Исследование ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток человека с помощью биохимических сенсоров

Шахмаева, Ирина Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток человека с помощью биохимических сенсоров
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток человека с помощью биохимических сенсоров"

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет"

На правах рукописи

4841)£0 1

Шахмаева Ирина Игоревна

ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩИХ БЕЛКОВ И МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о мдр 2011

Казань-2011

4840261

Работа выполнена на кафедре биохимии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет"

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ишмухаметова Диляра Гапимовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Чернов Владислав Моисеевич

доктор химических наук, профессор, Решетилов Анатолий Николаевич

Ведущая организация: ГОУДПО «Казанская государственная

медицинская Академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Казань.

Защита состоится "24" марта 2011 г. в 13.00 на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская, д.18, главное здание, аудитория 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета по адресу: г.Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Автореферат разослан февраля 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В основе многих методов медицинской диагностики лежит анализ ферментов и низкомолекулярных метаболитов, содержание которых в крови и других биологических жидкостях изменяется при различных нарушениях обмена веществ (Hairigan and Goodacre, 2003). Важным биохимическим маркером являются ферменты, катализирующие расщепление ДНК, в частности, ДНКаза I и ДНК-гидролизующие антитела (ДНК-абзимы). Изменение активности этих ферментов является ранним признаком ряда аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваний. Показано, что ДНКаза I является селективным маркером инфаркта миокарда (Yasuda et al., 2009), а гитр и свойства ДНК-абзимов служат показателем аутоиммунной патологии (Барановский и др., 2004). Однако до настоящего времени не разработаны доступные диагностические методы, позволяющие быстро и с высокой точностью определять активность ДНК-гидролизующих ферментов в биологических жидкостях.

Не менее значимым диагностическим объектом являются клетки крови и других тканей организма (Znidarcie et al., 2010). Актуальной задачей является разработка экспресс-методов оценки метаболической активности клеток для диагностики их функционального состояния, а также поиска лекарственных средств (Fernie et al., 2004; Quek et al., 2010). В частности, важное значение имеет определение в клетках макроэргических биомолекул, содержание которых отражает энергетический статус клеток и изменяется при патологических процессах, повреждении клеток и апоптозе (Crouch et al., 1993; Eltzschig et al., 2006).

Одним из наиболее актуальных направлений в анализе биохимических маркеров является использование биосенсоров, которые позволяют быстро и селективно исследовать биомолекулы, находящиеся в прямом контакте с преобразователем сигнала (Kerman et а!., 2003; lost et al., 2011). Исследование ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток с помощью биосенсоров особенно востребовано для раннего скрининга заболеваний, а также персональной диагностики состояния здоровья человека. Перспективным подходом в создании подобных биосенсоров является модификация преобразователя биоадгезивными наноматериалами и полимерами, которые обладают способностью связывать биологические компоненты и формировать поверхности, чувствительные к состоянию биомолекул и клеток.

Целью настоящего исследования явилась разработка диагностической системы на основе биоадгезивных материалов для анализа ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток человека.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить сорбционные взаимодействия углеродных нанотрубок с нуклеиновыми кислотами в различной конформации.

2. На основе сорбционных свойств углеродных нанотрубок разработать биосенсор для анализа ДНК-гидролизующих белков. С использованием биосенсора провести сравнительное исследование активности ДНК-гидролизующих белков в сыворотке крови в норме и при патологии.

3. Исследовать возможность оценки метаболической активности животных клеток с помощью биосенсоров, модифицированных биоадгезивными материалами.

Научная новизна

Выяснены особенности адсорбции различных форм плазмидной ДНК на многослойных углеродных нанотрубках. Разработан способ определения активности ДНК-гидролизующих белков в биологических жидкостях на основе электрохимического биосенсора; способ применен для избирательного анализа ДНКазы I и ДНК-гидролизующих антител в сыворотке крови в норме и при аутоиммунном тиреоидиге. Предложен способ оценки метаболической активности клеток человека, в том числе содержания в клетках адениновых нуклеотидов, с помощью биосенсора на основе углеродных нанотрубок. Показана возможность применения этого биосенсора для мониторинга метаболической активности клеток человека в составе полисахаридного матрикса.

Практическая значимость

Выявленные сорбционные свойства углеродных нанотрубок применимы для очистки суперскрученной плазмидной ДНК от примесей нуклеиновых кислот и белков для получения гснотерапевтичсских препаратов. Разработанный биосенсор, чувствительный к изменению молекулярной массы ДНК, можно использовать для скрининга заболеваний, сопровождающихся изменением активности ДНК-гидролизующих белков крови, в частности - аутоиммунного тиреоидита. Предложенный способ оценки метаболической активности клеток представляет интерес для диагностики заболеваний, сопровождающихся изменением содержания клеточных метаболитов, а также для оценки токсичности лекарственных средств.

Предложенные клеточные биосенсоры могут быть использованы для мониторинга жизнедеятельности клеток в составе полимерных матриксов.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на 14ом Международном симпозиуме по биомедицине (Mugla, Turkey, 2008), 2ой Международной конференции по бионанотехнологии «НаноБио-08» (Санкт-Петербург, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), I Всероссийском, с международным участием, биологическом конгрессе студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз-Россия-2008» (Казань, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), Всероссийской конференции «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), 1ой Международной летней школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Московская область, 2009), 13ом Европейском ежегодном симпозиуме для студентов-биологов «Симбиоз - 2009» (Казань, 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва - Пущино, 2009), Ной Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), I Всероссийской Интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2010), II Международной специализированной выставке «Нанотехнологии. Казань-2010» (Казань, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 125 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения с 36 рисунками и 1 таблицей, выводов и списка цитируемой литературы с 202 наименованиями.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан способ определения активности ДНК-гидролизующих белков в сыворотке крови, основанный на различии сорбции ДНК и ее фрагментов на углеродных нанотрубках.

2. Предложен способ оценки метаболической активности клеток в суспензии с использованием биосенсоров, адсорбирующих клеточные метаболиты.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Приготовление углеродных нанотрубок. В работе использовали многослойные углеродные нанотрубки (Sigma-Aldrich, Германия) с внутренним диаметром 1-3 нм, внешним диаметром 3-10 нм и длиной 0.1-10 мкм. Углеродные нанотрубки (УНТ) окисляли в смеси азотной и серной кислот при воздействии ультразвука (Абдуллин и др., 2007).

Исследование взаимодействия ДНК с углеродным« нанотрубкамн. Электрокинетический потенциал УНТ в растворе регистрировали методом динамического светорассеяния на анализаторе Zetasizer Nano ZS (Malvern). Плазмидную ДНК pEGFPN2 в различной конформации (суперскрученная, термически денатурированная или линейная формы) смешивали с УНТ в 15 мМ фосфатном буферном растворе (рН 7) и инкубировали смесь 30 мин. Степень связывания ДНК с УНТ оценивали с помощью электрофореза в 0.7 % агарозком геле до и после удаления УНТ из раствора центрифугированием^

Изготовление сенсоров и электрохимические измерения. Раствор УНТ наносили на рабочую поверхность стеклоуглеродного электрода (диаметр 1.5 мм) и далее высушивали. Морфологию поверхности модифицированных электродов (МЭ) исследовали с помощью атомно-силового микроскопа Solver Р47Н (ЗАО НТ-МДТ). Электрохимическая ячейка состояла из МЭ (рабочий электрод), хлоридсеребряного электрода сравнения и никелевой пластины (противоэлектрод). Электролитом служил 0.1 M хлорид натрия, содержащий 0.01 M ацетат натрия (рН 5). МЭ выдерживали в растворе исследуемого биологического компонента 5 мин и далее электрод промывали буферным раствором. Сигнал адсорбированных на МЭ компонентов регистрировали на потенциостате Autolab PGSTAT12 (EcoChemie) в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии (частота 10 Гц, амплитуда 10 мВ, шаг потенциала 5 мВ).

Расщепленне ДНК. Для механической фрагментации высокомолекулярную ДНК из эритроцитов цыплят обрабатывали ультразвуком на диспергаторе Sonopuls HD 2200 (Bandelin). Ферментативное расщепление ДНК под действием панкреатической ДНКазы I (Serva) проводили в 0.1 M натрий-ацетатном буферном растворе (рН 5) в присутствии 10 мМ Mg2+ и 2 мМ Са2+ (протокол Sigma SP-DNA02, 1997) и останавливали добавлением смеси КС1/ЭДТА. Сыворотки крови доноров, здоровых по общему анализу крови, и пациентов с диагнозом аутоиммунный тиреоидит предоставлены . диагностической лабораторией Межрегионального

клинико-диагностического центра (г. Казань). Для инактивации ДНКазы I сыворотки крови прогревали при 57°С в течение 45 мин. Для определения ДНК-гидролизующей активности разбавленные в 100 раз сыворотки крови смешивали с ДНК (0.5 мг/мл) в буфере: 100 мМ хлорид натрия, 20 мМ Трис, 50 мМ Mg2+ и 10 мМ Са2+ (рН 7.5). Смесь инкубировали при 37°С в течение 17 часов и далее регистрировали электрохимический сигнал расщепленной ДНК на МЭ. Статистический анализ сигналов сенсора проводили с помощью программы Microsoft Excel; достоверность различий между выборками оценивали по критерию Данна.

Подготовка н анализ клеток. Трансформированные клетки человека линии HeLa культивировали в среде DMEM, содержащей телячью эмбриональную сыворотку (10%), L-глутамин (2 мМ), стрептомицин (100 мкг/мл) и пенициллин (100 ед/мл). Клетки переводили в суспензию и отмывали от компонентов среды в фосфатно-солевом буфере. Клетки крови - мононуклеары (суммарная фракция) и эритроциты - выделяли из крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколл-пака (Boyum А., 1968).

Количество клеток определяли с помощью гемоцитометра. Жизнеспособность клеток оценивали по флуоресценции красителей: 10 мкг/мл акридинового оранжевого (окрашивает живые клетки в зеленый цвет) и 30 мкг/мл бромистого этидия (окрашивает мертвые клетки в красный цвет) на флуоресцентном микроскопе Axio Scope Al (Cari Zeiss). Клетки лизировали посредством обработки ультразвуком (30 с) или под действием осмотического шока в деионизованной воде.

Доксорубицин добавляли в среду при культивировании клеток HeLa. После инкубации с доксорубицином клетки переводили в суспензию, нормализовали по концентрации (0.5 млн/мл) и далее регистрировали сигнал .метаболитов в клеточных лизатах на МЭ.

