Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов-деструкторов ароматических ксенобиотиков
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов-деструкторов ароматических ксенобиотиков"
ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ
бесплатный
ЭКЗЕМГШЯР
На правах рукописи
Хоменков Василий Григорьевич
Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов-деструкторов ароматических ксенобиотиков
Специальность 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2005
Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им А Н Баха РАН
Научный руководитель- доктор химических наук, профессор
В О. Попов
Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор
A.C. Степанов,
доктор биологических наук, профессор A.C. Яненко
Ведущая организация: Институт микробиологии им. С Н Виноградского PAV
Защита состоится «_»_2005 г. в_ч._мин. на заседании диссертационного совета К 002 247 01 по присвоению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им АН Баха РАН по адресу 119071 Москва, Ленинский проспект, дом 33, кор. 2
С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу 119071, г. Москва, Ленинский проспект, дом 33, кор 1
Автореферат разослан «_»_2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
Орловский А Ф
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы В условиях все возрастающей техногенной активности человека, все большую актуальность приобретает очиспса окружающей среды и, в частности, атмосферы от разнообразных загрязнителей Основной вклад в загрязнение воздух? вносят предприятия химической, цллюлозо-бумажной, лакокрасочной и пищевой промышленности, сельскохозяйственные и перерабатывающие предприятия, комплексы интенсивного животноводства, предприятия по очистке сточных вод и обезвреживанию отходов. Последние, являются источниками выбросов в атмосферу токсичных и пахучих веществ, которые даже в небольших концентрациях вызывают у людей чувство дискомфорта, создают угрозу для жизни и здоровья.
В связи с интенсивным развитием промышленной биотехнологии микробиологические методы все более широко применяются для очистки индустриальных вентиляционных выбросов, содержащих летучие органические соединения [Ficker М. et al, 1999, Roy S. et al., 2003, Greene E.A. et al., 2000; Christensen B.B et al., 2000; Melier S et al, 1998; Molin S. etal., 1998].
Применение микробиологических фильтров основывается на процессах деструкции органических субстратов-ксенобиотиков, что в конечном итоге приводит к образованию естественных продуктов (ССЬ и воды) В отличие от физико-химических методов очистки (каталитического и простого сжигания) при функционировании микробиологических фильтров не образуются хлор, окислы серы и азота. По сравнению с методами адсорбции и фильтрования через селективные мембраны, эксплуатация микробиологических фильтров не связана с накоплением отработанных мембран или сорбеетов, загрязненных устойчивыми токсичными соединениями Биофильтры эффективны, не загрязняют окружающую среду, просты в эксплуатации, поэтому могут широко использоваться в технологических процессах утилизации основного объема промышленных и бытовых органических загрязнителей
Применение микробиологической очистки воздушных выбросов в промышленных условиях нуждается в современных методах мониторинга состояния работающих систем, а также выявления и характеристики процессов, протекающих внутри работающих биофильтров Методы микробиологической идентификации и типирования культур, не утрачивая актуальности, в настоящее время уже не могут обеспечить достаточную точность и быстроту анализа
Развитие молекулярных методов идентификации микроорганизмов и их применение в таксономии и экологии позволяет наиболее адекватно применять методы геносистематики и молекулярной биологии на практике при анализе природных и промышленных микробных культур
Основное достоинство молекулярно-генетических методов типирования бактериальных культур и сообществ заключается в возможности видовой идентификации микроорганизмов, входящих в состав различных консорциумов без предварительного культивирования, и получения статистически достоверных данных о количественном и качественном составе таких консорциумов
Пели и задачи исследования Целью настоящей работы являлись отбор и адаптация новых культур-деструкторов различных ароматических ксенобиотиков, изучение при помощи методов геносистематики и молекулярной биологии видового состава, отобранных микроорганизмов, а так же определение их мсггайппичягкпго потенциала Для достижения поставленной цели необходимо было решоть следующи "
1 Отобрать новые устойчивые бактериальные культуры, адаптированные к утилизации следующих Л ОС' толуол, стирол, этилбензол, о- и м-ксилол, нафталин
2 Молекулярно-биологическими и микробиологическими методами качественно и количественно охарактеризовать состав микробных культур и консорциумов, способных успешно утилизировать указанные ЛОС в лабораторных условиях
3 Обнаружить и охарактеризовать последовательности генов ключевых ферментов метаболизма ЛОС в геноме изучаемых культур
4 Изучить специфическую активность обнаруженных ключевых ферментов у охарактеризованных культур
Научная новизна Выделены и идентифицированы новые культуры микроорганизмов, эффективно деградирующих ксенобиотики ароматического ряда
Определены и зарегистрированы в международной базе данных N031 нуклеотидные последовательности, кодирующие гены 168-рРНК у полученных культур Также определены и депонированы последовательности, кодирующие соответствующие ключевые 1,2-и 2,3- катехолдиоксигеназы - ключевые ферменты метаболических путей биодеградации ароматических соединений Подтверждена экспрессия клонированных генов ферментов в изучаемых культурах
Показано, что методы геносистематики и молекулярной биологии являются эффективным инструментом, пригодным для изучения видового состава микробных сообществ, осуществляющих биодеградацию различных ЛОС в промышленных условиях, позволяя детектировать наличие некультивируемых форм и единичных клеток в их составе Кроме того, данный подход является более экспрессным, по сравнению с методами классической микробиологии, применяемыми для решения круга сходных задач
Практическая значимость Вновь полученные культуры могут быть использованы в биофильтрах для очистки техногенных выбросов, содержащих соответствующие летучие органические соединения, либо их смеси Методы геносистематики могут найти широкое применение в областях микробиологии и прикладной биотехнологии, связанных с отбором микроорганизмов-деструкторов, а также определением их метаболических возможностей, как одного из основных факторов отбора Молекулярно-биологические методы позволяют осуществлять экспрессный мониторинг, как природных микробных сообществ, так и промышленных консорциумов микроорганизмов-деструкторов, сложившихся в процессе длительной работы инженерных систем биологической очистки воздушных выбросов от техногенных ксенобиотиков
Апробация Материалы диссертационной работы были доложены на П Московском международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва 10-14 ноября 2003 г; П Международной научной конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ ОХРАНЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ», Москва, 25-27 мая 2004,1 Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 24-26 ноября
2004 г; XVII зимней молодежной научной школы «ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ», Москва, 7-10 февраля
2005 г.; 1* International Conference of Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz (Spain), March 15-18" 2005.
Публикации По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов-введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы, список литературы (360 источников), и приложения Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков и 7 таблиц
Материалы и методы
1. Культивирование, отбор и адаптация бактериальных культур.
Исходно, для культивирования брались материалы из коллекции лаборатории Инженерной энзимологии Института биохимии им А Н. Баха, на основании которых формировались накопительные культуры
Для культивирования микроорганизмов-деструкторов использовали минеральную среду состава описанного ранее в работе [Уткин И Б и др 1991] Культивирование в жидкой среде осуществляли в колбах, пропуская через бактериальную суспензию при комнатной температуре воздух, содержащий пары соответствующих субстратов
Для проверки активности выделяемых культур и изучения основных закономерностей процесса очистки воздуха использовали лабораторные установки «мини-реактор» В качестве инертного носителя для иммобилизации изучаемых культур использовали капроновое волокно (диаметр волокна 0,3-0,4 мм, объем 25 см3). Для поддержания оптимальной влажности биокатализатора минимальную среду из емкости перистальтическим насосом подавали по каплям в реактор (примерно 1 объем в час), откуда ее избыток сливался в ту же емкость (по замкнутой системе) Воздух при помощи компрессора подавали через ротаметр в дозатор, где создавалась необходимая концентрация летучих органических соединений (ЛОС), и затем в реактор Скорость воздушного потока варьировали в диапазоне 10-50 л/ч.
Эффективность очистки воздуха определяли по разности концентраций органических субстратов на входе в мини-реактор и на выходе из него методом ГХ на хроматографе «JIXM-2000» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором; способ I расчета - нормализация по площади Колонки заполняли Chromaton N-AW-DWCS
(d=150 мкм), пропитанным 5% SE-30 Параметры колонок 200см х Змм Температура колонок 90°С, температура испарителя 150°С, температура детектора 220° Газ-носитель - аргон, 15 мл/мин
Микроскопический контроль осуществляли с помощью биологического бинокулярного микроскопа со встроенным осветителем «Биолар» SK-23 (PZO, Польша), аналог микроскопа «Mikmed-2 2» (Carl Zeis, Германия)
2 Выделение геномной ДНК изучаемых культур
Для выделения суммарной (тотальной) геномной ДНК культуры высевали газоном на чашки с агаризованной минеральной средой. Чашки помещали в атмосферу соответствующих ЛОС Культуры подращивали 48 час при 28*С, полученную биомассу смывали с поверхности агаризованной среды 1,5 мл стерильной минимальной
минеральной среды, помещали в пластиковую пробирку и проводили лизис клеток для выделения ДНК
При выделении ДНК культур использовали набор Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit (50) производства «V-Gene Biotechnology Ltd.» (Китай) по протоколу производителя.
3. Методика ПЦР-клонирования амплификатов ieS-рДНК последовательностей из тотальной ДНК культур.
1 ПЦР-клонирование генов 16S-rRNA Амплификация последовательностей генов 16S рРНК с целью получение тотальных амплификатов из геномов каждой из культур была проведена с помощью праймеров, структура которых ранее опубликована в работе [Anzai Y. et al, 2000]:
8F (5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'),
1492R (5' ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3').
Ожидаемый размер амплифицированной ДНК составлял 1465 п н Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась в 30 мкл общей смеси, содержащей 100 нг ДНК, 200 мк Молей дезоксирибонулесгтидфосфатов («Сибэнзим», Россия), 1.5 мМ MgCb («Sigma», США), 200 пмоль каждого праймера, 10 мкл 10Х Taq буфера (Proraega) и 2 5 U Taq полимеразы (Бионем, Москва). Полимеразная цепная реакция проводилась натермоциклере «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия) по следующей программе: 94°С -1 мин, и 25 циклов по 94°С -10 с, 60°С - 6 е., 72°С - 40 с. Хранение - 4°С
4. Методика разделения гомогенных амплификатов посредством молекулярного клонирования в векторную систему pGEM-T-Easy.
Для клонирования брали 3 мкл каждого ПЦР-продукта с концентрацией ДНК равной 2 пМ.
Клонирование в pGEM T-vector, которое осуществлялось по стандартному протоколу с использованием расходных материалов из набора для клонирования pGem *-Т Vector System I («Promega», США/
Селекция полученных клонов осуществлялась с помощью цветного чашечного теста на среде, содержащей ИПТГ (изопропил-р-тиогалактозид) и X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-(3-0-галактопиранозид) в качестве индуктора. Полученные первичные клоны, которые предположительно содержали вставку, были подвергнуты экспресс-скринингу посредством ПЦР с использованием в качестве матрицы материала рекомбинантных колоний Е. coli.
Выделение плазмидных ДНК- конструкций производилось с использованием набора Rapid PlasmidDNA Daily Mini-prep Kit (50) («V-Gene Biotechnology Limited»), no инструкции производителя Итоговая концентрация плазмидной ДНК каждой точки составляла 20 нг/мкл
5. Методика ПЦР-клонированяя амплификатов последовательностей ключевых ферментов путей утилизации ЛОС из тотальной Д НК культур.
ПЦР-клонирование генов катехол-1,2-диоксигеназы (С120) и катехол-2,3-диоксигеназы (С230).
1 Амплификация последовательностей генов катехол-1,2-диоксигеназы, катехол-
2,3-диоксигеназы и получение тотальных амплификатов из геномов каждой из культур была проведена с помощью праймеров, структура которых ранее опубликована в работе [Okuta A et al., 2004]
С230 for 5'-ATGGATDTDATGGGDTTCAAGGT-3* C230 rev 5' - ACDGTCADGAADCGDTCGTTGAG -3' С120 for 5' - GCGHACVATGAAGGNCCRYTGTA- 3' C120 rev 5' - TCRCGSGTNGCAWANGCAAAGTC - 3'
Ожидаемый размер амплифицированной ДНК для генов С120 и С230 составлял соответственно 462 и 721 пар нуклеотидов
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась в 30 мкл общей смеси, содержащей 80 нг ДНК, 200 мкМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов («Сибэнзим», Россия), 1 5 мМ MgCh («Sigma», США), 200 пмоль каждого праймера, 10 мкл 10Х Taq буфера (Promega) и 3 0 ед Taq полимеразы (Бионем, Москва)
Полимеразная цепная реакция проводилась на термоциклере «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия) по следующим программам'
Программа (C23Q) 94°С - 3 мин
94°С - 1 мин , 54°С - 35 сек , 72°С -1 мин (30 циклов) 72°С -1 мин 30 сек 4°С - хранение
Программа (С 1201 94°С - 3 мин
94°С - 1 мин , 57°С - 1мин ; 72°С - 2 мин (30 циклов) 72°С -1 мин 30 сек 4°С - хранение
Для клонирования использовали 10 пмоль каждого ПЦР-продукта Секвенирование последовательностей клонированных амплификатов осуществлялось на автоматическом секвенаторе AbiPrism 3100 (Applied Biosystems, USA) со стандартной пары праймеров
pUC/M13 forward (3'- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC -5'), pUC/M13 reverese (3'- AGCGGATAACAATTTCACACAG<jA-5') Результаты секвенирования последовательностей были получены в электронном варианте, их анализ и обработка производились при помощи пакета программ DNA-star (программа SeqMan) и N-BLAST
Статистическая обработка результатов секвенирования, выравнивание и построение и филогенетических деревьев производилась с помощью программы MegAlign программного пакета DNA-star по алгоритму Clustal V
6 Штаммы-реципиенты полученных конструкций
Для трансформации и клонирования, полученных плазмидных конструкций ис пользовались следующие штаммы Е. coli
ВМН 7118 (thi, supE A(lac-proAB) [mutS TnlO] [?',proAB, lac\4Z ДМ15]), NM522 (siip E thi-l A(lac-proAB) MmcrB-hsdSM) (n - mk) [F, proAB, foci4Z AMI 5]) Для культивирования штаммов К coli использовались стандартные питательные среды LB и М9 [Maniatis Т et al, 1989]
7 ПДРФ-анализ полученных конструкций.
Для получения вторичных продуктов ПЦР клонированных последовательносте"' генов 16S-pPHK, в качестве матрицы были использованы полученные ранее плаз-мидные конструкции на базеpGem *-Т Vector System I («Promega», США)
Полимеразная цепная реакция проводилась в 20 мкл общей смеси, содержащей 30 нг плазмидной ДНК, 200 мк Молей дезоксирибонулеотидфосфатов («Сибэнзим», Россия), 1 5 мМ MgCb (Sigma, США), 200 п Молей каждого праймера, 10 мкл 10Х Taq буфера («Promega», США) и 2 5 ед активности Taq - полимеразы («Бионем», Россия)
Перед проведением анализа ПДРФ-анализа (полиморфизм длинны рестрикцион-ных фрагментов), полученные амплификаты были предварительно очищены при помощи PCR Clean-Up Kit (50) («V-Gene Biotechnology», Китай) По стандартному протоколу производителя
Для проведения анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов нами были выбраны 2 эндонуклеазы рестрикции производства «MBI Fermentas», Литва Msp I (сайт рестрикции З'-G G С^С-б') и Rsa I (сайт рестрикции З'-С АЛТ G-S') Объем рестрикционной смеси составлял 30 мкл, реакция проводилась в буфере Г Yellow Tangom (Fermentas, Литва)
Результаты ПДРФ-анализа оценивались посредствам электрофореза в 1 5% ага-розном геле и 6% полиакриламидном геле Протоколирование результатов осуществлялось при помощи системы регистрации изображений ViTran («Биоком», Россия)
Секвенирование последовательностей клонированных амплификатов осуществлялось на автоматическом секвенаторе AbiPrism 3100 (Applied Biosystems, USA) со стандартной пары праймеров
pUC/M13 forward (3'- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC -5'), pUC/M13 reverese (3'- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-5') Результаты секвенирования последовательностей были получены в электронном варианте, их анализ и обработка производились при помощи пакета программ DNAstar (программа SeqMan) и N -BLAST
Депонирование полученных последовательностей генов 16S-rRNA производилось при помощи программного пакета SEQIN
Статистическая обработка результатов сиквенирования, выравнивание последовательностей и построение дендрограм их сходства производились в операционной утилите MegAhgn программного пакета DNA-star с использованием алгоритма Clus tal V '
8. Определение удельной активности типированных диоксигеназ
Наращивание биомассы Отдельные колонии рассевали на чашки Петри с агаризо-ванной минимальной минеральной средой и выращивали в парах соответствующих ЛОС (м-ксилол, о-ксилол, этилбензол и стирол) Рост на чашках происходил в течение 48 ч при 28*С Далее, производили пересев смывом в колбы с 30 мл минимальной минеральной среды, содержащей 0,005%- дрожжевого экстракта (Difco, США), и дополнительно инкубировали культуры в парах соответствующих растворителей в течение 24 часов при 28°С
Катехол-1.2-диоксигеназа Удельная активность на клеточном лизате оценивалась по образованию цис,цис-муконовой кислоты (/.=260 нм, е=16 9 мкМхсм'1) в смеси, содержа-
щей 5 мМ ЭДТА, 1 мМ катехола и бесклеточный экстракт в 0 05 М фосфатном буфере рН=7,0 [Т Nakazawaet а1,1976 ]
Катехол-2-З-диоксигеназа Удельная активность на клеточном лизате оценивалась по образованию а-оксимуконового полуальдегида (>,=375 нм, е=33,4 мкМ-см-1) в смеси, содержащей 0,5 мМ катехола и бесклеточный экстракт в 0,05 М Трис-НС1 буфере рН=7,0 [М ИогаИ й а1, 1976 ]Общий белок определяли с помощью Бицинхонинового (ВСА) реагента, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин
Результаты и обсуждение
1. Выделение и адаптация культур микроорганизмов-деструкторов к утилизации различных ксенобиотиков
В работах [Ficker M et al, 1999, Roy S. et al, 2003; Greene E.A et al, 2000] показано, что нестерильные промышленные консорциумы, осуществляющие минерализацию различных органических ксенобиотиков как в аэробных, так и анаэробных условиях, состоят из 2-10 культур в различных количественных соотношениях Как правило, 1-2 культуры-деструкторы доминируют [Roy S et al., 2003; Meiler S et al., 1998] и несут на себе основную нагрузку по утилизации или трансформации соответствующего ксенобиотика Другие же составные части микробных сообществ в основном утилизируют продукты трансформации, образовавшиеся при первичной деструкции ксенобиотиков [Greene E.A et al, 2000; Christensen B.B. et al, 2000], либо живут как культуры-симбионты или консументы. Стабильность таких консорциумов дополнительно поддерживается способностью симбионтов поставлять ростовые факторы [Stoffels M. et al., 1998, Andersen J. et al., 1998]
В работе [Christensen В В et al, 2000] описывается распределение микробных сообществ в зависимости от расположения на поверхности биокатализатора с учетом нагрузок утилизируемых ксенобиотиков, как вертикальная, так и горизонтальная стратификация по поверхности биокатализатора. Характерно, что даже при незначительном изменении свойств утилизируемых ЛОС, в частности, при использовании их смеси, могут наблюдаться существенные вариации соотношения видов в уже сформированном микробном сообществе [Molin S et al, 1998]
Исходные лиофилизованные культуры были получены из музея культур микроорганизмов лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. АН Баха РАН, а так же ранее из ранее депонированных единиц хранения в ВКПМ.
Микробные культуры вносили в проточные лабораторные мини-реакторы, где I они могли осуществлять деградацию соответствующих ксенобиотиков [Уткин И.Б и
др. 1991; Безбородое AM. и др 1997; Безбородое AM. и др. 1998; Жуков В.Г. и др. 1998] Суммарная нагрузка ЛОС на каждый мини-реактор составляла -300-350 мг/м3. , Мини-реакторы функционировали в естественных нестерильных условиях.
Была проверена специфичность исходных культур по отношению к соответствующим субстратам и с помощью газовой хроматографии оценена активность и эффективность утилизации ЛОС по методике описанной в работе [Уткин И.Б и др.1991]
Микробные консорциумы в составе биокатализаторов обладали хорошей стабильностью и обеспечивали высокий уровень конверсии ЛОС Пробы микрофлоры с поверхности биокатализаторов рассевали на чашки Петри с агаризованной минимальной минеральной средой и выращивали в парах соответствующих ЛОС (м-ксилол, о-ксилол, этилбензол и стирол). Рост на чашках происходил в течение 48 ч при 28°С.
В биопленке биокатализатора, несмотря на определенную селективность условий, присутствует значительное количество организмов-консументов, симбионтов и олигокарбофилов, использующих продукты метаболизма основной культуры-деструктора, либо живущих на ее дебрисе
Для удаления слабо ассоциированных с деструкторами балластных штаммов и стабилизации уровня физиологической адаптации культур к утилизации определенного субстрата, колонии, образовавшиеся при высеве смывов с биокатализатора, пересевались несколько раз на плотной минимальной среде в парах одного из ЛОС в тех же условиях.
Культуры, выросшие на минимальной минеральной среде в присутствии соответствующих ЛОС, использовали для выделения суммарной геномной ДНК
2. Формирование выборки клонов и ПДРФ-анализ полученных конструкций с последовательностями 168-рДНК
Для определения размера выборки клонов 168-рДНК, подлежащих анализу методом ПДРФ (полиморфизма длинны рестрикционных фрагментов), достаточной для оценки количественной представленности видов в смешанной бактериальной популяции, необходимо учитывать гетерогенность изучаемой культуры, то есть число составляющих ее видов. Для обеспечения статистической достоверности, полученные р ходе анализа данные должны базироваться на факте обнаружения той или иной последовательности более одного раза, поэтому в размер выборки заложен критерий троекратной встречаемости любой подлежащей анализу последовательности Кроме того, была поставлена задача обеспечения возможности работы с консорциумами деструкторов, содержащими до 10 основных видов бактерий, т е при равной встречаемости каждого из основных видов на каждый из них приходится 10% точек от общей выборки клонов Поскольку каждая культура должна бьгть представлена не менее, чем тремя независимо полученными клонами рДНК, минимальный размер выборки клонов рДНК, необходимой для проведения ПДРФ-анализ а, составляет 30 клонов
Необходимо отметить, что при работе с консорциумами, составленными менее, чем 10 видами, содержание рДНК каждого типа в выборке клонов возрастает, что увеличивает статистическую достоверность результатов Напротив, повышение гетерогенности консорциума, а также наличие в нем штаммов, составляющих менее 10% от численности популяции, снижает достоверность результатов.
Основные этапы эксперимента по клонированию, ПДРФ-анализу и секвенирва-нию 168-рДНК приведены на блок-схеме на рис. 1.
Для картирования и разделения по типам индивидуальных профилей рестрикции (шизотипам) использовали как плазмидные ДНК конструкций, несущие вставку 168-рДНК, так и фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР отобранных конструкций на базерСет Т-уейог с использованием стандартных праймеров р11С-М13.
При проведении анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов с использованием ДНК плазмидных конструкций, несущих вставку 168-рДНК, различия в рестрикицонном портрете клонов обусловлены характерным расположением сайтов рестриктаз в последовательности, кодирующей гены 168-рРНК Таким образом, профиль получаемых фрагментов рестриктных фрагментов дает возможность их идентификации
Рис. 1 Блок-схема эксперимента.
В то же время, анализ ПДРФ с использованием плазмидной ДНК осложнен тем, что в нем присутствуют гибридные фрагменты, несущие стыки вектора со вставкой, которые в зависимости от ориентации клонированной вставки могут изменять профиль рестрикции по двум фрагментам Таким образом, каждой последовательности 1 бв-рРНК могут соответствовать два различных шизотипа При работе с большими выборками клонов это осложнение с трудом может быть преодолено за счет использования методов математической обработки результатов
L 12 3 4 5 L 6 7 8 9 10 L 11 12 13 14 15 L 16 17 18 19 20 L
Рис.2 Рестрикционныб анализ тотальных продуктов ГГЦР ieS-рДНК по Mspl и Rsal
1,11- m-xyl (Mspl); 2,12- EtBz (Mspl); 3,13- Tol (Mspl); 4,14- O-iyl (Mspl); 5,15-Sty (Mspl); 6,16- M-xyl (Rsal); 7,17- EtBz (Rsal); 8,18- Tol (Rsal); 9,19- O-xyl (Rsal); 10,20- Sty (Rsal). L- Gene Ruler (100 п.н. DNA ladder, «МВ1 Fermentas», Литва)
Таким образом, существенно более информативной и точной является анализ ПДРФ последовательностей 168-рДНК, вторично амплифицированных на ДНК-матрицах плазмидных клонов В то же время, анализ ПДРФ плазмидных ДНК является существенно менее трудоемким методом и полезен с точки зрения первичной оценки и корректировки размера выборки плазмидных клонов
12 34 56 7 89 10 11 L
Рис. 3 Электрофорегрямма основных шизотипов по рестриктазе Rsal, представленных в консорциумах
1-шизотип №1; 2- шизотип №2; 3-шизотип №3; 4- шизотип №4; 5- шизотип №5; б- шизотип №6; 7- шизотип №7; 8- шизотип №8;9- шизотип №9; 10- шизотип №10; 11- шизотип №11; L- Gene Ruler (100 п.н. DNA ladder, «MBI Fermentas», Литва)
Вычленение клонов, несущих идентичные или близкие по последовательности вставки, на первом этапе проводилась на основании результатов ПДРФ-анализа препаратов выделенной плазмидной ДНК этих клонов Основанием для группировка клонов в группы (шизотипы) являлось сходство, либо различие профилей рестрикции исследуемых клонов
В 4-х исследуемых выборках нами было выявлено 11 шизотипов Доминантные шизотипы в каждой из выборок были довольно схожи между собой и как впоследствии было установлено относятся к одной систематической группе Результаты ПДРФ-анализа представлены на рис 2 и 3
3. Анализ последовательностей отобранных клонов и восстановление видового состава консорциумов. Доминантные и минорные компоненты консорциумов. Изучение таксономического положения вновь охарактеризованных по последовательности рДНК доминантных культур консорциумов
По окончании типирования клонов рДНК методами ПДРФ с использованием плазмидной ДНК и их ПЦР-продуктов было проведено полное секвенирование типовых клонов, каждый из которых представлял один из наиболее представленных в выборке шизотипов Полученные в результате последовательности рДНК из 4 клонов были соотнесены с последовательностями, депонированными в банке генов NCBI (Таблица 1) В результате для каждого из шизотипов была обнаружена близкородственная (более 96-98% совпадений), последовательность, что позволило осуществить идентификацию видовой принадлежности их хозяев с точностью до рода, а иногда и вида Таким образом, было установлено, что шизотип №1 соответствует последовательности вида Sphmgobactenum multtvortim (97% совпадений), шизотип №2 - роду Paenibacillus (95% совпадений), шизотип №3 - роду Rhuobiom (90% совпадений), шизотип №4 -Alcahgenes xylosoxvdans (95% совпадений), шизотип №5 - Mesonrhizobium ciceri (98% совпа-
дений), шизотип №6 - Comamonas actdovorans (97% совпадений), шизотип №7 -Sphingobacterium multivorum (96% совпадений), шизотип №8 - роду Pedobacter (96% совпадений), шизотип №9 - Sphingobacterium multivorum (99% совпадений), шизотипу №10 - Pseudomonas fluorescens (99% совпадений) и шизотипу №11 - Pseudomonas veromi (99.6% совпадений)
-Bacillus cereus
— Achromobacter *yloeoxldan*-AY7S3652
-Achromobacter xylosoxidans
DeltHa acldovorans-AY753853
-Delftia acidovorans
Pseudomonas fluore*ceris-AY730552
Pseudomonas fluorescence
-Pseudomonas veronll-AY748440
-Pseudomonas veronll
Рис.4.Филогенетическое дерево, отражающее систематическое положение выявленных культур-деструкторов
Для подтверждения достоверности отнесения тех или иных клонов к конкретным видам или родам был проведен кладисгический анализ филогенетических отношений гипотетических бактерий-хозяев клонированных рДНК друг с другом и последовательностями рДНК, ранее депонированными в банке генов N031 Для анализы были выбраны 4 последовательности, определенных в рамках настоящей работы, и 7
ранее известных последовательности, наиболее сходных с вновь обнаруженными Укорененная (корневая) дендрограмма (рис 4, табл 1), построенная по встроенному алгоритму пакетом Custal V, с использованием в качестве внешней группы Bacillus cereus ZK (номер доступа NCBI' СР000001) показывает, что близкое сходство вновь определенных последовательностей с представителями видов и родов, предлагаемых для их отнесения, действительно весьма близко и не может бьггь обусловлено недостаточностью литературных данных об отдельных таксономических группировках эу-бакгерий (табл. 1).
Таблица. 1 Результаты статистической обработки выровненных последовательностей, кодирующих гены 16S-pPHK
Р А
3 Л И
4 и
Е, %
97,8
65,9
0,6 Н 65,9 27,5
ИДЕНТИЧНОСТЬ, %
81,8
83,8
28,0
14,0
13,2
17,4
16,8
19,4
18,3
64,4
84,0
84,6
67,1
13,4
12,8
17,1
16,4
18,9
17,8
97,5
80,2
81,3
74,1
79,0
28,3
22,8
22,0
24,5
23,5
0,9
80,7
79,0
81,5
70,3
79,1
79,3
18,5
17,8
19,4
18,8
94,8
8
77,5
79,5
68,1
77,9
78,3
97,9
17,2 0,5
19,6
18,5
97,8
79,3 1
80,7
71,5
78,5
80,1
98,9
98,9
1,9
1,0
98,2
0,6
1,1
Achromobacter
xylosoxydans
AY753652
Achromobacter xylosoxydans
Bacillus cereus
Delftia acido-
vorans
AY753653
Delftia acido-vorans
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas
fluorescens
AY730552
Pseudomonas
veronii
AY748440
Pseudomonas veronii
Всего в рамках работы было исследовано 4 культуры близкого происхождения, в течение длительного времени адаптированных к утилизации одного из следующих ЛОС о-ксилола, стирола, м-ксилола и этилбензола Необходимо отметить, что биохимические и этимологические характеристики известных в литературе штаммов позволяют предполагать, что практически один и тот же ферментативный аппарат,
кодируемый идентичным или сходным набором генов, пригоден для получения у большинства штаммов грам-отрицательных бактерий способности к утилизации всех перечисленных ЛОС В то же время результаты нашей работы показали наличие я каждой из смешанных культур различных главных компонентов консорциума (далее доминантные штаммы) Так в культуре утилизирующей этилбензол было обнаружено 4 шизотипа (1,2,8 и 10), из которых на долю доминантного штамма Pseudomonas fluorescens (шизотип 10) приходится 27 из 30 исследованных клонов, т е 90% культуры Оставшиеся три штамма составляют в сумме не более 10% от численности популяции.
Аналогичное распределение численности видов наблюдается и в других смешанных культурах, хотя доминантный штамм в каждом случае оказывается уникальным' для о-ксилола - Achromobacter xylosoxydans (80% от численности популяции), для стирола Pseudomonas veronii (83% от численности популяции), для м-ксилола - Delf-tia acidovorans (83% от численности популяции)
Обращает на себя внимание факт того, что в различных культурах в качестве основного доминирующего компонента выступают различные организмы. Причем, соответствующие доминанты специфичны именно для данной культуры и в других культурах не встречаются, даже в качестве сопутствующей микрофлоры. В то же время, минорные компоненты всех исследованных смешанных культур в основном сходны между собой Наиболее типичен в этом качестве род Sphmgobacterium, несколько менее представлены азотфиксирующие роды Rhizobium и Mesorhizobium, Pedobacter, а также психрофильный грам-положительный вид Paenibactlhis
Таблица 2. Результаты секвенирования генов 1бв-рРНК и номера доступа последовательностей, депонированных в банке генов >СВ1
Утилизируемый субстрат Штамм Номер
М-ксилол Delftia acidovorans AY753653
О-ксилол Achromobacter xylosoxidans AY753652
Стирол Pseudomonas veronii AY748440
Этилбензол Pseudomonas fluorescens AY730552
Толуол Pseudomonas graminis DQ059301
Нафталин Pseudomonas putida DQ026520
Таким образом, наблюдалась стабильность видового состава и численности минорных, но не основных компонентов бактериальных консорциумов в зависимости от типа утилизируемых ими ЛОС На основании этого наблюдения можно предположить, что функция доминантных и минорных компонентов в адаптации к составу среды в микрореакторах является взаимодополняющей, что способствует высокой стабильности и жизнеспособности, препятствуя их разделению методами классической микробиологии
Помимо исследованных ранее консорциумов, в задачи исследования входило выделение и типирование двух культур, способных расти на толуоле и нафталине, как единственных источниках углерода. Из имеющегося в наличии материат* методами классической микробиологии было выделено, соответственно, по 1 монокультуре на каждый из субстратов Из вновь полученных культур была выделена тотальная геномная ДНК и реамплифицированы последовательности
номная ДНК и реамплифицированы последовательности генов, кодирующих последовательности генов löS-рДНК Полученные амплификаты были клонированы и се-квенированы по приведенной выше схеме В результате было установлено, что монокультурой, осуществляющей утилизацию толуола является Pseudomonas graminis, а нафталина - Pseudomonas putida. Соответствующие им последовательности, кодирующие гены 16S-pÄHK были зарегистрированы в банке генов NCBI
4. ПЦР-клоннрование генов ключевых ферментов, ответственных за утилизацию JIOC по орто- и мета-пути. Сравнительная характеристика нуклеотид-ных последовательностей обнаруженных генов и их соотнесение с соответствующими консорциумами.
В рамках работы была выделена и исследована суммарная геномная ДНК 6 консорциумов, полученных их одной исходной культуры Тест на наличие генов катехолдиок-сигеназ проводился путем ПЦР-кпонирования при помощи соответствующих пар стандартных праймеров на соответствующие гены
По ходу проведения ПЦР были оптимизированы параметры и условия реакции позволяющие получить наиболее воспроизводимые результаты, что важно при работе с потенциально гетерогенными продуктами ПЦР, соответствующим нескольким различным копиям гомологичных генов в составе амплифицируемой ДНК
Полученные продукты ПЦР были очищены и клонированы в плазмидный вектор pGem - Т (Promega, США), их последовательности были установлены путем автомат!-ческого секвенирования по двум цепям
Для подтверждения достоверности отнесения тех или иных последовательностей к изучаемым генам, определенные последовательности С120 и С230 были сопоставлены с аналогичными последовательностями, депонированными в Банке генов NCBI По результатам сравнения данных был сделан вывод, что все клонированные продукты ПЦР являются копиями генов С120 и С230
L 1 2 3 4 5 6 L
Рис 5 Электрофореграмма ПЦР - продуктов (462 п.н.) гена С120 (катехол-1,2-диоксигеназа), в качестве матрицы использована суммарная геномная ДНК консорциумов, утилизирующих следующие субстраты:
1-толуол, 2-стирол, 3-этилбензол, 4-о-ксилол, 5-м-ксилол, 6-нафталин, Ь- 1тпн ДНК стандарт молекулярной массы
Полученные последовательности клонированных генов были подвергнуты множественному выравниванию между собой и с ранее опубликованными последовательностями, была проведена идентификация полиморфных позиций Полученное выравнивание было использовано для выявления филогенетических различий между всеми имеющимися последовательностями
6 Ь
Рис 6 Электрофореграмма ПЦР - продуктов (721 п.и.) гена С2ЭО (катехол-2,3-диоксигеназа), в качестве матрицы использована суммарная геномная ДНК консорциумов, утилизирующих следующие субстраты:
1-толуол, 2-стирол, З-этилбензол, 4-о-ксилол, 5-м-ксилол, 6-нафталин, Ь- 100 п.н. ДНК стандарт молекулярной массы
Результаты нашей работы показали наличие гена С230 (катехол-2,3-диоксигеназа) в культурах утилизирующих толуол, нафталин и м-ксилол. В то же время, ген С120 (кате-хол-1,2-диоксигеназа) были обнаружены у культур, утилизирующих стирол, этилбензол, о-ксилол и м-ксилол (Рис 2 и 3).
Таблица 3 Последовательности генов С120 и С230, выявленные в различных культурах.
Культура, обладающая специфической активностью к соответствующему ЛОС Ген и соответствую-щаяпоследовательность Номер в СепВапк (N081)
М-ксилол С120 ш-ху1(¥Ь) АУ882596
С230 Ш-ХУКУЬ) АУ882600
О-ксилол С120 о-ху1(у«1) АУ882595
Стирол С120 *1у(уЬ) АУ882594
Этилбензол С120 Е1Вл(уЬ) АУ882597
Толуол С230 1О1(УЬ) АУ882598
Нафталин С230 пя11(У)1) АУ882599
Плазмидная локализация _, c120jND&
__' в C1JO_pNDe
_| 2 С1.20 Etfiz
1 S C1,20_Sty
Хромосомная локализация .-14
———--I 7 C1,20 m-Jcyl
'-3 C1,20~mt-2
-1-1-1-1-1 i-1
12 10 8 в 4 2 0
Nucleotide Substitutions 6ri00)
Рис. 7 Филогенетическое дерево, отражающее систематическое положение выявленных последовательностей С120 относительно контрольной группы
Укорененная (корневая) дендрограмма (Рис 7 и 8), построенная по встроенному алгоритму пакетом Custal V, с использованием в качестве группы сравнения наиболее типичных представителей С120: ген CatA из транспозона mt-2 P. putida (NCBI AF363241), Cat А из плазмид pND6 (NCBI NC_005244) и pND6-l (NCBI AY208917 ) P. putida ND. Для C230 группу сравнения составили последовательности генов XylE, локализованные на плазмидах pWWO (NCBI AJ344068), pWW53 (NCBI AF102891) и pTOL (NCBI V0U61)
Плазмидная локализация ^_. 3 сг.зо_pwwo
' 1 4 C2|30_pT0L - 1 C2.30 Td
■o
22 .
— в C2,30_Nah
— 5 C2,30_rrv*yl
— 2 P. putida plasm pWW53 (xylE)
Ыис1ваЬс1е виЬв&ШЬол« (х100)
Рис. 8 Филогенетическое дерево, отражающее систематическое положение выявленных последовательностей С230 относительно контрольной группы
Полученные профили дендрограмм показывают, что близкое сходство вновь определенных последовательностей генов С120 и С230 с представителями, предлагаемых для их отнесения, действительно весьма близко и может бьггь обусловлено их высоким структурным и функциональным консерватизмом.
Необходимо отметить, что, основываясь на данных об анализе последовательностей, кодирующих изучаемые нами ферменты и их сопоставлении с уже имеющимися в базе N031 нуклеотидными последовательностями, кодирующими аналогичные ферменты, можно предположить, что.
• Гены С120 этилбензольной и стирольной культур имеют плазмидную локализацию и содержат общий мотив структурный мотив, аналогичный с последовательностью, кодирующей ген С120 из плазмиды рМ)6
• Напротив, гены С120 орто- и метаксилольной культур, локализованы на бактериальной хромосоме.
• Последовательности генов С230 всех изучаемых культур имеют плазмидную локализацию Гены С230 толуольной и нафталиновой культур по структуре своих последовательностей наиболее близки к аналогичным генам, локализованных на плазмидах типа рЦЧУО или рТОЬ Последовательность же гена
С230 по своему структурному мотиву более подобен гену, локализованному на плазмиде р!№У53 (ху1Б).
• Из всех рассмотренных нами культур, наиболее многофункциональной, является метаксилольная культура, т к в ее геноме присутствуют как С120, так и С230 Причем, у каждого из этой пары генов, кодирующих ключевые пути утилизации, различная физическая локализация в геноме (С120 - хромосомная, С230 - плазмидная).
5. Изучение специфической активности исследуемых диоксигеназ
Для подтверждения факта встречаемости исследуемых генов катехолдоксигеназ обоих типов в различных культурах и изучения эффективности их экспрессии были проведены эксперименты по непосредственному измерению активности соответствующих ферментов в культурах, непосредственно осуществляющих биодеградацию ксенобиотиков -Для этого был использован факт хромогенности осуществляемых ими реакций оксигени-рования катехола- продукты интрадиольного расщепления ароматического ядра - муконо-вый семиальдегид и эксградиольного расщепления - цис-оксимуконовая кислота разли- ^ чаются максимами поглощения Результаты этого эксперимента представлены в таблигг 4 Основываясь на сопоставлении активностей соответствующих диоксигеназ у различных культур можно заключить'
• Специфическая активность ключевых диоксигеназ, ранее выявленных на уровне амплификатов, была обнаружена у соответствующих исследуемых культур
• Удельная активность катехол-1,2-диоксигеназы наиболее высока у культуры утилизирующей стирол и равна 0,086 мкмоль/мин на мг белка. Наименьшая активность данной диоксигеназы выявлена у культуры утилизирующей м-ксилол (0,058 мкмоль/мин на мг белка), о-ксилольная и этилбензольная культуры занимают промежуточное положение со значениями удельной активности 0,064 и 0,073 соответственно.
• Наиболее высокая удельная активность катехол-2,3-диоксигеназы была у м-ксилольной культуры и составила 1,983 мкмоль/мин на мг белка У нафталиновой культуры активность катехол-2,3-диоксигеназы была наименьшей и составила 1,867 мкмоль/мин на мг белка По данному показателю толуольная культура занимала промежуточное положение и активность соответствующей диоксигеназы составила 1,884 мкмоль/мин на мг белка
• Необходимо отметить, что у м-ксилольной культуры активность катехол-1,2-диоксигеназы наименьшая, среди изучаемых культур, а катехол-2,3-диоксигеназы наибольшая Исходя из того, что по сравнительному анализу последовательностей, кодирующих соответствующие диоксигеназы, ранее было установлено, что кате- I хол-2,3-диоксигеназа м-ксилольной культуры, вероятно, имеет плазмидную локализацию, а катехол-1,2-диоксигеназа, возможно, геномную И, соответственно, исходя из данных посылок, возможно и объясняется этот факт.
• Несмотря на это, м-ксилольная культура является наиболее универсальной, среди всех рассмотренных культур, и, по-видимому, является наиболее перспективной для применения в качестве основного деструктора в промышленных установках для очистки воздуха от ЛОС.
Таблица 4 Удельная активность катехол-1,2- и катехол-2,3-диоксигеназы в бесклеточных экстрактах различных культур (мкмоль/мин на мг белка)
Фермент Культура, обладающая специфической активностью к соответствующему ЛОС
м-ксилол о-ксилол Этилбензол Стирол Толуол Нафталин
Катехол-1,2-диоксигеназа 0,058+0,002 0,064±0,004 0,073±0,003 0,086±0,004 - -
Катехол-2,3-диоксигеназа 1,983±0,12 - - - 1,884±0,07 1,867±0,09
Выводы:
1 Методом культивирования в миниреакторах с использованием соответствующих ЛОС в качестве субстрата отобраны новые устойчивые бактериальные культуры, адаптированные к утилизации одного из четырех ЛОС' стирол, этилбензол, о- и м-ксилол Помимо этого, методами классической микробиологии были выделены культуры, адаптированные к утилизации толуола и нафталина
2 Методами микробиологии и генотипирования показана качественная устойчивость видового состава микробного консорциума, утилизирующего ЛОС в условиях миниреактора В то же время, количественное соотношение численности видов в консорциуме изменялось в зависимости от состава утилизуиремого ЛОС
3 Показано доминирование в каждой из смешанных культур неидентичных главных компонентов консорциума в зависимости от утилизиуремого ЛОС Все мажорные компоненты относились к различным порядкам класса Грам-отрицательных бактерий Минорные компоненты всех четырех консорциумов совпадали
4 Показано наличие в суммарном геноме консорциумов генов ключевых ферментов обоих известных путей утилизации ароматических ЛОС' 1,2- и 2,3- катехолдиок-сигеназ.
5 Показано наличие в клеточных лизатах изучаемых культур специфической активности ключевых ферментов «нижних путей» утилизации углеводородов, в основном, коррелирующей с наличием в них генов соответствующего типа
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1 Жуков В Г, Хоменков В.Г., Комаров А.В., Парк К Дж, Джанг С.Х. Попов В О. Промышленные установки для микробиологической дезодорации газо-воздушных выбросов И Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы П Московского международного конгресса (Москва 10-14 ноября 2003 г.) М
ЗАО «ПИК «Максима»», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2003 - часть 1 с. 8-9.
2 Жуков В.Г., Попов В.О., Хоменков В.Г Микробиологические методы очистки промышленных вентиляционных выбросов от летучих примесей. Возможности и перспективы практического использования технологии «БИОРЕАКТОР».для боргу \ бы с индустриальными загрязнениями атмосферы //Наука Москвы и регионов, научно-технический журнал (инновации, разработки, производство) №3, 2003
г, с. 61-68.
3 Хоменков В.Г, Шевелев А Б., Купцов А И Использование методов геносистема-тики для анализа бактериальных сообществ, осуществляющих биодеградацию ксенобиотиков в промышленных условиях■ Тезисы докладов П Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды», Москва, 25-27 мая 2004 г//ред проф АП Садчиков, д.б н С.В Котелевцев - М:, 2004 -с. 180
4 В.Г. Хоменков, А Б Шевелев Изучение видового состава консорциума микроорганизмов утилизирующих летучие органические ксенобиотики методами геноси-стематики.■ Молекулярная генетика, геномика и биотехнология. Международная научная конференция, Минск, 24-26 ноября 2004 г.: Материалы конференции / Ред. Кол : Н.А Картель и др - Минск LV, 2004 г - с 266-268
5 Жуков В Г., Хоменков В.Г., Попов В О. Биофильтры для очистки газовоздушных выбросов от летучих органических соединений.. Биотехнология микробов: Всероссийский симпозиум, посвященный 120-летию со дня рождения В.Н. Шапошникова. Москва, МГУ им М В. Ломоносова, 20-23 октября 2004 г • Тезисы докладов / Под ред А И Нетрусова, Н.Н. Колотиловой. - М.: Макс Пресс, 2004. -с.ЗЗ.
J
6 Хоменков В.Г, Шевелев А Б Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов деструкторов ароматических ксенобиотиков Тезисы докладов и стендовых сообщений ХУП зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-10 февраля 2005 г // под ред Т В Овчинниковой и Т И. Сорокиной - М. «Изд-во ИБХ РАН», 2004 - с.97-98.
7 Хоменков В.Г, Шевелев А Б , Жуков В Г, Курлович А.Е , Загустина Н А, Попов В О Применение методов геносистематики для исследования бактериальных культур, утилизирующих летучие органические соединения И Прикладная биохимия и микробиология 2005 Т. 41 №2 С 176-185
8 Хоменков В.Г, Шевелев А Б , Жуков В Г, Курлович А Е , Загустина Н А, Попов В О Молекулярно-генетическая характеристика метаболических путей утилизации ароматических углеводородов консорциумами микроорганизмов II Прикладная биохимия и микробиология 2005 Т 41 №3 С 298-303.
9 И Н Крахмалева, С С Шишкин, Н И Шаховская, Е Б Столярова, А.Г. Плугов, А.И Князев, В.Г. Хоменков, А Б Шевелев, Н Н Чернов ДНК-технологии, позволяющие выявлять SNP's, в решении некоторых вопросов прикладной биохимии.!! Прикладная биохимия и микробиология 2005.Т 41 №3 С 303-307
10 V.G. Khomenkov, А В Shevelev, V G Zhukov, N A Zagustina and V.O Popov Gem-systematic approach to study of bacterial cultures utilizing volatile organic compounds and mapping their principal biodegradation pathways Iя International Conference of Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz (Spain), March 15-18" 2005, Book Of Abstracts P 113
»15132
РЫБ Русский фонд
200М: 11642
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 30.08.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 504. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хоменков, Василий Григорьевич
Введение.
I. Литературный обзор.
Введение: Организация генов метаболических путей биодеградации ароматических ксенобиотиков.
Верхние пути
1. Гены пути .мета-расщепления ароматического кольца.
1.1 Экстрадиольные диоксигеназы.
2. Гены пути ор/яо-расщепления ароматического кольца.
2.1Гены модифицированных орто-путей.
2.2 Интрадиольные диоксигеназы.
Нижние пути
3. Гены периферических (нижних) ферментов метаболических путей.
3.1 Диоксигеназы многокомпонентных ароматических колец.
3.2 Монооксигеназы.
З.ЗДегалогеназы.
4. Регуляторные гены. Транскрипционная регуляция метаболических путей биодеградации ароматических ксенобиотиков.
5. Механизмы генетической адаптации микроорганизмов к утилизации ароматических ксенобиотиков.
5.1 Перенос генов.
5.2 Точечные мутации.
5.3 Геномные перестройки.
5.4 Дупликация генов.
5.5 Транспозиции.
5.6 Инсерционная активация.
6. Основные подходы и методы молекулярной систематики, филогении для идентификации микроорганизмов и микробных сообществ.
П. Материалы и методы.
1. Культивирование, отбор и адаптация бактериальных культур.
2. Выделение геномной ДНК изучаемых культур
3. Методика ПЦР-клонирования 168-рДНК последовательностей из тотальной ДНК культур.
4. Разделение гетерогенных ПЦР-продуктов путем молекулярного клонирования в векторную систему рСЕМ-Т-Еаэу.
5. Клонирование ПЦР-продуктов генов ключевых ферментов путей утилизации ЛОС из тотальной ДНК культур.
6. Штаммы-реципиенты, использованные при клонировании
7. ПДРФ-анализ плазмидных клонов л продуктов ПЦР
8. Измерение удельной активности типированных диоксигеназ.3.
Ш. Результаты и их обсуждение
1. Выделение и адаптация культур микроорганизмов-деструкторов к утилизации различных ксенобиотиков.
2. Формирование выборки клонов и ПДРФ-анализ полученных конструкций с последовательностями 168-рДНК.
3. Анализ последовательностей отобранных клонов и восстановление видового состава консорциумов. Доминантные.и минорные компоненты консорциумов. Изучение таксономического положения вновь охарактеризованных по последовательности рДНК доминантных культур консорциумов
4. ПЦР-клонирование генов ключевых ферментов, ответственных за утилизацию ЛОС по орто- и мета-пути. Сравнительная характеристика нуклеотид-ных последовательностей обнаруженных генов и их соотнесение с соответствующими консорциумами
5. Изучение специфической активности диоксигеназ исследуемых культурах
IV. Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов-деструкторов ароматических ксенобиотиков"
В условиях постоянно возрастающих объемов промышленного и сельскохозяйственного производства, все большую актуальность приобретают вопросы защиты окружающей среды и, в частности, атмосферы от разнообразных техногенных загрязнителей. Основной вклад в промышленное загрязнение воздуха вносят предприятия химической, целлюлозно-бумажной, лакокрасочной и пищевой промышленности, сельскохозяйственные и перерабатывающие предприятия, комплексы интенсивного животноводства, предприятия, осуществляющие очистку сточных вод и обезвреживание отходов. Промышленные предприятия являются источниками выбросов в атмосферу токсичных и пахучих веществ, которые даже в небольших концентрациях вызывают у людей чувство дискомфорта, создают угрозу жизни и здоровью.
В последнее время для очистки индустриальных вентиляционных выбросов, содержащих летучие органические соединения, все шире применяются микробиологиче9кие методы, появившиеся в связи с интенсивным развитием промышленной биотехнологии.
Действие микробиологических воздушных фильтров основано на деструкции органических субстратов микроорганизмами, приводящей, в конечном итоге, к образованию продуктов терминальной минерализации - СОг и воды. В отличие от методов химического окисления (каталитического, плазменного и обычного сжигания) при работе микробиологических фильтров не образуется окислов серы и азота, хлора и других экологически опасных веществ. В отличие от адсорбции и фильтрования через селективные мембраны, эксплуатация микробиологических фильтров не ведет к образованию и накоплению отработанных мембран и сорбентов, загрязненных удалявшимися из воздуха продуктами. Биофильтры эффективны, не загрязняют окружающую среду, просты в эксплуатации, поэтому могут широко использоваться в технологических процессах утилизации основного объема промышленных и бытовых органических загрязнителей.
Широкое применение микробиологической очистки воздушных выбросов в промышленных условиях нуждается в современных методах мониторинга состояния работающих систем, а также выявления и характеристики процессов и механизмов организации микробных сообществ внутри работающих биофильтров. Методы микробиологической идентификации и типирования культур, не утрачивая своей актуальности, в настоящее время уже не могут обеспечить достаточную точность и быстроту анализа.
Развитие молекулярных методов идентификации микроорганизмов и их применение в таксономии и экологии позволяет наиболее адекватно применять методы геносистематики и молекулярной биологии на практике при анализе природных и промышленных микробных сообществ.
Основное достоинство молекулярно-генетических методов типирования бактериальных культур заключается в возможности предварительной видовой идентификации микроорганизмов непосредственно в составе различных консорциумов с получением статистически достоверных данных о количественном и качественном составе таких консорциумов.
Дели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение, отбор и адаптация новых культур-деструкторов различных ароматических ксенобиотиков, определение их видовой принадлежности и отличительных характеристик с использованием * методов геносистематики и молекулярной биологии, а также оценка их метаболического потенциала в отношении ряда ароматических ксенобиотиков.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Отобрать новые устойчивые бактериальные культуры, адаптированные к утилизации следующих ЛОС: толуол, стирол, этилбензол, о- и м-ксилол, нафталин
2. Молекулярно-биологическими и микробиологическими методами качественно и количественно охарактеризовать состав микробных культур и консорциумов, способных успешно утилизировать указанные ЛОС в лабораторных условиях.
3. Обнаружить и охарактеризовать последовательности генов ключевых ферментов метаболизма ЛОС в геноме изучаемых культур.
4. Изучить специфическую активность обнаруженных ключевых ферментов у охарактеризованных культур
I. Литературный обзор
Введение: Организация генов метаболических путей биодеградации ароматических ксенобиотиков
Прогресс в развитии химической технологии, интенсификация природопользования приводит к тому, что различные по структуре ароматические соединения неприродного происхождения во все возрастающих количествах попадают в окружающую среду. Несмотря на то, что общая продукция синтетических ароматических соединений гораздо меньше объема ароматических соединений, образующихся при разложении материалов растительного происхождения, необычность структуры последних, а также формирование нетипичных для природнх источников сочетаний таких соединений, могут служить причиной значимых изменений в составе микробных сообществ-биодеструкторов. Многие ароматические соединения метаболизируются лишь при участии особых ферментных систем, имеющихся исключительно у специализированных групп микроорганизмов. Такие соединения могут выступать фактором позитивной селекции, обогащая природные сообщества нетипичными группами микроорганизмов. В особенности этот эффект характерен для хлороорганических растворителей, гербицидов и пестицидов, имеющих группировка с необычными химическими свойствами. Необходимость выяснения приницпов адаптации бактерий к утилизации опасных загрязнителей окружающей среды послужила основанием для широкомасштабных изысканий в области биохимии, генетики и физиологии указанных микроорганизмов.
Разнообразие метаболических путей, обнаруженное у микроорганизмов множества отдаленных систематических групп, отражено в постоянно обновляющихся и общедоступных базах данных, таких как «Biocatalysis/Biodegradation Database». Сведения о способности микроорганизмов к биодеградации различных субстратов напрямую применяются на практике в области биоремедиации, отдельные реакции биотрансформации потенциально интересны для применения в химическом синтезе.
Одним из основных классов ксенобиотиков являются ароматические соединения, содержащие различные химические заместители: метильные группы, атомы галогенов, сульфо-, нитро- и нитрозо-группы. Как правило, любые заместители снижают возмож- ' ность биодеградации соответствующих соединений. Сходство химического строения ароматических ксенобиотиков с различными промежуточными метаболитами микроорганизмов создает основу для адаптации микроорганизмов к их утилизации. Учет этого фактора значительно облегчает понимание механизмов и процессов биодеградации ксенобиотиков в окружающей среде. На настоящее время сравнительные характеристики метаболических путей и механизмов биодеградации ароматических ксенобиотиков у различных групп микроорганизмов систематизированы в ряде обзорных работ [30-32, 35, 68, 179, 181]. Сопоставление основных путей катаболизма ароматических соединений у бактерий позволяет заметить, что несмотря на огромное разнообразие первых стадий конверсии ароматических ксенобиотиков, затрагивающих лишь алифатические боковые заместители бензольных ядер («верхние пути»), в конечном итоге все метаболиты этих путей трансформируются в ограниченное число центральных интермедиатов: протокатехоат и замещенные катехолы [30-32, 35, 49, 68, 179, 181]. Эти унифицированные интермедиаты метаболизи-руются по одному из двух возможных «нижних» путей непосредственного окисления ароматического компонента - мета- и орто-путн [80]. Оба эти пути непосредственно выходят на центральные метаболические узлы микробной клетки, например, внутри цикла трикарбоновых кислот.
Мета-путь
Орто-путь
Схема 1
СйА ТсЬС т*ас
ОсА
СИ,
Интрадиольные и экстрадиольные диоксигеназы - центральные ферменты «нижних путей». Катехол-2,3-диоксигеназы, кодируемые генами ху/Е, шШ [80], и йтрЪ [14] катализируют мета-расщепление катехола, как это указано стрелками на схеме. В . надсемейство экстрадиольных ферментов включены также ферменты, кодируемые генами todE [274], пак С [80], ЬрИС [60] и сЬрС.[\01\ На схеме также приведены оптимальные субстраты для данного класса ферментов и сайты расщепления ими ароматических колец. Орто-расщепление ароматических колец катализируется интрадиольны-ми диоксигеназами. Надсемейство интрадиольных диоксигеназ включает в себя про-токатехоат-3,4-диоксигеназы, кодируемые геном рсаОН. [42, 86, 157, 276, 277], кате-хол-1,2-диоксигеназу, кодируемую геном ся/А [150] и хлоркатехол-1,2-диоксигеназы, кодируемые генами ЮЬС, 0ЫС и с/сА [54, 66, 247].
Все гены, кодирующие катаболические ферменты, организованы в два пространственно разделенных кластера, каждый из которых представляет собой скоординированно регулируемый блок. Первый кластер содержит гены, кодирующие ферменты «верхнего пути», т.е. пути окисления боковых заместителей исходного субстрата до превращения его в однин из центральных интермедиатов, содержащих ароматкческое ядро. Второй кластер содержит гены ферментов «нижнего пути», катализирующих реакции окисления центральных ароматических интермедиатов до метаболитов цикла Кребса [53, 76,147].
Исходя из приведенной выше общей схемы (схема 1) метаболических путей катаболизма ароматических соединений, можно заключить, что микроорганизмы расширяют спектр утилизируемых ими субстратов за счет увеличения количества начальных стадий деградации исходных соединений и, соответственно, ферментов, которые осу-щестляют данные процессы и начинают трансформировать начальный субстрат, приводя его по химическому строению к одному их центральных ароматических интермедиатов.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хоменков, Василий Григорьевич
IV. Выводы
1. Методом культивирования в миниреакторах с использованием соответствующих ЛОС в качестве субстратов отобраны новые устойчивые бактериальные культуры, адаптированные к утилизации одного из четырех ЛОС: стирол, этилбензол, о-и м-ксилол. Помимо этого, методами классической микробиологии были выделены культуры, адаптированные к утилизации толуола и нафталина.
2. Методами микробиологии и генотипирования показана качественная устойчивость видового состава микробного консорциума, утилизирующего ЛОС, в условиях миниреактора. В то же время, количественное соотношение численности видов в консорциуме изменялось в зависимости от состава утилизуиремого ЛОС.
3. .Показано доминирование в каждой из смешанных культур неидентичных гла^г ных компонентов консорциума в зависимости от утилизируемого ЛОС. Все мажорные компоненты относились к различным порядкам класса Грам-отрицательных бактерий. Минорные компоненты всех четырех консорциумов совпадали.
4. Показано наличие в суммарном геноме консорциумов генов ключевых ферментов обоих известных путей утилизации ароматических ЛОС: 1,2- и 2,3- катехолдиок-сигеназ.
5. Показано наличие в клеточных лизатах изучаемых культур специфической активности ключевых ферментов «нижних путей» утилизации углеводородов, в основном, коррелирующая с наличием в них генов соответствующего типа.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хоменков, Василий Григорьевич, Москва
1. Aelion, С. M., С. M. Swindoll, and F. K. Pfaender. 1987. Adaptation to and biodégradation of xenobiotic compounds by microbial communities from a pristine aquifer. Appl. Environ. Microbiol. 53:2212-2217.
2. Aldrich, T. L., and A. M. Chakrabarty. 1988. Transcriptional regulation, nucleotide sequence, and localization of the promoter of the catBC operon in Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 170:1297-1304.
3. Aldrich, T. L., B. Frantz, J. F. Gill, J. J. Kilbane, and A. M. Chakrabarty. 1987. Cloning and complete nucleotide sequence determination of the catB gene encoding cis,cis-muconate lactonizing enzyme. Gene 52:185-195.
4. Alexander, M. 1981. Biodégradation of chemicals of environmental concern. Science 211:132-138.
5. Alexander, M. 1985. Biodégradation of organic chemicals. Environ. Sci. Technol. 18:106111.
6. Aronson, B. D., M. Levinthal, and R. L. Somerville. 1989. Activation of a cryptic pathway for threonine metabolism via specific IS3-mediated alteration of promoter structure in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171:5503-5511.
7. Assinder, S. J., and P. A. Williams. 1988. Comparison of the meta pathway opérons on NAH plasmid pWW60-22 and TOL plasmid pWW53-4 and its evolutionary significance. J. Gen. Microbiol. 134:2769-2778.
8. Assinder, S. J., and P. A. Williams. 1990. The TOL plasmids: determinants of the catabo-lism of toluene and the xylenes. Adv. Microb. Physiol. 31:1-69.
9. Barkay, T. 1987. Adaptation of aquatic microbial communities to Hg2+ stress. Appl. Environ. Microbiol. 53:2725-2732.
10. Barkay, Т., С. Liebert, and M. Gillman. 1989. Hybridization of DNA probes with whole-community genome for detection of genes that encode microbial responses to pollutants: mer genes and Hg2" resistance. Appl. Environ. Microbiol. 55:1574-1577.
11. Barkay, T., and H. Pritchard. 1988. Adaptation of aquatic microbial communities to pollutant stress. Microbiol. Sci. 5:165-169.
12. Bartels, I., H.-J. Knacknuss, and W. Reineke. 1984. Suicide inactivation of catechol 2,3-dioxygenase from Pseudomonas putida mt-2 by 3-halocatechoIs. Appl. Environ. Microbiol. 47:500-505.
13. Bartilson, M., I. Nordlund, and V. Shingler. 1989. Nucleotide sequence and expression of the catechol 2,3-dioxygenaseencoding gene of phenol catabolizing Pseudomonas CF600. Gene 85:233-238.
14. Beacham, I. R. 1987. Silent genes in prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev. 46:409-417.
15. Bej, A. K., R. J. StefTan, J. DiCesare, L. Haff, and R. M. Atlas. 1990. Detection of coliform bacteria in water by polymerase chain reaction and gene probes. Appl. Environ. Microbiol. 56:307-314.
16. Blom, A., W. Harder, and A. Matin. 1992. Unique and overlapping pollutant stress proteins of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 58:331-334.
17. Вое, L. 1990. Mechanism for induction of adaptive mutations in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 4:597-601.
18. Broderick, J. B., and T. V. O'Halloran. 1991. Overproduction, purification, and characterization of chlorocatechol dioxygenase, a non-heme iron dioxygenase with broad substrate tolerance. Biochemistry 30:7349-7358.
19. Bruhn, C., R. C. Bayly, and H.-J. Knackmuss. 1988. The in vivo construction of 4-chloro-2-nitrophenol assimilatory bacteria. Arch. Microbiol. 150:171-177.
20. Burlage, R. S., L. A. Bemis, A. C. Layton, G. S. Sayler, and F. Larimer. 1990. Comparative genetic organization of incompatibility group P degradative plasmids. J. Bacteriol. 172:6818-6825.
21. Burlage, R. S., S. W. Hooper, and G. S. Sayler. 1989. The TOL (pWWO) catabolic plas-mid. Appl. Environ. Microbiol. 55: 1323-1328.
22. Cairns, J., J. Overbaugh, and S. Miller. 1988. The origin of mutants. Nature (London) 335:142-145.
23. Chakrabarty, A. M., D. A. Friello, and L. H. Bopp. 1978. Transposition of plasmid DNA segments specifying hydrocarbon degradation and their expression in various microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3109-3112.
24. Chatfield, L. K., and P. A. Williams. 1986, Naturally occurring TOL plasmids in Pseudomonas strains carry either two homologous or two nonhomologous catechol 2,3-oxygenase genes. J. Bacteriol. 168:878-885.
25. Chatteijee, D. K., and A. M. Chakrabarty. 1983. Genetic homology between independently isolated chlorobenzoatedegradative plasmids. J. Bacteriol. 153:532-534.
26. Chatteijee, D. K., and A. M. Chakrabarty. 1984. Restriction mapping of a chlorobenzoate degradative plasmid and molecular cloning of the degradative genes. Gene 27:173-181.
27. Chatteijee, D. K., S. T. Kellogg, S. Hamada, and A. M. Chakrabarty. 1981. Plasmid specifying total degradation of 3-chlorobenzoate by a modified ortho pathway. J. Bacteriol. 146:639-646.
28. Chaudhry, G. R., and S. Chapalamadugu. 1991. Biodégradation of halogenated organic compounds. Microbiol. Rev. 55: 59-79.
29. Clarke, P. H. 1982. The metabolic versatility of pseudomonads. Antonie Leeuwenhoek 48:105-130.
30. Clarke, P. H. 1984. The evolution of degradative pathways, p. 11-27. In D. T. Gibson (ed.), Microbial degradation of organic compounds. Marcel Dekker, Inc., New York.
31. Claverys, J.-P., and S. A. Lacks. 1986. Heteroduplex deoxyribonucleic acid base mismatch repair in bacteria. Microbiol. Rev. 50:133-165. ,
32. Coco, W. M., U. M. X. Sangodkar, and A. M. Chakrabarty. 1989. Recruitment of tft and clc biodegradative pathway genes: modes of evolution. Adv. Appl. Biotechnol. 4 :44-59.
33. Diels, L., and M. Mergeay. 1990. DNA probe-mediated detection of resistant bacteria from soils highly polluted by heavy metals. Appl. Environ. Microbiol. 56:1485-1491.
34. Don, R. H., and J. M. Pemberton. 1981. Properties of six pesticide degradation plasmids isolated from Alcaligenes paradoxus and Alcaligenes eutrophus. J. Bacteriol. 145:681-686.
35. Dorn, E., M. Heliwig, W. Reineke, and H.-J. Knackmuss. 1974. Isolation and characterization of a 3-chlorobenzoate degrading pseudomonad. Arch. Microbiol. 99:61-70.
36. Dorn, E., and H.-J. Knackmuss. 1978. Chemical structure and biodegradability of halo-genated aromatic compounds. Two catechol 1,2-dioxygenases from a 3-chlorobenzoate-grown pseudomonad. Biochem. J. 174:73-84.
37. Doten, R. C., K.-L. Ngai, D. J. Mitchell, and L. N. Ornston. 1987. Cloning and genetic organization of the pea gene cluster from Acinetobacter calcoaceticus. J. Bacterid. 169:31683174.
38. Duggleby, C. L., S. A. Bayley, M. J. Worsey, P. A. Williams, and P. Broda. 1977. Molecular sizes and relationships of TOL plasmids in Pseudomonas. J. Bacterid. 130:1274-1280.
39. Echols, H., and M. F. Goodman. 1991. Fidelity mechanisms in DNA replication. Annu. Rev. Biochem. 60:477-511.
40. Ensley, B. D., B. J. Ratzkin, T. D. Osslund, M. J. Simon, L. P. Wackett, and D. T. Gibson. 1983. Expression of naphthalene oxidation genes in Escherichia coli results in the biosynthesis of indigo. Science 222:167-169.
41. Erickson, B. D., and F. J. Mondello. 1992. Nucleotide sequencing and transcriptional mapping of the genes encoding biphenyl dioxygenase, a multicomponent polychlorinated-biphenyl-degrading enzyme in Pseudononas strain LB400. J. Bacterid. 174:2903-2912.
42. Fetzner, S., R. Muller, and F. Lingens. 1992. Purification and some properties of 2-halobenzoate 1,2-dioxygenase, a twocomponent enzyme system from Pseudomonas cepacia 2CBS. J. Bacterid. 174:279-290.
43. Fewson, C. A. 1988. Microbial metabolism of mandelate: a microcosm of diversity. FEMS Microbiol. Rev. 54:85-110.
44. Franken, S. M., H. J. Rozeboom, K. H. Kalk, and B. W. Dijkstra. 1991. Crystal structure of haloalkane dehalogenase: an enzyme to detoxify halogenated alkanes. EMBO J. 10:12971302.
45. Franklin, F. C. H., P. R. Lehrbach, R. Lurz, B. Rueckert, M. Bagdasarian, and K. N. Timmis. 1983. Localization and functional analysis of transposon mutations in regulatory genes of the TOL catabolic pathway. J. Bacterid. 154:676-685.
46. Frantz, B., and A. M. Chakrabarty. 1986. Degradative plasmids in Pseudomonas, p. 295323. In J. R. Sokatch (ed.), The biology of Pseudomonas. Academic Press, Inc., New York.
47. Frantz, B., and A. M. Chakrabarty. 1987. Organization and nucleotide sequence determination of a gene cluster involved in 3-chlorocatechol degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4460-4464.
48. Fredrickson, J. K., R. J. Hicks, S. W. Li, and F. J. Brockman. 1988. Plasmid incidence in bacteria from deep subsurface sediments. Appl. Environ. Microbiol. 52:2916-2923.
49. Fulthorpe, R. R., and R. C. Wyndham. 1989. Survival and activity of a 3-chlorobenzoate-catabolic genotype in a natural system. Appl. Environ. Microbiol. 55:1584-1590.
50. Fulthorpe, R. R., and R. C. Wyndham. 1991. Transfer and expression of the catabolic plasmid pBRC60 in wild bacterial recipients in a freshwater ecosystem. Appl. Environ. Microbiol. 57:1546-1553.
51. Furukawa, K., N. Arimura, and T. Miyazaki. 1987. Nucleotide sequence of the 2,3-dihydroxybiphenyl dioxygenase gene of Pseudomonasp pseudoalcaligenes. J. Bacteriol. 169:427-429.
52. Furukawa, K., N. Hayase, K. Taira, and N. Tomizuka. 1989. Molecular relationship of chromosomal genes encoding biphenyl/polychlorinated biphenyl catabolism: some soil bacteria possess a highly conserved bph operon. J. Bacteriol. 171:5467- 5472.
53. Furukawa, K., and T. Miyazaki. 1986. Cloning of a gene cluster encoding biphenyl and chlorobiphenyl degradation in Pseudomonas pseudoalcaligenes. J. Bacteriol. 166:392-398.
54. Galas, D. J., and M. Chandler. 1989. Bacterial insertion sequences, p. 109-163. In D. E. Berg and M. M. Howe (ed.), Mobile DNA. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
55. Ghosal, D., and I.-S. You. 1988. Gene duplication in haloaromatic degradative plasmids pJP4 and pJP2. Can. J. Microbiol. 34:709-715.
56. Ghosal, D., and I.-S. You. 1988. Nucleotide homology and organization of chlorocatechol oxidation genes of plasmids pJP4 and pAC27. Mol. Gen. Genet. 211:113-120.
57. Ghosal, D., and I.-S. You. 1989. Operon structure and nucleotide homology of the chlorocatechol oxidation genes of plasmids pAC27 and pJP4. Gene 83:225-232.
58. Gibson, D. T., and V. Subramanian. 1984. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons, p. 181-252. In D. T. Gibson (ed.), Microbial degradation of organic compounds. Marcel Dekker, Inc., New York.
59. Goldstein, R. M., L. M. Mallory, and M. Alexander. 1985. Reasons for possible failure of inoculation to enhance biodégradation. Appl. Environ. Microbiol. 50:977-983.
60. Haigler, B. E., S. F. Nishino, and J. C. Spain. 1988. Degradation of 1,2-dichlorobenzene by a Pseudomonas sp. Appl. Environ. Microbiol. 54:294-301.
61. Haigler, B. E., and J. C. Spain. 1989. Degradation of p-chlorotoluene by a mutant of Pseudomonas sp. strain JS6. Appl. Environ. Microbiol. 55:372-379.
62. Hall, B. G. 1988. Widespread distributions of deletions of the bgl operon in natural isolates of Escherichia coli. Mol. Biol. Evol. 5:456-467.
63. Hall, B. G. 1990. Directed evolution of a bacterial operon. Bioessays 12:551-558.
64. Hancock, J. M., and G. A. Dover. 1990. 'Compensatory slippage' in the evolution of ribo-somal RNA genes. Nucleic Acids Res. 18:5949-5954.
65. Harayama, S., P. R. Lehrbach, and K. N. Timmis. 1984. Transposon mutagenesis analysis of meta-cleavage pathway operon genes of the TOL plasmid of Pseudomonas putida mt-2. J. Bacterid. 160:251-255.
66. Harayama, S., J. L. Ramos, and K. N. Timmis. 1986. Experimental evolution of plasmid-specified functions. Banbury Rep. 24:389-402.
67. Harayama, S., and M. Rekik. 1989. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. J. Biol. Chem. 264:15328-15333.
68. Harayama, S., and M. Rekik. 1990. The meta cleavage operon of TOL degradative plasmid pWWO comprises 13 genes. Mol. Gen. Genet. 221:113-120.
69. Harayama, S., M. Rekik, and K. N. Timmis. 1986. Genetic analysis of a relaxed substrate specificity aromatic ring dioxygenase, toluate 1,2-dioxygenase, encoded by TOL plasmid pWWO of Pseudomonas putida. Mol. Gen. Genet. 202:226- 234.
70. Haugland, R. A., U. M. X. Sangodkar, and A. M. Chakrabarty. 1990. Repeated sequences including RSI 100 from Pseudomonas cepacia AC 1100 function as IS elements. Mol. Gen. Genet. 220:222-228.
71. Hayase, N. K. Taira, and K. Furukawa. 1990. Pseudomonas putida KF715 bphABCD operon encoding biphenyl and polychlorinated biphenyl degradation: cloning, analysis, and expression in soil bacteria. J. Bacteriol. 172:1160-1164.
72. HenikofF, S., G. W. Haughn, J. M. Calvo, and J. C. Wallace. 1988. A large family of bacterial activator proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6602-6606.
73. Horn, J. M., S. Harayama, and K. N. Timmis. 1991. DNA sequence determination of the TOL plasmid (pWWO) xylGFJ genes ofPseudomonasputida: implications for the evolution of aromatic catabolism. Mol. Microbiol. 5:2459-2474.
74. Hughes, E. J., M. K. Shapiro, J. E. Houghton, and L. N. Ornston. 1988. Cloning and expression of pea genes from Pseudomonas putida in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 134:2877-2887.
75. Hutchins, S. R., M. B. Tomson, J. T. Wilson, and C. H. Ward. 1984. Microbial removal of wastewater organic compounds as a function of input concentration in soil columns. Appl. Environ. Microbiol. 48:1039-1045.
76. Imai, R, Y. Nagata, M. Fukuda, M. Takagi, and K. Yang. 1991. Molecular cloning of a Pseudomonas paucimobilis gene encoding a 17-kilodaIton polypeptide that eliminates HCl molecules from y-hexachlorocyclohexane. J. Bacterid. 173:6811- 6819.
77. Inouye, S., A. Nakazawa, and T. Nakazawa. 1981. Molecular cloning of TOL genes xylB and xylE in Eschenichia coli. J. Bacteriol. 145:1137-1143.
78. Inouye, S.„ A. Nakazawa, and T. Nakazawa. 1983. Molecular cloning of regulatory gene xylR and operator-promoter regions of the xylABC and xylDEGF operons of the TOL plasmid. J. Bacteriol. 155:1192-1199.
79. Inouye, S., A. Nakazawa, and T. Nakazawa. 1987. Expression of the regulatory gene xylS on the TOL plasmid is positively controlled by the xylR gene product. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5182-5186.
80. Irie, S., S. Doi, T. Yorifiiji, M. Takagi, and K. Yano. 1987. Nucleotide sequencing and characterization of the genes encoding benzene oxidation enzymes of Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 169:5174-5179.
81. Jeenes, D. J., W. Reineke, H.-J. Knackmuss, and P. A. Williams. 1982. TOL plasmid pWWO in constructed halobenzoate- degrading Pseudomonas strains: enzyme regulation and DNA structure. J. Bacteriol. 150:180-187.
82. Jobling, M. G., S. E. Peters, and D. A. Ritchie. 1988. Plasmid-borne mercury resistance in aquatic bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 49:32-37.
83. Kabisch, M., and P. Fortnagel. 1990. Nucleotide sequence of metapyrocatechase I (catechol 2,3-oxygenase I) gene mpcl from Alcaligenes eutrophus JMP222. Nucleic Acids Res. 18: 3405-3406.
84. Kaluza, K., M. Hahn, and H. Hennecke. 1985. Repeated sequences similar to insertion elements clustered around the nif region of the Rhizobium japonicum genome. J. Bacteriol. 162:535-542.
85. Kaphammer, B., J. J. Kukor, and R. H. Olsen. 1990. Regulation of tfdCDEF by tfdR of the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation plasmid pJP4. J. Bacteriol. 172:2280-2286.
86. Kap hammer, B., and R. H. Olsen. 1990. Cloning and characterization of tfdS, the repres-sor-activator gene of tfdB, from the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid catabolic plasmid pJP4. J. Bacteriol. 172:5856-5862.
87. Keil, H., M. R. Lebens, and P. A. Williams. 1985. TOL plasmid pWW15 contains two nonhomologous, independently regulated catechol 2,3-oxygenase genes. J. Bacteriol. 163:248-255.
88. Khan, A. A., and S. K. Walia. 1991. Expression, localization, and functional analysis of polychlorinated biphenyl degradation genes cbpABCD of Pseudomonas putida. Appl. Environ. Microbiol. 57:1325-1332.
89. Kilbane, J. J. 1986. Genetic aspects of toxic chemical degradation. Microb. Ecol. 12: DSNS.
90. Kirsthein, J. D., H. W. Paerl, and J. Zehr. 1991. Amplification, cloning, and sequencing of a nifH segment from aquatic microorganisms and natural communities. Appl. Environ. Mi. crobiol. 57:2645-2650.
91. Kivisaar, M., L. Kasak, and A. Nurk 1991. Sequence of the plasmid-encoded catechol 1,2-dioxygenase-expressing gene, pheB, of phenol-degrading Pseudomonas sp. strain EST1001. Gene 98:15-20.
92. Kivisaar, M. A., J. K. Habicht, and A. L. Heinaru. 1989. Degradation of phenol and m-toluate in Pseudomonas sp. strain EST1001 and its Pseudomonas putida transconjugants is determined by a multiplasmid system. J. Bacteriol. 171:5111-5116.
93. Klecka, G. M., and D. T. Gibson. 1981. Inhibition of catechol 2,3-dioxygenase from Pseudomonas putida by 3-chlorocatechol. Appl. Environ. Microbiol. 41:1159-1165.
94. Klein, T. M., and M. Alexander. 1986. Bacterial inhibitors in lake water. Appl. Environ. Microbiol. 52:114-118.
95. Klingmuller, W. 1991. Plasmid transfer in natural soil: a case by case study with nitrogen-fixing Enterobacter. FEMS Microbiol. Ecol. 85:107-116.
96. Kobori, H., C. W. Sullivan, and H. Shizuya. 1984. Bacterial plasmids in antarctic natural microbial assemblages. Appl. Environ. Microbiol. 48:515-518.
97. Kohler, T., S. Harayama, J.-L. Ramos, and K. N. Timmis. 1989. Involvement of Pseudomonas putida RpoN a factor in regulation of various metabolic functions. J. Bacteriol. 171: 4326-4333.
98. Krockel, L., and D. D. Focht. 1987. Construction of chlorobenzene- utilizing recombinants by progenitive manifestation of a rare event. Appl. Environ. Microbiol. 53:2470-2475.
99. Kuhm, A. E., M. Schlomann, H.-J. Knackmuss, and D. H. Pieper. 1990. Purification and characterization of dichloromuconate cycloisomerase from Alcaligenes eutrophus JMP134. Biochem. J. 266:877-883.
100. Kuhm, A. E., A. Stolz, K.-L. Ngai, and H.-J. Knackmuss. 1991. Purification and characterization of a 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase from a bacterium that degrades naphthalenesulfonic acids. J. Bacteriol. 173:3795-3802.
101. Kukor, J. J., R. H. Olsen, and D. P. Ballou. 1988. Cloning and expression of the catA and catBC gene clusters from Pseudomonas aeruginosa PAO. J. Bacteriol. 170:4458-4465.
102. Kunkel, T. A., and A. Soni. 1988. Mutagenesis by transient misalignment. J. Biol. Chem. 263:14784-14789.
103. Kurkela, S., H. Lehvaslaiho, E. T. Palva, and T. H. Teen. 1988. Cloning, nucleotide sequence and characterization of genes encoding naphthalene dioxygenase of Pseudomonas putida strain NCEB9816. Gene 73:355-362.
104. Lai, M.-D., and K. L. Beattle. 1988. Influence of DNA sequence on the nature of mispair-ing during DNA synthesis. Biochemistry 27:1722-1728.
105. Latorre, J., W. Reineke, and H.-J. Knackmuss. 1984. Microbial metabolism of chloroanili-nes: enhanced evolution by natural genetic exchange. Arch. Microbiol. 140:159-165.
106. Leahy, J. G., and R. R. Colwell. 1990. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbiol. Rev. 54:305-315.
107. Lehrbach, P. R, I. McGregor, J. M. Ward, and P. Broda. 1983. Molecular relationships between Pseudomonas Inc P-9 degradative plasmids TOL, NAH and SAL. Plasmid 10:164174.
108. Lehrbach, P. R., J. Zeyer, W. Reineke, H.-J. Knackmuss, and K. N. Timmis. 1984. Enzyme recruitment in vitro: use of cloned genes to extend the range of haloaromatics degraded by Pseudomonas sp. strain B13. J. Bacteriol. 158:1025-1032.
109. Levinson, G., and G. A. Gutman. 1987. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Mol. Biol. Evol. 4:203-221.
110. Locher, H. H., T. Leisinger, and A. M. Cook 1991. 4-Toluene sulfonate methyl-monooxygenase from Comamonas testosterone T-2: purification and some properties of the oxygenase component. J. Bacteriol. 173:3741-3748.
111. Lopilato, J., and A. Wright. 1990. Mechanisms of activation of the cryptic bgl operon of Escherichia coli K-12, p. 435-445. In K. Drlica and M. Riley (ed.), The bacterial chromosome. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
112. Lorenz, M. G., B. W. Aardema, and W. Wackernagel. 1988. Highly efficient genetic transformation of Bacillus subtilis attached to sand grains. J. Gen. Microbiol. 134:107-112.
113. Lorenz, M. G., D. Genets, and W. Wackemagel. 1991. Release of transforming plasmid and chromosomal DNA from two cultured soil bacteria. Arch. Microbiol. 156:319-327.
114. Madsen, E. L., J. L. Sinclair, and W. C. Ghiorse. 1991. In situ biodégradation: microbiological patterns in a contaminated aquifer. Science 252:830-833.
115. Markus, A., D. Krekel, and F. Lingens. 1986. Purification and some properties of component A of the 4-chlorophenylacetate 3,4-dioxygenase from Pseudomonas species strain CBS. J. Biol. Chem. 261:12883-12888.
116. Meulien, P., R. G. Downing, and P. Broda. 1981. Excision of the 40kb segment of the TOL plasmid from Pseudomonas putida mt-2 involves direct repeats. Mol. Gen. Genet. 184:97101.
117. Mittler, J. E., and R. E. Lenski. 1990. New data on excisions of Mu from E. coli MCS2 cast doubt on directed mutation hypothesis. Nature (London) 344:173-175.
118. Mittler, J. E., and R. E. Lenski. 1992. Experimental evidence for an alternative to directed mutation in the bgl operon. Nature (London) 356:446-448.
119. Modrich, P. 1987. DNA mismatch correction. Annu. Rev. Biochem. 56:435-466.
120. Mokross, H., E. Schmidt, and W. Reineke. 1990. Degradation of 3-chlorobiphenyl by in vivo constructed hybrid pseudomonads. FEMS Microbiol. Lett. 71:179-186.
121. Mondello, F. J. 1989. Cloning and expression in Escherichia coli of Pseudomonas strain LB400 genes encoding polychlorinated biphenyl degradation. J. Bacteriol. 171:1725-1732.
122. Nakai, C., K. Horiike, S. Kuramitsu, H. Kagamilyama, and M. Nozaki. 1990. Three isozymes of catechol 1,2-dioxygenase (pyrocatechase), aa, al, and ,B3, from Pseudononas arvilla C-l. J. Biol. Chem. 265:660-665.
123. Nakatsu, C., J. Ng, R. Singh, N. Straus, and C. Wyndham. 1991. Chlorobenzoate catabolic transposon TnS271 is a composite class I element with flanking class II insertion sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8312-8316.
124. Nakazawa, T., S. Inouye, and A. Nakazawa. 1980. Physical and functional mapping of RP4-TOL plasmid recombinants: analysis of insertion and deletion mutants. J. Bacteriol. 144:222-231.
125. Negoro, S., S. Nakamura, and H. Okada. 1984. DNA-DNA hybridization analysis of nylon oligomer-degradative plasmid pOAD2: identification of the DNA region analogous to the nylon oligomer degradation gene. J. Bacteriol. 158:419-424.
126. Neidle, E. L., C. Hartnett, and L. N. Ornston. 1989. Characterization of Acinetobacter calcoaceticus catM, a repressor gene homologous in sequence to transcriptional activator genes. J. Bacteriol. 171:5410-5421.
127. Neidle, E. L., and L. N. Ornston. 1986. Cloning and expression of Acinetobacter calcoace-ticus catechol 1,2-dioxygenase structural gene cat A in Escherichia coli. J. Bacteriol. 168:815- 820.
128. Nordlund, I., J. Powlowski, and V. Shingler. 1990. Complete nucleotide sequence and polypeptide analysis of multicomponent phenol hydroxylase from Pseudomonas sp. strain CF600. J. Bacteriol. 172:6826-6833.
129. Nordlund, I., and V. Shingler. 1990. Nucleotide sequences of the meta-cleavage pathway enzymes 2-hydroxymuconic semialdehyde dehydrogenase and 2-hydroxymuconic semialdehyde hydrolase from Pseudomonas CF600. Biochim. Biophys. Acta 1049:227-230.
130. Oltmanns, RH., H. G. Rast, and W. Reineke. 1988. Degradation of 1,4-dichlorobenzene by constructed and enriched strains. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28:609-616.
131. Osborne, D. J., R. W. Pickup, and P. A. Wldliams. 1988. The presence of two complete homologous meta pathway opérons on TOL plasmid pWW53. J. Gen. Microbiol. 134:2965-2975.
132. Parker, L. L., P. W. Betts, and B. G. Hall. 1988. Activation of a cryptic gene by excision of a DNA fragment. J. Bacteriol. 170:218-222.
133. Paul, J. H., L. Cazares, and J. Thurmond. 1990. Amplification of the rbcL gene from dissolved and particulate DNA from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 56:1963- 1966.
134. Perkins, E. J., M. P. Gordon, 0. Caceres, and P. F. Lurquin. 1990. Organization and ser quence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and dichlorocatechol oxidative opérons of plasmid pJP4. J. Bacteriol. 172:2351-2359.
135. Perkins, E. J., and P. F. Lurquin. 1988. Duplication of a 2,4-dichlorophenoxyacetic acid monooxygenase gene in Alcaligenes eutrophus JMP134(pJP4). J. Bacteriol. 170:56695672.
136. Peterson, K. R., N. Ossanna, A. T. Thliveris, D. G. Ennis, and D. W. Mount. 1988. Derepression of specific genes promotes DNA repair and mutagenesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 170:1-4.
137. Pettigrew, C. A., B. E. Haigler, and J. C. Spain. 1991. Simultaneous biodégradation of chlorobenzene and toluene by a Pseudomonas strain. Appl. Environ. Microbiol. 57:157162.
138. Pettigrew, C. A., and G. S. Sayler. 1986. The use of DNA.DNA colony hybridization in the rapid isolation of 4-chlorobiphenyl degradative bacterial phenotypes. J. Microbiol. Methods 5:205-213.
139. Pickup, R. W. 1991. Development of molecular methods for the detection of specific bacteria in the environment. J. Gen. Microbiol. 137:1009-1019.
140. Pieper, D. H., A. E. Kuhm, K. Stadler-Fritzsche, P. Fischer, and H.-J. Knackmuss. 1991. Metabolization of 3,5-dichlorocatechol byAlcaligenes eutrophus JMP 134. Arch. Microbiol. 156:218-222.
141. Pieper, D. H., W. Reineke, K.-H. Engesser, and H.-J. Knackmuss. 1988. Metabolism of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 4-chloro-2-methylphenoxyacetic acid and 2- methyl-phenoxyacetic acid by Alcaligenes eutrophus JMP134. Arch. Microbiol. 150:95-102.
142. Ramos, J. L., and K. N. Timmis. 1987. Experimental evolution of catabolic pathways of bacteria. Microbiol. Sci. 4:228-237.
143. Ramos, J. L., A. Wasserfallen, K Rose, and K. N. Timmis. 1987. Redesigning metabolic routes: manipulation of TOL plasmid pathway for catabolism of alkylbenzoates. Science 235:593-596.
144. Rangnekar, V. M. 1988. Variation in the ability of Pseudomonas sp. strain B13 cultures to utilize meta-chlorobenzoate is associated with tandem amplification and deamplification of DNA. J. Bacterid. 170:1907-1912.
145. Reineke, W. 1984. Microbial degradation of halogenated aromatic compounds, p. 319-360. In D. T. Gibson (ed.), Microbial degradation of organic compounds. Marcel Dekker, Inc., New York.
146. Reineke, W., D. J. Jeenes, P. A. Williams, and H.-J. Knackmuss. 1982. TOL plasmid pWWO in constructed halobenzoatedegrading Pseudomonas strains: prevention of meta pathway. J. Bacteriol. 150:195-201.
147. Reineke, W., and H.-J. Knackmuss. 1988. Microbial degradation of haloaromatics. Annu. Rev. Microbiol. 42:263-287.
148. Reynolds, A. E., J. Felton, and A. Wright. 1981. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature (London) 293:625-629.
149. Rochelle, P. A, M. J. Day, and J. C. Fry. 1988. Occurrence, transfer and mobilization in epilithic strains of Acinetobacter of mercury-resistance plasmids capable of transformation. J. Gen. Microbiol. 134:2933-2941.
150. Rochelle, P. A., J. C. Fry, and M. J. Day. 1989. Factors affecting conjugal transfer of plasmids encoding mercury resistance from pure cultures and mixed natural suspension of epilithic bacteria. J. Gen. Microbiol. 135:409-424.
151. Rochelle, P. A., J. C. Fry, and M. J. Day. 1989. Plasmid transfer between Pseudomonas spp. within epilithic films in a rotating disc microcosm. FEMS Microbiol. Ecol. 62:127136.
152. Rochelle, P. A., M. K. Wetherbee, and B. H. Olson. 1991. Distribution of DNA sequences encoding narrow- and broadspectrum mercury resistance. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1581-1589.
153. Rojo, F., D. H. Pieper, K.-H. Engesser, H.-J. Knackmuss, and K. N. Timmis. 1987. Assemblage of ortho cleavage route for simultaneous degradation of chloro- and methylaromatics. Science 238:1395-1398.
154. Saint, C. P., N. C. McClure, and W. A. Venables. 1990. Physical map of the aromatic amine and m-toluate catabolic plasmid pTDNl in Pseudomonas putida: location of a unique meta-cleavage pathway. J. Gen. Microbiol. 136:615-625.
155. Sander, P., R.-M. Wittich, P. Fortnagel, H. Wilkes, and W. Francke. 1991. Degradation of12.4-trichloro- and 1,2,4,5- tetrachlorobenzene by Pseudomonas strains. Appl. Environ. Microbiol. 57:1430-1440.
156. Sayler, G. S., S. W. Hooper, A. C. Layton, and J. M. H. King. 1990. Catabolic plasmids of environmental and ecological significance. Microb. Ecol. 19:1-20.
157. Sayler, G. S., and A. C. Layton. 1990. Environmental application of nucleic acid hybridization. Annu. Rev. Microbiol. 44:625-648.
158. Schell, M. A. 1985. Transcriptional control of the nah and sal hydrocarbon-degradation operons by the nahR gene product. Gene 36:301-309.
159. Schell, M. A., and M. Sukordhaman. 1989. Evidence that the transcription activator encoded by the Pseudomonas putida nahR gene is evolutionarily related to the transcription activators encoded by the Rhizobium nodD.genes. J. Bacterid. 171:1952-1959.
160. Schlomann, M., P. Fischer, E. Schmidt, and H.-J. Knackmuss. 1990. Enzymatic formation, stability, and spontaneous reactions of 4-fluoromuconolactone, a metabolite of the bacterial degradation of 4-fluorobenzoate. J. Bacteriol. 172:5119-5129.
161. Schlomann, M., E. Schmidt, and H.-J. Knachmuss. 1990. Different types of dienelactone hydrolase in 4-fluorobenzoateutilizing bacteria. J. Bacterid. 172:5112-5118.
162. Schmidt, E., and H.-J. Knackmuss. 1980. Chemical structure and biodegradability of halo-genated aromatic compounds. Conversion of chlorinated muconic acids into maleoylacetic acid. Biochem. J. 192:339-347.
163. Schmidt, E., G. Remberg, and H.-J. Knackmuss. 1980. Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds. Halogenated muconic acids as intermediates. Biochem. J. 192:331-337.
164. Schneider, B., R. Mfiller, R Frank, and F. Lingens. 1991. Complete nucleotide sequences and comparison of the structural genes of two 2-haloalkanoic acid dehalogenases from Pseudomonas sp. strain CBS3. J. Bacterid. 173:1530-1535.
165. Scholten, J. D., K.-H. Chang, P. C. Babbitt, H. Charest, M. Sylvestre, and D. Dunaway-Mariano. 1991. Novel enzymic hydrolytic dehalogenation of a chlorinated aromatic. Science 253:182-185.
166. Schuitt, C. 1989. Plasmids in the bacterial assemblage of a dystrophic lake: evidence for plasmid-encoded nickel resistance. Microb. Ecol. 17:49-62.
167. Schweizer, D., A. Markus, M. Seez, H. H. Ruf, and F. Lingens. 1987. Purification and some properties of component B of the 4-chlorophenylacetate 3,4-dioxygenase from Pseudomonas species strain CBS3. J. Biol. Chem. 262:9340-9346.
168. Schwien, U., E. Schmidt, H.-J. Knachmuss, and W. Reineke. 1988. Degradation of chloro-substituted aromatic compounds by Pseudomonas sp. strain B13: fate of 3,5-dichlorocatechol. Arch. Microbiol. 150:78-84.
169. Scordilis, G. E., H. Ree, and T. G. Lessie. 1987. Identification of transposable elements which activate gene expression in Pseudomonas cepacia. J. Bacteriol. 169:8-13.
170. Shaw, L. E., and P. A. Williams. 1988. Physical and functional mapping of two cointegrate plasmids derived from RP4 and TOL plasmid pDKl. J. Gen. Microbiol. 134:2463-2474.
171. Shimp, R. J., and F. K. Pfaender. 1987. Effect of adaptation to phenol on biodégradation of monosubstituted phenols by aquatic microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 53:1496-1499.
172. Shingler, V., J. Powlowsld, and U. Marklund. 1992. Nucleotide sequence and functional analysis of the complete phenol/3,4- dimethylphenol catabolic pathway of Pseudomonas sp. strain CF600. J. Bacteriol. 174:711-724.
173. Smit, E., and J. D. van Elsas. 1990. Determination of plasmid transfer frequency in soil. Consequences of bacterial mating on selective agar media. Curr. Microbiol. 21:151-157.
174. Spain, J. C., and S. F. Nishino. 1987. Degradation of 1,4- dichlorobenzene by a Pseudomonas sp. Appl. Environ. Microbiol. 53:1010-1019.
175. Spain, J. C., and P. A. van Veld. 1983. Adaptation of natural microbial communities to degradation of xenobiotic compounds: effects of concentration, exposure, time, inoculum, and chemical structure. Appl. Environ. Microbiol. 45:428-435.
176. Spooner, R. A., K. Lindsay, and F. C. H. Franklin. 1986. Genetic, functional and sequence analysis of thexylR and xylS regulatory genes of the TOL plasmid pWWO. J. Gen. Microbiol. 132:1347-1358.
177. Stainthorpe, A. C., V. Lees, G. P. C. Salmond, H. Dalton, and J. C. Murrell. 1990. The methane monooxygenase gene cluster of Methylococcus capsulatus (Bath). Gene 91:27-34.
178. Steffan, R. J., and R. M. Atlas. 1988. DNA amplification to enhance detection of genetically engineered bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 54:21852191.
179. Steffan, R. J., and R. M. Atlas. 1991. Polymerase chain reaction: applications in environmental microbiology. Annu. Rev. Microbiol. 45:137-161.
180. Steffan, R. J., A. Breen, R. M. Atlas, and G. S. Sayler. 1989. Application of gene probe methods for monitoring specific microbial populations in freshwater ecosystems. Can. J. Microbiol. 35:681-685.
181. Stephens, G. M., J. M. Sidebotham, N. H. Mann, and H. Dalton. 1989. Cloning and expression in Escherichia coli of the toluene dioxygenase gene from Pseudomonas putida NCIB11767. FEMS Microbiol. Lett. 57:295-300.
182. Stotzky, G., and H. Babich. 1986. Survival of, and genetic transfer by, genetically engineered bacteria in natural environments. Adv. Appl. Microbiol. 31:93-135.
183. Streber, W. R., K. N. Timmis, and M. H. Zenk. 1987. Analysis, cloning, and high-level expression of 2,4-dichlorophenoxyacetate monooxygenase gene fd4 of Alcaligenes eutro-phus. J. Bacterid. 169:2950-2955.
184. Suzuki, M., T. Hayakawa, J. P. Shaw, M. Rekik, and S. Harayama. 1991. Primary structures of xylene monooxygenase: similarities to and differences from the alkane hydroxyla-tion system. J. Bacteriol. 173:1690-1695.
185. Swindoll, C. M., C. M. Aelion, and F. K. Pfaender. 1988. Influence of inorganic and organic nutrients on aerobic biodégradation and on the adaptation response of subsurface microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 54:212-217.
186. Taira, K., N. Hayase, N. Arimura, S. Yamashita, T. Miyazaki, and K. Fumkawa. 1988. Cloning and nucleotide sequence of the 2,3-dihydroxybiphenyl dioxygenase gene from the PCB-degrading strain of Pseudomonas paucimobilis Ql. Biochemistry 27:3990-3996.
187. Taira, K., J. Hirose, S. Hayashida, and K. Furukawa. 1992. Analysis of bph operon from the polychlorinated biphenyldegrading strain of Pseudononas pseudoalcaligenes KF707. J. Biol. Chem. 267:4844-4853.
188. Tautz, D., M. Trick, and G. A. Dover. 1986. Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation. Nature (London) 322:652-656.
189. Thomas, A. W., J. H. Slater, and A. J. Weightman. 1992. The dehalogenase genes dehl from Pseudomonas putida PP3 is carried on an unusual mobile genetic element designated DEH. J. Bacteriol. 174:1932-1940.
190. Thomas, A. W., A. W. Topping, J. H. Slater, and A. J. Weightman. 1992. Localization and functional analysis of structural and regulatory dehalogenase genes carried on DEH from Pseudomonas putida PP3. J. Bacteriol. 174:1941-1947.
191. Timmis, K. N., F. Rojo, and J. L. Ramos. 1990. Design of new pathways for the catabolism of environmental pollutants. Adv. Appl. Biatechnol. 4:61-82.
192. Tomasek, P. H., B. Frantz, U. M. X. Sangodkar, R. A. Haugland, and A. M. Chakrabarty. 1989. Characterization and nucleotide sequence determination of a repeat element isolated from a 2,4,5-T degrading strain of Pseudomonas cepacia. Gene 76:227-238.
193. Tsuda, M., and T. lino. 1988. Identification and characterization of Tn4653, a transposon covering the toluene transposon Tn4651 on TOL plasmid pWWO. Mol. Gen. Genet. 213:72-77.
194. Tsuda, M., and T. lino. 1990. Naphthalene degrading genes on plasmid NAH7 are on a defective transposon. Mol. Gen. Genet. 223:33-39.
195. Walia, S., A. Khan, and N. Rosenthal. 1990. Construction and applications of DNA probes for detection of polychlorinated biphenyl-degrading genotypes in toxic organic-contaminated soil environments. Appl. Environ. Microbiol. 56:254-259.
196. Weier, W. J., J. Hofsteenge, J. M. Verejjken, P. A. Jekel, and J. J. Beintema. 1982. Primary structure ofp-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens. Biochim. Bio-phys. Acta 704:385-388.
197. Weisburg, W. G., S. M. Barns, D. A. Pelletier, and D. J. Lane. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. 173:697-703.
198. Weisshaar, M.-P., F. C. H. Franklin, and W. Reineke. 1987. Molecular cloning and expression of the 3-chlorobenzoatedegrading genes from Pseudomonas sp. strain B13. J. Bacterid. 169:394-402.
199. Weller, R., J. W. Weller, and D. M. Ward. 1991. 16S rRNA sequences of uncultivated hot spring cyanobacterial mat inhabitants retrieved as randomly primed cDNA. Appl. Environ. Microbiol. 57:1146-1151.
200. Wickham, G. S., and R. M. Atlas. 1988. Plasmid frequence fluctuations in bacterial populations from chemically stressed soil communities. Appl. Environ. Microbiol. 54:2192-2196.
201. Williams, P. A., S. J. Assinder, and L. E. Shaw. 1990. Construction of hybrid xylE genes between the two duplicate homologous genes from TOL plasmid pWW53: comparison of the kinetic properties of the gene products. J. Gen. Microbiol. 136:1583-1589.
202. Williams, P. A., and K. Murray. 1974. Metabolism of benzoate and the methylbenzoates by Pseudomonas putida (arvilla) mt-2: evidence for the existence of a TOL plasmid. J. Bacterid. 120:416-423.
203. Williams, P. A., and M. J. Worsey. 1976. Ubiquity of plasmids in coding for toluene and xylene metabolism in soil bacteria: evidence for the existence of new TOL plasmids. J. Bacteriol. 125:818-828.
204. Wilson, J. T., C. G. Enfield, W. J. Dunlap, R. L. Cosby, D. A. Foster, and L. B. Baskln. 1981. Transport and fate of selected organic pollutants in a sandy soil. J. Environ. Qual. 10:501- 506.
205. Wood, M. S., C. Lory, and T. G. Lessie. 1990. Activation of the lac genes of Tn951 by insertion sequences from Pseudomonas cepacia. J. Bacteriol. 172:1719-1724.
206. Wyndham, R. C., R. K. Singh, and N. A. Straus. 1988. Catabolic instability, plasmid gene deletion and recombination in Alcaligenes sp. BR60. Arch. Microbiol. 150:237-243.
207. Yen, K.-M., and C. M. Serdar. 1988. Genetics of naphthalene catabolism in pseudomonads. Crit. Rev. Microbiol. 15:247-268.
208. You, I.-S., D. Ghosal, and I. C. Gunsalus. 1991. Nucleotide sequence analysis of the Pseudomonas putida PpG7 salicylate hydroxylase gene (nahG) and its 3-flanking region. Biochemistry 30:1635-1641.
209. Zafarullah, M„ D. Charlier, and N. Glansdorff. 1981. Insertion of IS3 can "turn-on" a silent gene in Eschenichia coli. J. Bacteriol. 146:415-417.
210. Zeph, L. R, M. A. Onaga, and G. Stotzky. 1988. Transduction of Eschenchia coli by bacteriophage PI in soil. Appl. Environ. Microbiol. 54:1733-1737.
211. Zhou, L., K. N. Timmis, and J. L. Ramos. 1990. Mutations leading to constitutive expression from the TOL plasmid meta-cleavage pathway operon are located at the C-terminal end of the positive regulator protein XylS. J. Bacteriol. 172: 3707-3710.
212. Zylstra, G. J., and D. T. Gibson. 1989. Toluene degradation by Pseudomonasputida Fl. J. Biol. Chem. 264:14940-14946.
213. Zylstra, G. J., W. R. McCombie, D. T. Gibson, and B. A. Finette. 1988. Toluene degradation by Pseudomonas putida Fl: genetic organization of the tod operon. Appl. Environ. Microbiol. 54:1498-1503.
214. Zylstra, G. J., R. H. Olsen, and D. P. Ballon. 1989. Cloning, expression, and regulation of the Pseudomonas cepacia protocatechuate 3,4-dioxygenase genes. J. Bacteriol. 171:59075914.
215. Zylstra, G. J., R. H. Olsen, and D. P. Ballou. 1989. Genetic organization and sequence of the Pseudomonas cepacia genes for the alpha and beta subunits of protocatechuate 3,4-dioxygenase. J. Bacteriol. 171:5915-5921.
216. Anzai Y, Kim H, Park JY, Wakabayashi H, Oyaizu H. Phylogenetic affiliation of the pseu-domonads based on 16S rRNA sequence. 2000. Int. J. Syst. Evol Microbiol. V.50. Pt 4. P. 1563-1589.
217. Maniatis T., Sambrook J., Fritsch E.F //Molecular cloning: a laboratory. 2nd ed. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 450 P.
218. Ficker, M., Krastel, K., Orlicky, S., and Edwards, E., Molecular characterization of a toluene-degrading methanogenic consortium. Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol. 65, no. 12, pp. 5576-5585.
219. Greene, E.A., Kay, J.G., Jaber, K., Stehmeier, L.G., and Voordouw, G. Composition of soil microbial communities enriched on a mixture of aromatic hydrocarbons. Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol. 66, no. 12, pp. 5282-5289.
220. Moller, S., Sternberg, C., Andersen, J., Christensen, B.-B., Ramos, J.-L., Givskov, M., and Molin, S. Establishment of new genetic traits in a microbial biofilm community. Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol. 64, no. 2, pp. 721-732.
221. Gibson, J., and C. S. Harwood. 2002. Metabolic diversity in aromatic compound utilization by anaerobic microbes. Annu. Rev. Microbiol. 56:345-369.
222. Nakazawa T Kojima Y, Fujisawa H, Nakazawa A, , Kanetsuna F, Taniuchi H, Nozaki M, Hayaishi O. Studies on pyrocatechase. I. Purification and spectral properties. J. Biol. Chem. 1978 V. 242. no. 14.P. 3270-3278.
223. Nozaki M, Kagamiyama H, Hayaishi O. Crystallization and some properties of metapyro-catechase. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 2. V. 11. P. 65-69.
224. Pieper, D. H., and W. Reineke. 2001. Engineering bacteria for bioremediation. Curr. Opin. Biotechnol. 11:262-270.
225. Deo, P. G., and N. G. Karanth. 1994. Biodégradation of hexachlorocyclohexane isomers in soil and food environment. Crit. Rev. Microbiol. 20:57-78.
226. Okuta A, Ohnishi K, Harayama S. PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene. 1998. V. 212. no.2. P.221-228.
227. Mishra, V., R. Lai, and Srinivasan. 2001. Enzymes and opérons mediating xenobiotic degradation in bacteria. Crit. Rev. Microbiol. 27:133-166.
228. Анисимова JI.A, Андреева А.Л., Воронин A.M. Устойчивость к оловоорганическим соединениям, обусловленная плазмидами из бактерий рода Pseudomonas. Антибиот. мед. биотехнол. 1985. Т. 30. № 5. С. 337-341.
229. Бактерии рода Pseudomonas// Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Киев.: Наук, думка., 1990.-264 с.
230. Воронин A.M., Балашов C.B., Грищенков В.Г., Козлова Е.В., Кочетков В.В., Соколов С.Л. Биология плазмид бактерий Pseudomonas. //Информационный бюллетень РФФИ. 1995, №3, Т. 4, с. 427.
231. Воронин А.М., Цой T.B. Генетические системы биодеградации: организация и регуляция экспрессии. Генетика. 1989. Т. 25. № 4. С. 581-594.
232. Воронин А.М, Цой Т.В, Кошелева И.А, Аринбасаров М.У., Аданин М.В. Клонирование в клетках Escherichia coli генов Pseudomonas putida, ответственных за основные этапы окисления. Генетика. 1989. Т. 25. № 2. С. 226-37.
233. Воронин А.М, Кулакова А.Н, Цой Т.В, Кошелева И.А, Кочетков В.В. Молчащие гены мета-пути окисления катехола у плазмид биодеградации нафталина. Докл. Акад. Наук СССР. 1988. Т. 299. № 1. С. 237-2340.
234. Воронин А.М, Анисимова Л.А., Головлева Л.А, Джусупова Д.В., Скрябин Г.К. Участие плазмид в в деградации альфа-метилстирола Микробиология. 1985 Т. 54.№ 5. С. 854-856.
235. Воронин А.М., Филонов А.Е., Балакшина В.В., Кулакова А.Н. стабильность плазмид биодеградации нафталина NPL-1 и NPL-41 в популяции Pseudomonas putida при длительном культивировании. Микробиология. 1985. Т. 54. № 4. С. 610-615.
236. Воронин А.М. Биология плазмид // Успехи микробиологи. М.: Наука, 1983.- Т. 18.-с.163-183.
237. Воронин А.М. Плазмиды резистентности и биодеградации бактерий рода Pseudomonas: Дисс. д-ра биол. наук. М., 1987. 500 с.
238. Головлева Л.А, Воронин А.М, Алиева P.M., Рустемов С.А., Кочетков С.А. Деградация альфа-метилстирола и толуола плазмид-содержащими штаммами рода Pseudomonas. Изв. Акад. Наук СССР. Биол. 1988. №4 С. 558-564.
239. Головлева Л. А., Воронин А.М, Алиева P.M., Рустемов С.А., Кочетков С. А. Деградация альфа-метилстирола и толуола плазмид-содержащими штаммами рода Pseudomonas. Изв. Акад. Наук СССР. Биол. 1988. №4 С. 558-564.
240. Генетика промышленных микроорганизмов// Под ред. акад. В.Г. Дебабова. М.: Наука., 1990. 278 с.
241. Измалкова Е.Ю., Сазонова О.И, Соколов С.Л., Кошелева И.А, Боронин А.М. Разнообразие генетических систем, отвечающих за деградацию нафталина у различных штаммов Pseudomonas fluorescens. Микробиология. 2005.Т. 74., №1. С. 70-78.
242. Кошелева И.А, Балашова Н.В., Измалкова Е.Ю, Филонов А.Е., Соколов С.Л, Сле-пенькин A.B., Боронин А.М. Деградация фенантрена мутантными штаммами нафталин-деструкторов. Микробиология. 2000., Т. 69., №6. С. 783-789.
243. Кошелева И.А, Соколов С.Л, Балашова Н.В., Филонов А.Е., Мелешко Е.И., Гаязов Р.Р., Боронин А.М. Генетический контроль биодеградации нафталина штаммом of Pseudomonas sp. 8909N. Генетика. 1997., Т. 33, № 6. С. 762-768.
244. Кошелева И.А Цой Т.В, Ивашина Т.В., Селифонов С.А., Старовойтов И.И. Мутации плазмиды pBS286, блокирующие начальные стадии окисления нафталина, индуцированные Тп5-транспозоном. Генетика. 1988. Т. 24. № 3. С. 396-404.
245. Кошелева И.А, Кошелева И.А, Кулакова А.Н, Боронин А.М. Сравнительный анализ организации плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина у Pseudomonas putida и ее производных. Генетика. 1986. Т. 22. № 10. С. 2389-97.
246. Кочетков В.В., Боронин А.М. Плазмиды биодеградации нафталина несовместимые с IncP-2 и IncP-7 группами плазмид. Генетика. 1985. Т. 21. № 4. С. 522-529.
247. Кулакова А.Н., Кулаков Л.А., Воронин A.M. Клонирование генов деградации 3-хлоробензоата из штамма Pseudomonas putida 87. Генетика. 1991.Т. 27. № 10.С. 16971704.
248. Мавроди Д.В., Коноваленко Н.П., Соколов С.Л., Парфенюк В.Г., Кошелева И.А, Воронин А.М. Идентификация ключевых ферментов катаболизма нафталина в препаратах ДНК из почвы. Микробиология. 2003.,Т.72., №5. С. 672-680.
249. Соколов С.Л., Кошелева И.А, Филонов А.Е, Воронин A.M. Влияние транспозонов на экспрессию генов биодеградации нафталина у Pseudomonas putida BS202(NPL-1) и производных штамма. Микробиология. 2005., Т.74., №1.С.79-86.
250. Цой Т.В, Кошелева И.А, Замараев B.C., Трелина О.В., Селифонов С.А. Клонирование и экспрессия в клетках Escherichia coli генов Pseudomonas putida контролирующих активность катехол-2,3-диоксигеназы. Генетика. 1988 Т. 24. № 9. С. 1550-1561.
251. Цой Т.В, Грибанова Л.К., Кошелева И.А, Воронин А.М. Клонирование и локализация регионов репликации и мобилизации на D-плазмиде широкого круга хозяев pBS286 (IncP-9) из Pseudomonas putida. Генетика. 1988. Т. 24. № 6. С. 980-92.
252. Цой Т.В, Кошелева И.А, Воронин А.М. Nah-гены Pseudomonas putida: молекулярно-генетический анализ плазмиды pBS286. 1986. Т. 22. № 11. С. 2702-2712.
253. Чен И.-К., Лиу X., Жу Л.-Ч., Жин И.-Ф. Клонирование и характеристика гена кате-хол-2,3-диоксигеназы, локализованного в хромосоме Pseudomonas aerugenosa ZD 4-3. Микробиология. 2004. Т. 73. № 6. С. 802-809.
254. Якимов М.М, Уткин И.Б., Матвеева Л.Н, Козляк Е.И, Рогожин И.С, Соломон З.Г., Безбородое A.M. Деградация полициклических ароматических соединений штаммом Pseudomonas fluorescens 16N2. Прикл. биохим. микробиол. 1991. Т. 27. № 1. С. 76-81.
255. Якимов М.М., Якимов М.М, Козляк Е.И., Рогожин И.С. Биологические методы очистки воздуха. Прикл. биохим. микробиол. 1989. Т. 25. № 6. С. 723-33.
-
Хоменков, Василий Григорьевич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.04
- Изменение состава сообществ бактерий-деструкторов в условиях загрязнения устойчивыми органическими соединениями
- Изучение микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов и их использование в технологии биоремедиации загрязненных почв
- Экология микроорганизмов техногенных территорий
- Микробная деградация ароматических ПАВ
- Культивируемые аэробные бактерии из района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей
