индивидуальных ферментов являете,'! неотъемлемой частью биохимических исследований плодов на разных стадия;, их развития. Б этом отношении особенно большое значение приобретает исследование глшозо-6-фосфатдегидро~'эназы (ГоФДГ) - ключевого фермента пентозофосфатного цикла окисления глюкозы. Изучение этого фермента интересно еще и тем, что оно позволяет судить о функционировании пентозофосфатного цикла в целом. Однако в рас-тителышх тканях и, в особенности, в'сочных плодах 1БФДГ изучена слабо, а в плодах яблони - прагтически не исследована.

Цель и задачи работ ]. Целью настоящей работы является исследование Г6ФДГ плодов яблони и ее роль в процессе их созревания. Уля достижения этой цели нг.ми были поставлены следующие задачи:

- подобрать оптимальные условия приготовления активного ферментного препарата Г6ФДГ и определить активность фермента;

- определить внутриклею лую локализацию и молекулярные' формы Г6ФДГ;

- изучить изменение активности Г6ФДГ при созревании плодов яблонл;

- исследовать Елияние синтетических регуляторов роста и созревания - этрола (2-хлорэтилфосфоновая кислота) и гидрела (бис гидразиневая соль 2-хлорзтилфосфоновой кислоты) на скорость созревания яблок я на динамику лзл.еления акти лссти Г6ФДГ.

Научная новизна работы. Впервые выявлена а"тивность Г6ФДГ в яблоках и тем самым доказано функционирование пентозофосфатного цикла в этих плодах. Установлено, что при оптимальных условиях выделения ферментный препарат ГбФ^Г стабилен л может храниться в течение нескольких часов при комнатной температуре. Г6ФДГ яблок специфичен к НАДФ и ингабируется НАДФН, да своей каталитической активности не требует присутствия двухвалентных катяо-

нов в среде. Фермент не характеризуется четким оптимумом рН и проявляет достаточно высокую активность в пределах рН 8.0-9.0,

Установлено, что основная часть 1Б$ДГ сосредоточена в ци-тошшзматичьокой фракции клетки, В оубэпивермалъных тканях яблок фермент представлен тремя мслекуляршда формами, существенно отлчающишся во электрофоретической подеикности. . Наиболее активная и доминирующая форма локализована в цитозоле, а две ' другие, менее активные - в субклеточных частицах, осаждаемых при 15000 и 30000 £ .

Показано, что процесс созревани.1 плодов сопровождается повышением активности Г6ФДГ. Факторы, ускоряющие процесс созревания существенно повышают активность фермента, причем преимущественно ее цитозольнсД формн.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют и углубляют наши знания о характере функционирования Г65ДГ, следовательно, и пентозофосфатного цикла при созревании плодов яблсшя, Опи могут служить основой для дальнейших исследований в этом направлении и помочь создан™ биохимических приемов регуляции послеуборочной кизни плодов.

Легкость и простота разработанных ме-.одоз получения активного препарата Г6ФДГ, определения ее активности и электрофоретичес-кого исследова!шя, а такке термостабильность фермента позволяли • включить эти методы в учебную программу по большому спец.практикуму для студентов, специализирующихся на кафедре биохимии и биотехнологии Б1У им.М.А. Расулзаде.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуздекы на: коллоквиуме лаборатории биохимии иммунитета растений Института биохимии им.А.Н.Бахи АН РФ (Москва, 1992); III Симпозиуме Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993); II-Республиканской биохимической конференции ■(Баку, 1993); Научной конференции аспирантов и молодых специалистов, посвященной 75-летию создания Бакинского Государственного Университета (Боку, 1994); заседании кафедры биохимии и биотехнологии Е1У рм.М.А.Расулзаде.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы; Диссертация изложена на 1Яа страницах машинописного текста я содержит _4_ фотографии, _з_ схега,

Ю таблиц и 24 рисулка, Состоит и? введения, обзора литературы, зкэцержентальпой части, результатов и их обсуждения,

выводов, списков сокращений я цитируемой литературы ( 2Z7 наименований, в том числа 200 иностранных работ).

•МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований слукшш яблоки двух сортов ( Py'rus Malus l. ), отличашлося по времени оозревакия: Антоновка (осенний сорт) и Ренет Симяренко (знаний сорт), выращенные в Кубинском районе Азербайджанской Республики я поселке Щемякино Московской области РФ. Для эксперимента использовали плоды, ьаходящяеся на разных стадиях роста и созревания. После сбора плоды хранились при +4°С и относительной влажности 85-90$.

Эксттокция 1ВФДГ. Среднш пробу брали из субэпидермальпой' гканл пяти яблок. Навеску растирали в ступке о экстрагирующим раствором, приготовленным на основе Трис-HCI - буфера с pH 9.0 (0.I5M), содержащего 1% ПВП (М.в. - 2400СЩ) и 0.0IM 2-меркапто-! этанол. Соотношение ткани и экстрагирующего раствора было 1:3. Полученный гомогенат пропускали через двойной слой капроновой ткани и фильтрат центрифугировали при 12000g -в течение 20 мин. Ос.док отбрасывали и супернатант использовали в качестве неочищенного ферментного препарата 1БФДГ.

Частичная очистка Фермента. В среде экстракции растворимый ПБП заменили нерастворимым (Поликлар AT), а такяе добавляли в среду 0,01 М длэтилдитиокарбамат натрия. Э?о было -'.еобходимо для удаления мутного осадка ПБП с сульфатом аммония, с помощью которого осаждали белки. Осадок отделили центрифугированием-(10 мин., 5 ООО g ) я растворяли в 5 шг раствора, состоящего из О,IM Трис-HCI - буфера' (pH 8.0), 15? ПВП и G,0IM 2-меркаптоэтанола. Полученную суспензию диализировали против того ке раствора, с исюго-чением 2-меркаптоэтанола, 12 ч, при +4°С. '. .

Активность Р6ФДГ определяли спектрофотометрически на СФ-46 при 340 нм по скорости восстановления НАД®. Инкубационная среда состояла из: О,IM трис-HCI - буфера с pH 9.0, 20 мкМ глшозо-6-фосфата, 0,40 мкМ НАДФ и 20 мкМ ¿лоряда магния. Общий объем инкубационной среди был 3 мл, из которого 0,25 мл - фергентный препарат. ....

Зг единицу ферментативной активности принималось количество изменения превращаемой НАДФ за одну минуту. Расчет активнооти проводили на исходный вес сырой ткани пля на I кг белка.

Содержание белка определяли по Лоури (Ьоигу еЬ а1., 1951).

Внутриклеточную яокализоцию Г6ФДГ исследовали методом дифференциального центрифугирования. Фильтрат подвергали последовательному центрифугированию при 1000, 15000 , 30000 и 105000$ . Активность и лзоферментный состав в осадке исследовали после обработки 0,1% Твид-80. Для предотвращения осмотического шока и сохранения структурной организации субклеточных частиц экстрагирующую среду готовили на 0,5М сахарозе. Ионную силу создавали 0.5МКС1.

Г'ль-электрофорёз ГбФ.Щ? л ПААГ проводили и приборе фирмы "Реанал". В основе летал метод Девиса ( Баухеа в.,х., 1969 ), который был частично модифицирован. Были использованы 7,5^-ный акршшмид'для мелкопористого и 4,75^-шй акрилашд для крупнопористого гелей, а также 25%'-ная сахароза в качестве антиконвекцп-ошюй среди. Разделение фермента проводилось в течение 3 часов, при силе тока (I мА первне 20 мин.) 3 мА. на' каящую трубку.

Окрашивание полосы 1БФДГ проводили гистохимическим методом с помощью нитросинего тетразолия. Столбики геля после электрофореза промывали холодной дисти;ишрг>ванной водой, инкубировали в точешш часа, в темноте, при +ЗС°С в среде, которую использовали для определения активности фермента, добавив к ней феназшшета-сульфат (0,02 мг/мл) и нигросшшй тетразолий (0,2 мг/ыл). Окрасу фермента фиксировали раствором, состоящем из этанола, диc,!:ШJJШpo-в.: нной воды и уксусной кислоты в соотношения 1:3:1.

Денситометрироьание полос фермента осуществляли с помощью микроденситометра 1/Д-Ю0.

Обработка плодов этиленпродуцентами. Для ускорения процессов созревания яблока обрабатывали синтетическими регуляторами роста и созревания - этрелом (2-хлсрэтилфосфоновой кислотой) и х-ядрелом (бис гидрозиневой солью 2-хлорзтилфосфоновой кислоты). Обработка плодов на материнском дереве проводилась путем опрыскивания растворами этрела и гидр°ла (0,п мг/мл) вручную из распыли-теля за 28-30 дней до сбора плодов. Контрольные плоды опрыскивались водой.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

опрщшш лкшшости гефдг яслони

Использование сочнюс плодов, ь частности лблок, в бяохани-

чеекях исследованиях сопровождается некоторыми методическими трудностями, вызванными высоким содержанием фенольных соединений, пектиновых веществ и органических кислот. Полностью избежать негативных влияний этих веществ при получении активного ферментного препарата практически не удается. Поэтому условием проведения экспериментов с сочными плодами является удачное преодоление указанных трудностей и особенно действия нолифенолов. В настоящее время для преодоления отрицательных влияний фенолъных соединений на ферментные белки пользуются реагенты, адсорбирующие и предотвращающие их окисления В качестве адсорбентов часто применяют ПВП, Карбовакс, Поликлар АТ, ПЭГ, а в качестве восстановителей -аскорбиновую кислоту, 2-меркаптоэтанол, ЭДТА и метабисульфит натрия.

Эксперименты по подберу оптимальных условий получения активного ферментного препарата ГЗФДГ показали, что гомогенизация ткани в буферных растворах без адсорбентов к восстановителей не позволяет получить желаемый результат. В частности, это выразкалось в быстром побуренди и потере активности фермента. Присутствие адсорбентов и восстановителей способствовало получению активного ферментного препарата Г6ФДГ. Было выявлено, что наиболее эффективным реагентом для нейтрализация действия фенольных соединений в приготовлении препарата Г6ФДГ является ПВП. Замена его на поликлар АТ приводила к уменьшению активности фермента на 20-30'*, а на ПЭГ - к полному исчезновению активности. Что же касается восстановителей, то ЭДТА, аскорбиновая кислота ж метьбисульфит натрия, по сравнению с 2-меркаптоэтанолом, оказались менее эффективными. Использование 2-меркантоэтанола способствовало сохранению исходного цвета экстракта до трех суток. А потеря активности за этот период составляла всего лишь 30-35%.

Величина рН экстрагирующего раствора имела существенное значение для активности Г6ФДГ (табл.1), ^дя по полученным данным, высокая кислотность клеточного сока неблагоприятна для выделения активной Г6$ДГ. Так, при значения.рН экстрагирующего раствора 7.0, вследствие повышенной кислотности субэпвдета»,алышх тканей яьлок, рН гомогената существенно снижался. Увеличение рП экстрагирующей среды благоприятствовало поучению активного препарата Г6ФДГ, а наиболее подходящее ¡значение рН трис-КС1 буфера явилось 8,5-9,0. При значении ке рН више 9.0 активность проявилась мало.

Предложенная среда экстракции имеет ряд положительных осо-

Таблица I

Влияние рН экстрагирующего раствора на рН гомогената и активность глькозо-б-фосфатдевдро-геназы яблок ( Dg^Q-IO^MiiH-1 гомогената)

__Антоновка___Ренет Сиииренко_

рН гомогената активность рН гомогената активность

7,J 4.6 . .0 -4.8 ■ 0

7.5 6.0 132+2,6 7.0 102+2.I

8.0 7.8 196+3.9 7.9 128+2.5

8.5 8.1 228+4.2 - 8.2 142+3.2

9.0 8.6 240+5.4 8.7 150+4.I

9.5 9.2 ' 230f4.4 9.3 140+3.4

бенностей. Во-первых, ферментный препарат, преготовленный на этой среде, оказался термостабильнкм i не было необходимым проведение процедуры выделения на холоде. Во-вторых, активность фермента не менялась в течение 7-8 ч. при комнатной температуре. Подцерюние фзрментиого препарата при +4°С и в замороженном состоянии позволяло продлить срок хранения ферментного препарата до трех суток.

Таким образом, использование трлс-HCI буфера (0,15 М) рН. 8,5-9,0, содержащего 1% ПВП и 0,01М 2-меркаптоланол в ¡качестве экстрагирующей среды позволило получить активный и стабильный препарат 1БФДГ из плодов яблони.

НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТЕА Г6ФДГ ШОДОВ ЯПОКИ

Исследоваше нижеперечисленных свойств Г6ФДГ осуществлялось с использованием частячноочищенного ферментного препарата.

Влияние рН инкубационной среды. Частичноочшцешшй ферментный препарат Г6ФДГ сохранял свою функциональную активность в широком диапазоне рН (рис.1). При этом отсутствовал четкий рН оптимум В пределах рН 7.0-9.0 трис-KCl буфера наибольшая активность фермента проявилась при рН 9.0.

Такая зависимость активности от рН не являете: редкостью (Cronet a.G.,. hartoan o.i.u., "1977 ), но в большинстве случаев фермент характеризуется определенным оптимумом рН. В зависимости от источника Г6ФЦГ оптимумы рН могут существенно отличаться. Г65ДГ из ягод винограда была.наиболее активна при рН 7.0-7.4 ( HawVcer l.s., 1969 ), а из проростков пшеницы - при 8.0-8.5 (iiiri'iichrai И., ¿uleb Ii , 1939).

1 t 12

Рис.I

Зависимость ферментативной' активности. ГбФДГ ст pH. инкубационной среды; ■

1 - Антоновка, '

2 - Ренет Симиренко

6 ' 7 ' 8 ' 9' pH

Влияние ионов двухвалентных катионов. Присутствие ионов Мп'

„2+

и Св В инкубационной среде на активность Р>фЦГ не оказывало какое-либо заметное влияние. А ионы Mg2+ в пределах концентрации от 10 до 15 мм приводила к повышении активности фермента з препаратах,Г6ФДГ, полученных из плодов Антоновки и Ренета Симиренко,' соответственно на 4% и 6% (рис.2 а). Такое незначительное повышение активности,, гозможно, связано с Г6ФДГ хлоропластного происзсодценяя, которая для своей каталитической активности требует наличие ионов . Mgв среде.

Ферментные препараты ГЗЗЩГ большинства источников активируются ионами . но проявляют каталитическую активность и в их отсутствие (Levy H.H., 1979 ). Другие двухвалентные катионы также способны влиять на активность ГбфДГ. При этом, в зависимости от источника фермента тот или иной катион может оказаться более эффективным. Так, Г6$ЦГ к проростков гороха'активировалась ионами Са2+ в большей степени, чем Mg2+ (при 20-60 мкМ),

р , V

a подавлял ее активность ( Mirfaehrei м. ,• ллаеЪ ъ.1989 ) •

Напротив, ионы Ип2* ускоряли ферментативную активность Г6ФДГ из проростков нута в гораздо большей степени,'чем ионы Mg2+ (Äshihara Н., Komamiue А., 1976).

Действие катионов на активность Г6&ЦГ может определяться также составом и значением ионной силы инкубационной среды. Например, ионы могут активировать ГбЗШГ'в буферном растворе глицил-глицина. Однако, в буферном растворе фосфата и триэтанол-вышга такал активация не обнаружена (Dronet a.,G., Hartman c.l.R., 1977).

Таким образом, Г6ФЛГ плодов яблони практически не нуздалась в присьтствия ионов Kg2'!" , Сс.2+ и Мп2+ в инкубационной среде.

Inc.ii Зависимость активности 1БФДГ яблок от концентрации ионов Ms (а), глюкозч,-6-фо.4ата (б) НАДФ (в) я НАДФН (г) в инкубационной среде: ( о) - Антоновка; (о) - Ре.:ет Слмкренко.

Точкам;: на графике указаны средние значения опытных величин, среднеквадратическое отклонение которых ке превышало +3.

Определение оптимальной концентрации Г6Ф и НАДФ. Зависимости активностей Г60ДГ яблок от концентрации глюкозо-6-фосфата и НАДО в гшеубационней среде характеризовались типичной кривой 1.'ихаолнса-1«ентен (рис.? б,в). Ородст; о охого фермента к кофактору было более чем на порядок вине, чем сродство к субстрату. Г62ДГ «блок но проявляла активность в присутствии ШД. В это« отношении она существенно отличается от Г65ЩГ микроорганизмов. которые часто могут обладать каталитической активностью как с НАД, так и с НАДФ (Lev;.- II., 1979 )•

Влияние куклеотидов. Из цепыташшх нами нушюотидов (АТШ,

АДФ, АМФ, НАД, ПАДЛ, ЛАД®!) только НАДИ был способен влиять на активность БЗФДГ яблок (рис.2 г). Он проявил: себя как ингибитор-КАДФ. Результаты ингибирующего действия НАДФВ, представленные в двойных обратных координатах, показа~и его1 конкурентный характер. Аналогичное действие НАДФН'на активность этого феркента отмеча-. ЛОСЬ Я другикш авторами ( Kather I.K. Gl" al.» -1972; Hosemoyor E., 1987). По-видимому, соотношение НАДФК/НАДЗ яграег определенную роль в регуляции активности Г6ФДГ плодов яйггешг.

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЙ ГБ^ДГ-ЯМОК

Результаты исследований по распределении' активности ГоФДГ плодов яблони в суиернатанте а в частица^осатщаекых при различных значения! " £ " представлены в таблице 2. Как видно из полученных данных, активность фермента по фракпдяы распределена не-зивномерно. Большая её часть была сосредоточена в еупернатанте. Так, в яблоках Ренет Сныиренко 77%, а в Антоновке общей ферментативной активности была обнаружена а сзсёргэтгкге 105000 g . Небольшая активность {1-4% для Антоновки. для Ренет Симирен-ко) была выявлена в осадках фракций 15000: aSOCTOg после их обработки Твин-60 з присутствии KCl. В осадке 105003$ активность 1БФДГ отсутствовала. Такое распределеглта активности фермента, по Есей вероятности, свидетельствует' о преобладании Цитозоль-ной формы Г6ФД1', а также о связи определенно! части фермента с субклеточными частицами, осаждаемыми пря L5GQQ и 2QG00g .

По литературным даннш.:, альтернативная kgctoü локализации Г6ФДГ в растительных тканях являются хлоропласта С Eichoi t и., Coabiis В., 1968; Anderson S.Z., Du^gan I.X.„ 1975; Jan X.II., Andersen L.E., 1987 ). Ряд наших наблюдений основание предположить, что и в исследуемых нами яблоках этот фермент нахо- • дится тог.е в хлогюпластах. Так, фракции, ссдеряэщвг хлоропласта, всегда обладали активностью 1БФДГ. Эю, прежде всего, наблюдалось в осадке 15000 g . Осадок, полученный из яблок Рэпет Симиренко (сорт более зеленый и богатый хлоропластами\ бшг обильнее, более зеленым и обладал относительно большей активности, чем аналогичной осадок из яблок Антоновка. При этом обща! уровень ферментативной активности в плодах Антоновки был в £¡5-2 ре за выше, чем в Ренет Симиренко. Осадок же еупернатанта 30000 g, который считается фракцией,обращенной митохондриями ('Levy н., 1979 )• в наших опытах, судя по своей окраске, содержал также разрушенные

Таблица ?.

Распределение активности Г6ФЦГ в плодах яблони сортов Антоновка и Ренет Симиренко в супернатанте и в частицах, осаждаемых прл 15000, 30000 и 105000£

Фракция

Объем (мл)

Общая активность

(ЕМ НАД® мшЬ"1. сыр.в.тк.)_

Концентрация белка Удельная активность % активности от

(мг/мл х 10' )

(яМ НАД^Н'ЬМн"гг белка)

общей

Антоновка Ренет Симиренко Антоновка Ренет Симиренко Антоновка Ренет Стзиренко Антоновка Ренет Симиренко

Гомогенат 35 265+4,1 170+2,6 132+2,0 123+2,0 гооьз.э 132+2,0 100 • юо

Супернатанты м

1000 д 30 250+3,9 150+2,4 131+2,0 121+1,9 191+3,6 124+1,9 94,3 88,2 1

25 241+3,5 140+2,1 12С^1,9 116+1,9 20С^З,9 122+1,8 90,9 62,3

30000^ 20 225+3,1 132+1,9 112+1,8 91+1,8 200+3,9 145+2,3 84,8 77,3

105000^ 15 225+3,1 131+1,9 104+1,4 83+1,6 215+4,1 157+2,4 84,6 77,1

Осадки +

1/Йвин-вО

+0.5М КС1

15000 £ 3 -0+0,1 13+0,2 .28+0,4 21+0,3 35+0,6 62+1,2 3,7 7,6

30000 $ ■ 3 6+О.Х 7+0,1 21+0,4 12+0,7 28+0,4 58+1,0 2,2 4Д

105000 £ 3 сл. сл. 6+0,1 4+0,1

хлоропласты. Поэтому не исключено, что проявленная активность ' Г6ФДГ в этой фракции также связана с хлоропластами. Осадок супер-натанта 105000 g , где хлоропласты отсутствуют, практически лишен ферментативной активности 1ВФДГ.

Таким образом, основная часть активности ГБФДГ яблок локализована в цитоплазматической фракции, а меньшая в субклеточных частицах, осаждаемых при 15000 и.30000g . Результаты наших исследований хорошо согласуются с имеющимися в литературе данными. Так, из листьев гороха около 80$ общей активности была обнаружена В Цитоплазматической фракции ( Fickenscher E.I., Schexbe Е.Х. 1986). В суспензионной культуре риса на долю растворимой фракции попало чуть больше 90% общей активности Г6ФДГ ( Ikuo Z., et al., 1981).

. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФОРШ 1ВФДГ ПЛОДОВ ЯБЛОНИ '

На рис.3 представлены зимсграммы диск-электрофореза в ПААГ различных фракций субэпидермальной ткани яблок, позволяющие определить количество молекулярных форм 1БФДГ и их,внутриклеточную локагизагую. Зимограммы супернатантов 1000 и 15000 g , 30000 и ÍOpOOOg, а -пакже осадки 15000 и SOOOOg- оказались схожими.

Супернатанты 1000 и 15000-g- , приготовленные па обычной экстрагирующей среде (т.е. без K0I и сахарозы) после'электрофореза в МАГ активность не проявляли (гель JS I). Добавление 0,5М KCI в экстрагирующую среду или же в супернатанты, но с последующим выдерживанием в течение 30 мин. приводило к появлению трех молекулярных форм фермента (гель 2), Эти формы характеризовались значением ЕГ 0,11, 0,29 и 0,56. Полоса изофермеятм.'с Р£ 0,56 окрашивалась более интенсивно и ее толщина значительно превосходила остальные. Очевидно, она и является доминирующей молекулярной формой ГБФДГ в плодах яблони.

Присутствие KCI было необходимым условием электрофореза и для других фракций. В его отсутствие практически вся активность обнаруживалась на поверхности крупнопористого геля. Видимо, 1БФДГ яблок склонна к образованию агрегацчй больших размеров. Такая особенность наблюдалась и у Г6ФДГ из культуры клеток риса (ijcuo I., Iliroshi Т., Kiyoshi В., Kasunori S., 1981).

Электрофорез супернатантов 30000 g и 105000 g- , приготовленных в присутствии 0,5М сахарозы с последующ™ добавлением 0,5М KCI, выявил единственную молекулярную форму Г61ДГ с иг 0,55

Рис.3

Диск-электрофорез 1БВДГ в различных фракциях субэщ-дермальной т'саяи яблок Антоновка.

I - супернатант 1000 g без KCl; . 2 - то же самой в присутствии kcl;

3 - супернатант 105000 а ;

4 - осадок 15000 g , обрабо-

танный Твик-80.

(гель № 3). Две .другие формы с 1« 0,11 и 0,29 не проявились. Это, вероятно, свздетельствует о том, чтс доминирующий изофермент с Е£ 0,56 локализован в дитопяазмо, а другие-в субклеточных частицах, осаждаемых при 15000 л 300С0 с- . Электрофорез этих фракций после обработки Твик-БО лэказал характерное окрашивание в районе ег 0,11-0,29 (гель & 4). На зимограмме осадка 105000® активность Б5ФДГ но обнаруживалась.

Таким образом, Г62ДГ в плодах яблоки представлена тремя молекулярными формами. Дитоплазматйчеекая фракция имеет одну - наиболее активную ж 'дышнирушцую'молекулярную форму с к£ 0,56, .а фракция субклеточных частиц, осавдаемых вря 15000 и ЗС000 § - две формы Г60ДГ, дмешие.-значение НГ 0,11 я 0,29.

ОСОБЕННОСТИ ШСЩ0НИР0ВАШЯ 1БФДГ

при созревай® .плодов яблони

Исследование изменения активности Г6ФДГ яблок дает возможность псзнать и оценить участие и pc.it этого фермента, а также ПФ-цикла при созревания этих плодов.

Характер изменения активности Г6ФДГ яблок на материнское дереве за месяц до -съема плодов представлен на рис.4. :в фазе созревания яблок активность 1БФДГ существенно возрастала. Тенденция к повышению активности Г6ФДГ в плодах Антоновки обнаружилась уже спустя четыре для с начала опыта (рис.4). После первой недели интенсивность функционирования ферлента,еще больше

'Ж "

Г- w

j • ■ • • ■.. I

Рис.4

Изменение активности Г6$ДГ при созревании плодов яблоня: о - Антоновка; « - Ренет Симиренко '

Í Г . 'Л 21 28 ДНИ

усилилась и в конце третьей недели достигала своего максимума. В это время активность Г6ФДГ по сравнению с исходной увеличилась-на 16$. Такой высокий уровень активности фермента оставался неизменным' до конца эксперимента.

В первые две недели проведения экспериментов активность 16ФДГ плодов Ренет Симирекко-увелишлась незначительно (рис.4), после чего наблюдался резкий подъем уровня активности фермента, который продолжался до кокца третьей недели. В этот период активность ГбфЦГ была самой высотой и превышала первоначальную активность на 19%, а затзм уровень активности стабилизировался.

Таким образом, процесс созревания плодов яблони сопрововда-ется значительным усилением активности Г65ЩГ - ключевого фермента ПФ-цикла.

Поскольку , в плодах яблони Г6ФДГ представлена нескольким изоферментами и распределение активности фермента по субклеточным частицам неравномерно, в последующей серш экспериментов мы решили выяснить,-за счет каких молекулярных форм и какой субклеточной активности происходит увеличение активности Г6ФДГ?

Характер изменения, активности Г6ВДГ в -супернатантах фракций 15000 и 30000 g в плодах Антоновка и Ренет Симиренко напоминает динамику общей активности фермента, обнаруженной в супернатанте фракции 1000 g (рис.5). Так, в супернатантах обеих фракций плодов Антоновка наблюдалось заметное повышение активности фермента у.-ш в конце первой недели. В последующие две неделя активность Г63ЩГ еще больше усилилась. После этого до съема плодов на уровнях активности фермента в супернатантах всех фракций заметные изменения не наблюдались. В день съема плодов разница уровней активности Г6ВДГ в супернатантах 10000, 15000 и 30000 g составила и-

14$, соответственно, что была идентичной с той, наблюдаемой в супер!.атантах аналогичных фракций в начале опыта. ■

140 ^120 ►4100

О

о 50

К рр

ЕЯ Н

и 130

ПО 90

70

1. 7 14 21 28 ДНИ

Рис.5 Изменение активности Г6ФДГ в сулернатаятах фракций 1000, 15000 и 30000 £ при созревании лбло^ (в $ по отношению к активности фермента в супернатанте 1000¿5 ). За 100$ принималась активность Г6ФДГ в супернатанте фракции 1000 £ в день начала опыта. А - Антоновка, Б - Ренет Сширенко; Ш , , Ш - суцернатанты

1С00 § , 15000 и 30000 д , соответственно.

Похо?кая картина .была получена при созревании яблок Ренет Ссмиренко (рис.5 б). Анализы данных, представленных на этом рисунке, показали, что характер изменения активности Г6ФДГ в суперна тантах 'фракций 15000 и 30000 £ был идентичным с динамикой общей активности Г6ФДГ, обнаруживаемой в супернатанте 1000 д Количественные различия обнаружены лишь в объемах потери актив-

1

71

к, Л

X/

а/ •

Г £

у

ности фермента в соответствующих супернатантах. В плодах Рене'г Симиренко она была больше на &% и на 4$ и составила 15% и 18$ на' протяжении всего опыта.

Таким образом, усиление активности Г6ЗДГ цри созревании ™ло-дов яблони обусловливается ее цитоплазматической фракцией.

Для выяснения механизма активации цятозольной формы Г6ФДГ нами било проиедено электрофореткческое исследование ферментного белка в супернатантах фракции 1000, 30000 £ и в осадке фракции 15000g (рис.6),

'А'

Б

В

Рис.6 Зимограмма и денситограмма различншс фракций Г6ЭДГ яблок при их созревании: Л, Б - супернатанты 1000§ и 30000§ , соответственно; В - осадок 15000^ + Твин-80; I. 30 - дал проведения эдектрофоретячес- • ких исследований.

Судя по зимограммам различных фракций, в период созревания •плодов яблоня в лзофермент'ном составе Г6§ДГ особых изменений не происходит. В начале опыта в гелях'еупернатаята фракции ■ 1000 £ были выявлены три полосы ферментного белка со значениями нг 0,11; 0,29; 0.56, в осадке 15000 g - характерное диффузионное

затемнение б районе 0,11-0,29. Такая ке картина наблюдалась в зимограшах аналогичных фракций яблок обоих сортов в день съема плодов. Однако, в конце опыта интенсивность окрашивания полосы ГоОДГ с Е1' 0,56 усилилась в супернатантах 1000 и 30000£ ,

Таким образом, в период-созревания плодов яблони в изофер-мойтном составе 1БФДГ не происходят количественные изменения. Наблкгаеше качественные изменения в интенсивности окрашивания полос ферментного белка хороао согласуются с характером распределения активности Г6ФДГ по 'фракциям и изменениям этой активности в исследуемых фракциях.

МИЯНйЕ ЭТРЕЛА И ЩЕЕ1А НА СОЗЕЕБАШ И НА Ш^ДОМРОВАНИЗ Г6ФДГ ПЛОДОВ ЯБЛОНИ

Этрел и гидрел, будучи синтетическими этилен-продуцентами,, в определенных условиях обработки адсорбируются через покровные ткали сочных плодов в мякоть, распадают к выделяют отклеп, благодаря которому- о'бладают способностью ускорять созревание плодов. Поэтому изучение действия этих регуляторов на активность ГбАДГ представляет особый интерес. Заметил, что дашше раооты по влиянию этрела и гидрела ка особенности функционирования 1В5ИГ в тканях высших растений практически отсутствуют.

Влияние этрела и гидрела на ход созревания плодов. Влияние синтетических этиленпродуцентов на созревание плодов оце.лвалось путем учета таких показателей зрелости, как размер, вес, окраска и количество падалицы.

Результаты исследования показали, что обработка плодов этрелом и гидрелоы в концентрации 0,5 г/л за месяц до съема плодов •увеличивает их размеры и вес. В плодах Антоновкэ увеличение веса плодов у опытных вариантов было в среднем на 15$ больше, чем у контрольных, причем, симулирующее действие гидрела оказалось более "-ильным. Разница в привесе яблок сорта Ренет Си. лренко мезду контрольными и обработанными этиленпродуцентами плодов составила в среднем 45$.

; Обработка плодовэтрелом и гидредом также увеличивала интенсивность 'ладения плодов в обоих сортах почтя в два раза.

Результаты учета изменения окраски яблок показали, что зти-."екпродуценты стимулировали развитие окраски, характерное для созревших ¡йодов. Так, если среди контрольных плодов Антоновки на дол» золеянх пришлось 54$, то среди обработанных этрелом и гидре-

лом таких плодов было 12$ и '19%, соответственно. Среди контрольных плодов яблони сорта Ренет Симиренко 4$ имели характерную для зрелых плодов желтую, а 15$ - зелено-желтую окраску. Среди обработанных же плодов это соотношение было 27 и 52$ в варианте с этрелом и 39$ и 44$ - с гидрелом.

Таким образом, полученные донные подтверждают имеющиеся в литературе данные (Кулиев A.A., 1982) о том, что этрел и гидрел являются регуляторами роста и созреЕанпя яблок.

Влияние этредд и гидрела на функционирование Г6ФДГ плодов яблони. Характер изменения активности Г6ФДГ при созрегании плодов Антоновки в присутствии этрела и гидрела представлен на рис.7. Синтетические регуляторы роста, спустя уже два дня после обработки, заметно увеличивали активность Г6ФДГ. Причем, дейстЁие гидрела в течение всего периода проведения эксперимента превосходило действие этрела. В последующие сутки влияние обоих регулятороз еще усиливалось и на седьмой день эксперимента достигало своего максимума. -За это время в плодах, отработанных гидрелом, скорость увеличения активности Г6ФДГ превышала скорость аналогичного процесса в контрольных плодах на 28$. А в плодах, подвергнутых дейст-

3 5 7 14 21 28 Л

Рис. 7

Влияние этрела и гидрела на активность глюкозо-6-фосХатдегидрогеназы плодср яблопк:

1 - контроль (диет'.года)

2 - этрел (0,5 г/л)

3 - гидрел (0,5 г/л)

Точками на графике указаны средние значения оштних величин, среднеквадра тпческсо отклонение которых не превышало +2,7-

—

вию этрела, активность фермента превышала активность ее в контрольных плодах на 22%. В последующе дна активность фермента в обоих вариантах оставалась на этом же уровне. После 21 суток она постепенно-уменьшалась, но' уровень активности "^ЗДГ в опытных плодах был высоким по сравнению с контрольными.

Похожие результаты получены и в плодах Ренет Симиренко (рис. 7). В этих плодах под влиянием этрела и гидрела активность Г6ВДГ ужа через неделю существенно увеличивалась. Самый, высокий уровень активности фермента отмечался в 21 день эксперимента,■когда ак-гивнос^ь Г6Щ" на 1% в плодах, обработанных этрелом и 22%- - у гидрелного варианта превышала активность наблюдаемую в контрольных плодах. В последние 7 дней исследования.обнаружено незначительное падение активности фермента в обоих опытных вариантах, но уровень'-оставался выше контрольного.

Таким образом, при созревании яблок-синтетические регуляторы •ростя существенно увеличивали активность ТСФДГ.

Исследование изменения активности' Г6ФДГ в супернагантах различных .фракций при. стимулкрованнл созревания этиленпродуценташ плодов яблони показало, что под деЧстЕием стрела к гидрела увеличивается активность только цптозольной формы Г65ДГ. Такая же картина наблюдалась и при. созревании плодов, но подвергнутых влиянию этрела и гчдрела. Однако, в отличие от контрольного варианта, этяленпродуценты способствовали падении уровня той части фермента, которая локализована в субклеточных частицах, осаждаемых при 15000 g и 30000 £ . Так, если объем потери активности фермента в соответствующих сушрнатантах обоих плодов в конце I недели был в среднем 14% и 18$, то в конце экспериментов эта разница соста-. вяла и 1%, соответственно, ото, 'видимо, связано деструктивными процессами,.происходящими е этих субклеточных частицах.

Таким образом, обработка плодов этилзнпродуцентами приводила к значительному повышению активности Гб'ЩГ, причем ее повьпкение касалось только цитозольной формы фер;. -нта.

Зимограммы и денситограммы электрофореткческих исследований ГбфЦГ, обработанных этрелом и гидрелом плодов показали, что в период созревания т.д. действием этрела и гидрела в изоферментном составе Г6ФДГ плодов яблони особых изменений не происходит. В день обработки я гелях супернатанта фракций 1000 £ и 15000 ^ были выявлены три полосы ферментного белка со значениями 0,11: 0,29; 0,56, в осадке 15000 £ - характерное ¿шффузиошюе окрашивание в рг.:':гне В! 0,11-0,29. Такая же картина габладзлась в

зимограммах аналогичных фракций плодов спустя три недели после обработки плодов этиленпродуцентами, 1 хотя активность Г6ФДГ в это время была самой высокой. Однако, обнаруживались'некоторые изменения в интенсивности окрашивания в полосах ГЗЗ^а исследуемых фракций, характер которых отличался от контрольного. Судя по ден-ситограмме, в 21 день спита' ослабилась интенсивность окрашивания в полосах с Н£ 0,11 и 0,29. Интенсивность окрашивания полосы 0,56, наоборот, усилилась, причем оба изменения были более ярко выражены в соответствующих гелях опытных плодов, что хорошо коррелирует с динамикой агтивности ферг/ента в различных фракциях клетки, исследуемых для изу зния распределения активности Г6ФДГ. Что касается активности диффузионного 0крашива1шя в районе Н£ 0,11-0,29 в ссэдке 15000в контрольных и опытных вариантах заметного отличия обнаружить не удалось.

Таким образом, этрел и гидрел ускоряют функционирование ци-тозольной формы Г6ФДГ, при этом в изоферментном составе фермента не наблюдаются качественные изменения. Сравнительный анализ елияния этих стимуляторов на общий ход созревания плодов и на изменение активности Г6ФЦГ позволяет придти к выводу о том, что в период созревания ябло." повышенная скорость функционирования фермента не носит случайный характер, а является закономерным процессом. Видимо, качественный переход ростовых процессов к созреванию требует дополнительное количество НАДФ, а также участие промежуточных продуктов ПФ-цикла-.

ВЫВОДЫ

7. Впервые подобраны оптимальные условия выделения ГбфДГ и определена ее активность в яблоках и тем самым доказано наличие пентозофосфатногг цикла в этих плодах.

2. Установлено, что Г6ЩЦГ яблок НАДФ специфична, не требует для своей каталитической активности присутствия двухвалентных катионов и не характеризуется четким оптимумом рН. Ферментный препарат не очень чувствителен к температуре и может храниться в течение нескольких часов при комнатной температуре,

3. Изучена внутриклеточная локапзация Г6ФДГ. Установлено, что в субэпидермальной' ткани плодов яблони'оснозная часть активности фермента сосредоточена в цитоплазматлческой фракции.'

4. Методом диск-электрофореза з ПААГ выявлены три молекуляр-

кые фермы Г6ФДГ. Наиболее активная и доминирующая молекулярная форма фермента с м 0,56 локализована в цитозоле, а.две другие, существенно менее активные о и - 0,11 и 0,29 - в субклеточных частицах, осаждаемых при 15000 и 30000 £ .

5 Показано, что созревание яблок сопровождается значительным усилением активноси ^бФД1. повышение активности происходит за пчвх датозольной формы фермента.

При созревании плодов в изоферментном составе Г6ФДГ- не наблюдается качественных изменений.

. 6. Показано, что синтетические регуляторы роста - этрел и гидрел стимулируют как общий ход созревания, так и функционирование Г6ФДГ .'яблок. Эти регуляторы ке влияют на изоферментнкй состаЕ Г6ФДГ и, в основном, увеличивают активность растворимой (цито-зольной). формы фермента.

' 7. Полученные данные позеоляют предположить о том. что Г6ФДГ, а возможно, ПФ-цикл в целом, имеет существенное значение в росте и созревании плодов яблони. .

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. С.Г.Гюльахмедов, З.М.Мамедов, А.А.Кулиев, 1993. Об изменении основных агробиологических показателей плодов яблони под действием синтетических этиленпродуцентов. Тезисы доклада на П Республиканской биохимической конференции. Баку. 107.

2. З.М.Мамедов, С.Г.Гюльахмедов, А.А.Кулиев, 1993. Влияние этрела и гидрела на основные НДЦФ-Н - генерирующие ферменты плодов яблони. Тезисы доклада Ш Всероссийского общества физиологов растений. Санкт-Петербург. 67.

3. З.М.Мамедов, С.Г.Гюльахмедов, А.А.Кулиев, Е.Г.Салькова, 1993. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеяаза плодов яблоки. Прикладная биохимия и микробиология. XXIX, I, 206-211.

4. З.М.Мамедов, А.А.Кулиев, С.Г.Гюльахмедов, Е.Г.Салькова, 1993. Внутриклеточная локализация и молекулярные формы глюкозо-6-фо'сфатдегидрогеназы плодов яблони. Прикладная биохимия и микробиология. ШХ, 3, 449-454.

5. С.". .Гюльахкедов, 1994. Влияние этрела и гидрела на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при созревании плодов яблони. Тезисы доклада аспирантов и молодых специалистов на научной конференции посвященной к 7Ь-летию Бакгосуниверситета. Баку. 88.

6. С. Г. Гш.ьахмедов, З.М.Мамедов", А.А.Кулиев, 1995. Опреде-

леняе активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в паренхимной ткани плодов яблони. Вестник Бакинского Государственного Университета. Баку. П. 1-7.

X Y Л А' 0 9

Диссертаснда иши' алиа мез'вэлэрииин детишмэ деврундэ ПФ -тсиклинин тэнзимлэзичи фериентинин-глукозо-б-фосфатдеЬидрокеназа-нын тэдгигинэ Ьэср едилчишдир. Бу фермент Ьедвани тохуиаларда, naja кебэлэклэриндэ во бактеризаларда нисбзтэч захшы езрэннлмиш, битки тохукаларында, хусусэн ширэли меДзэлзрдо зэиф тэдгиг едил-мииаир. Алмаларда иса, практики оларчг езрэнилмэмишдир.

Гэдгигат ишлэримизин нэгичэсиндэ илк дэфэ Гб&ДЬ -нын фэаллычы тэ"зкн едилмиз! вэ бунунла да tlí-тсиклинин алиа мезвэлэриндэ глуко-занын иетаболизминдэ иштиракы кеотэрилмипднр.

1ерменти ajapmar учун оптимал муЬит зарадылмыпд^р ки, бу мт-Ьитдэ онун фэаллычы отаг температурунда бир нечэ саат нуддэтиндэ стабил олмушдур. Гисмэн тэмизлэнмии фермент препарзтинда гзнпера-турун, инкубаси^а муЬитишш рН-tm, икивалентли метал ионларыньж Гб£Д[1-нын фэаллыгына тэ"сири езрэнилмиш вэ фэаллыгын субстрат вэ кс^ерментин гатылыгындан асылылыгы wyajjsii олунмушлур.

Гб$ДЬ-ньн Ьучедрэдахили локализаси^аоы вэ молекулзар {юрмала-ры езрэнилшгадир. Феркентик фэаллыгынын экоэр Ьиссэсинэ ситоплзз-нада тэсадуф едилмишдир. ПАА келиндэ димелектрофорез методу илэ ГбЗ?ДИ-нын 3 молекулзар формасы aj^pn едилмиодир кь, бунлардан эн фэал форма (rí0,56) ситоплазнада, галан икнси исэ, (nf 0,11 ; 0,29) Ьучезрэнин 15000 вэ 30000 g агырлыг гуввэсиндэ чокэн Ьиссэ-чиклэриндэ зерлэвмшилэр.

MrsjjsH олуннушдур ки, алквларьн зетишмзси деврундэ Г65ДЬ-нан фэаллыгы гЬэмиззэгли дэрэчэдэ артыр, Белэ динамика ферментин ситозол (кг 0,56) фракси^всы илэ формаласыр.

Алнбларин ^етитсмэ деврундэ ГбДЗЬ-нин фэаллыгына,.онун Ьучез-рэ дахили органоидльрдэ пазланмасина, фернентин молекулзар форма-ларына етрелин вз гипреяин тэ"оири вдрэнилмипдир. ¡SYsjjsH ояук-мушдур ки, синтетик етиленпродусентлэр алмаларан зетисшэ фазасын-ад Гб?ДЬ-нын синтозол формвсыкын фэаляигыны эЬэмиззэтли дэрэчэдз артирир. ГбЯЫшн изоферкент тэркибина ~ нэзэрэ чарпэчаг тэ"сир коотармир.

i 24 -

S 0 H II A 3 i

Studies of G6FDH are of Great intenst bjcause they allow the operation of the pentose phosphate cycle as a whole to be analyzed. The enzyme has been relatively well studies in animal tissues, and in yeasts ani bacteria. However, few studies have been carriei". out in plant tissues, especially sap- containing fruits ; there are virtually no reports on the enzyme in apple fruits. We describe here a method for the cxstraction of G6FDH from subepidermal apple fruits tissues, and a method for assaying its activity, ant* we describe so.ne of its properties in the studies of maturation and sinescensa of apple fruits.

GSFDH has been detected for the first time in the subepidermal tissues of apple fruits. Ensyme activity was stable for several hours in optimal conditions at room temperature. A partially purified preparation was specific for NAD3T, 'ana was inhibited by NADEH. Activity levels were similar in the presence of the divalent cations Mn2+, Mg^* and Ca2+. Enzyme activity in fruits of the Antonovka variety was 1,5-2 times greater than in the Henet Simirenko variety.

The greater part of the G6FDH activity in appln fruit subepidermal tissues was found in the cytoplasmic fraction. Pollac-rylamide disk gel elecfcroforesis revealed three molecular forms of the enzyme v/ith significantly different electroforetic mobilities. The moot active and dominant molecular form of G6:FDH war present in the cytcsol, end the tvio other, less active, forma were found in subcellular particles precipitating at 15000 and 30000 g.

Заказ 167. Тираж 100. Бесплатно. Тип. АПУ им. Н. Туе». Баку, ул. У. Гаджибекова, 34.

Бесплатно

ЛзэрОа^чан Ресиубликасы Елмлзр Академ^'асы Нэбатат Институту

Эл]азмасы Ьугугунда УОТ 581.19:577.188

КУЛЭЬМЭДОВ С А Ь И Б ГУРБАН оглу

ГЛУКОЗО—6—ФОСФАТДЕЬИДРОКЕНАЗАНЫН (КФ 1.1.1.49) АЛМАЛАРДА ТЭДГИГИ ВЭ БУ МЕЛВЭЛЭРИН ЛЕТИШМЭ ПРОСЕСИНДЭ ОНУН РОЛУ

03.00.04 — Биоложи ким}а 03.00.12 — Битки физиолоки]асы

Биолоки]а елмлэри нампзэди елми дэрэчэси алмаг учуи тэгдим едилмиш диссертас^анын

АВТОРЕ Ф ЕРАТЫ Г> а к 1,1 — 1995