Для иммобилизации клеток на стеклянных слайдах и электродах использовали поликатионы (полилизин, полиорнитин, полиэтиленимин) в концентрации 0.5 мг/мл или 1.5% агарозу низкого плавления (Sigma-Aldrich).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование активности ДНК-гидролизукнцих белков с помощью биосенсора

Поскольку ДНК-гидролизующие белки расщепляют высокомолекулярную ДНК на фрагменты, представляло интерес разработать биосенсор для выявления изменений в молекулярной массе ДНК. Для создания биосенсора использовали модифицированный электрод (МЭ) на основе многослойных углеродных нанотрубок (УНТ) (Абдуллин и др., 2007). МЭ обладает шероховатой наноструктурированной поверхностью (рис.1), способной адсорбировать различные биокомпоненты, в частности, ДНК. Адсорбированная ДНК генерирует сигнал (ток окисления) при характерном потенциале около +1.05 В (рис.2) вследствие окисления гуаниновых нуклеотидов в составе ДИК (Абдуллин и др., 2007). Величина сигнала ДНК на МЭ прямо пропорциональна ее концентрации в исследуемом растворе. Кроме того, этот сигнал зависит от особенностей адсорбции ДНК с различной структурой на электроде.

Рисунок 1 - Трехмерное изображение поверхности модифицированного углеродными нанотрубками электрода по данным атомно-силовой микроскопии.

Потенциал.В

Рисунок 2 - Вольтамперограмма окисления высокомолекулярной ДНК, адсорбированной на модифицированном электроде. Концентрация ДНК: 1 мг/мл.

Для выяснения механизма адсорбции ДНК на поверхности МЭ мы изучили сорбционные взаимодействия ДНК с УНТ в водном растворе. При рН 7 УНТ формируют стабильную коллоидную систему с электрокинетическим потенциалом -56 мВ, что связано с присутствием отрицательно заряженных карбоксильных групп в окисленных нанотрубках. В качестве модели мы использовали плазмидную ДНК в разных конформациях: суперскрученная, линейная (рестрикт), кольцевая и

денатурированная формы. Установлено, что УНТ связывают линейную форму плазмидной ДНК пропорционально количеству УНТ в пробе и не адсорбируют суперскрученную ДНК (рис.3). Также обнаружено, что УНТ адсорбируют денатурированную форму плазмидной ДНК и не связывают кольцевую ДНК (рис. 4).

Рисунок 3 - Электрофореграмма плазмидной ДНК рЕСРРШ (10 мкг/мл) после инкубации с УНТ в различной концентрации: М - ДНК-маркер;

1 - суперскрученная плазмидная ДНК;

2 -линейная форма плазмидной ДНК; 3, 4, 5 - суперскрученная ДНК + УНТ (200, 100, 50 мкг/ш);

6, 7, 8 - линейная ДНК + УНТ (200, 100, 50 мкг/мл).

Рисунок 4 - Электрофореграмма плазмидной ДНК рЕОРРШ (10 мкг/мл) после инкубации с УНТ в различной концентрации: 1 — смесь кольцевой (а), суперскрученной (6) и денатурированной (в) форм плазмидной ДНК (контроль):

2, 3 - ДНК + УНТ (100 и 50 мкг/мл); 4, 5 -ДНК + УНТ (¡00 и 50 мкг/мл) после центрифугированы; М - ДНК-маркер.

Результаты показывают, что УНТ адсорбируют денатурированную и линейную формы плазмидной ДНК, которые содержат пространственно доступные азотистые основания в концевых и одноцепочечных участках. В то же время УНТ не связывают формы ДНК, основания в которых труднодоступны для взаимодействия с УНТ (суперскрученная и кольцевая плазмидная ДНК). Адсорбция азотистых оснований ДНК на УНТ, вероятно, происходит в результате гидрофобных взаимодействий ароматических гетероциклов с графитовыми стенками нанотрубок. Это согласуется с полученными нами ранее данными об интенсивной адсорбции пуринов на электроде, модифицированном УНТ (Абдуллин и др., 2008).

Подобный механизм взаимодействия ДНК с УНТ можно использовать в биосенсорах для детектирования расщепления ДНК по изменению ее адсорбционного

поведения и, следовательно, тока окисления на МЭ. Сигнал ДНК на МЭ действительно увеличивался после расщеплении ДНК ультразвуком пропорционально уменьшению размера образующихся фрагментов ДНК. Эта зависимость объясняется появлением в концевых участках фрагментов ДНК азотистых оснований, адсорбирующихся на УНТ, что приводит к увеличению сигнала ДНК на МЭ.

Для изучения ферментативного расщепления ДНК с помощью МЭ мы использовали панкреатическую ДНКазу I - нейтральную нуклеазу, катализирующую гидролиз ДНК в присутствии ионов двухвалентных металлов. Установлено, что с увеличением общей активности ДНКазы I в пробе сигнал ДНК на МЭ линейно увеличивается (рис.5) пропорционально степени расщепления ДНК и образованию низкомолекулярных фрагментов (рис.6). Сходное изменение сигнала ДНК наблюдали при варьировании времени ДНКазной реакции.

16 14 12

I 10

с „ я 8

<5 е-

4 -

2 -

Р1=0.98

О 2 4 6 8 10 12 14 16 Общая активность ДНКазы, ед/мл

Рисунок 5 - Изменение сигнала ДНК на модифицированном электроде после гидролиза ДНКазой 1.

23130 9416 6557

МК1 234567

Рисунок 6 - Электрофореграмма проб ДНК,

обработанных ДНКазой I:

М -ДНК-маркер;

К - нашивная ДНК (контроль);

1-8 — общая активность фермента в пробе

1,3.5,7.9,11,13 ед/мл соответственно.

Время реакции 20 мин.

Исследована возможность детектирования активности ДНК-гидролизующих белков в сыворотке крови, являющейся основным источником этих ферментов для анализа. Выяснено, что адсорбированная на МЭ сыворотка крови человека генерирует сигнал при потенциале около +0.8 В (рис.7), который, вероятно, обусловлен белками сыворотки, в частности, альбумином и иммуноглобулинами, окисляющимися при сходном потенциале (рис.8). Тот факт, что потенциалы окисления сыворотки крови и ДНК не совпадают, допускает возможность электрохимического детектирования ДНК в присутствии сыворотки.

0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 Потенциал, В

Рисунок 7 - Сигнал сыворотки крови человека на модифицированном электроде. Разбавление сыворотки - 100 раз.

-0,2-Ч—.—,—.—,—.—,—.—,—,—,—,—, 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2

Потенциал, В

Рисунок 8 - Сигнал сывороточных белков и ДНК на модифицированном электроде. 1 - ¡ёй (0.4 мг/мл); 2 - альбумин (5 мг/мл); 3 - ДНК (1 мг/мл).

Установлено, что совместная адсорбция сывороточных белков с высокомолекулярной ДНК на МЭ приводит к уменьшению сигнала ДНК более чем в 2 раза. Сходный эффект наблюдался в присутствии сыворотки крови, которая уменьшает сигнал ДНК в 8.5 раз (рис.9). Это объясняется блокированием поверхности электрода белками и другими компонентами сыворотки, которые существенно затрудняют диффузию и адсорбцию ДНК па МЭ.

0,6-

0,6

1 0,4-

3 0,4

0,2-

0,2

0,0

0,0-

ДНК ДНК ДНК ДНК+

+ БСА +1д в сыворотка

Потенциал, В

Рисунок 9 - Влияние соадеорбции белков и сыворотки крови на сигнал ДНК на модифицированном электроде. Концентрация ДНК - 1 мг/мл, альбумина -5 мг/мл, иммуноглобулина - 0.4 мг/мл. Разбавление сыворотки - 100 раз.

Рисунок 10 - Сигнаи окисления ДНК в присутствии сыворотки крови на

модифицированном электроде. (-) До

инкубации; (- - -) после инкубации с сывороткой. Концентрация ДНК - 0.5 мг/мл. Разбавление сыворотки 100 раз.

Обнаружено, что инкубация ДНК с сывороткой крови здорового донора сопровождается расщеплением ДНК ферментами сыворотки, что приводит к существенному увеличению сигнала ДНК на МЭ (рис. 10).

Увеличение отклика биосенсора, очевидно, обусловлено тем, что фрагменты ДНК. по сравнению с высокомолекулярной ДНК, лучше диффундируют через слой адсорбированных белков и аккумулируются на поверхности МЭ (рис. 11). При этом сигнал ДНК пропорционален степени ее фрагментации и, следовательно, активности ДНК-гидролизующих белков сыворотки крови.

Рисунок II - Схема адсорбции высокомолекулярной ДНК (I) и фрагментированной ДНК (2) в присутствии белков сыворотки крови (3) на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками (4).

Результаты свидетельствуют, что разработанный биосенсор может быть использован для определения ДНК-гпдролизующих белков в сыворотке крови по увеличению сигнала ДНК на МЭ. Биосенсор протестирован для анализа ДНК-гидролизующих белков в норме и при аутоиммунном тиреоидите (АИТ) -распространенном заболевании щитовидной железы, сопровождающимся повышением активности ДНК-гидролизующих антител (У^звоу е1 а1., 1998). Разбавленные сыворотки крови инкубировали с высокомолекулярной ДНК (см. Материалы и методы) и далее регистрировали увеличение сигнала расщепленной ДНК на МЭ.

На рисунке 12 приведены значения отклика биосенсора для сывороток 21 здорового донора и 17 пациентов с диагнозом АИТ до и после прогревания сывороток для избирательной инактивации ДНКазы I.

Для сывороток крови здоровых доноров среднее значение сигнала биосепсора по медиане составляло 0.27 мкА. Этот сигнал отражает уровень суммарной ДНК-гидролизующей активности сыворотки, основной вклад в которую вносит ДНКаза I (Черепанова и др., 2006).

Рисунок 12 — Распределение сигнала биосенсора для ДНК, инкубированной с сыворотками крови здоровых доноров и пациентов с АНТ.

(°) - непрогретые сыворотки здоровых доноров;

(а) — прогретые сыворотки здоровых доноров;

(*) — непрогретые сыворотки пациентов с ЛИТ;

(а) - прогретые сыворотки пациентов с ЛИТ.

* Средние значения сигнала окисления ДНК по медиане.

Инактивация ДНКазы I приводила к почти четырехкратному уменьшению отклика биосенсора до 0.07 мкА. Наблюдаемая остаточная ДНК-гидролизующая активность, вероятно, обусловлена присутствием других расщепляющих ДНК ферментов, не инактивируемых прогреванием (Барановский и др., 2004).

Для сывороток крови пациентов с АИТ наблюдалось увеличение сигнала биосенсора в 2.8 раз (до 0.75 мкА) по сравнению с нормой, что свидетельствует о повышении суммарной ДНК-гидролизующей активности сыворотки крови при АИТ. Прогревание этих сывороток не приводило к достоверному уменьшению сигнала ДНК. Это показывает, что основной вклад в ДНК-гидролизующую активность сывороток крови пациентов с АИТ вносят ДНК-абзимы, что согласуется с данными о повышении их активности при АИТ (\nassov е! а1., 1998). Следует отметить, что сигнал биосенсора для прогретых сывороток крови пациентов с АИТ был почти в 9 раз выше по сравнению с нормой (рис.12).

Таким образом, существенное различие в сигнале ДНК после ее гидролиза ферментами сыворотки крови в норме и при АИТ свидетельствует о возможности применения разработанного способа для диагностики АИТ и, предположительно, других заболеваний, сопровождающихся изменением активности ДНКазы I (Уазис1а е1 а!., 2009) и ДНК-абзимов (УкэБОУ е1 а1., 1998).

1.2-

1,0-

% 0,8-

Ц 0,6-

го

|_ X 0,4-

0,2-

0,0-

-0,2-

0.75 мкА" • . .

5? * • •

0.27 мкА*

_ о

СО

о ^ 0.07 мкА*

сРо

<£Ь

сР

0.6 мкА*

30 45 60 № пробы

75 90

Исследование метаболической активности клеток человека

Следующим этапом явилось изучение с

помощью МЭ метаболической активности

клеток человека, выращенных в культуре или

выделенных из крови. Обнаружено, что

клетки линии HeLa (А), мононуклеары (Б) и

эритроциты крови (В), суспендированные в

буферном растворе, генерируют на

поверхности МЭ пики при потенциалах +0.8,

+1.1 и +1.2 В, далее обозначенные как пик 1,

2 и 3 соответственно (рис.13).

Удаление клеток из раствора

центрифугированием не приводило к

изменению вольтамперограмм (рис.13). Это

свидетельствует о том, что регистрируемые

на МЭ пики обусловлены выделяющимися из

клеток метаболитами. Достаточно

симметричная форма пиков и их

воспроизводимость после отмывки электрода

указывает на то, что детектируемые вещества

хорошо адсорбируются на МЭ. Подобная

адсорбция характерна для веществ, имеющих

Рисунок 13 - Сигнал окисления ароматическую природу (Абдуллин и др., клеток HeLa (А), мононуклеаров (Б) и эритроцитов крови (В) на 2008).

поверхности модифицированного Для выяснения природы детектируемых

электрода.

на МЭ соединений, измерили потенциалы окисления чистых препаратов биомолекул - метаболитов клеток. Установлено, что НАДН, глутатион, цистеин, тирозин и белки окисляются на МЭ при потенциале около +0.8 В; ГТФ - при потенциале +1.06 В; АТФ - при потенциале +1.2 В (таблица 1).

Сопоставив потенциалы пиков этих биомолекул и пиков, генерируемых клетками в суспензии (рис.13), мы предположили, что пик 1, имеющий наименьший потенциал окисления, соответствует серосодержащим и ароматическим аминокислотам и их производным, в частности, глутатиону - распространенному антиоксиданту клеток.

аб 0:7 ав 0.9 1.0 1.1 1.2 ГЬпен*едВ

Таблица 1. Потенциалы пиков окисления некоторых биомолекул на модифицированном электроде.

Метаболит

НАДН2 +0.8

ГТФ +1.06

АТФ + 1.2

Глутатион +0.81

Цистеин +0.82

Тирозин +0.79

Альбумин, IgG, миоглобин +0.8

Серотонин +0.63

Пики 2 и 3, вероятно, обусловлены окислением гуаниновых и адениновых нуклеотидов и отражают присутствие в клетке соответственно ГТФ и АТФ. Все эти биомолекулы способны транспортироваться из животных клеток в норме и при стрессе (Richie et al., 1996; Eltzschig et al., 2006), что подтверждает возможность их детектирования в клеточной суспензии.

На примере клеток HeLa установлено, что более 85% клеток сохраняют жизнеспособность в буферном растворе в течение 6 часов инкубации; при этом пики метаболитов на вольтамперограммах постепенно увеличиваются. После 6 часов инкубации число жизнеспособных клеток в суспензии резко уменьшалось (до 20%), что совпадало по времени с выходом сигнала клеток на плато. Результаты указывают на то, что наблюдаемые на МЭ пики (рис.13) обусловлены метаболитами, постепенно выделяющимися из живых клеток и накапливающимися в растворе.

Для экспрессного определения клеточных метаболитов применили лизис клеток с помощью ультразвука или осмотического шока в деионизованной воде. Установлено, что лизис клеток приводит к существенному увеличению электрохимического сигнала, генерируемого клеточными компонентами, очевидно, вследствие разрушения мембран клеток и высвобождения метаболитов в раствор (рис.14).

Величина регистрируемых после лизиса пиков отражает суммарное содержание клеточных метаболитов и может служить показателем метаболической активности различных клеток в норме и при патологии. При сопоставимом уровне высвобождения клеточных метаболитов осмотический лизис, по сравнению с

ультразвуковой обработкой, является более щадящим и удобным способом разрушения клеток для последующего анализа на МЭ.

0,5-

Рисунок 14 - Сигнал мононуклеаров крови на модифицированном электроде после разрушения ультразвуком (УЗ) или осмотическим шоком (Осм).

Сигнал

0,45 0,3-

0,1-

К - интактные клетки. Белые колонки — пик 1. черные колонки - пик 2, серые колонки -пик 3.

0,0 '—'

К УЗ Осм К УЗ Осм К УЗ Осм

Одним из наиболее диагностически значимых метаболитов клеток является АТФ, однако существующие методы его определения (Crouch, 1993) являются трудоемкими и дорогостоящими, что ограничивает их использование в медицинской диагностике. Изучена возможность применения МЭ для количественного определения АТФ в клетках человека с помощью метода добавок. Сигнал окисления чистого препарата АТФ на МЭ линейно увеличивался в диапазоне концентраций АТФ 0.1-10 мМ согласно уравнению: 1(мкА) =О.ОЗ±О.15+О.6±О.ОЗхС(л«А0, R=0.99.

Установлено, что добавление АТФ к лизату клеток HeLa (здесь и далее — после осмотического лизиса) приводит к увеличению пика 3 при потенциале +1.2 В. При этом величина регистрируемого пика 3 была равна сумме пиков, генерируемых отдельно АТФ и клеточным лизатом (рис. 15).

АТФ

АТФ+клетки

0.2

Рисунок 15 - Величина пика 3, генерируемого лизатом клеток HeLa, АТФ (0.5 мМ) и смесью клеточного лизата и АТФ на модифицированном электроде.

Результаты свидетельствуют о возможности детектирования АТФ в клетках с помощью МЭ, что представляет интерес для оценки энергетического статуса клеток и их жизнеспособности, в том числе при действии цитотоксических агентов.

Мы применили МЭ для изучения эффекта антрациклинового антибиотика доксорубицина на клетки HeLa в культуре. Предварительно с помощью MTS-теста были подобраны две концентрации вещества: нетоксичная (2 мкМ) и вызывающая ингибирование роста клеток на 50% (9 мкМ).

Установлено, что в обеих концентрациях доксорубицин вызывает уменьшение пика 3 клеток (рис.16), по нашим данным соответствующего адениновым нуклеотидам. Уменьшение величины этого пика указывает на понижение содержания макроэргических биомолекул и ингибирование метаболических процессов в клетках, вероятно, вследствие индукции апоптоза клеток под действием доксорубицина (Guzman et al., 2002). Пик 1 клеток, напротив, увеличивался под действием доксорубицина в низкой концентрации, что, вероятно, обусловлено синтезом биомолекул, выполняющих антиоксидантную функцию. По данным литературы выработка глутатиона является одной из форм защиты опухолевых клеток при действии цитотоксических агентов (Godwin et al.. 1992).

Рисунок 16 Влияние доксорубицина

на сигнал клеток НеЬи (0.5 млн/мл)

на модифицированном электроде.

К - клетки, культивируемые без

доксорубицина.

Белые колонки - пик /,

серые колонки - пик 3.

9 мкМ К 2 мкМ 9 мкМ

Результаты свидетельствуют о применимости МЭ для детектирования изменений в активности метаболических процессов в клетках. Подобный анализ метаболической активности клеток востребован как в диагностике различных заболеваний человека, так и для токсикологического исследования лекарственных средств in vitro (Harrigan and Goodacre, 2003).

Разработка биосенсоров на основе иммобилизованных клеток

Одним из подходов к созданию клеточных биосепсоров является осуществление прямого контакта клеток с электродом, что позволяет исследовать метаболическую активность клеток па поверхности и/или в составе различных материалов. Так как подобный контакт требует иммобилизации клеток на электроде, мы изучили адгезию клеток человека на поверхностях, модифицированных биоадгезивными поликатионами (полилизин, полиорнитин, полиэтиленимин).

Предварительно мы оценили адгезию клеток НеЬа из суспензии на поверхности золотых и стеклянных слайдов как моделей электродов с помощью флуоресцентной микроскопии. Обнаружено, что на немодифицированных слайдах клетки плохо закрепляются и при этом быстро гибнут, о чем свидетельствует красная окраска клеток (рис. 17 А и В).

Модификация слайдов всеми поликатионами приводила к существенному улучшению адгезии клеток (рис. 17Б и Г), что, вероятно, обусловлено способностью поликатионов электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженными мембранами клеток (Вгупс1а е1 а1., 2005).

А Б В Г

Рисунок 17 - Флуоресцентные микрофотографии клеток НеЬа, адгезированных на различных поверхностях. А - Золото, Б - золото, модифицированное полиорнитином (0.5 мг/мл), В стекло, Г стекло, модифицированное полиорнитином (0.5 мг/мл). Окрашивание: смесь акридинового оранжевого и бромистого этидкя. Шкала - /00,чаи.

Установлено, что на поверхности слайдов, модифицированных полиорнитином, большинство прикрепленных клеток сохраняют жизнеспособность (рис. 17Б и Г). Сходные результаты получены при исследовании адгезии клеток на : слайдах, модифицированных полилизином. Полиэтиленимин вызывал гибель клеток на модифицированных слайдах, очевидно, вследствие его высокой цитотоксичности (Вгипо! е! а1., 2007). Результаты показывают, что полиорнитин и полилизин, в отличие от полиэтилепимипа, формируют биосовместимое микроокружение для иммобилизованных клеток.

Установлено, что на поверхности золотого и стеклоуглеродного электродов, модифицированных поликатионами, иммобилизованные клетки человека в условиях эксперимента не генерируют электрохимический сигнал. Поэтому мы применили подход, основанный на последовательной модификации электрода углеродными нанотрубками и поликатионами, где УНТ предназначены для усиления сигнала клеток, а поликатион - для их иммобилизации на электроде.

Для предварительной оценки эффективности адгезии и выживаемости клеток на модифицированном электроде использовали стеклянный слайд, покрытый УНТ и поликатионами. По данным флуоресцентной микроскопии поверхность, послойно модифицированная УНТ и полиорнитином, содержала наибольшее количество адгезированных жизнеспособных клеток НеЬа, чем при использовании других поликатионов (рис. 18).

140

120-1

х о

| 100-

§ 80

® 60

4020 0

Рисунок 18 — Количество клеток ЯеСа, адгезированных на стеклянном слайде, последовательно модифицированном углеродными нанотрубками и поликатионами.

ПО - полиорнитин, ПЛ - полилизин, ПЭ - полиэтилен им ин. Белые колонки — общее количество кчеток, серые колонки - количество жизнеспособных клеток.

УНТ

УНТ+ПО УНТ+ПЛ УНТ+ПЭ

Поэтому мы применили электрод, модифицированный УНТ и полиорнитином, для создания клеточного биосенсора. Выяснено, что иммобилизованные на таком электроде клетки генерируют единственный слабо выраженный пик, наблюдаемый при потенциале пика 1 клеток (+0.8 В). Отсутствие других пиков метаболитов клеток и низкий уровень регистрируемого сигнала объясняется блокированием поверхности УНТ поликатионом.

Результаты показывают, что биоадгезивные поликатионы позволяют иммобилизовать на поверхности преобразователей клетки человека с сохранением их жизнеспособности и метаболической активности. Однако дополнительная модификация электрода на основе УНТ поликатионами существенно уменьшает чувствительность биосенсора к клеточным метаболитам.

Перспективным подходом в дизайне клеточных биосенсоров является включение и анализ клеток в составе трехмерных матриксов, которые воссоздают

естественное микроокружение клеток. В качестве модельного матрикса использовали агарозу с температурой плавления 37°С. Схема иммобилизации клеток в составе агарозного геля приведена на рисунке 19.

37°С I

¡1881110

lllIliMI

25 °С

г*-/* :

Рисунок ¡9 - Схема создания биосенсора на основе клеток человека, включенных в агарозный матрикс.

I — Смешивание суспензии клеток с расплавленной агарозой; II - нанесение аликвоты смеси на поверхность электрода, модифицированного УНТ; III -формирование агарозного геля с включенными клетками при комнатной температуре.

По данным флуоресцентной микроскопии более 90% иммобилизованных в геле агарозы клеток НеЬа сохраняли жизнеспособность в течение не менее 3 часов инкубации. При этом клетки проявляли метаболическую активность, регистрируемую с помощью МЭ по появлению хорошо выраженных пиков метаболитов - пика 1 и 2 (рис. 20). Сигналы метаболитов клеток в геле постепенно увеличивались с выходом на предельные значения к 4-му часу инкубации (рис. 21), что совпадало по времени с резким снижением количества живых клеток в геле.

Это показывает, что живые клетки, иммобилизованные в агарозе, выделяют метаболиты, которые диффундируют к поверхности МЭ; при этом агарозный матрикс, в отличие от поликатионов, не оказывает блокирующего эффекта при детектировании метаболитов клеток на МЭ.

0.1

0.0

s О

-0.1-

1.5 1.2

0.9 0.6 0.3 0.0

0.6 0.7

0.8 0.9 1.0 Потенциал, В

1.1 1.2

Рисунок 20 - Регистрация метаболической активности клеток НеЬа в составе агарозного матрикса (—) и в суспензии (- - -) с помощью модифицированного электрода.

0 1 2 3 4 5 6 Время, часы

Рисунок 21 — Зависимость сигнала метаболитов клеток НеЬа в составе агарозного матрикса от времени инкубации, (и) - пик 1, (*) - пик 2. Кон11ентраг1ия клеток в геле - 1 млн/мл.

Полученные результаты демонстрируют возможность мониторинга метаболической активности клеток человека, иммобилизованных в полимерном матриксе, с помощью электрохимических биосенсоров. Предложенный подход может быть использован для оценки биосовместимости полимерных материалов, а также для исследования действия лекарственных средств на клетки в трехмерном микроокружении.

выводы

1. Многослойные углеродные нанотрубки в водном растворе не адсорбируют суперскрученную и кольцевую формы плазмидной ДНК, но адсорбируют линейные формы ДНК, вероятно, в результате взаимодействия с азотистыми основаниями в концевых участках ДНК.

2. Сигнал окисления ДНК на модифицированном углеродными нанотрубками электроде увеличивается пропорционально степени ферментативного расщепления ДНК. На основе этой зависимости разработан биосенсор, позволяющий детектировать изменение активности ДНКазы I и ДНК-абзимов в сыворотке крови при аутоиммунном тиреоидите по сравнению с нормой.

3. Биосенсоры на основе углеродных нанотрубок, адсорбирующие клеточные метаболиты, позволяют оценивать метаболическую активность животных клеток в суспензии и в составе полимерных матриксов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Никитина, И.И. Электрохимические ДНК-сенсоры на основе углеродных нанотрубок (Обзор) / И.И. Никитина, О.В. Бондарь, P.P. Хазиахметова, Ф.К. Алимова, Т.И. Абдуллин // Ученые записки КГУ, серия "Физико-математические науки". - 2007. - Т. 149. - Кн.З. - С.21-37.

2. Абдуллин, Т.И Выявление депуринизации ДНК с помощью модифицированного углеродными нанотрубками электрода / Т.И. Абдуллин, И.И. Никитина, О.В. Бондарь // Журн. аналит. химии. -2008. - Т.63. - №7. - С.756-759.

3. Абдуллин, Т.И. Биосенсоры на основе углеродных нанотрубок для характеристики структуры ДНК / Т.И. Абдуллин, О.В. Бондарь, А.А. Ризванов, И.И. Никитина // Прикл. биохимия и микробиология. - 2009. - Т.45. - №2. - С. 252-256.

4. Abdullin, T.I. Effect of size and protein environment on electrochemical properties of gold nanoparticles on carbon electrodes / Т. I. Abdullin, О. V. Bondar, 1.1. Nikitina, E. R. Bulatov, M. V. Morozov, A. Kh. Hilmutdinov, M. Kh. Salakhov, M. Qulha // Bioelectrochera. - 2009. - V. 77(1). - P. 37-42.

Патенты:

5. Никитина, И.И. «Способ оценки депуринизации нуклеиновых кислот и устройство для его осуществления» / И.И. Никитина, О.В. Бондарь, Т.И. Абдуллин // Патент РФ на изобретение № 2390009, опубликован 20.05.2010, Бюл. № 14.

6. Никитина, И.И. «Способ определения ДНК-гидролизующей активности молекул и устройство для его осуществления» / И.И. Никтина, О.В. Бондарь, Т.И. Абдуллин // Положительное решение по заявке № 2008137068 (приоритет от 15.09.2008) на получение патента РФ на изобретение.

Тезисы докладов н материалов конференции:

7. Abdullin, T.I. Evaluation of DNA Structure Integrity Using Carbon Nanotube Based Biosensors / T.I. Abdullin, I.I. Nikitina, O.V. Bondar, F.K. Alimova, M. Qulha, A.A. Rizvanov // 14th International Biomedical Science and Technology Symposium. Mugla, Turkey, May 3-7, 2008. - P.95-96.

8. Никитина, И.И. Чувствительные электрохимические биосенсоры для оценки структурного состояния ДНК / И.И. Никитина, О.В. Бондарь, P.P. Хазиахметова, Т.И. Абдуллин // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, 11-15 мая, 2008. С.296.

9. Nikitina, I.I. Simultaneous detection of distinct DNA lesions on carbon nanotube modified electrode / I.I. Nikitina, O.V. Bondar, E.R. Bulatov, T.I. Abdullin // The Second St. Petersburg International Conference on Nanobiotechnologies «NanoBio-08», St. Petersburg, Russia, June 16-18, 2008. P.135-136.

Ю.Никитина, И.И. Прямое определение белков и нуклеиновых кислот на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками / И.И. Никитина, О.В. Бондарь, Э.Р. Булатов, Н.О. Туаева, Т.И. Абдуллин // Сборник статей "Биология: традиции и инновации в XXI веке" по итогам I Всероссийского, с международным участием, биологического конгресса студентов и аспирантов - биологов "Симбиоз-Россия-2008", Казань, 6-10 июля, 2008. С.83-85.

11. Бондарь, О.В. Сорбенты нуклеиновых кислот на основе углеродных нанотрубок / О.В. Бондарь, Э.Р. Булатов, М.Ш. Исмагилов, И.И. Никитина, И.С. Газизов, А.А. Ризванов, Т.И. Абдуллин // Материалы V съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2-4 декабря, 2008. С.23.

12. Никитина, И.И. Биосенсор для экспрессного определения активности' ДНК-повреждающих факторов / И.И. Никитина, Д.В. Сайфуллина, Т.И. Абдуллин // Материалы конференции «Ломоносов-2009», Москва, 13-18 апреля, 2009. С. 24-25.

13.Nikitina, I.I. Carbon nanotube-based method for detection of DNA cleavage proteins / I.I. Nikitina, D.V. Saifullina, T.I. Abdullin // 1st International summer school "Nanomaterials and nanotechnologies in living systems", June 29 - July 4, 2009. P. 302303.

14. Abdullin T. Simple electrochemical detection of chemical and biochemical DNA cleavage agents / T. Abdullin, I. Nikitina, O. Bondar, M. Culha // IUBMB Life, 2009, 61(3), 382.

15.Nikitina, I.I. Study of electrochemical response of mammalian cells with carbon nanotube-modified sensors / I.I. Nikitina, O.V. Bondar, D.V. Saifullina, T.I. Abdullin // Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2009" "Biology: Expansion of Borders", Kazan, 30 July - 8 August, 2009. P. 88.

16. Никитина, И.И. Унифицированная технология создания сорбентов и сенсоров на основе углеродных нанотрубок для фракционирования и анализа нуклеиновых кислот / И.И. Никитина, Э.Р. Булатов, О.В. Бондарь, Т.И. Абдуллин // Сборник тезисов Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, Москва - Пущино, 28 сентября - 1 октября, 2009. Т. 2. С. 168-169.

17. Шахмаева, И.И. Анализ метаболитов клеток человека с помощью сенсоров на основе углеродных нанотрубок / И.И. Шахмаева, Д.В. Сайфуллина, Т.И. Абдуллин // Материалы 14 Международной Пущинской школы-конфеернции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 19-23 апреля, 2010, С. 95-96.

18. Сайфуллина, Д.В. Разработка электрохимического метода диагностики инфаркта миокарда / Д.В. Сайфуллина, И.И. Шахмаева // Сборник трудов I Всероссийской Интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии», Казань, 17-22 ноября, 2010, С. 138.

Благодарности

Выражаю глубокую благодарность д.б.н., профессору Диляре Галимовне Ишмухаметовой и к.б.н., доценту Тимуру Илдаровичу Абдуллину за всестороннюю помощь в подготовке диссертационной работы.

Отзывы на автореферат прошу отправлять по адресу 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, д.18, Казанский университет, Отдел аттестации научных, кадров, Ученому секретарю диссертационного совета Д 212.081.08 З.И. Абрамовой, факс: (843)238-76-01. E-mail: shakhmaevairi@gmail.com.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте КФУ http://w\vw.ksu.ru/uni/sank/index.php?id=7

V. 'во 4

Подписано в печать 16.02.11. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Формат 60x84 1/16. Гарншура «Times New Roman». Усл. печ. л. Уч.-изд. л. 1,6. Тираж 100 экз. Заказ 58/2

Отпечатано с готового оригинала - макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. (843) 233-73-59,292-65-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шахмаева, Ирина Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ДНК-гидролизующие белки как диагностические биомаркеры

1.1.1 Характеристика ДНК-гидролизующих белков

1.1.2 Биологическая роль и диагностическая значимость ДНК-гидролизующих белков

1.1.3 Методы анализа ДНК-гидролизующих белков

1.2 Метаболическая активность клеток человека

1.2.1 Характеристика некоторых метаболитов клеток

1.2.2 Методы анализа метаболической активности клеток

1.3 Биосенсоры как инструмент для анализа биомолекул и клеток

1.3.1 Биосенсоры для исследования клеток

1.3.2 Способы иммобилизации клеток на поверхности и в составе материалов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток человека с помощью биохимических сенсоров"

В основе многих методов медицинской диагностики лежит анализ ферментов и низкомолекулярных метаболитов, содержание которых в крови и других биологических жидкостях изменяется при различных нарушениях обмена веществ (Harrigan and Goodacre, 2003). Важным биохимическим маркером являются ферменты, катализирующие расщепление ДНК, в частности, ДНКаза I и ДНК-гидролизующие антитела (ДНК-абзимы). Изменение активности этих ферментов является ранним признаком ряда аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваний. Показано, что ДНКаза I является селективным маркером инфаркта миокарда (Yasuda et al., 2009), а титр и свойства ДНК-абзимов служат показателем аутоиммунной патологии (Барановский и др., 2004). Однако до настоящего времени не разработаны доступные диагностические методы, позволяющие быстро и с высокой точностью определять активность ДНК-гидр о л изующих ферментов в биологических жидкостях.

Не менее значимым диагностическим объектом являются клетки крови и других тканей организма (Znidarcic et al., 2010). Актуальной задачей является разработка экспресс-методов оценки метаболической активности клеток для диагностики их функционального состояния, а также поиска лекарственных средств (Fernie et al., 2004; Quek et al., 2010). В частности, важное значение имеет определение в клетках макроэргических биомолекул, содержание которых отражает энергетический статус клеток и изменяется при патологических процессах, повреждении клеток и апоптозе (Crouch et al., 1993; Eltzschig et al., 2006).

Одним из наиболее актуальных направлений в анализе биохимических маркеров является использование биосенсоров, которые позволяют быстро и селективно исследовать биомолекулы, находящиеся в прямом контакте с преобразователем сигнала (Kerman et al., 2003; lost et al., 2011). Исследование ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток с помощью биосенсоров особенно востребовано для раннего скрининга заболеваний, а- также' персональной диагностики состояния здоровья человека. . Перспективными подходом^ в создании подобных, биосенсоров: является; модификация. преобразователя биоадгезивными наноматериалами и полимерами, которые, обладают способностью,- связывать, биологические компоненты и формировать поверхности; чувствительные к состоянию? биомолекул и клеток.

Целью настоящего исследования явилась разработка диагностической системы на основе биоадгезивных материалов для: анализа ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток человека.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить сорбционные взаимодействия углеродных нанотрубок с нуклеиновыми кислотами в различной конформации;

2. На основе сорбционных свойств углеродных нанотрубок разработать биосенсор для анализа ДНК-гидролизующих белков. (3 использованием биосенсора провести' сравнительное исследование активности • ДНК-гидролизующих белков в сыворотке крови в норме и при патологии.

Научная новизна

Выяснены особенности адсорбции различных форм плазмидной ДНК на многослойных углеродных нанотрубках. Разработан способ определения активности ДНК-гидролизующих белков в биологических жидкостях на основе электрохимического биосенсора; способ применен для избирательного анализа ДНКазы I и ДНК-гидролизующих антител в сыворотке крови в норме и- при аутоиммунном тиреоидите. Предложен способ оценки метаболической активности клеток человека, в том? числе содержания-в клетках адениновых нуклеотидов, с помощью биосенсора на основе углеродных нанотрубок. Показана возможность применения^ этого биосенсора для мониторинга метаболической* активности клеток человека в» составе полисахаридногоматрикса.

Практическая значимость

Выявленные сорбционные свойства углеродных нанотрубок применимы для очистки суперскрученной плазмидной ДНК от примесей нуклеиновых кислот и белков для получения генотерапевтических препаратов. Разработанный биосенсор, чувствительный к изменению молекулярной массы ДНК, можно использовать для скрининга заболеваний, сопровождающихся изменением активности ДНК-гидролизующих белков крови, в частности - аутоиммунного тиреоидита. Предложенный способ оценки метаболической активности клеток представляет интерес для диагностики заболеваний, сопровождающихся изменением содержания клеточных метаболитов, а также для оценки токсичности лекарственных средств. Предложенные клеточные биосенсоры могут быть использованы для мониторинга жизнедеятельности клеток в составе полимерных матриксов.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на 14ом Международном симпозиуме по биомедицине (Mugla, Turkey, 2008), 2ой> Международной конференции по бионанотехнологии «НаноБио-08» (Санкт-Петербург, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), I Всероссийском, с международным участием, биологическом конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз— Россия-2008» (Казань, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), Всероссийской конференции «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), 1ой Международной летней школе

Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Московская область, 2009), 13ом Европейском ежегодном. симпозиуме для студентов-биологов «Симбиоз - 2009» (Казань, 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), Ной Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2010), I Всероссийской Интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2010), II Международной специализированной выставке «Нанотехнологии. Казань—2010» (Казань, 2010).

Положения, выносимые на защиту:

По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шахмаева, Ирина Игоревна

выводы

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шахмаева, Ирина Игоревна, Казань

1. Абдуллин, Т.И. Адсорбция* и окисление пуриновых оснований, и их производных на электроде, модифицированном углеродными' нанотрубками / Т.И. Абдуллин, И.И. Никитина, О.В. Бондарь // Электрохимия. 2008. - Т.44. -№11. — С.1346-1350.

2. Абдуллин, Т.И. Биосенсоры на основе углеродных нанотрубок для характеристики структуры ДНК / Т.И. Абдуллин, О.В. Бондарь, A.A. Ризванов, И.И. Никитина // Прикл. биохимия и микробиология. — 2009. — Т.45. — №2. — С. 252-256.

3. Барановский, А.Г. Дезоксирибонуклеазы человека (обзор) / А.Г. Барановский, В.Н. Буиева, Г.А. Невинский // Биохимия.1 2004. - Т.69(6). -С. 720-741.

4. Блюменфельд, Л.А. Гемоглобин / Л.А. Блюменфельд // Соросовский образовательный журнал. 1998. - №4. - С.33-38.

5. Бондарь, О.В. Оценка структурного состояния ДНК с помощью электрохимических биосенсоров / О.В. Бондарь, И.И. Никитина, P.P. Хазиахметова, A.A. Ризванов, Т.И. Абдуллин // Ученые записки КГУ, серия "Естественные науки". 2007. - Т. 149(4). - С. 106-111.

6. Бельков, B.B. «Многомерная биология- XXI века и Клиническая лабораторная диагностика» / В.В. Бельков Электронный ресурс. // «Химия и Жизнь». 2007. - № 3. - Режим доступа: http://www.cbio.ru/article.php?storyid=2715

7. Герасимов, И.Г. Оценка жизнеспособности клеток по их морфометрическим параметрам на примере культивируемых фибробластов / И.Г. Герасимов, А.Г. Попандопуло // Цитология. 2007. - Т.49(3). - С.204-209.

8. Гончаров, А.Г. Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса: Практикум / А.Г. Гончаров; И.С. Фрейдлин; B.C. Смирнов и др.; Под общей редакцией М.Г. Романцева / Калинигр. ун-т. Калининград, 1997. - 73с.

9. Дементьева, Е.И. Реагент для определения аденозин-5-трифосфата / Е.И. Дементьева, Г.Д. Кутузова, И.А. Лундовских, H.H. Угарова // Патент на изобретение № 2164241, опубликован 10.03.2001.

10. Зборовская, И.А. Антителообразование к ДНКазе I при системной красной волчанке: возможный механизм нарушения функции фермента / И.А. Зборовская, A.C. Трофименко, И.П. Гонтарь // Научно-практическая ревматология. 2007. - №3. - С.64-68.

11. Канышкова, Т.Г. Лактоферрин и его биологические функции / Т.Г. Канышкова, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский // Биохимия. — 2001. № 66. - С. 513.

12. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. - 479 с.

13. Невзорова, Т.А. ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке: Дис. . канд.биол.наук: 03.00.04: защищена 24.03.05: утв. 03.06.05 / Невзорова Татьяна Александровна. Казань, 2005. — 170с.

14. Никитина, И.И. Электрохимические ДНК-сенсоры на основе углеродных, нанотрубок (Обзор) / И.И. Никитина, О.В. Бондарь, P.P. Хазиахметова, Ф.К.

15. Алимова, Т.И. Абдуллин // Ученые записки КГУ, серия "Физико-математические науки". 2007. - Т.149. - Кн.З. - С.21-37.

16. Семенова, Н. Хронический ^ аутоиммунный тиреоидит заболевание щитовидной железы, / Н. Семенова Электронный ресурс., // Medpopul. -Режим доступа http://wwvv.medpopul.ru/text/tireoidit.html.

17. Угарова, Н:Н. Реагент для- определения аденозин-б'-трифосфата / Н.Н. Угарова, Л.Ю. Бровко, Е.И. Беляева, И.В. Березин // Патент РФ №• 1041568, 29.06.93: Биотехнология. - 1992. - №5. - С. 43-51.

18. Чечеткин, В.Р. Биочипы для медицинской диагностики / В.Р.Чечеткин, Д.В. Прокопенко, А.А. Макаров, А.С. Заседателев II Российские Нанотехнологии. 2006. - Т. 1. - №1-2.

19. Шапот, B.C. Нуклеазы / В. Шапот. М.: Медицина, 1968;

20. Baird, C.L. Current and emerging commercial optical biosensors / C.L. Baird, D.G. Myszka /I Journal of Molecular Recognition. 2001. - V.14(5). - P. 261268.

21. Banerjee, P. Mammalian cell-based biosensors forpathogens and toxins I P. Banerjee, A. K. Bhunia // Trends in Biotechnology. 2009: - V.27(3). - P. 179188.

22. Baranovsky, A. G. DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from the blood of patients with various forms of viral hepatitis / A. G. Baranovsky, V. G. Matyushin,

23. A. V. Vlassov, V. G. Zabara, V. A. Naumov et al. // Biochemistry (Moscow)- -1997. V.62. - Pi 1358-1366.

24. Basnakian, A.G. DNase I-like endonuclease in rat kidney cortex that* is activated^ during ischemia/perfusion injury / A.G. Basnakian, N. Ueda, G.P. Kaushal, M.V. Mikhailova, S.V. Shah // J. Am. Soc. Nephrol. 2002;-V. 13.- P: 1000-1007.

25. Beigi B.M. Effect of ovarian stimulation on the endometrial apoptosis at implantation period / B.M. Beigi, M. Salehnia, A.Rl Khalatbary, S. Pourbeiranvand; B.N. Beigi; S. Ebrahimi // Iran Biomed.J. 2010. - V.14(4). -P.171-7.

26. Belli, S.E Biochemical characterization of human PC-1, an enzyme possessing alkaline phosphodiesterase and nucleotide pyrophosphatase activities / S.I: Belli, J.W. Goding // Eur J Biochem. -1994. Dec.l. - V.226(2); - P. 433-43.

27. Berry, E.M. Is the biological antioxidant system integrated andregulated? / E.M. Berry, R. Kohen // Med.Hypoth. 1999; - V.53. - P. 397-401.

28. Bhatiaj S. R. Polyelectrolytes for cell encapsulation / S. R: Bhatia, S. F. Khattak, S. G. Roberts // Current Opinion in Colloid & Interface Science. 2005. -V.10.-P. 45-51.

29. Brindle, J.T. Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using lH-NMR-based metabonomics / J.T. Brindle, et al. // NatMed. 2002. -V.8 (12). -P. 1439-1444.

30. Bronstein, I. B. DNA-specific antiidiotypic antibodies in the sera of patients with autoimmune diseases / I.B. Bronstein, A.M. Shuster, G.V. Gololobov, I. I. Gromova, O. A. Kvashuk et al. IFEBS Lett. 1992. - V.314. - P.259-263.

31. Brown, M. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology / M. Brown and C. Wittwer // Clin Chem. 2000. - V.46(8). - P. 1221-9.

32. Brunot, C. Cytotoxicity of polyethyleneimine (PEI), precursor base layer of polyelectrolyte multilayer films / C. Brunot, L. Ponsonnet, C. Lagneau, P. Farge, C. Picart, B. Grosgogeat // Biomaterials 2007. - V.28. - P.632-640.

33. Brynda, E. Surface immobilized protein multilayers for cell seeding / E. Brynda, J. Pacherni'k, M. Houska, Z. Pientka, P. Dvora'k // Langmuir. 2005. -V.21.-P. 7877-7883.

34. Campasa, M. A review of the use of genetically engineered enzymes in electrochemical biosensors / M. Campasa, B. Prieto-Simonc, J.-L. Marty // Seminars in Cell & Developmental Biology. 2009. - V.20(l). - P.3-9.

35. Capranico G. Local sequence requirements for DNA cleavage by mammalian topoisomerase II in the presence of doxorubicin / G. Capranico, K.W. Kohn, Y. Pommier // Nucl. Acids Res. 1990.-V. 18(22).-P.6611-6619.

36. Chen, J: Electrochemical anti-tumor drug sensitivity test for leukemia K562 cells at a carbon nanotubes modified electrode / J. Chen, D. Du, F.Yan, 1J.X. Ju, HZ. Lian // Chem-Eur. J. 2005. - V. 11. - P. 1467-72.

37. Chen, W.J. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I / W.J. Chen, T.H. Liao // Protein and Peptide Letters. 2006. - V. 13(5). - P., 44753. . '■;;■;•;.■ ■ ■

38. Chen, H. H. W. Role of glutathione in the regulation of Cisplatin resistance in cancer chemotherapy / H. H. W. Chen, M.T. Kuo // Met. Based Drugs. 2010. -V. 2010.-P.7.

39. Cho, S.H. Review Article: Recent advancements in; optoflixidic flow cytometer / S.H. Cho, J.M. Godin, C.H. Chen, W. Qiao, H. Lee, Y.H. Lo //. Biomicrofluidics. 2010. - V.4(4). - P.43001.

40. Choi, C.K. An endothelial cell compatible biosensor fabricated using optically thin indium tin oxide silicon nitride electrodes / C.K. Choi, A.E. English, S.-I. Jun, K.D. Kihm, P.D. Rack // Biosens. Bioelectron. 2007. - V.22. - P.2585-90.

41. Choi, S-J. Fluorometric Determination of Deoxyribonuclease I Activity with PicoGreen / S-J. Choi, C. S. Francis // Analytical Biochemistry. 2000. - V.281. -P. 95-97.

42. Claase, M.B. Enhanced bone marrow stromal cell adhesion and growth on segmented poly(ether ester)s based on poly(ethylene oxide) and poly(butylenes terephthalate) / M.B. Claase, et al. // Biomacromolecules. — 2003. V.4. - P. 5763.

43. Clark, L.C. Electrode systems for continuous monitoring in; cardiovascular surgery / L.C. Clark, J.R. Lyons, C. Lyons // Ann. New York Acad; Sci. 1962. - . V.102. -P.29-45.

44. Collier, J.H. Engineering a biospecific communication pathway between cells and electrodes / J.H. Collier, M. Mrksich // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2006. -V.103.-P. 2021-5.

45. Counis, M: F. DNases and apoptosis / M. F. Counis, A. Torriglia // Biochemistry and Cell Biology. 2000. - V.78(4). - P. 405-14.

46. Crouch, S.P: The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity / S.P. Crouch, R. Kozlowski, K.J. Slater, J.J. Fletcher // Immunol Methods. 1993. - V. 160(1): - P.81-8.

47. Cui, J. Pharmacological evidence for the selectivity of in vivo signals obtained with enryme-based electrochemical sensors / J. Cui, N.V. Kulagina, A.C. Michael // J. Neurosci. Methods. 2001. - V. 104. - P. 183-189.

48. Cui, H.F. Microelectrode array biochip: tool for in vitro drug screening based on the detection of a drug effect on dopamine release from PC 12 cells / H.F. Cui, J.-S. Ye, Y. Chen, S.-C. Chong, F.-S. Sheu, // Anal. Chem. 2006. - V.78. - P. 6347-55.

49. Curran, J.M. The guidance of human mesenchymal stem cell differentiation in vitro by controlled modifications to the cell substrate / J.M. Curran, R. Chen, J.A. Hunt // Biomaterials. 2006. - V.27. - P. 4783-93.

50. Curtis, T. Development of a mast cell-based biosensor / T. Curtis, et al. // Biosens. Bioelectron. 2008. - V.23. - P. 1024-1031.

51. Davis, J.C. Jr. Recombinant human DNasel (rhDNase) in patients with lupus nephritis / J.C. Jr. Davis, S. Manzi, C.Yarboro, et al. // Lupus. 1999. - V.8(l). -P. 68-76.

52. Ding, L. A disposable impedance sensor for electrochemical study and monitoring of adhesion and proliferation of K562 leukaemia cells / L. Ding, D. Du, J. Wu, H.X. Ju // Electrochem. Commun. 2007a. - V.9. - P. 953-8.

53. Ding, L. A bio-inspired support of gold nanoparticles-chitosan nanocomposites gel for immobilization and electrochemical study of K562 Leukemia cells / L. Ding, C. Hao, Y.D. Xue, H.X. Ju // Biomacromolecules. -2007b. -V.8.-P.1341-6.

54. Ding, L. Trends in cell-based electrochemical biosensors / L. Ding, D. Du, X. Zhang, H. Ju // Current Medicinal Chemistry. 2008. - V. 15(14). - P. 1-11.

55. Du, D. Construction of a biomimetic zwitterionic interface for monitoring cell proliferation / D. Du, J.Cai, H.X. Ju, F. Yan, J. Chen et al. // Langmuir. 2005. -V.21. — P.8394-9.

56. Economidou-Karauglou, A. Variations in serum alkaline DNase activity. A new means for therapeutic monitoring of malignant lymphomas / A. Economidou-Karauglou, M. Lans, H.S. Taper, J.L. Michaux, M.B. Roberfroid // Cancer. -1988.-V.61.-P.1838.

57. Eltzschig, H.K. ATP release from activated neutrophils occurs via connexin 43 and modulates adenosine-dependent endothelial cell function / H.K. Eltzschig, T. Eckle, A. Mager, N. Küper, C. Karcher et al. // Circ Res. 2006. - V.99(10). -P.l 100-8.

58. Eriksson, P. B cell abnormalities in Wegener's granulomatosis and microscopic polyangiitis: role of CD25+-expressing B cells / P. Eriksson, C. Sandeil, K. Backteman, J. Ernerudh // J Rheumatol. 2010. - V.37(10). - P.2086-95.

59. Eron, L. Inhibition of deoxyribonuclease action by actinomycin D and ethidium bromide / L. Eron, B. McAuslan // Biochim. Biophys. Acta. 1966. -V.114. - P. 633-636.

60. Ershova, N.A. Association between DNA antibodies levels in the blood of patients with multiple sclerosis and clinical presentation of the disease / N.A.

61. Ershova, N.V. Garmashova, V.N. Buneva, A.S. Mogel'nitskiT, O.B. Tyshkevich et al. // Zh. Nevrol. Psikhiatr. Im. S.S. Korsakova. 2003(2). -P.25-33.

62. Evansa; C. J. DNase II: genes, enzymes and-function// C. J. Evansa, R. J. Aguilera // Gene, -r 2003. Dec., 11.- V.322. - P.l-15.

63. Fernie, A.R. Metabolite profiling: from' diagnostics to systems biology / A.R., Fernie, R.N. Trethewey, A.J. Krotzky, L. Willmitzer // Nat Rev Mol Cell Biol. -2004.-V. 5(9). P.763-9.

64. Funakoshi, A. Clinical investigation-of serum deoxyribonucleaseTI: Clinical studies of serum deoxyribonuclease activity in pancreatic disease / A. Funakoshi, H. Wakasugi, H. Ibayashi // Gastroenterol. Jpn. 1979. -V. 14. - P. 436.

65. Gewirtz, D.A. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin / D.A.Gewirtz // Biochem Pharmacol. 1999. - V.57(7). - P.727-41.

66. Gibson; U.E. An antibody capture bioassay (ACB) for DNase in- humanserum samples / U.E. Gibson, D.L. Baker, D.V. Sinicropi // J. Immunol Methods. -1992. V.155(2). - P. 249-56.

67. Goguen, B. Clonogenic cytotoxicity testing by microdrop encapsulation / B. Goguen, N. Kedersha//Nature. 1993. - V.363. - P.189-190.

68. Gololobov, G.V. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies / G.V. Gololobov, S.V. Mikhalp, A.V. Starov, A.V. Kolesnikov, A.G. Gabibov // App. Biochem. Biotechnol. 1994. - V.47. - P. 305315.

69. González-Cháveza, S. A. Lactoferrin: next term structure, function and» applications / S. A. González-Cháveza, S. Arévalo-Gallegosa, Q. Rascón-Cruz //1.ternational Journal of Antimicrobial Agents. 2009. - V.33(4). - P. 301.el-301.e8.

70. Granicka, L.H. Encapsulation of OKT3 cells in hollow fibers / L.H. Granicka, J.W. Kawiak, E. Glowacka, A. Werynski // Trans. ASAIO. 1996. -V.42. — P.863-866.

71. Gu, H.Y. The immobilization of hepatocytes on 24 nm-sized gold colloid for enhanced hepatocytes proliferation / H.Y. Gu, Z. Chen, R.X. Sa, S.S. Yuan, H.Y. Chen, Y.T. Ding, A.M. Yu // Biomaterials. 2004. - V.25. - P. 3445-51.

72. Guzman, M. L. Preferential induction of apoptosis for primary human leukemic stem cells /M. L. Guzman, C. F. Swiderski, D. S. Howard, B. Grimes, R. M. Rossi et al. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. V.99. - P. 16220-16225.

73. Harosh, I. Mechanism of action of deoxyribonuclease II from human lymphoblasts / I. Harosh, D.M. Binninger, P.V. Harris, M. Mezzina, J.B. Boyd // Eur J Biochem. 1991. - Dec.5. — V.202(2). - P. 479-84.

74. Harrigan, G.G. Metabolic profiling: its role in biomarker discovery and gene function analysis / G.G. Harrigan and R. Goodacre // Kluwer Academic Publishers, 2004.-337p.

75. Hart, J.P. Some recent designs and developments of screen-printed carbon electrochemical sensors/biosensors for biomedical, environmental, and industrial analyses / J.P. Hart, A. Crew, E. Crouch // Anal. Lett. 2004. - V.37(5). - P.789-830.

76. Ito, K. Phosphodiesterase I in human urine:, purification and characterization of the enzyme / K. Ito, T. Yamamoto, N.J. Minamiura // Biochcm. 1987. - Aug. -V.102(2). -P. 359-67. ,

77. Jeulin, C. Reversible intracellular ATP changes in intact rat spermatozoa and effects on flagellar sperm movement / C. Jeulin and J.-C. Soufir // Cell Motility and the Cytoskeleton: 1992. - V.2T(3):- P.210-222;

78. Jonsson, O. Minimal safe arterial blood flow during selective; antegrade cerebral perfusion; at 20° centigrade / O. Jonsson, A. Morell, V. Zemgulis,, E. Lundstrôm, T. Tovedal et al. // Ann. Thorac. Surg. 2011. Epub ahead of print.

79. José, C. The use of monochlorobimane to determine hepatic GSH levels and synthesis / C. José, F. Checa, N. Kaplowitz // Analytical Biochemistry. 1990. -V.190(2).-P. 212-219.

80. Junowicz, E. Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclase A. I. General properties and activation with different bivalent metals / E: Junowicz and J. Spencer//Biochim. Biophys. Acta. 1973. - V.312. - P. 72.

81. Kamei, K. The construction of endothelial cellular biosensing system for the control of blood pressure drugs / K. Kamei, T. Haruyama, M. Mie, Y.Yanagida, M. Aizawa, E. Kobatake // Biosens. Bioelectron. 2004. - V. 19. - P. 1121-4.

82. Kamp, G. Spermatozoa: models for studying regulatory aspects of energy metabolism / G. Kamp, G. Busselmann, J. Lauterwein // Cellular and Molecular Life Sciences. 1996. - V.52(5). -P.487-494.

83. Kanyshkova, T. G. DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk; of healthy human; mothers / T. G. Kanyshkova, D. V. Semenov, D. Yu. Khliinankov, V. N. Buneva, G. A. Nevinsky // FEBS Lett. -1997. V.416. — P.23-26.

84. Kawai, Y. Diagnostic Use of Serum Deoxyribonuclease I Activity as a Novel Early-Phase Marker in Acute Myocardial Infarction. / Y. Kawai, M. Yoshida, K. Arakawa//Circulation; 2004. - V. 109. - P. 2398-2400.

85. Kerman, K. Recent trends in electrochemical DNA biosensor technology / K. Kerman, M. Kobayashi, E. Tamiya // Meas. Sci. Technol. 2004. — V. 15. - Rl-Rll.

86. Kohen, R. Skin antioxidants: their role in aging and in oxidative stress — new approaches for their evaluation / R. Kohen // BiomedL Pharmacother. — 1999. — V.53. P.181-192.

87. Kohen, R. Biological Redox Activity: Its Importance, Methods, for Its Quantification and Implication for Health and Disease / R. Kohen, J. Hrbac // Drug Dev. Res. 2000. - V.50. - P. 516-527.

88. Kovacs, G.T. Electronic sensors with living cellular components / G.T. Kovacs // Proc. IEEE. — 2003. — V.91. — P. 915-929.

89. Kowalski, R. Immune cell function testing: an adjunct to therapeutic drug monitoring in transplant patient management / R. Kowalski, D. Post, M. C. Schneider, J. Britz, J. Thomas et al. // Clinical Transplantation. 2003. - V.17(2). -P.77-88.

90. Kravtsov, V.D. Use of the microculture kinetic assay of apoptosis to determine chemosensitivities of leukaemias / V.D. Kravtsov, J.P. Greer, J.A. Whitlock, M.J. Koury//Blood. 1998. - V.92. - P. 968-980;

91. Lachmann, P.J.' Allergic reactions, connective tissue and diseases / P.J. Lachmann// Sei. BasisMed. Ann. Rev. 1967. -P.36-58.

92. Lachmann, „ P.J: Lupusand desoxyribonuelease / P.J. Lachmann / Lupus. -2003. V.12(3). -P.202-206.

93. Lam, N.Y.L. EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis / N.Y.L. Lam, T.H. Rainer, R.W.K. Chiu, Y.M. D. Lo // Clinical Chemistry. 2004. - V.50. - P.256-257.

94. Lazarides, E. Actin is the naturally occurring inhibitor of Deoxyribonuclease I / E. Lazarides and U. Lindberg // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1974. - V.71. -P. 4742.

95. Lee, S.J. Response of MG63 osteoblast-like cells onto polycarbonate membrane surfaces with different micropore sizes / S.J. Lee, et al. // Biomaterials. 2004. - V.25. - P. 4699-707.

96. Lee, J. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art / J. Lee, et al. // Tissue Eng. Part B Rev. 2008. - V.14. - P. 61-86.

97. Leist, M. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis / M. Leist, B. Single, A.F. Castoldi, S. Kühnle, P.J. Nicotera // Exp Med. 1997. - V. 185(8). - P. 1481-6.

98. Liao, T. Reversible inactivation of pancreatic deoxyribonuclease A by sodium dodecyl sulfate. Removal of COOH-terminal residues from the denatured protein by carboxypeptidase A / T. Liao // J. Biol. Chem. — 1975. V.250. - P. 3831.

99. Liao, T.H. Deoxyribonuclease I and its clinical applications / T.H. Liao // Journal of the Formosan Medical Association. 1997. - V.96(7). — P. 481-7.

100. Liu, X. DFF, a Heterodimeric Protein That Functions Downstream of . Caspase-3 to Trigger DNA Fragmentation during Apoptosis / X. Liu, H. Zou, C. Slaughter, X. Wang // Cell. -1997. April, 18. - ¥.89(2).-PU75-1;84.;

101. Liu, Q.Y. Apoptosis-related functional features of the DNase 1-like family of nucleases / Q.Y. Liu, M. Ribecco, S. Pandey, P.R. Walker, M. Sikorska // Annals of the New York Academy of Sciences. 1999.- V.887. - P. 60-76.

102. Liu, II. Glutathione metabolism during aging and in Alzheimer disease / H. Liu, H. Wang, S. Shenvi, T. M: Hagen, R.-M Liu //Ann. N. Y. Acadl Sci. 2004, -V.1019.-P. 346-349.

103. Liu, J.L. An analysis of the magnetic resonance imaging and pathology of intracal lymphoplasmacyte-rich meningioma / J.L. Liu, J.L. Zhou, Y.H. Ma, C. Dong // Eur. J. Radiol. — 2011. Epub ahead of print.

104. Madaio, M.P. Spontaneously produced anti-DNA/DNasel autoantibodies modulate nuclear apoptosis in living cells / M.P. Madaio, M. Fabbi, M. Tiso, // Eur. J. Immunol. 1996. - V.26(12). - P. 3035-3041.

105. Mannherz, H.G. A new function for an old enzyme: the role of DNase I in apoptosis / H.G. Mannherz, M.C. Peitsch, S. Zanotti, R. Paddenberg, B. Polzar // Current Topics in Microbiology and Immunology. 1995. - V.198. - P.161-74.

106. Matsuda, M. Specificity of DNase I. estimation of nucleosides present at the 5'-phosphate terminus of a limit digest of DNA by DNase I / M. Matsuda and H. Ogoshi // J. Biochem (Tokyo). 1966. - V.59. - P. 230.

107. Matsuno, H. Kinetic Studies of DNA Cleavage Reactions Catalyzed by an ATP-Dependent Deoxyribonuclease on a 27-MHz Quartz-Crystal Microbalance / H. Matsuno, H. Furusawa, Y. Okahata // Biochemistry. 2005. - V.44 (7). - P. 2262-2270.

108. May, K.M.L. Development of a whole-cell-based biosensor for detectinghistamine as a model toxin / K.M.L. May, Y. Wang, L.G. Bachas, K.W. Andersoni

109. Anal. Chem. -2004. -V.76. -P.4156-61.

110. Meyerhotf, M.E. New in vitro analytical approaches for clinical chemistry measurements in critical care / M.E. Meyerhotf // Clin. Chem. — 1990. — V.36. — P.1567-1572.

111. Miyatake, K. Structure-functionnext term analysis and molecular modeling of DNase catalytic antibodies / K. Miyatake, H. S. Zeina, J. A. Teixeira da Silva // Immunology Letters. 2010. - March, 10. - V. 129(1). - P. 13-22.

112. Morrow, D.A. The search for a biomarker of cardiac ischemia / D.A. Morrow, J. A. de Lemos, M.S. Sabatine, E.M. Antman // Clinical Chemistry. -2003. V.49. — P.537-539.

113. Mortensen, L.S. Identifying hypoxia in human tumors: a correlation study between 18F-FMISO PET and the Eppendorf oxygen-sensitive electrode /L.S. Mortensen, S. Buus, M. Nordsmark, L. Bentzen, O.L. Munk et al. // Acta Oncol. -2010. V.49(7). - P.934-40.

114. Moschopoulou, G. Engineering of the membrane of fibroblast cells with virus-specific antibodies: a novel biosensor tool for virus detection / G. Moschopoulou, et al. // Biosens. Bioelectron. 2008. -V.24. - P. 1033-1036.

115. Mouratou, B. Development of nonradioactive microtiter plate assays for nuclease activity / B. Mouratou, S. Rouyre, S. Pauillac, J.L. Guesdon // Anal. Biochem. 2002. - V.309. - P. 40-47.

116. Murai, K. Purification and properties of deoxyribonuclease II from human urine / K. Murai, M. Yamanaka, K. Akagi, M. Anai // J Biochem. 1980. -V.87(4). - P. 1097-103.

117. Nadano, D. Measurement of deoxyribonuclease I activity in human tissues and body fluids by a single radial enzyme-diffusion method / D. Nadano, T. Yasuda and K. Kishi // Clin. Chem. 1993. - V.39/3. - P. 448-452.

118. Nevinsky, G.A. Natural catalytic antibodies (abzymes) in normalcy and pathology / G.A. Nevinsky, T.G. Kanyshkova, V.N. Buneva // Biochemistry (Mosc).-2000(11).-P. 1245-55.

119. Newman, J.D. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective / J.D. Newman, A.P. Turner // Biosens Bioelectron. 2005. - V.20(12). - P. 243553.

120. Nitsche-Schmitz, D.P. Invasion mechanisms of Grampositive pathogenic cocci / D.P. Nitsche-Schmitz, et al. // Thromb. Haemost. 2007. - V.98. - P.488-496.

121. Odaka, C. Role of macrophage lysosomal enzymes in the degradation of nucleosomes of apoptotic cells / C. Odaka, T. Mizuochi // J Immunol. 1999. -V.163(10).-P. 5346-52.

122. Ormerod, M.G. Flow cytometry: A practical approach. / M.G. Ormerod (ed.) // IRL Press, Oxford. 1990.

123. Pagliaro, L. Glycolysis in vivo: fluorescence microscopy as a tool for studying enzyme organization in living cells / L. Pagliaro //Advances in Molecular and Cell Biology. 1995. - V.l 1. - P. 93-123.

124. Pampaloni, F. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue / F. Pampaloni, et al. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. - V.8. - P. 839-845.

125. Parks, D.R. Antigen-specific identification and cloning of hybridomas with a Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) / D.R. Parks, V.M. Bryan, V.M. Oi, V.T. Oi, L.A. Herzenberg // Proc. Natl. Acad. Sci. 1979. - V.76(4). - P. 19621966.

126. Patel, P.S. Evaluation of serum alkaline DNase activity in treatment monitoring of head and neck cancer patients / P.S. Patel, B.P. Patel, R.M. Rawal, G.N. Raval, M.M. Patel, J.B. Patel, F.P. Jha, D.D. Patel // Tumor Biol. 2000. -Y.21.-P. 82.

127. Paul, S. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody / S. Paul, D.J. Voile, C.M. Beach, D.R. Johnson, M.J. Powell, R.J. Massey // Science. 1989. - V.244(4909). - P. 1158-62.

128. Ramsden, J.J. Optical biosensors / J.J. Ramsden // Journal of Molecular Recognition. 1997. - V.10(3). - P. 109-120.

129. Repetto, M. Oxidative stress in blood of HIV infected patients / M. Repetto, C. Reides, M. L. Gomez Carretero, M. Costa, G. Griemberg, S. Llesuy // Clin.Chim.Acta. 1996. - V.255. — P. 107-117.

130. Richie, J.P. Long-term stability of blood glutathione and cysteine in humans / J.P. Richie, Jr. P. Abraham, Y. Leutzinger // Clin Chem. 1996. - V.42(7). -P.1100-5.

131. Richter, C. Control of apoptosis by the cellular ATP level / C. Richter, M. Schweizer, A. Cossarizza, C. Franceschi // FEBS Letters. 1996. - V.378 (2). - P. 107-110.

132. Sallai, K. Antinucleosomeantibodiesand decreased deoxyribonuclease activity in sera of patients with systemic lupus erythematosus assay / K. Sallai, E. Nagy, B. Derfalvy, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. - V.12(l). - P. 5659.

133. Scully, C. Serum alkaline deoxyribonuclease in oral cancer and premalignant lesions / C. Scully, D.A. Spandidos, W.P: Booth, I.A. McGregor, P. Boyle//Biomedicine.- 1981. V.35.-P. 179.

134. Shuster, A.M. DNA hydrolyzing autoantibodies / A.M. Shuster, G.V. Gololobov, O.A. Kvashuk, A.E. Bogomolova, I.V. Smirnov, A.G. Gabibov // Science. 1992. - V.256(5057). - V. 665-7.

135. Sigma quality control test / Электронный ресурс. 1997 // Режим доступа http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/EnzymeAssay/163. d4263enz.Par.000r.File.tmp/d4263enz.pdf

136. Simmonds, M.J. A nonsense mutationin exon 2 of the DNasel gene is not present in UK subjects with systemic lupus erythematosus and Graves' disease / MJ. Simmonds, J.M. Heward, M.A. Kelly, // Arthr. Rheum. 2002. - V.46(l 1). -P. 3109-3110.

137. Simonnet, H. Low mitochondrial respiratory chain content correlates with tumor aggressiveness in renal cell carcinoma / H. Simonnet, N. Alazard, K. Pfeiffer, C. Gallou, C. Beroud et al. // Carcinogenesis. 2002. - V.23(5). - P.759-68.

138. Smith, J. Redox state is a central modulator of the balance between self-renewal and differentiation in a dividing glial precursor cell / J. Smith, E. Ladidagger, M. Mayer-Proschel, M. Noble // PNAS. V.97(18). - P. 1003210037.

139. Spandidos, D.A. Serum deoxyribonucleases in patients with breast cancer / D.A. Spandidos, G. Ramandanis, J. Garas, S.D. Kottaridis // Eur. J. Cancer. -1980.-V.16.-P.1615.

140. Spence, D. M. Dynamic Monitoring of Glutathione in Erythrocytes, without a Separation Step, in the Presence of an Oxidant Insult I D. M. Spence, M. Raththagala, P. D. Root // Anal. Chem. 2006. - V.78. - P.8556-8560.

141. Stolarek, R. Effect of various agonists on nitric oxide generation by human polymorphonuclear leukocites / R. Stolarek, P. Kulf, Z. Kurmanowska, D. Nowak //Int. Clin. Lab. Res. 1998. - V.28. -P.104-109.

142. Subapriya, R. Oxidant-antioxidant status in patients with oral squamous cell carcinomas at different intraoral sites I R. Kumaraguruparan, C.R. Ramachandran, S. Nagini // Clin. Biochem. 2002. - V.35. - P. 489-493.

143. Subrahmanyam; S. Application?of natural receptors in sensors and; assays / S. Subrahmanyam; et al. // Anal: Chem: 2002; - V.74I - P.3942-3951.

144. Suck, D. DNA recognition by DNasel / D. Suck;// J. Mol. Recognita 1994. -V.7(2>-P.65-70y . - ■ ' ■ "" ■ •

145. Tamkovich, S.N. Circulating DNA and DNase activity in human blood / S.N. Tamkovich, A.V. Chercpanova, E.V. Kolesnikova, E.Y. Rykova, D.V. Pyshnyi, V.V. Vlassov, P:P: Laktiono^T/Anm:N;Y. Acad: Sci: 2006; - V.1075. — P: 191. . ,

146. Tew, M.B. A mol¿cular analysis of the low serum deoxyribonuclease activity in<lupus patients / M.B; Tew, R.W. Johnson, J.D. Reveille, et-al7/ Art hr. Rheum. 2001.-V.44(10). - P.2446-2447.,

147. Thevenot, D.R. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification / D.R. Thevenot, K. Toth, R. Durst et al. // Anal. Lett. 2001. - V. 38(10).-P:635-659.

148. Timme-Laragy, A. R. Antioxidant Responses and NRF2 in Synergistic Developmental Toxicity of PAHs in Zëbrafish / A. R. Timme-Laragy, L. A. Van Tiem, E. A. Linney, R.T. Di Giulio // Toxicol; Sci. 2009: - V. 109(2). - P: 217227.

149. Tkac, J. Biosensors with immobilised microbial cells using amperometric and thermal detection principles / J. Tkac, V. Stefuca, P. Gemeiner // Applications of Cell Immobilisation Biotechnology. Focus on Biotechnology. 2005. - V.8B (5). -P.549-566.

150. Tong, C. An annexin V based biosensor for quantitatively detecting early apoptotic cells / C. Tong, et al. // Biosensors and Bioelectronics. 2009. -V.24(6). — P. 1777-1782.

151. Tsujimoto, Y. Apoptosis and necrosis: intracellular ATP level as a determinant for cell death modes / Cell Death Differ. 1997. - V.4(6). - P.429-34.

152. Vaidyanathan, S.Metabolome analyses: strategies for systems biology / S. Vaidyanathan,G.G. Harrigan,R. Goodacre // Hardcover, 2005. 394 p.

153. Vane, J.R. Mechanism of action of antiinflammatory drugs / J.R. Vane and R.M. Botting // Int. J. Tissue React. 1998. - V.20(l). -P.3-15.

154. Vivancos, P. D. A nuclear glutathione cycle within the cell cycle / P. D. Vivancos, T. Wolff, J. Markovic, F.V. Pallardo, C.H. Foyer // Biochem. J. -2010. — V.431(2). — P. 169-78.

155. Vlassov, A. Characterization and selectivity of catalytic antibodies from human serum with RNase activity / A. Vlassov, C. Florentz, M. Helm, V. Naumov, V. Buneva et al. // Nucleic Acids Res. 1998. - V.26. - P.5243-5250.

156. Widlak, P. Action of Recombinant Human Apoptotic Endonuclease G on Naked DNA and Chromatin Substrates: cooperation with exonuclease and DNase I / P. Widlak, L. Y. Li, X. Wang, W. T. Garrard // J. Biol. Chem. 2001. - V.276. -P. 48404-48409.

157. Wong Shi Kam, N.Electrical stimulation of neural stem cells mediated by humanized carbon nanotube composite made with extracellular matrix protein / N.

158. Wong Shi Kam, E. Jan, N. A. Kotov // Nano Letters. 2009. - V. 9(1). - P.273-278.

159. Xing, J.Z. Dynamic monitoring of cytotoxicity, on microelectronic sensors / J.Z. Xing, L.J. Zhu, J.A. Jackson, S: Gabos, X.-J. Sun, X.-B. Wang, X. Xu // Chem. Res. Toxicol. -2005. V. 18. - P. 154-6 L

160. Xing, J.Z. Microelectronic cell sensor assay for detection" of cytotoxicity and prediction of acute toxicity / J.Z. Xing, L. Zhu, S. Gabos, L. Xie // Toxicol, in Vitro. 2006. - V.20. - P. 995-1004.

161. Yamada, K.M. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D / K.M. Yamada and E. Cukierman // Cell. 2007. - V.130 (4). - P.601-610.

162. Yan, F. Immobilization and electrochemical behavior of gold nanoparticles modified leukemia K562 cells and application in drug sensitivity test / F. Yan, J. Chen, H.X. Ju // Electrochem. Commun. 2007. - V.9. - P. 293-8.

163. Yang, L.J. Interdigitated array microelectrodebased electrochemical impedance immunosensor for detection of Escherichia coli 0157:H7 / L.J. Yang, Y.B. Li, G.F. Erf// Anal. Chem. 2004. - V.76. - P. 1107-13.

164. Yasuda, T. Serum deoxyribonuclease I can be used as a useful marker for diagnosis of death due to ischemic heart disease / T. Yasuda, R. Iida, Y. Kawai, T. Nakajima, Y. Kominato et al. // Legal Medicine. 2009. - V.l 1. - P.S213-S215.

165. Yeh, T.M. Deoxyribonuclease-inhibitory antibodies in systemic lupus erythematosus / T.M. Yeh, H.C. Chang, C.C. Liang, et al. // J. Biomed. Sei. -2003. V.10(5). - P. 544-551.

166. Zaman, M.H. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis / M.H. Zaman, L.M. Trapani, A.L. Sieminski, D. MacKellar, H. Gong et al. // PNAS. 2006. -V. 103(29). -P.10889-10894.

167. Znidarcic, Z. Clinical cytology and primary health care of children and adults / Z. Znidarcic, T. Jeren, G. Kaie, I. Kardum-Skelin, A. Rnezevic-Obad et al. // Coll Antropol. 2010. - V.34(2). - P.737-48.

168. Zunino, F. The interaction of daunorubicin and doxorubicin with DNA and chromatin / F. Zunino, A. Di Marco, A. Zaccara, R. A. Gambetta // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Nucleic Acids and Protein Synthesis. - 1980. -V.607(2). - P.206-214.

Информация о работе

Шахмаева, Ирина Игоревна
кандидата биологических наук
Казань, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Исследование ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток человека с помощью биохимических сенсоров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы