Исследование биологических эффектов воздействия преобразованного солнечного света

Фахранурова, Лилия Ильгизовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование биологических эффектов воздействия преобразованного солнечного света
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование биологических эффектов воздействия преобразованного солнечного света"

005"'

На правах рукописи

Щгь/ш&'/е/гг.

Фахраиурова Лилия Ильгизовна

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРЕОБРАЗОВАННОГО СОЛНЕЧНОГО СВЕТА

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 >012

Пущино-2012

005014392

Работа выполнена в лабораториях биофизики возбудимых сред и ультраструктуры нейрона Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук Храмов Роберт Николаевич

кандидат биологических наук Саиталова Ирипа Михайловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Маевский Евгений Ильич (зав. лаб. энергетики биологических систем ИТЭБ РАН)

доктор биологических наук Векшин Николай Лазаревич

(г.н.с. лаб. структуры и функций редокс-белков ИБК РАН)

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «28» марта 2012 года в 1400 на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат диссертации разослан «27 » февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физ.-мат. наук

г Ланина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБЛЕМЫ Актуальность проблемы. Электромагнитные поля оптического диапазона низкой интенсивности оказывают влияние на функциональное состояние живых клеток, тканей и на организм в целом, поэтому из года в год растет интерес к лечению различных заболеваний естественными и искусственно создаваемыми физическими факторами. Наиболее часто в фототерапии применяют низкоинтенсивпое излучение лазеров и светодиодных ламп (Oliveira et al., 2008; Ablon, 2010). Альтернативой является источник белого света, излучение которого модулируется с помощью светофильтров (Кару и др., 1984; Монич и др., 1994; Saczko et al., 2005). Светофильтры на основе фотолюминофоров (светопреобразующие материалы) позволяют использовать весь солнечный спектр, при этом УФ-компонента преобразуется в дополнительную к солнечному спектру оранжево-красную компоненту (преобразованный солнечный свет - ПСС). В литературе имеются лишь единичные упоминания об использовании таких материалов для биомодуляции функций животных организмов, в частности при фотостимуляции репаративных процессов (Воробьев, 1998).

Многие исследователи, получая положительный ответ при действии красного света, отмечают, что механизм данного влияния на живые системы пока не известен (Кару, 2005; Lane, 2006). В настоящее время показано, что основными первичными реакциями после светопоглощения в клетках и их окружении являются поглощение световой энергией фотоакцепторами (каталазой, супероксиддисмутазой, цитохром с оксидазой и др.), образование активных формы кислорода (АФК), образование оксида азота (NO), временное повышение локальной температуры (Владимиров и др., 2004; Grzelak et al., 2001; Jou et al., 2002; Karu, 2008; Xu et al., 2008).

Поскольку в настоящее время имеется лишь несколько работ, посвященных действию ПСС, мы исследовали влияние ПСС на различные тест-системы, начиная от воды до сложных систем - клетка, эмбрион, мышца, организм в стрессовых условиях.

Данное исследование направлено на изучение воздействия преобразованного солнечного света с дополнительной оранжево-красного компонентой (Хтах=626 нм) на биологические системы разных уровней организации, что является актуальным не только для решения ряда задач биомедицины, но и для выявления фундаментальных законов взаимодействия света с организмом млекопитающих.

Цель и задачи исследования

Целью работы является исследование воздействия преобразованного солнечного света на биологические объекты разного уровня организации.

Были поставлены задачи:

1. Исследовать влияние преобразованного солнечного света на жизнеспособность клеточных культур;

2. Исследовать влияние преобразованного солнечного света на раннее эмбриональное развитие зародышей мышей в условиях in vitro;

3. Исследовать влияние преобразованного солнечного света на физическую работоспособность мышей и на их структурные характеристики клеток сердечной мышцы;

4. Исследовать влияние преобразованного солнечного света на функциональные и структурные характеристики сердечной мышцы гипертензивных крыс. Провести сравнительный анализ полученных результатов с эффектами от светодиодной матрицы, широко используемой в медицине;

5. Исследовать роль активных форм кислорода, как возможных регуляторов действия преобразованного солнечного света на культуре клеток фибробластов.

Научная новизна. Впервые показано, что добавление люминесцентной оранжево-красной компоненты на Х.тах 626 им в состав солнечного света приводит к дозозависимому воздействию на жизнеспособность культивируемых in vitro клеток млекопитающих. Определены дозы светового воздействия, при которых происходит угнетение (155 Дж/см2 при облучении СС) и повышение жизнеспособности клеток линии НЕр-2 и ЗТЗ clone NIH (13,3 Дж/см2 при облучении ПСС).

Список сокращемнЛ:

СС - солнечный свет (моделируется с помощью ксепоновой лампы, спектр которой наиболее близок к солнечному спектру).

СС-УФ - солнечный свет без УФ-компоненты.

ПСС - преобразованный солнечный свет (УФ-компонента преобразована в дополнительную оранжево-красную компоненту к солнечному свету, за счет действия фотолюминофора оксисульфида иттрия, активированного европием - У2С>23(Еи); спектр возбуждения люминофора находится в УФ-диапазоне 200-370 нм, а спектр эмиссии - в области оранжево-красного света с максимумом люминесценции на 626 нм).

Впервые определены дозы светового воздействия и режимы облучения ПСС, при которых происходит угнетение (50 Дж/см2) и повышение жизнеспособности (20 Дж/см2) доимплантационных эмбрионов мыши и нормализация их развития в условиях in vitro.

Впервые установлено, что воздействие ПСС (31,1 Дж/см2) увеличивает физическую работоспособность мышей линии CD-I (на 35%) и стимулирует у них активацию морфообразовательных процессов в клетках сердечной мышцы (наблюдается увеличение относительной площади сечения митохондрий, саркоплазматического ретикулума и миофибрилл).

Впервые обнаружено, что ПСС оказывает положительное влияние на структурно-функциональные характеристики клеток сердечной мышцы гипертензивных крыс линии SHR, проявляющееся в нормализации временных характеристик сокращения папиллярной мышцы крыс и в двукратном увеличении относительной площади сечения саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов.

Исследована гипотеза, объясняющая возможный механизм воздействия ПСС посредством стимуляции образования активных форм кислорода в водных растворах, запускающих каскады внутриклеточных реакций, в конечном счете, приводящих к структурно-функциональным изменениям в биологических системах, на примере культуры клеток фибробластов.

Научно-ирактическаи значимость работы и внедрение результатов исследования. Полученные данные позволяют рекомендовать светопреобразующие материалы для использования в медицине и амбулаторно, как альтернативу применения других источников оранжево-красного света (светодиодная матрица, лазер). Светопреобразующие материалы могут найти применение при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, в восстановительной и спортивной медицине (для повышения физической работоспособности) и в репродуктивных технологиях (для повышения жизнеспособности и нормализации развития культивируемых in vitro эмбрионов).

Работа выполнена в рамках исследований по проектам Российского фонда фундаментальных исследований (№04-04-27292) РФФИ; государственного контракта № 02.513.12.3006.

Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 15 печатных работах, в том числе в 6 статьях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международные школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007; 2008; 2009), 11-я школа-конференция молодых ученых «Биомедицинская инженерия-2007» (Пущино, 2007), 5-й Международный конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2009), International Conference «Medical Radiations; Research and application» (Marrakech, Morocco, 2010), конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика'11» (Пущино, 2011).

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, приложений. Работа изложена на № страницах, содержит 7~ таблиц и 3cf рисунка. Список литературы включает 2^/6 источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследовали влияние ПСС на различные тест-системы: клеточная культура, эмбриональные клетки, организм в стрессовых условиях (предельная физическая работоспособность мышей линии CD-I), гипертензивные крысы SHR.

I. Тест-система - клеточная культура.

В работе были использованы эпителиальные клетки линии НЕр-2 (первичный источник - эпидермоидная карцинома гортани), культура фибробластов линии ЗТЗ clone NIH и линии NCTC clone L929. Клетки линии НЕр-2 культивировали в среде ДМЕМ/К12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; FBS HyClone) и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% С02. Культуры фибробластов культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% ЭТС. Клетки высевали на поверхность 96-луночных планшетов с плотностью 20 тыс.кл/см2. Число параллельных экспериментов составляло не менее трех. Эксперименты проводились с учетом тепловых измерений, нагрев среды не превышал десятых градуса. Работа проведена совместно с к.ф-м.н. Давыдовой Г.А. на базе Лаб. роста клеток и тканей Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Облучение клеток.

1. Для определения полулетальной дозы облучения СС клетки были облучены однократно в течение 2 с. (0,26 Дж/см2), 50 с. (6,5 Дж/см2), 150 с. (19 Дж/см2), 600 с. (77,6 Дж/см2), 1200 с. (155 Дж/см2).

2. Планшет с культурой был поделен на 5 групп: 1) интактный контроль; 2) контроль с диметилсульфоксидом (ДМСО); 3) облучение «солнечным светом» - СС (19 Дж/см2; 140 е.); 4) облучение «солнечным светом» без УФ-компоненты - СС-УФ (12,8 Дж/см2; 600 е.), 5) облучение преобразованным солнечным светом - ПСС (13,3

Дж/см2; 600 е.). Клетки были облучены на расстоянии 15 см от светового источника. Через сутки после облучения определяли жизнеспособность клеток.

Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста, основанного на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) митохондриальиыми и цитоплазматическими дегидрогеназами метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, растворимого в ДМСО. Развитие окраски регистрировали измеряя оптическую плотность при длине волны 540 нм с помощью фотометра (модель 680 BIO-RAD, США).

II. Тест-система - эмбриональные клетки.

В работе с эмбрионами было использовано свыше 200 зародышей мышей CBAxC57BL/6 (Питомник лабораторных животных; п. Столбовая). Работа проведена совместно с к.б.н. Чайлахян Т.А. на базе Лаб. биофизики клетки и межклеточных взаимодействий Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Выделение и культивирование эмбрионов. Суперовуляцию самок мышей линии СБА стимулировали по стандартной методике (Манк, 1990) инъекцией гормона Folligon (содержит сывороточный гонадотропин жеребых кобыл; действующее вещество со свойствами фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов; Intervet International B.V., Нидерланды) и через 44 ч инъецировали гормон HCG (хорионический гонадотропин человека; Sigma).

Самок подсаживали к самцам в вечерние часы. На следующий день в утром проверяли наличие копулятивной пробки, свидетельствующей о произошедшем спаривании. День обнаружения копулятивной пробки принимали за первый день беременности. 2-клеточных эмбрионов вымывали на второй день беременности из яйцеводов самок, которых забивали с помощью цервикальной дислокации (Манк, 1990). Группы из 10-15 эмбрионов помещали в отдельные пластиковые 4-х луночные планшеты (Nunc Gibco Europe Ltd). Для манипулирования с эмбрионами использовали среду М2 (Sigma, содержит HEPES), культивировали в среде М16 (Sigma) в инкубаторе С02 Binder. За развитием зародышей наблюдали с . 12-24 ч интервалом в течение 4 суток. Определяли общее количество зародышей, полностью прошедших доимплантационное развитие и сформировавших бластоцисты, количество бластоцист, выходящих из оболочки оплодотворения (блестящая оболочка, zona pellucida), т.е. готовых к дальнейшему этапу развития - имплантации в стенку матки, и количество бластоцист с аномальным строением.

Облучение эмбрионов. Зиготы мышей разделяли на 3 группы. Первую контрольную группу сформировали из интактных зигот, во второй группе зиготы облучали однократно СС-УФ (7,5 мин. - 9,6 Дж/см2; 15 мин,- 19,2 Дж/см2; 37,5 мин. -48 Дж/см2), в третьей группе - ПСС (7,5 мин. - 9,9 Дж/см2; 15 мин. - 20 Дж/см2; 37,5 мин. - 50 Дж/см2).

III. Тест-система - мыши линии CD-I.

Исследование проводилось на 45 самцах мышей линии CD-I (3 мес., вес 30±5 г.; питомник лабораторных животных «Пущино» Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН), содержащихся в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде. Мыши были поделены на 3 группы: первая - контрольная группа, во второй - животных облучали СС-УФ (30,6 Дж/см2), в третьей - ПСС (31,1 Дж/см2). У всех животных перед облучением со

спины удаляли шерсть. Облучали животных ежедневно по 30 мин в день в течение 16 дней. При этом, оцененная плотность потока дополнительной оранжево-красной компоненты составляет 1,5 Вт/м2, т.е. доза облучения за счет люминесцентной компоненты составляет 0,5 Дж/см", которая находится в диапазоне терапевтических доз при лечении различных заболеваний у человека (Hamblin, 2008).

В качестве теста по определению физической работоспособности использовали плавание до отказа с отягощением 7% от массы тела мыши (Бобков, 1984). Регистрировали предельное время плавания, которое отмеряли от момента помещения животного в сосуд с термостатируемой водой (28°С) до критического времени погружения под воду (7 сек). Плавательный тест проводили через день спустя 30 мин после сеанса облучения.

Электронная микроскопия.

Образцы субэндокардиального отдела левого желудочка миокарда фиксировали в течение 24 часов в забуференном растворе 2,5% глутарового альдегида (рН 7,3), затем в течение двух часов дофиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия. После дегидратации в восходящем ряду спиртов и ацетоне заливали в эпон-812. Ультратонкие срезы, ориентированные поперечно, получали с помощью ультратома LKB-3 и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Срезы просматривали и фотографировали в электронном микроскопе Tesla BS-500 при увеличении ЮОООх. С помощью программы Reconstruct (версия 1.0.3.2.) измеряли следующие параметры: относительную площадь сечения саркоплазматического ретикулума; миофибрилл; митохондрий (рис. 1).

Рисунок 1. Структура кардиомиоцита мыши линии CD-1. МФ - миофибриллы; МТ -митохондрии; CP -саркоплазматический ретикулум.

Работа проведена на базе лаб. ультраструктуры нейрона Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

IV. Тест-система - гипертензивные крысы.

Исследование проводилось на самцах гипертензивных крыс линии SHR (Spontaneously Hypertensive Rat) и нормотензивных крыс WKY (Wistar-Kyoto) (питомник лабораторных животных «Пущино» Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН), содержащихся в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде. Работа проведена на 42 крысах SHR (3 мес., вес 300±50 г.), 14 крысах Wistar-Kyoto (3 мес., вес 300±50 г.). У гипертензивных крыс с 3-х мес. стабильно наблюдается повышенное артериальное давление (175±9 мм.рт.ст.), в отличие от нормотензивных крыс (115-130 мм.рт.ст.). У всех животных перед облучением со спины удаляли шерсть.

Облучение светодиодной матрицей. Гипертензивные крысы SHR облучали в течение 13 дней по часу в день фотонной матрицей Коробова «Барва-Флекс» (1

1№: :МТ.

Дж/см2), что соответствует терапевтической дозе облучения при лечении артериальной гипертензии данной матрицей (Тондий и др., 2008).

Облучение преобразованным солнечным светом. Животные были поделены на 4 группы. Первую группу сформировали контрольные нормотензивные \УКУ, вторую - контрольные гипертензивные БНЯ. В третьей группе крыс ЭНЯ облучали СС-УФ (30,6 Дж/см2), в четвертой группе - ПСС (31,1 Дж/см2). Облучали ежедневно по 30 мин в день в течение 16 дней.

Электрофизиология.

Выделенную из правого желудочка папиллярную мышцу (ПМ) животных помещали в термостатируемую (30 ± 1°С) камеру с проточным физиологическим раствором (рН 7,4). Раствор оксигенировали карбогеном: Ог (95 %) и СО? (5 %). Диаметр препаратов ПМ варьировал от 0,7 до 1,3 мм, длина - от 1,2 до 1,8 мм. Зависимость силы сокращения от частоты подаваемых электрических импульсов исследовали в интервале частот от 0,1 до 1 Гц. Потенциация сокращения паузой тестировалась для частот стимуляции 0,3 и 0,5 Гц. Длительность паузы составляла 60 сек. Измеряли кинетические характеристики изометрического сокращения ПМ: время достижения максимума (ВДМ) и время полурасслабления (ВР5|)) (рис. 2).

Рисунок 2. Схема изометрического сокращения ПМ сердца крысы. На графике обозначены время достижения максимума (ВДМ) и время полурасслабления (ВР5о).

Работа проведена совместно с к.б.н. Захаровой Н.М. на базе лаб. исследования механизмов гипометаболических состояний Института Биофизики клетки РАН.

V. Определение концентраций АФК в водном растворе.

На бидистилированную воду, насыщенную воздухом в течение суток, воздействовали СС-УФ (24,8 Дж/см2) и ПСС (25 Дж/см2). Для количественного определения Н2Ог использовали метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол-4-йодфенол-пероксидазы хрена (Черников и др., 2007; Гудков и др., 2010). Интенсивность хемилюминесценции измеряли жидкостным сцинтилляционным счетчиком Бета-1 («Медаппаратура», Украина). Калибровку измерений осуществляли с помощью Н2Ог известной концентрации. Гидроксильные радикалы определяли с помощью флуоресцентного зонда - кумарин-3-карбоновой кислоты. Флуоресценция проб измерялась на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían, США) при )ъ<,х=400 нм и ^•ет=450 нм. Калибровку результатов осуществляли растворами 7-гидроксикумарин-З-карбоновой кислоты известной концентрации (Гудков и др., 2006). Работа проведена совместно с к.б.н. Гудковым С. на базе лаб. изотопных исследований Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Определение жизнеспособности фибробластов в зависимости от концентрации перекиси водорода.

Нами были выбраны дозировки 50 нМ, 100 нМ, 500 нМ, 3 мкМ, 15 мкМ, 150 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ, 1 мМ, 5мМ перекиси водорода. Перекись водорода (19,5 М)

была внесена в среду с фибробластами линии NCTC clone L929, время инкубации 60 мин, после среда была замещена чистой, а на следующий день был проведен МТТ-тест.

Статистический анализ.

Статистический расчет и построение графиков производили с помощью программы Excel 2007 и Sigma Plot 11.0. Для сравнения данных применяли параметрический критерий Стьюдента (t-test), непараметрический критерий Манни-Уитни (U-критерий), для уровня значимости р<0,001 и р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние преобразованного солнечного света на жизнеспособность эпителиальных клеток линии НЕр-2 и культуры фибробластов ЗТЗ clone N1H.

Сравнение данных активности митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ показало, что облучение «солнечным светом» (СС) носит дозозависимый характер, в дозе 155 Дж/см (1200 сек) приводит к гибели 80-90% клеток обоих культур. Наименьшая доза (2 сек; 0,25 Дж/см2) является не эффективной для данных клеток. Облучение СС в дозе 19 Дж/см2 приводит к гибели 50% клеток обоих типов культур, т.е. является полулетальной дозой (LD50).

Наши эксперименты показали, что экран, поглощающий УФ-компоненту, защищает от вредного действия СС (LDS0), при этом наблюдается незначительное снижение жизнеспособности клеток обоих культур (на 17% по сравнению с

Рисунок 3. Показатели жизнеспособности эпителиальных клеток НЕр-2 и культуры фибробластов ЗТЗ clone N111 по данным МТТ-теста при различных способах облучения. *- достоверное отличие по отношению к контролю,

который принят за 100%, # -сравнение СС и контроля; & - ПСС по сравнению с СС-УФ (M±SEM, t - test, р<0,05).

Облучение ПСС оказывает защитное действие на фибробласты линии ЗТЗ (р<0,05) и клети линии НЕр-2 (р>0,05), по сравнению с облучением СС-УФ. Кроме

того, при облучении ПСС культуры фибробластов линии ЗТЗ clone NIH наблюдается не только увеличение выживаемости клеток, но и стимуляция роста по сравнению с интактным контролем (на 20%, р<0,05). Это является положительным моментом, поскольку ПСС оказывал стимулирующее и пролиферативное действие на фибробласты, не способствовал росту клеток карциномного происхождения (НЕр-2).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что возможно, ПСС активируют сигнальные пути, приводящие к увеличению жизнеспособности клеток, что согласуется с литературными данными (например, АФК/Эгс-каскад, Zhang et al., 2008).

2. Влияние преобразованного солнечного света на преднмплантацпонное эмбриональное развитие зародышей мышей в условиях in vitro.

Известно, что доимплантационное эмбриональное развитие очень чувствительно к действию различных физических факторов, в том числе и к влиянию оптического излучения (Oh et al., 2007).

Первоначально определили оптимальную дозу облучения ПСС. Как видно из табл. 1, облучение ПСС в течение 7,5 мин не приводит к достоверному увеличению количества бластоцист с выходом из блестящей оболочки, по сравнению с облучением СС-УФ. Наибольшая доза - 37,5 мин облучения, как СС-УФ, так и ПСС, для доимплантационного развития зародышей мышей является вредной, количество сформировавшихся бластоцист резко снижается при увеличении продолжительности облучения.

Наблюдение за эмбриональным развитием зародышей in vitro после облучения в течение 15 мин показало, что данная временная экспозиция наиболее эффективна (табл. 1).

Через 48 ч культивирования среди зародышей в контроле наблюдали в основном 8-клеточные морулы, после облучения СС-УФ были 10-12 клеточные морулы; после действия ПСС - 16-клеточные морулы.

Спустя 72 ч культивирования в контроле были в основном морулы с кавитацией и ранние бластоцисты (36,9% от общего числа зародышей). Среди зародышей, облученных ПСС и СС-УФ были преимущественно зрелые бластоцисты.

Через 96 ч культивирования в контроле наблюдались морулы (27%), в тоже время как у большинства зрелых бластоцист в группе облученных ПСС (94 %, р<0,05)

отмечались уже выходы из блестящей оболочки (82%; р<0,05), причем их было значительно больше, чем в группе облученных СС-УФ (45,7%).

Таблица 1. Анализ бластоцист, сформировавшихся при различных способах и продолжительности облучения при последующем культивировании доимплантационных эмбрионов (результаты 96 ч культивирования в условиях in vitro). _

Группа Общее Общее количество Бластоцисты, Аномально

количест- сформировавшихся выходящие из zona развитые

во бластоцист pellucida, от общего эмбрионы от

эмбрио- количества общего

нов количества

Кол-во % Кол-во % Кол-во %

7,5 мин

Контроль 29 12 41 6 21 11 37,9

СС-УФ 35 23 66 12 34 12 34

ПСС 34 27 79 11 32 12 35

15 Mill!

Контроль 31 21 68 9 29 8 26

СС-УФ 35 26 74 16 45,7 8 23

ПСС 33 31 94* 27 82* 2 6*

37,5 мни

Контроль 32 16 50 6 19 10 31

СС-УФ 30 8 27* - - 13 43

ПСС 31 3 10* 1 3* 20 64,5*

* достоверное различие по отношению к контролю, р<0,05 (U-критерий).

Увеличение количества бластоцист с выходом из блестящей оболочки после облучения ПСС в выбранной дозе можно объяснить тем, что в облученных зиготах происходит активизация ядерного аппарата клеток и биосинтетических процессов (Зубкова и Крылов, 1976), увеличение продукции макроэргических соединений (Девятков и др., 1987; РаязагеПа е! а1., 1984) и др.

Как известно, только часть зародышей млекопитающих развивается до рождения. У мышей погибает до 40% эмбрионов, причем две трети случаев гибели приходится на начальный, доимплантационный период развития (Межевикина и др., 1991). Наблюдение за развитием эмбрионов выявило интересный факт - образование аномальных клеток зависит от времени облучения (табл. 1). Процент аномально

развитых эмбрионов при облучении в течение 7,5 мин был на уровне контроля, как в группе ПСС, так и в СС-УФ. Облучение эмбрионов СС-УФ в течение 15 мин, наоборот приводит к увеличению количества аномально развитых эмбрионов, в то время как облучение ПСС приводит к достоверному снижению по сравнению с группой СС-УФ и контрольными показателями. Облучение в течение 37,5 мин приводит к значительному повышению числа аномальных эмбриональных клеток в обоих облученных группах, по сравнению с контролем, это также свидетельствует о том, что данная временная экспозиция облучения является повреждающей для постимплантационного развития зародышей мышей.

Таким образом, облучение ПСС в дозе 19.8 Дж/см2 увеличивает жизнеспособность эмбрионов, способствует образованию и «выклевыванию» зрелых бластоцист и уменьшает количество аномально развитых бластоцист в условиях in vitro.

3.1. Влияние преобразованного солнечного света на физическую работоспособность мышей,

В течение двух месяцев адаптировали мышей к плавательным нагрузкам. Продолжительность плавания за этот период возрастает в четыре раза (с 70 до 280 сек) и сохраняется стабильной перед курсом облучения (рис. 4, начальный период). Адаптация к нагрузкам необходима для выявления изменений физической работоспособности животных в результате проведенного курса облучения, а не из-за тренированности. В первую половину курса (8 дней) не выявлено значительных различий между показателями в группах животных (рис. 4). Последующее 8-ми дневное облучение ПСС приводит к достоверному увеличению продолжительности плавания (на 35% по сравнению с группой СС-УФ). Увеличение только с шестого дня после начала облучения может быть объяснено необходимым временем наработки мышечных белков в ходе адаптации к действию ПСС на организм (Самойлов, 2000; Вихлянцев и др., 2007). Повышенный уровень физической работоспособности сохраняется в течение 6 дней после завершения курса облучения ПСС.

J) 200

г §

с о

Нач. До облучения период сс.уф 1ПСС

i ■>;;;■< 8-Облучение

После облучения

Рисунок 4. Влияние облучения на физическую работоспособность мышей CD-I в тесте плавания до отказа. * -достоверное отличие в продолжительности плавания между группами (р<0,05, t-test, MiSEM).

Стоит отметить, что прирост физической работоспособности наблюдается у натренированных животных, при этом согласно литературным данным, даже небольшой прирост работоспособности у действующего спортсмена считается хорошим результатом (Сейфулла и Орджоникидзе, 2003).

Повышение физической работоспособности в условиях тренировки под влиянием воздействия ПСС и отсутствие нарушений работоспособности при действии предельных физических нагрузок может свидетельствовать о том, что воздействие ПСС способствует повышению функциональных резервов организма (Каплан и др., 1990).

3.2. Влияние преобразованного солнечного света на структурные характеристики клеток сердечной мышцы мышей.

В результате электронно-микроскопического анализа в кардиомиоцитах (КМЦ) левого желудочка интактных мышей обнаружен характерный набор цитоплазматических органелл: развитый миофибриллярный аппарат, саркоплазматический ретикулум, представленный канальцами и цистернами, митохондрии с четко выраженными кристами, преимущественно округлой формы, располагающиеся между миофибриллами и в околоядерной зоне.

Сравнительный анализ клеток миокарда тренированных мышей из группы,

облучающихся СС-УФ, по сравнению с интактными животными, выявил ряд

существенных отличий. Встречаются КМЦ с признаками явного структурного

нарушения, таких как набухание митохондрий, просветление матрикса, частичная

фрагментация и дезорганизация крист, неравномерное сокращение миофиламентов, в

ряде случаев разупорядочение их структур, а цистерны саркоплазматического ретикулума в таких клетках сильно расширены. Это свидетельствует о возможном предпатологическом состоянии КМЦ, что обычно наблюдается при повышенных физических нагрузках (Самойлов, 2000).

г?

Митохондрии Миофибриллы ■ Контроль СС-УФ и ПСС

СПР

Рисунок 5. Влияние разных способов облучения на относительную площадь сечения митохондрий,

миофибрилли саркоплазматического

ретикулума по отношению к контролю

(принят за 100%). * достоверное различие по отношению к контролю, (р<0,05; и-критерий).

Количественный ультраструктурный анализ КМЦ мышей, облучающихся СС-УФ, выявляет незначительное увеличение относительной площади сечения митохондрий (на 11%), ретикулума (на 13%), миофиламентов (на 14%), по сравнению с контрольными животными (рис. 5).

При облучении ПСС КМЦ с признаками структурного нарушения встречаются реже, чем при облучении СС-УФ. Облучение мышей ПСС приводит к улучшению морфологического состояния митохондрий; относительная площадь сечения достоверно увеличивается более чем на 27% (р < 0,05), по сравнению с контрольными животными (рис. 5). Отмечаются скопления митохондрий, преимущественно небольшого размера в центральных областях клеток и околоядерной зоне. Также значительно увеличиваются объемы саркоплазматического ретикулума (на 23,7%, р < 0,05) и миофибриллярного аппарата (на 19,4%; р >0.05). Увеличение относительных площадей сечения этих органелл может служить основой для обеспечения требуемой функциональной активности сердечной мышцы в условиях интенсивного физического напряжения (Меерсон и Пшенникова, 1988; Перелыгина, 1999).

4.1. Влияние облучения преобразованным солнечным светом н светодиодной матрицей на функциональные характеристики сердечной мышцы крыс.

Электрофизиологические данные свидетельствуют о том, что у контрольных гипертензивных крыс линии SHR сила изометрического сокращения папиллярной мышцы (ПМ) была на 30% выше, чем у нормотензнвных животных, что, по мнению ряда авторов, объясняется нарушением кальциевого гомеостаза в клетке (Manso et al., 1999). Другие показатели сокращения - временные параметры изометрического сокращения ПМ у контрольных крыс также превышают значения нормотензнвных крыс (рис. 6), что, по-видимому, обусловлено нарушением работы саркоплазматического ретикулума в миоцитах (Sliibata and Ghishan, 1990; Manso et al., 1999).

Хроническое облучение СС-УФ гипертензивных крыс ведет к дальнейшему увеличению временных параметров сокращения ПМ (рис. б). А В

SHR, контроль

SHR, СС-УФ SHR, ПСС

SHR, SHR, СС-УФ SHR, ПСС контроль

Рисунок 6. Кинетические характеристики изометрического сокращения папиллярной мышцы крыс. А - время достижения максимума, В - время полу расслабления. * - сравнение значений между \VK_Y и БНК, облученными преобразованным солнечным светом; # -сравнение значений контрольными ЭНЯ и ЭНЯ, облученными преобразованным солнечным светом (р<0,05, и-критерий).

Облучение ПСС, наоборот, приводит к снижению временных параметров сокращения в среднем более чем на 20% (р<0,05), по сравнению с контрольными гипертензивными крысами, достигая значений, характерных для нормотензивных крыс \УКУ (рис. б). Таким образом, было установлено, что воздействие ПСС способствует нормализации сократительной активности ПМ гипертензивных крыс.

Эффект потенциации паузой (77/7).

Эффект потенциации паузой (амплитуда первого после паузы сокращения) у нормотензивных крыс выражается в увеличении сокращения ПМ на 18±9% по отношению к базовой величине сокращения (рис. 7). У гипертензивных крыс этот эффект не наблюдается, что косвенно свидетельствует об уменьшении буферной емкости саркоплазматического ретикулума (Manso et al., 1999). Однако, после облучения ПСС и светодиодной матрицей эффект потенциации паузой становится более выраженным и сравнимым с эффектом обнаруженным у нормотензивных крыс.

Рисунок 7. Эффект потенциации паузой у крыс. * - достоверное различие по отношению к контролю (р<0,05; !_)-критерий).

Если принять во внимание, что величина ПП является косвенным показателем содержания кальция в саркоплазматическом ретикулуме (Lukas and Bose, 1986), и, что у гипертензивных крыс заведомо более низкое освобождение кальция из ретикулума по сравнению с нормотензивными крысами (Perez et al., 1993), то можно предположить, что облучение крыс in situ действует таким образом, что функционирование ретикулума в КМЦ гипертензивных крыс становится близким к состоянию здоровых животных.

4.2. Ультраструктурный анализ миокарда крыс после облучении преобразованного солнечного свста и светодиодной матрицей.

Строение КМЦ нормотензивных крыс имеет типичные характеристики сократительных кардиомиоцитов. У гипертензивных крыс по сравнению с нормотензивными наблюдается гипертрофия миокарда, которая обусловлена утолщением соединительной ткани и саркоплазмы. Часто наблюдаются клетки с очаговой деструкцией крист митохондрий и нарушением продольной ориентации миофибрилл.

Длительное облучение гипертензивных крыс СС-УФ негативно влияет на структуру кардиомиоцитов. Наблюдается отек миофибрилл и их разволокнение. В структуре многих митохондрий встречаются патологические изменения: набухание, разрывы внутренней и внешних мембран с частичной деградацией митохондрий. Эти данные свидетельствуют о негативном воздействии продолжительного курса облучения СС-УФ, Относительная площадь сечения саркоплазматического ретикулума увеличивается на 34% по сравнению с контролем (р>0,05) (рис.8).

Рисунок 8. Влияние различных видов облучения на относительную площадь сечения саркоплазматического

ретикулума: *,#,&- достоверное различие по отношению к контролю, который принят за 100% (р<0,05; и-критерий).

Облучение ПСС существенно влияет на структуру кардиомиоцитов. Это проявляется в улучшении морфологического состояния всех органелл. Хотя мы не обнаружили увеличения относительной площади профилей митохондрий и миофиламентов по отношению к значениям, полученных у контрольных крыс, следует отметить отсутствие патологических изменений в их структуре. Основное изменение претерпевает структура ретикулума, его размеры увеличиваются почти в 2 раза (р<0,05) (рис. 8).

Как известно, основной вклад в удаление кальция из цитоплазмы после стимуляции у крыс и мышей, в отличие от других млекопитающих, вносит саркоплазматический ретикулум, который поглощает до 90% этих ионов (Вегэ, 2000). У контрольных гипертензивных крыс он представлен короткими канальцами и малочисленными цистернами, его площадь была почти в 3 раза меньше, по сравнению с показателями у нормотензивных крыс (рис. 8). Увеличение площади сечения ретикулума после облучения ПСС, возможно, ведет к пропорциональному росту кальцийпоглощающих возможностей ретикулума. Это в свою очередь

воо

250 200 150 100

5НЯ, БНР, СС- Бит, ПСС БНИ, 1.ЕО контроль УФ

положительно сказывается на работе мышцы, а именно на уменьшении времени сокращения и расслабления, что показано в электрофизиологических экспериментах.

После облучения светодиодной матрицей также наблюдается достоверное двукратное увеличение относительной площади сечения саркоплазматичсского ретикулума (р<0,05) (рис. 8).

Рассматривая данные полученные в экспериментах с использованием облучения через светопреобразующие экраны и светодиодной матрицей, мы обнаружили сопоставимые результаты, как в электрофизиологических, так и в ультраструктурных исследованиях. Это позволяет предположить возможность использования светопреобразующих материалов в медицине и амбулаторпо, как альтернативу применения традиционно используемых в клинике источников красного света.

5. Влияние преобразованного солнечного света на образование АФК

Известно, что большие концентрации АФК могут привести к повреждению ДНК, белков и липидов, апоптозу и некрозу, к возникновению и злокачественной трансформации раковых клеток (Day and Suzuki, 2006; Fruehauf and Meyskens, 2007). Однако, как было недавно установлено, малые концентрации АФК являются вторичными мессенджерами, стимулируют клеточный рост и увеличивают жизнеспособность клеток (Day and Suzuki, 2006).

Как показали наши данные, сверхмалые концентрации перекиси водорода (50500 нМ) не влияют на фибробласты NCTC clone L929, при этом большие концентрации (>150 мкмМ) приводят к значительному снижению жизнеспособности клеток (рис. 9). Примечательно, что доза 3 мкМ является стимулирующей, вызывая прирост жизнеспособности по сравнению с интактным контролем на 59% (р<0,05).

Рисунок 9. Показатели жизнеспособности фибробластов NCTC clone L929 по данным МТТ-теста при различных концентрациях перекиси водорода. За 100% приняты показатели контроля,

обозначен линией. * - по сравнению с контролем (р<0,05, t-test, MiSEM).

В качестве одной из главных физических мишеней действия низкоинтенсивного оптического излучения в живых системах можно рассматривать воду, которая является основной структурной компонентой живой клетки. Поэтому необходимо было установить количество АФК, образующихся в воде под действием ПСС. В наших экспериментах было установлено, что при облучении ПСС наблюдается увеличение образования АФК в воде (рис. 10). При этом перекиси водорода при облучении ПСС образуется в три раза больше по сравнению с СС-УФ (30 нМ, р<0,05).

Рисунок 10. Образование перекиси водорода (Н2О2) и гидроксильных радикалов (ОН") в воде под воздействием ПСС и СС-УФ в течении 30 мин. * - группой «ПСС» и «СС-УФ».

(р<0,05;Мез1, М±8ЕМ).

Полученные результаты позволяют предположить, что в рассматриваемом случае, ПСС, возможно, действует посредством образования сверхмалых концентраций АФК, которые активируют сигнальные пути, приводящие к увеличению жизнеспособности клеток.

о S? х

g 150 о;

Ч 50 100 500 3 15 150 400 500 1 5

нМ нМ нМ мкМ мкМ мкМ мкМ мкМ мМ мМ Концентрация НгО,

,05).

Н202 ОН-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

В настоящее время существует огромное количество работ, посвященных воздействию солнечного света и отдельных участков его спектра. Однако оставался неизвестным тот факт насколько сильно могут изменяться эти эффекты при добавлении небольшой дополнительной оранжево-красной компоненты к солнечному свету (Хтах=626 нм). Как было обнаружено ранее, светопреобразующие материалы очень эффективны для стимуляции ростовых процессов у растений при естественном солнечном освещении (Кособрюхов и др., 2000), также показана фотостимуляция репаративных процессов у человека (Воробьев, 1998). Наша работа впервые посвящена исследованию воздействия преобразованного солнечного света (ПСС) на биологические объекты разного уровня организации.

В серии опытов по исследованию жизнеспособности при облучении ПСС культуры фибробластов линии ЗТЗ clone NIH обнаружено увеличение выживаемости клеток на 20% больше (р<0,05), по сравнению с интактным контролем. Также, в ходе работы найден оптимальный режим облучения ПСС, при котором наблюдается увеличение количества выходов бластоцист из блестящей оболочки, при этом стоит отметить, что уменьшается количество аномально развивающихся клеток.

Показано, что ПСС приводит к увеличению физической работоспособности мышей. Выявленные качественные и количественные изменения в соотношениях саркоплазматического ретикулума, миофибрилл и митохондрий в миоцитах, что указывают на развитие адаптативно-компенсаторных процессов, ведущих к активации биосинтетических процессов и возрастанию энергетического потенциала сердечной мышцы, увеличивающих ее функциональные возможности.

Как известно, основной вклад в удалении кальция из цитоплазмы после стимуляции у крыс и мышей, в отличие от других млекопитающих, вносит саркоплазматический ретикулум, который поглощает до 90% этих ионов (Bers, 2000). Облучение ПСС гипертензивных крыс приводит к значительному увеличению относительной площади сечения саркоплазматического ретикулума, что, возможно, ведет к пропорциональному росту его кальций-поглощающих возможностей. Это в свою очередь сказывается на работе папиллярной мышцы, а именно на улучшении кинетических характеристик ее сократительной способности.

В работе впервые сопоставлены эффекты, наблюдаемые после курсов облучения светодиодной матрицей и светопреобразующих материалов. По литературным

данным, биостимуляция клеток, в частности стимуляция синтеза ДНК, вызванная облучением клеток непрерывным красным светом (Х.=633 нм), практически не зависит от источника излучения, т.е. эффект биостимуляции не связан с когерентностью излучения (Кару и др., 1982). Аналогичные данные получены и другими исследователями (Лобко и др., 1985; Клебанов и др., 2006; Vinck et al., 2002). Поэтому можно предположить, что светопреобразугощие материалы могут служить также альтернативой низкоинтенсивному лазерному излучению (НИЛИ) в красном диапазоне спектра.

Одна из гипотез, объясняющих эффекты красного света, основывается на предположении об участии в этом процессе активных форм кислорода (АФК), как возможных регуляторов внутриклеточных реакций. Согласно литературным данным, при умеренном синтезе, АФК действуют как специфические сигнальные молекулы и участвуют в регуляции иммунных процессов, работы кровеносной, эндокринной и других физиологических систем (Турпаев, 2002; Thannickal and Fanburg, 2000). Также известно об образовании малых количеств АФК под действием видимого света (Гудков и др.. 2010; Eichler et al., 2005; Lavi et al., 2010). В нашей работе впервые были получены данные о том, что малые концентрации АФК приводят к увеличению жизнеспособности фибробластов NCTC clone L929. Учитывая, что под действием ПСС наблюдается увеличение образования сверхмалых концентраций АФК в воде, можно предположить, что ПСС, возможно, в ряде случаев действует посредством образования сверхмалых концентраций АФК, которые активируют сигнальные пути, приводящие к увеличению жизнеспособности клеток.

ВЫВОДЫ:

1. Преобразованный солнечный свет оказывает стимулирующие и пролиферативные действие па фибробласты линии ЗТЗ clone N1H, при этом не влияя на клетки эпидермоидной карциномы гортани линии НЕр-2.

2. Облучение преобразованным солнечным светом увеличивает жизнеспособность эмбрионов, способствует образованию и «выклевыванию» зрелых бластоцист и уменьшает количество аномально развитых бластоцист в условиях in vitro.

3. При облучении преобразованным солнечным светом наблюдается увеличение физической работоспособности мышей. Облучение преобразованным солнечным светом приводит к стимуляции морфогепетических процессов в кардиомиоцитах мышей, а именно к увеличению относительной площади сечения митохондрий, миофибрилл и саркоплазматического ретикулума.

4. Преобразованный солнечный свет нормализует сократительную активность папиллярных мышц гипертензивных крыс, приближая функциональные значения к характеристикам мышц нормотензивных животных. При этом улучшаются структурные характеристики КМЦ гипертензивных крыс, и наблюдается увеличение площади саркоплазматического ретикулума более чем в 2 раза. После облучения светодиодной матрицей, используемой в медицине, наблюдаются сопоставимые результаты.

5. Возможным механизмом облучения на клеточной культуре является образование малых доз АФК, которые, в свою очередь, запускают различные каскады клеточной трансдукции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1) Свиридова-Чайлахян Т.А., Паскевич С.И., Фахранурова Л.И., Храмов Р.Н., Манохин А.А., Симонова Н.Б., Чайлахян Л.М. Фотобиомодуляция люминесцентным излучением Хмах=62б им развития ранних эмбрионов мышей // Доклады РАН. 2007. том 417. №5. С.710-714.

2) Санталова И.М., Захарова Н.М., Храмов Р.Н., Краев И.В., Мурашев А.Н., Аверин А.С., Фахранурова Л.И. Структурно-функциональные изменения в миокарде гипертензивных крыс линии SHR, вызванные фотонным облучением // Биофизика. 2008. т. 53. С. 879-885.

3) Храмов Р.Н., Санталова И.М., Фахранурова JI.II., Манохин А.А., Симонова Н.Б., Ржевский Д.И., Мурашев А.Н. Стратегия «Полезное солнце» повышает физическую работоспособность и вызывает адаптивные структурные перестройки в миокарде мышей // Биофизика. 2010. т. 55. вып. 3. С. 507-513.

Сборники трудов научных конференции

1) Sviridova-Chailakhyan Т.A., Fakhranurova L.I., Paskevich S.I., Simonova N.B., Khraraov R.N., Manokhin A.A., Chailakhyan L.M. Photobiomodulation of early mouse embryo development // Biophotonics: Photonic solutions for better health care, Proc. of SPIE. 2008. Vol. 69991. P. 69912B-1 - 69912B-7.

2) Santalova I.M., Zakharova N.M., Khramov R.N., Kraev I.V., Murashev A.N., Averin A.S., Fakliranurova L.I. Positive changes in the miocardium of SHR rats induced by photon radiation // Biophotonics: Photonic solutions for better health care, Proc. of SPIE 2008. Vol. 6991. P. 699125-1 - 699125-8.

3) Khramov R.N., Fakhranurova L.I., Santalova I.M., Simonova N.B., Vikhlyantsev I.M., Karaduleva E.V., Manokhin A.A., Kreslavski V.D., Rzhevsky D.I., Murashev A.N., Vorobiev V.A. Novel "useful sun" strategy to improve physical endurance // Biophotonics: Photonic solutions for better health care, Proc. of SPIE. 2008. Vol. 6991. P. 6991 1Z1-69911Z7.

Тсзнсы научных конференции

1) Фахранурова Л.И., Храмов Р.Н., Санталова И.М. Новая технология фотобиостимуляции организма с помощью светопреобразующих материалов // Материалы 11-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», Пущино, 2007. С. 286.

2) Фахранурова Л.И., Свиридова-Чайлахян Т.А., Паскевич С.И., Храмов Р.Н. Фотобиомодуляция люминесцентным излучением (626 нм) развития ранних эмбрионов мышей // Материалы школы-конференции молодых ученых: «Биомедицинская инженерия-2007», Пущино, 2007. С. 20-24.

3) Фахранурова Л.И., Свиридова-Чайлахян Т.А., Храмов Р.Н. Фотобиостимуляция доимплантационного развития эмбрионов мышей in vitro // Материалы 12-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», Пущино, 2008. С. 187-188.

4) Фахранурова Л.И., Санталова И.М., Храмов Р.Н. Структурные изменения в миокарде гипертензивных крыс, вызванные фотонным облучением // 5-й

Международный конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 29 мая-3 июня 2009. с. 158.

5) Fakhranurova L.I., Khramov R.N., Santalova I.M., Rzhevsky D.I., Murashev A.N. New method for increase of physical endurance by light-converting materials // International Conference «Medical Radiations: Research and application», April 7-9 2010, Marrakech, Morocco.

6) Фахранурова Л.И., Храмов P.H. Влияние преобразованного солнечного света на жизнеспособность клеток // Сборник работ молодых ученых ИТЭБ РАН «Экспериментальная и теоретическая биофизика' 11», Пущино, 2011. С. 22.

Подписано в печать:

22.02.2012

Заказ № 6709 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фахранурова, Лилия Ильгизовна, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

61 12-3/654

На правах рукописи

Фахранурова Лилия Ильгизовна

Исследование биологических эффектов воздействия преобразованного солнечного света

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук

Храмов Р.Н., кандидат биологических наук Санталова И.М.

ПУЩИНО-2012

Глава 1. Общая характеристика работы 6

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

2.1. Источники красного света

2.2. Механизмы действия красного света 12

2.3. Эффекты светового воздействия на культуру клеток и 24 эмбриональное развитие

2.4. Эффекты светового воздействия на сердечно-сосудистую 25 систему

2.5. Эффекты светового воздействия на физическую 28 работоспособность

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3 0

3.1. Процедура облучения. Характеристики световых источников

3.2. Расчет доз излучения 32

3.3. Тест-система - клеточная культура 34

3.4. Тест-система - эмбриональные клетки 37

3.5. Тест-система - мыши линии CD-I 39

3.6. Тест-система - гипертензивные крысы 42

3.7. Определение концентрации АФК в водной среде 45 Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 47

4.1. Влияние преобразованного солнечного света на жизнеспособность клеток

4.1.1. Определение дозы солнечного света, оказывающего 47 повреждающее действие на клетки

4.1.2. Сравнительный анализ протекторного действия ПСС и 48

светодиодной матрицы на жизнеспособность клеток.

4.1.3. Определение действия ПСС на жизнеспособность 49 эпителиальных клеток линии НЕр-2 и культуры фибробластов ЗТЗ clone

NIH

4.1.4. Влияние различных способов облучения на 50 фибробласты линии NCTC clone

4.2. Влияние преобразованного солнечного света на 51 предимплантационное эмбриональное развитие зародышей мышей в условиях in vitro

4.2.1. Облучение СС-УФ (9,6 Дж/см2) и ПСС (9,9 Дж/см2) в 51 течение 7,5 мин

4.2.2. Облучение СС-УФ (19,2 Дж/см2) и ПСС (19,8 Дж/см2) в 52 течение 15 мин

4.2.3. Облучение СС-УФ (48 Дж/см2) и ПСС (50 Дж/см2) в 54 течение 37,5 мин

4.2.4. Количество аномально развитых эмбрионов в 55 зависимости от облучения

4.3. Влияние преобразованного солнечного света на 57 физическую работоспособность мышей и на структурные характеристики клеток сердечной мышцы

4.3.1. Влияние преобразованного солнечного света на физическую работоспособность мышей

4.3.2. Влияние преобразованного солнечного света на 58 структурные характеристики клеток сердечной мышцы мышей

4.4. Влияние облучения преобразованным солнечным светом и 60 светодиодной матрицей на функциональные характеристики сердечной мышцы гипертензивных крыс

4.4.1. Ультраструктурный анализ миокарда крыс после 63 облучения преобразованным солнечным светом и светодиодной матрицей

4.4.2. Ультраструктурный анализ миокарда крыс после 66 облучения светодиодной матрицей

4.4.3. Анализ капилляров субэндокарда левого желудочка 66

крыс

4.5. Изучение роли активных форм кислорода, как возможных 67 регуляторов действия преобразованного солнечного света на культуре

клеток фибробластов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 72

ВЫВОДЫ 74

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 75

Приложение 1. Анализ бластоцист, сформировавшихся при 100 различных способах и продолжительности облучения при культивировании доимплантационных эмбрионов (результаты 96 ч культивирования в условиях in vitro)

Приложение 2А. Динамика плавания мышей 101

Приложение 2В. Ультраструктура кардиомиоцитов левого 102

желудочка мышей

Приложение 3. Характеристики изометрических сокращений ПМ 103 нормотензивных и гипертензивных крыс

Приложение 4А. Ультраструктура кардиомиоцитов левого 104

желудочка крыс

Приложение 4В. Количественная морфологическая характеристика 106 паренхиматозно-стромальных взаимоотношений миокарда крыс

Приложение 5. Ультраструктура кардиомиоцитов левого 107

желудочка крыс, облученных светодиодной матрицей.

Список сокращений

СС - солнечный свет (моделируется с помощью ксеноновой лампы, спектр которой наиболее близок к солнечному спектру). СС-УФ - солнечный свет без УФ-компоненты.

ПСС - преобразованный солнечный свет (солнечный свет без УФ-компоненты, которая преобразована в дополнительную оранжево-красную компоненту, за счет действия фотолюминофора оксисульфида иттрия, активированного европием - Y202S(Eu)). УФ - ультрафиолетовое излучение. ИК - инфракрасное излучение. КМЦ - кардиомиоциты. СПР - саркоплазматический ретикулум. АФК - активные формы кислорода. МТ - митохондрии. МФ - миофибриллы. МТТ - метилтиазолтетразолий. ПОЛ - перекисное окисление липидов. ПП - потенциация покоем. ВР - время расслабления. ВДМ - время достижения максимума.

Глава 1. Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Электромагнитные поля оптического диапазона низкой интенсивности оказывают влияние на функциональное состояние живых клеток, тканей и на организм в целом, поэтому из года в год растет интерес к лечению различных заболеваний естественными и искусственно создаваемыми физическими факторами. Наиболее часто в фототерапии применяют низкоинтенсивное излучение лазеров и светодиодных ламп (Oliveira et al., 2008; Ablon, 2010). Альтернативой является источник белого света, излучение которого модулируется с помощью светофильтров (Кару и др., 1984; Монич и др., 1992; Saczko et al., 2005). Светофильтры на основе фотолюминофоров (светопреобразующие материалы) позволяют использовать весь солнечный спектр, при этом УФ-компонента преобразуется в дополнительную к солнечному спектру оранжево-красную компоненту (преобразованный солнечный свет - ПСС). В литературе имеются лишь единичные упоминания об использовании таких материалов для биомодуляции функций животных организмов, в частности при фотостимуляции репаративных процессов (Воробьев, 1998).

Многие исследователи, получая положительный ответ при действии красного света, отмечают, что механизм данного влияния на живые системы пока не известен (Кару, 2005; Lane, 2006; Hamblin, 2008). В настоящее время показано, что основными первичными реакциями после светопоглощения в клетках и их окружении являются поглощение световой энергией фотоакцепторами (каталазой, супероксиддисмутазой, цитохром с оксидазой и др.), образование активных формы кислорода (АФК), образование оксида азота (NO), временное повышение локальной температуры (Владимиров и др., 2004; Grzelak et al., 2001; Jou et al., 2002; Karu, 2008; Xu et al., 2008).

Данное исследование направлено на изучение воздействия преобразованного солнечного света с дополнительной оранжево-красного компонентой (Атаах=626 нм) на биологические системы разных уровней организации, что является актуальным не только для решения ряда задач биомедицины, но и для выявления фундаментальных законов взаимодействия света с организмом млекопитающих.

Цель и задачи исследования

Были поставлены задачи:

1. Исследовать влияние преобразованного солнечного света на жизнеспособность клеточных культур;

Научная новизна.

Впервые показано, что добавление люминесцентной оранжево-красной компоненты на А,тах=626 нм в состав солнечного света приводит к дозозависимому воздействию на жизнеспособность культивируемых in vitro клеток млекопитающих. Определены дозы светового воздействия, при которых

происходит угнетение (155 Дж/см при облучении СС) и повышение жизнеспособности клеток линии НЕр-2 и ЗТЗ clone N1H (13,3 Дж/см2 при облучении ПСС).

-у

Впервые установлено, что воздействие ПСС (31,1 Дж/см ) увеличивает физическую работоспособность мышей линии CD-I (на 35%) и стимулирует у них активацию морфообразовательных процессов в клетках сердечной мышцы (наблюдается увеличение относительной площади сечения митохондрий, саркоплазматического ретикулума и миофибрилл).

Научно-практическая значимость работы и внедрение результатов

исследования.

Полученные данные позволяют рекомендовать светопреобразующие материалы для использования в клинике и амбулаторно, как альтернативу применения других источников оранжево-красного света (светодиодная матрица, лазер). Светопреобразующие материалы могут найти применение при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, в восстановительной и спортивной медицине (для повышения физической работоспособности) и в репродуктивных технологиях (для повышения жизнеспособности и нормализации развития культивируемых in vitro эмбрионов).

Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 15 печатных работах, в том числе в 6 статьях.

2009), 11-я школа-конференция молодых ученых «Биомедицинская инженерия-2007» (Пущино, 2007), 5-й Международный конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2009), International Conference «Medical Radiations: Research and application» (Marrakech, Morocco,

2010), конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика'11» (Пущино, 2011).

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Источники красного света

Светолечение (фототерапия) традиционно используется в физиотерапии и косметологии. Первые публикации по данной теме относятся к концу XIX века. Так, монография Эдвина Бэббитта «Принципы света и цвета. Исцеляющая сила цвета» была опубликована в 1878 году. Несколько позже был издан целый ряд работ: «Светолечение» Н. Финзена (1901), «Применение света в медицине» В. Бика (1906), «Руководство по светолечению» В. Хаусманна (1929) (Кирьянова, 2003). Результаты клинических наблюдений и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что фототерапия оказывает генерализованное влияние на организм, вовлекая в ответную реакцию все его органы, ткани и функциональные системы. С развитием научно-технического прогресса появились искусственные источники света: лазеры, светодиодные лампы, лампы дневного света, имитирующие видимое излучение и др.

Лазерное излучение обладает свойствами: монохроматичностью (наличие в спектре источника световых волн преимущественно одной длины волны); когерентностью (упорядоченность распределения и совпадение фаз электромагнитных колебаний, усиливающих друг друга); высокой поляризацией (закономерное изменение направления и величины вектора излучения в плоскости, перпендикулярной световому лучу). С помощью лазеров можно получить монохроматическое излучение любой длины волны оптического диапазона: ультрафиолетового (УФ), видимого и инфракрасного (ИК) участка

спектра. В медицине используют лазерное излучение различной интенсивности:

2 6 2

высокоэнергетическое (высокоинтенсивное; 10-10 Вт/м ) излучение находит применение в хирургической практике для рассечения и разрушения тканей; среднеэнергетическое (среднеинтенсивное) - в косметологической практике; низкоэнергетическое (низкоинтенсивное; НИЛИ; около 0,1 Вт/см2) - в физиотерапии (Ремизов и др., 2007).

Монохроматический красный свет от наиболее распространенного источника в медицине гелий-неонового лазера (А,тах=632,8 нм) с успехом используют для лечения ран и язв (ЕеШ й а1., 2004; ЕгсИе е1 а1., 2008; ОНуека е1

al., 2008), дерматологических заболеваний (Ablon, 2010), ишемической болезни сердца (Malinovskaya et al., 1999, 2008; Корочкин и др., 2007), гипертонии (Князева и др., 1996) и др. заболеваниях.

В медицине наряду с лазерным излучением используют светодиодное излучение. Светодиоды или светоизлучающий диод (СД, СИД, LED, англ. Light-emitting diode) - полупроводниковый прибор с электронно-дырочным р-п переходом или контактом «металл - полупроводник», генерирующий (при прохождении через него электрического тока) оптическое (видимое) излучение. Излучаемый свет лежит в узком диапазоне спектра, его цветовые характеристики зависят от химического состава, использованного в нем полупроводника. Светодиоды излучают свет в относительно узкой полосе спектра, ширина которой составляет 20-50 нм. Такое узкополосное излучение называют «квазимонохроматическим» (Давиденко, 2004; Шмидт, 2007). В клинике светодиоды успешно применяются при лечении инфицированных, отеков, ожогов, травм и различных сердечно-сосудистых заболеваниях (Малиновская и др., 1999; Илларионов и Ларюшин, 2000; Desmet et al., 2006).

В биологических исследованиях используются светофильтры, которые выделяют определенную область спектра, а в качестве источника света применяются лампы разного типа (Минц и др., 1990; Jarmak et al., 1996; Saczko et al., 2005).

Будет ли зависеть конечный эффект от поляризации или когерентности света? Ряд авторов считает, что важна поляризация (Гуляр и Лиманский, 2006). Однако, Кару и др. в своих работах показали, что элементарные процессы (светопоглощение хромофора и фотохимия) не зависят от степени поляризации и когерентности света на примере стимуляции клеточной адгезии клеток HeLa (Лобко и др., 1985; Karu et al., 2008). Аналогичные данные показаны при сравнении эффективности действия когерентного и некогерентного излучений на скорость ПОЛ раневого экссудата крыс (Клебанов и др., 2006); на пролиферацию фибробластов (Vinck et al., 2002) и др.

2.2. Механизмы действия красного света

Несмотря на существование большого количества экспериментальных работ, посвященных применению красного света, механизм его биологического действия во многом остается неизвестным. Биофизика взаимодействия облучения с биологическими тканями определяется параметрами облучения (длина волны, интенсивность подачи энергии, режим облучения и т.п.), а также оптическими свойствами самих тканей, их водосодержанием, интенсивностью местного кровотока. Например, стенка кровеносных сосудов обладает значительным поглощением на длинах волн 193, 248 и 308 нм (Байбеков и др., 1991). Более эффективно воспринимают световую энергию точки акупунктуры (Лупырь и Самойлов, 1990; Илларионов, 1992; Козлов, 1999).

В диапазоне длин волн от 650 до 1200 нм наблюдается оптическая прозрачность биологических тканей. При этом большей проникающей способность обладают волны ближнего ИК-диапазона, глубина проникновения может достигать 40-70 мм. Для длин волн от 450 до 590 нм глубина проникновения луча равна примерно 0,5-2,5 мм (рис. 1) (Байбеков и др., 1991).

Падающий

Рисунок 1. Схема проникновения и прохождения фотонов в коже (Владимиров и Проскурнина, 2007).

Свет красного и/или ИК - спектра (>620 нм), проникая в кожу достаточно глубоко, достигает поверхностных микрососудов и может действовать на кровь, циркулирующую здесь с невысокой скоростью (Липатов и др., 2006).

При взаимодействии света с тканями имеют место обычные оптические эффекты, возникающие при прохождении фотона через различные среды (рис. 1). Небольшая часть падающего излучения (около 5%) отражается от ее поверхности из-за различия коэффициентов преломления света самой ткани и окружающей среды. Проникающее облучение подвергается многократному рассеив�

Информация о работе

Фахранурова, Лилия Ильгизовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование биологических эффектов воздействия преобразованного солнечного света - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы