Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование метода контактно-сорбционного обезвоживания для получения сухих музейных культур возбудителя дифтерии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование метода контактно-сорбционного обезвоживания для получения сухих музейных культур возбудителя дифтерии"

РГ8 ОД

2 ^ НОВ

На правах рукописи

КОЗУБ Сергей Николаевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА КОНТАКТНО-СОРБЦИОННОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СУХИХ МУЗЕЙНЫХ КУЛЬТУР ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИИ

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

КОЗУБ Сергей Николаевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА КОНТАКТНО-СОРБЦИОННОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СУХИХ МУЗЕЙНЫХ КУЛЬТУР ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИИ

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена на кафедре микробиологии Омской государственной медицинской академии и в бактериологической лаборатории войсковой части

23453.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор A.A. ОБГОЛЬЦ

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор, Эберт Л.Я.

доктор медицинских наук Литусов Н.В.

Ведущее учреждение:

Военно-медицинская академия им. Киров

Защита диссертации состоится 2. 3 о Хо.

часов на заседании диссертационного совета К.084

_1997 г

часов на заседании диссертационного со!ета К.084.04.03 при Челябинске медицинском институте по адресу: 454092, Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Челябинско: государственного медицинского института.

Автореферат разослан " Н " ирлТ^_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор A.B. Зурочка

Актуальность исследования. В практике работы баклабораторий шитарно-эпидемиологических учреждений (СЭУ) и госпиталей евозможно обойтись без музейных штаммов микроорганизмов, эдцерживаемых в жизнеспособном состоянии, которые используются в икробиологической диагностике и, в частности, для проверки качества гтательных сред. Отсутствие во многих СЭУ наборов музейных культур грицательно сказывается на качестве их работы (Максимов А.Н. Обухов ).И., 1995). Причиной этого служит то, что в распоряжении 1клабораторий нет достаточно совершенного метода сохранения узейных культур в физиологически и генетически неизменном состоянии, спользуемые практическими лабораториями метод периодических ^ресевов и хранение под слоем минерального масла имеют ряд ¡достатков, к которым относятся большие материальные и временные ¡траты, необходимость соблюдения регламента пересевов, недостаточная :зопасность для персонала лабораторий (Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. •61, Иваницкая Л.П с соавт. 1982, СидякинаТ.М. 1988, Heckly R.J. 1978, apage S.P. с соавт. 1973), и, самое главное, эти методы не гарантируют »хранение всех культуральных особенностей микроорганизмов при яогократных пассажах (Сидякина Т.М. 1988, Heckly R.J. 1978). овременные же методы хранения культур (криоконсервировакие, блимационное высушивание), несмотря на их всеобщее признание и )фективность, не могут быть использованы в условиях практических Мораторий, так как требуют специального дорогостоящего юрудования и сложного технологического обслуживания.

Разработанный в последнее время метод контактно-сорбционного ¡езвоживания (КСО) с использованием влагоемких сорбентов (A.c. SU(||) 30138 А! С 12N 1/04.1992г.) для сохранения туляремийного вакцинного гамма №15, Е. Coli HB 101 и S. enteritidis var. Isatchenko в отличие от ;тодов сублимационного высушивания и криоконсервации прост в :ализации, не требует специального оборудования, особых >офессиональных навыков и'позволяет длительно сохранять 1кроорганизмы в жизнеспособном состоянии с одновременной абилизацией их свойств. В доступной нам литературе отсутствуют стематические исследования по изучению вопросов длительного хранения различных штаммов микроорганизмов, высушенных методом ZO, и не имеется сведений о возможности высушивания этим методом >збудителя дифтерии, токсигенные штаммы которого должны держаться в баклабораториях любой категории. Для определения ксигенности С. diphtheriae необходим заведомо токсигенный штамм

данного вида с воспроизводимыми показателями экспресс дифтерийного токсина. Сохранение тест-культуры возбудителя дифтер методом пересевов и подслоем минерального масла, регламентированы методическими указаниями, недостаточно надежно и может привести потере культурой токсигенности. Это может создать определенш трудности в диагностике, особенно в отдаленных СЭУ, госпиталях, г нет возможности быстрой доставки нового токсигенного штамма.

Сохраняемость микроорганизмов в процессе высушивания последующего хранения связана с их различной реакцией на воздейств внешних факторов окружающей среды (Голдовский A.M. 1986). завис от множества факторов (Сидякина Т.М. 1988, Heckly R.J. 1978). Мет КСО для хранения музейных культур опробован лишь на нескольких вид микроорганизмов и показал, в принципе, перспективность е использования. Применение этого метода высушивания для друг; микроорганизмов требует проведения дополнительных исследований i изучению ряда факторов, влияющих на выживаемость конкретно микроорганизма при высушивании и последующем хранении.

Исходя из этого целью нашей работы явилось разработка и научн обоснование условий получения контактно-сорбционным методом cyxi дифтерийной культуры, обладающей высокой стабильность биологических свойств при длительном хранении.

В соответствии с поставленной целью были определены следуют задачи:

1. Оценить возможность получения методом КСО сух< жизнеспособной культуры возбудителя дифтерии.

2. Определить зависимость выживаемости культуры п] высушивании от возраста, концентрации клеток, времени экспозиции среде высушивания и выбрать оптимальный режим подготовки культу| к высушиванию.

3. Выявить стабилизирующий эффект компонентов сре; высушивания на культуру в процессе обезвоживания и хранения п] различных температурных режимах.

4. Изучить влияние химического состава и температу! регидратирующей жидкости на восстанавливаемость сухой культуры.

[ 5. Изучить выживаемость клеток, сохранность ими юрфологических, культуральных, биохимических и токсигенных свойств процессе длительного хранения.

В качестве отдельной задачи:

6. Оценить возможность использования КСО для сохранения [екоторых типовых диагностических и вирулентных штаммов шкроорганизмов, необходимых для работы в практических аклабораториях, а также изолятов патогенных бактерий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые получена культура СогупеЬайепит сЦрЬШепае, высушенная онтактно-сорбционным методом, сохраняющая в полном объеме ультурально-биохимические и токсигенные свойства при длительном ранении.

Впервые исследованы и определены оптимальные условия ехнологического процесса, связанные с подготовкой, обезвоживанием, ранением и восстановлением культуры коринебактерий дифтерии.

Показана принципиальная возможность использования метода КСО ля создания набора музейных культур и сохранения изолятов патогенных актерий.

Доказано, что выживаемость при высушивании зависит от возраста леток, их концентрации, времени экспозиции в среде высушивания, гмпературы сорбента, состава и температуры регидратирующей идкости, условий и сроков хранения. Показана необходимость спользования в составе среды высушивания высоких концентраций 1харов.

Результаты исследований отражены в 2 рационализаторских редложениях и опубликованы в виде 2 статей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. |

Разработаны технологические условия высушивания возбудителе сПрЬШепас методом КСО, позволяющие длителыю сохранять эти штамд Данный метод может быть использован в практике рабо баклабораторий СЭУ госпиталей любого уровня, а также в сист< здравоохранения. Метод КСО позволяет значительно снизить затраты поддержание музейного штамма традиционным методом и обеспечив, надежное длительное хранение. Полученные результаты исследовак реализованы в "Методических рекомендациях по контакт! сорбционному обезвоживанию токсигенного штамма С. сПрЬШепае ' внедрены в работу баклабораторий Омского областного ЦСЭ Самарского ВМФ, используются в учебном процессе Омск государственной медицинской академии. Теоретическое значен представляют результаты исследований сохраняемости жизнеспособно! коринебактерий и их свойств в зависимости от условий подготовю высушиванию, обезвоживания, сроков и условий хранения последующего восстановления культуры С. сНрЫЬепае.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертациони работы доложены на расширенной научной конференции кафед микробиологии Омской государственной медицинской акадсмш участием врачей-микробиологов г. Омска.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выживаемость коринебактерий дифтерии, высушенн контактно-сорбционным методом, зависит от возраста культур концентрации клеток, времени эквилибрации, состава среды высушиваь и условий последующего восстановления.

2. Культурально-биохимические и токсигенные свойства сух культуры после ее восстановления сохраняются полностью и независи от длительности и температурного режима хранения.

3. Метод КСО позволяет консервировать и длительно сохраю штаммы дифтерии в условиях обычной бактериологической лаборатор]

4. Метод может быть применен для консервации музейных штам^ других видов микроорганизмов, а также для сохранения изолят патогенных бактерий.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, шострирована 17 таблицами и 11 рисунками.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы о тгериалах и методах исследований, 5 глав собственных исследований, суждения результатов, выводов. Библиография содержит 122 источника, ! них 82 отечественных и 40 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В качестве объекта исследования были использованы 13 штаммов >збудителя С. diphtheriae, выделенных от больных и носителей, Зладающих типичными морфологическими, культуральными, юхимическими и токсигенными свойствами.

С целью оценки возможности использования метода КСО для •здания музея культур были использованы возбудители дизентерии, льмонеллеза, типовые музейные штаммы Yersinia enterocolitica № 05, ersinia pseudotuberculesis № 4227, Vibrio cholerae P-9741, а также жцинные штаммы EV возбудителя чумы и СТИ возбудителя сибирской вы, и некоторые другие микроорганизмы.

Количество живых микроорганизмов в стабилизированной спензии клеток(ССК) и сухих образцах после их регидратации феделяли методом серийных десятикратных разведений с высевом 0.1 i соответствующих разведений на чашки Петри.

Обработка и оценка результатов. Концентрацию живых клеток (БК) 1 мл ССК (К1), рассчитывали по формуле:

К1 = NrlOn+l, I

где N - количество колониеобразующих единиц (КОЕ), п - кратность 1зведения.

Количество жизнеспособных клеток в регидратированной после юушивания (К2) или после хранения (КЗ) культуре, содержащихся в щом флаконе, рассчитывали по формуле:

К2(КЗ) = №ЮП+2 2

Процент клеток, сохранивших жизнеспособность в процессе юушивании (Al) и при последующем хранении (А2) определяли по фмулам:

А1 = К2/К1г10г100% 3

А2 = КЗ/К2Г100% 4

Статистическую обработку полученных экспериментальных данш проводили общепринятыми в микробиологии методами (Ашмарин ИЛ Воробьев А.А. 1962) Оценку значимости полученных результат рассчитывали по критерию Стьюдента, равном 0.05 (Р 0.95).

Подготовка защитной среды. Для высушивания бактериальш культур были использованы защитные среды (ЗС) следующего составе

• физиологический раствор

• сахароза-30%, пептон-1%, тиомочевина-1%, глютамат натрия-2

• сахароза-30%, пептон-1%, тиомочевина-1%

• сахароза-17%, пептон-0,5%, тиомочевина-0,5%, глютамат натрия-1

• сахароза-20%

• декстрин-2%, хлорид аммония-0,5%, тиомочевина-0,5' аскорбиновая кислота-0,5%

• декстран-5%, сахароза-5%, глютамат натрия 1%

• сахароза-10%, сорбит-1,5%, декстрин-1,25%, тиомочевина-1 %

Навески соответствующих компонентов последователь] растворяли в дистиллированной воде, при 50-60 °С. Готовые сре; стерилизовали автоклавированием при температуре 120 °С в течение минут в пробирках по 5 мл.

Подготовка сорбента влаги. В качестве сорбента влаги использова коммерческую ионообменную смолу КБ-4П-2. Смолу промыва, проточной водопроводной (1-2 часа), затем дистиллированной водой час) и высушивали при температуре 110-120°С в сухожаровом шкафу , остаточной влажности менее 1%. Влажность смолы определя: гравиметрическим методом, высушивая ее до постоянного веса сухожаровом шкафу при температуре 105 °С. Сухую смолу фасовали : 0.7 г в стеклянные флаконы вместимостью 10.0 см3, после чего флако! со смолой досушивали и стерилизовали в сухожаровом шкафу 4-6 час при той же температуре. После досушивания флаконы немедлен] закрывали резиновыми пробками и фиксировали алюминиевыми. Пер использованием флаконы с сорбентом охлаждали в морозильной каме в течение 1-2 часов.

Питательные среды и метод культивирования. Для выращивания культур возбудителя дифтерии использовали 10% сывороточный агар (СА). С целью стандартизации условий выращивания бактериальных культур в качестве посевного материала использовали суспензию коринебактерий содержащую 1 млрд. клеток в 1 мл, для чего культуру, выращенную на сывороточном агаре (СА) в чашках Петри при температуре 37°С в течение 24 часов, смывали 5 мл мясопептонного бульона (МПБ).

ПОДГОТОВКА КУЛЬТУРЫ

ПОДГОТОВКА СОРБЕНТА

Промывка сорбента водой

Внесение ССК во ^ флаконы (сушка)

Укупорка флаконов

ЭКСПОЗ! коми темпе (до суш щия при атной ратуре ивание)

Приготовление защитной среды Высушивание сорбента

Контроль жизнеспособности Фасовка сорбента во флаконы

1

ВЫСУШИВАНИЕ КУЛЬТУРЫ / Досушивание и стерилизация флаконов с сорбентом

Контроль -> Хранение сухой

жизнеспособности культуры

Рис. 1. Схема высушивания контактно-сорбционным методом

Концентрацию клеток доводили до МО9 клмл"1 по стандар мутности института им. Тарасевича. Полученный посевной материал объеме 1 мл вносили в чашку Петри с сывороточным агаром распределяли по всей поверхности питательной среды. Излишки посевно материала удаляли пипеткой.

Выращивание других микроорганизмов проводили на плотнь питательных средах, рекомендуемых для культивировав соответствующих видов.

Подготовка культуры. Выращенную в чашках культуру смывали поверхности агара 5 мл ЗС. Приготовленную таким образо стабилизированную суспензию клеток (ССК), переносили пипеткой стерильный флакон и до высушивания хранили при комнатнс температуре.

Высушивание культуры. Во флакон с охлажденным сорбенто вносили 0.1 мл ССК. После этого флакон закрывали пробкой, котору фиксировали алюминиевым колпачком. Для окончательно! перераспределения влаги между клеточной суспензией и сорбенто флаконы оставляли на 3 суток при комнатной температуре, после чего I хранили при необходимом температурном режиме. Схема высушивани подготовки суспензии и сорбента представлена на рис 1.

Восстановление жизнеспособности высушенной культурь

Восстановление жизнеспособности высушенной культуры осуществляло! путем ее регидратирования в жидких средах, в качестве которь: использовали мясопептонный бульон, сывороточный бульо] физиологический раствор или дистиллированную воду. Для этого I флаконы с сухой культурой вносили по 10 мл регидратирующей жидкост: перемешивали содержимое встряхиванием в течение 1-2 минут и зате высевали по 0.1 мл на чашки Петри. В качестве разводящей жидкое! использовали МПБ.

Биохимические и другие свойства нативных и восстановленных пос; высушивания культур коринебактерий определяли по стандартной схем разработанной для дифференциации культур возбудителя дифтерии. V биохимических свойств определяли разложение цистина, глюкозь сахарозы, крахмала и мочевины. Токсигенность культур определял методом двойной иммунодиффузии в геле с использование монозонального диагностического антитоксина.

Ультраструктуру С. diphtheriae изучали с помощью электронной микроскопии, которую проводили в Гос. научно-исследовательском центре прикладной микробиологии, Оболенск, Московская обл.

С целыо прогнозирования сроков хранения культуры при определенных температурах, в течение которых титр жизнеспособных клеток упадет' до порогового значения, использовали тест на ускоренное храпение(МШс S. с соавт. 1974, Сидякина Т.М. 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ РАЗРАБОТКА УСЛОВИЙ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУХОЙ КУЛЬТУРЫ С. DIPHTHERIAE МЕТОДОМ КСО.

Возбудитель дифтерии относится к грамположительным микроорганизмам, которые, как правило, более устойчивы к воздействию неблагоприятных физико-химических факторов в сравнении с грамотрицательными микроорганизмами. Поскольку процесс КСО является более жестким, чем сублимационное высушивание (быстрый, направленный поток воды сквозь всю толщу микроорганизма, температурная реакция в процессе дегидратации, повышение щелочности при регидратации), первоначально нами проведена оценка возможности использования метода КСО для высушивания возбудителя С. diphtheriae. С этой целыо были применены основные условия КСО, разработанные щля консервирования вакцинного штамма туляремии. Полученные результаты показали, что бактерии С. diphtheriae хорошо переносят процесс КСО, что подтверждает относительно высокую устойчивость грамположительных микроорганизмов к высушиванию. Выживаемость после высушивания составила в среднем 20,9% (от 10,3 до 30,1), при этом ie обнаружено достоверных отличий в выживаемости между эиовариантами mitis и gravis.

Одним из важных моментов, оказывающих влияние на устойчивость эактерий к обезвоживанию являются условия культивирования микроорганизмов. Как правило максимальную устойчивость к ¡ысушиваншо проявляют бактериальные культуры в стационарной фазе )азмножения (Аркадьева З.А. с соавт. 1975, Сидякина Т.М. 1988, Heckly l.J. 1978). Поскольку на твердых питательных средах стадийность >азмножения бактерий менее выражена, чем при их культивировании в кидких средах, нами была исследована сравнительная устойчивость С. liphtheriae к высушиванию в зависимости от времени их культивирования.

Время культивирования коринебактерий варьировали от 12 до 48 часог после чего определяли общую концентрацию клеток (ОК), концентрат« живых клеток (биологическая концентрация - БК). Через 3-5 суток поел высушивания в сухой культуре определяли абсолютное количество живы клеток, находящихся в одной пробе (БКс) и рассчитывали выживаемост при высушивании (А1). Результаты исследования представлены в табл. 1 Для определения стационарной фазы размножения был использова! показатель отношения количества живых клеток к общему их числу) - тс есть отношение БК/ОК. Было показано, что максимального значения это показатель достигает в начале стационарной фазы размножени: бактериальной культуры, затем постепенно снижается, так как част] бактериальных клеток перестает делиться и отмирает. Установлено, чт< максимальный процент выживаемости при высушивании имела 15-1 часовая культура (для С. сИрМЬепае это, по-видимому, логарифмическа; фаза размножения). Полученные результаты не согласуются с данным! литературы, так как большинство бактериальных культур имее: максимальную устойчивость к высушиванию в стационарной фазе роста Тем не менее такие данные имели место при высушивании Ш-изоЫип шеНой (Ата^ег N. с соавт. 1972) однако выживаемость при храненш таких культур в высушенном состоянии уступала культурам, взятым ] стационарной фазе.

Таблица

Влияние возраста культуры С. сПрМЬепас па её выживаемость при высушивании

Показатели Возраст культуры, час

12 15 18 24 30 36 48

ОК в 1 мл, х109 16.3 25.2 39.5 41.7 55.7 58.7 59.0

БКвССК в 1мл,х109 (К1) 8.6 15.0 16.7 32.2 38.8 32.1 18.5

БК/ОК 0.53 0.60 0.77 0.78 0.70 0.55 0.32

БКс, х109 0.1 0.39 0.63 0.55 0.42 0.38 0.26

выживаемое тъ(А1).% 12.2 26.0 21.1 17.0 10.8 12.1 13.7

Несмотря на полученную нами максимальную выживаемость при /шке 15-и часовой культуры С. diphtheriae эти образцы имели меньшее эсолютное количество живых клеток в сухом образце. Культуры, сращиваемые в течение 18 - 24 часов имели более низкий процент клеток, греживших процесс КСО, однако максимальное абсолютное количество нвых клеток имели именно эти культуры. Эти же культуры имели и самые асокие значения показателя БК/ОК.

Таким образом установлено, что для получения сухой культуры С. iphtheriae, имеющей максимальное количество живых клегок необходимо спользовать 18-24 часовую культуру (при выращивании на СА).

Для изучения влияния плотности клеточной суспензии на охраняемость С. diphtheriae использовали ССК с различной онцентрацией. Для получения более концентрированной клеточной успензии был использован прием, позволяющий исключить ополнительное воздействие на клетки, возникающее при механических риемах концентрирования. Установлено, что более плотные клеточные успензии имеют и незначительно более высокий процент выживаемости ри высушивании с одновременно значительно более высокими бсошотными значениями живых С. diphtheriae в высушенных образцах. 1ри увеличении концентрации клеток в ССК с 16 до 91 млрд/мл ыживаемость при высушивании повысилась с 13,6 до 17,9 %, а онцентрация жизых клеток в сухих культурах повысилась более чем в 7 аз. Предварительное концентрирование позволяет значительно величить число живых С. diphtheriae в сухих культурах, однако усложняет [етодику высушивания. Дальнейшие исследования, проведенные с целыо рогнозирования сроков сохранения жизнеспособности возбудителя ифтерии показали, что культуры, высушенные без предварительного онцентрирования обеспечивают достаточно длительные сроки охранности клеток. Поэтому введение дополнительного этапа в ехнолопло КСО С. diphtheriae было нецелесообразным.

Наиболее важное значение в практике консервирования шкроорганизмов имеет правильный подбор компонентов защитной реды, позволяющей снизить влияние неблагоприятных факторов на ¡актериальную клетку в процессе консервирования и последующего ранения. Поскольку в задачу наших исследований не входило создание штимизированной ЗС для КСО коринебактерий, а ограничивалось лишь ;ыбором среды и ее компонентов, позволяющих выполнить поставленную адачу, в качестве сред высушивания испытывали небольшой набор сред [ их компонентов, широко используемых в практике. Результаты, юлученные при использовании этих ЗС показали безусловную

необходимость их применения для КСО коринебактерий. Так образць где в качестве среды высушивания применяли физиологический раство; имели выживаемость на 2-3 порядка ниже (табл. 2).

Оценка компонентного состава сред показала, что среды, имеющи в своем составе большой процент содержания Сахаров, обеспечили боле высокую выживаемость бактерий при высушивании. Сделанно предположение о ведущей роли Сахаров в обеспечении выживаемость пр] высушивании подтвердилось в дальнейшем, при исследовании влияни. процентного содержания сахарозы в составе среды высушивания №2 (Рис 2.). Максимальную выживаемость бактерий наблюдалась в образцах ЗС содержащих в своем составе 25 - 35 % сахарозы. Это можно объяснит] тем, что ЗС с высоким содержанием сахарозы имеют больше осмотическое давление и при внесении в нее клеток происходит частично' их обезвоживание еще до контакта суспензии клеток со смолой.

Таблица ^

Выживаемость возбудителя дифтерии, суспендированного в различных средах высушивай

N среды высушиван ия Состав среды % БКв ССК, х109 БКс, хЮ9 Выжива емость, %

1 физиологический раствор 26,3 0,0005 0,015±0, 01

2 сахароза-30, пептон-1, тиомочевина-1, глютамат натрия-3 30 0.57 17.7±3,4

3 сахароза-17, пептон-0,5, тиомочевина-0,5, глютамат натрия-1,7 25.9 0.37 14.2+2,7

4 сахароза-20 18.4 0.24 13.0±2,9

5 (Нейлора-Смитта) декстрин-2, хлорид аммония-0,5, тиомочевина-0,5, аскорбиновая к-та-0,5 29.5 0.05 1.6+0,46

6 (Гривса) декстран-5, сахароза-5, гшотамат натрия 1 32.0 0.20 6.1+2,4

7 (Котенок) сахароза-10, сорбит-1,5, декстрин-1,25, тиомочевина-1 25.4 0.20 7.7±1,5

Содержание сахарозы в защитной среде, %

Рис. 2. Выживаемость С. сНрЫЬепае при высушивании в :ависимости от процентного содержания сахарозы в защитной среде.

Сравнение данных по выживаемости С. сНрЫЬ.епае при высушивании I после хранения при положительных и отрицательных температурах юказало, что тиомочевина, пептон и глютамат натрия оказывают юложителыюе влияние на выживаемость клеток как при обезвоживании, ак и в процессе хранения. При этом положительное действие пептона [роявлялось при высушивании и хранении, а тиомочевины - при хранении, »собенно при температуре 37 °С(Рис. 3.). Это, по-видимому, связано с нтиоксидантным действием тиомочевины, поскольку образование вободных радикалов, губительно действующих на сухую клетку [роисходит более интенсивно при высоких температурах. Показана и роль лютамата натрия, действие которого проявляется как при высушивании, ак и в процессе хранения, однако в дальнейшем, при определении времени арантированного хранения было выяснено, что ЗС без глютамата натрия [езначительно уступает среде с глютаматом.

Рис. 3. Влияние компонентного состава среды высушивания н выживаемость С. сПрИШепае после хранения при температуре 37 °С

Примечание: среда №1- сахароза-30, пептон-], тиомочевина-1, глютамат-Ка-З; среда №2- сахароза-30, пептон -1; среда №3- сахароза-30, тиомочевина-1; среда №4- сахароза-30, глютамат-Ыа-З; среда №5 -

сахароза-30

Выявлено влияние времени эквилибрации (Вэ) на устойчивость С сПрЫЬепае при высушивании. Наши данные показали, что Вэ должно быт не менее 1 часа. Так при технологически минимально возможно экспозиции клеток в ЗС, равной 5 мин, выживаемость составила 3,4% пр содержании живых клеток в сухом препарате 0,1 Зг 109. При увеличени времени эквилибрации с 5 до 90 мин концентрация клеток в ССК упала 38г109до 20г109живых клеток в 1 см3, а выживаемость при высушивани возросла с 3,4% до 33%. При этом абсолютная концентрация живы коринебактерий в сухом препарате увеличилась с 0,13г109 до 0,7Ь'Ю9.Этс по-видимому, связано с тем, что часть клеток при экспонировании в 3( отмирает, а оставшиеся клетки, более устойчивые, лучше переживаю процесс высушивания. В дальнейшем после незначительного увеличени происходит снижение выживаемости при высушивании, количество живы клеток в сухом препарате, при увеличении Вэ с 60 до 120 мин, оставалос практически одинаковым. Можно предположить, что отмеченны

максимальные значения выживаемости и БК с сухих препаратах в интервале Вэ 60-120 мин связаны также и с тем, что в этот период происходит подготовка клеток к высушиванию, так как в среде, содержащей большое количество Сахаров происходит перераспределение влаги между клеткой и ЗС. В дальнейшем при высушивании частично обезвоженная клетка лучше сохраняется. Для доказательства этого предположения необходимо специальное оборудование, позволяющее определить количество воды в компонентах системы (ЯМР-спектрограф), поэтому нами исследования в этом направлении не проводились.

Показанное нами влияние температуры сорбента на выживаемость бактерий при высушивании согласуется с литературными данными (Ильин A.A. с соавт. 1990). Логично, что если температура в точке контакта сорбента и ССК повышается от исходной на 65-70 °С, то снижение температуры сорбента уменьшит и максимальную температуру клеток в точке контакта. Поэтому предварительное охлаждение сорбента перед высушиванием до температуры минус (12±2) °С повысило выживаемость бактерий почти на треть.

При изучении условий восстановления высушенных культур показана эффективность использования в качестве РЖ мясо-пептонного и сывороточного бульона, имеющих в своем составе компоненты, необходимые для восстановления сублетальных повреждений С. diphtheriae. Однако и при регидратировании физиологическим раствором были получены сравнимые результаты (табл. 3).

Очевидно процесс восстановления жизнедеятельности клеток начинает происходить во время регидратации. хотя в дальнейшем для роста культуры требуется оптимальная питательная среда. Процесс восстановления физиологической активности сухой культуры требует, по-видимому, определенного времени. Это подтверждается обнаруженной нами задержкой роста на 1 - 3 час регидратированных, по сравнению с нативными или ранее восстановленными культурами. Полученные результаты показали, что время регидратации должно быть не менее 15 мин и оптимум ее лежит в интервале 15-30 мин. Более низкая восстанавливаемость культуры С. diphtheriae при 5-и минутной экспозиции в РЖ, по-видимому, связана с недостаточно полной регидратацией в течение этого интервала времени. Имеющий место при регидратации сдвиг pH, связанный со щелочностью сорбента не оказывал существенного влияния на восстанавливаемость С. diphtheriae, так как обнаруженные различия в восстанавливаемости клеток у содержащих и

не содержащих в своем составе буферные вещества РЖ незначительны Однако при увеличении времени регидратации (выше 30 мин) в РЖ н< содержащих буфера, происходит уменьшение количества в о останов л енны) клеток.

Таблица 3

Восстановление ростовых свойств С. сИрЬШепае в зависимости от состава, буферных свойств регцдратирующей жидкости и времени регидратации

РЖ рн среды после регидра тации БК, х 10бжмк/мл

Время от начала регидратации до высева на ППС, мин.

5 15 30 60 средние значения

НгОдист 7.95 3.9 4.7 3.8 2.5 3.93

ФР 7.88 4.0 5.1 5.3 4.8 4.80

МПБ 8.02 5.9 6.2 6.5 5.3 5.98

СБ 8.00 5.3 6.4 6.0 6.5 6.01

Буф. р-р 7.24 4.6 4.0 4.2 3.9 4.18

БФР 7.20 4.3 5.2 5.0 5.4 4.98

БМПБ 7.28 5.4 7.1 6.8 7.1 6.60

БСБ 7.18 5.9 5.8 6.1 7.3 6.28

Средн. знач. РЖ 7.96 4.78±0.96 5.60±0.81 5.30+1.15 4.78±1.65

БР Ж 7.23 5.01±0.72 5.53±1.26 5.53±1.13 5.93+1.57

Получены результаты, показывающие более эффективное восстановление сухой культуры С. сПрЫЬепае при регидратации ее охлажденной РЖ. Так, при регидратации культуры мясопептонньш бульоном (МПБ), имеющим температуру 22°С, количество восстановленных коринебактерий составило 66,6% по отношению к МПБ, имеющему температуру 4°С. Эти данные согласуются с тем, что низкотемпературная регидратация всегда обеспечивает более оптимальные условия для восстановления сухой культуры (Сидякина Т.М. 1988).

Применив метод прогнозирования сохраняемости сухих культур бактерий, нами были рассчитаны сроки "гарантированного хранения'' культуры С. сИрЬШепае (т. е. когда титр живых сухих клеток упадет до значения 104), высушенной методом КСО с использованием ЗС №2 (с глютаматом Иа и без него). Полученные результаты позволили сделать вывод о возможности весьма длительного хранения коринебактерий даже

при положительных температурах. Например, сроки хранения для ЗС №2 (с глютаматом №) при температуре 20°С, 4°С и минус 10°С могут составить 8.7, 22.5 и 62.5 лет, а для ЗС №2 (без гшотамата N3) - 7, 16.7 и 39.7 лет соответственно. Несмотря на то, что глютамат Ка оказывает свое влияние на выживаемость при высушивании и хранении, ЗС без него лишь на 10 -35% по длительности "гарантированного хранения" уступает ЗС, в которой присутствует глютамат. Учитывая это было сделано заключение о нецелесообразности использования в ЗС глютамата N3.

Таким образом, в результате проведенных исследований были определены условия подготовки культуры к высушиванию, режим обезвоживания, восстановления, а также рассчитаны сроки жизнеспособности культур при различных температурных режимах хранения.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КУЛЬТУР С. В1РНТНЕШАЕ, ВОССТАНОВЛЕННЫХ ПОСЛЕ ХРАНЕНИЯ

С помощью световой микроскопии установлено, что как нативные, так и восстановленные после высушивания методом КСО С. ФрЫЬепае имели сходную, типичную морфологию. Интересным представлялось изучение влияния контактно-сорбционного высушивания на ультраструктуру С. сНрЬМепае. При просмотре препаратов, приготовленных из сухой культуры клеток, в электронном микроскопе были обнаружены сильно деформированные клетки, расположенные в виде включений в защитной среде. Структура клеток была сильно изменена, в некоторых клетках имелись утолщения. После восстановления регидратированной культуры на сывороточном агаре клетки коринебактерий восстанавливали полностью типичную ультраструктуру. Культуры клеток, подвергшиеся высушиванию и регидратированные в МПБ на средах КТА и СА образуют колонии не отличающиеся по форме, размерам и другим признакам от колоний нативной культуры, однако рост их становятся заметными на 1 - 3 часа позже по сравнению с нативной культурой. При пересеве выросшей на СА или КТА культуры время появления колоний нативной и восстановленной культур не отличаются, то есть ростовые свойства восстанавливаются. У всех исследованных штаммов коринебактерий после высушивания и различной продолжительности хранения в высушенном состоянии при положительных и отрицательных температурах определяли основные биохимические свойства, которые также не изменялись после обезвоживания и различных сроков и температурных режимов хранения. Сохранность токсигенных свойств культурой коринебактерий,

хранящейся в музее является основополагающей в микробиологическо диагностике дифтерии, поэтому изучение этих свойств в восстановленнь культурах С. сИрЬШепае проводили при всех исследованных режима хранения. У штаммов №№ 30,54,119 и 328 исследованных культур изучал не только сохраняемость свойства токсигенности, но и время появлени линий преципитации. В результате проведенных экспериментов нам доказано, что все исследованные культуры сохранили токсигенны свойства, причем независимо от сроков хранения и температуры, пр которой хранились образцы высушенных культур. Было также изучен время появления линий преципитации у регидратированных культур д их полного восстановления на плотных питательных средах. С этой целы каплю регидратированной культуры наносили на среду, для определени токсигенности и сравнивали время появления линий преципитации контрольным штаммом коринебактерий. В результате проведенны экспериментов нами показано, что время появления линий преципитаци у регидратированных штаммов запаздывает на 12 - 24 часа в сравнении полностью восстановленной культурой. Такие же результаты получены при предварительном концентрировании регидратированной культуры целью увеличения посевной дозы при определении токсигенности. Эт: данные согласуются с тем, что для выработки токсина культур необходимо определенное время, а также с тем, что токсин выделяете гибнущими клетками (Фаворова Л.А. с соавт. 1988).

Условия хранения. На хранение были заложены штаммы С сНрЫЬепае, выращенные на СА в течение 24 час, суспендированные течение 60 мин в среде высушивания, содержащей 30% сахарозы, 1°/ пептона и 1% тиомочевины. Штаммы №30 и № 54 сушили в среде дополнительно содержащей 3% глютамата натрия. Результат! жизнеспособности С. сНрЬШепае при различной температуре ] продолжительности хранения представленные в табл. 4, совпадают расчетными.

Таким образом результаты, полученные при исследовании свойст: С. сНрЬШепае хранившихся в сухих образцах показали, что в процесс хранения морфологические, культуральные, биохимические и токсигенны свойства не изменились. Показано, что хранение культур С. сЦрЫЬепае высушенных методом КСО, при отрицательных и положительны: температурах, обеспечивает длительную их сохраняемость. Дл: использования сухой культуры с целью определения токсигенных свойст] (в качестве контроля), необходимо восстановление культуры н; питательных средах.

Таблица 4

Сохраняемость культур С. (ЦрЬЙгепае после хранения при различных температурных режимах

Температура хранения, °С Хранение 12 мес. Хранение 24 мес.

Выживаемость, % Выживаемость, %

расчетная фактическая расчетная фактическая

-10 76 74.6+8.08 57

4 52 52.3±2.68 27

20 21 28.6±7.2 4,2

37 1.9 1.85±0.35 - -

Результаты, полученные при высушивании методом КСО других видов микроорганизмов, показали принципиальную возможность использования данного метода для их консервации. Большие различия в выживаемости исследованных микроорганизмов можно объяснить их разной устойчивостью к высушиванию, неотработанностыо вопросов подготовки культур к высушиванию, а также незначительным количеством проведенных экспериментов. Тем не менее все исследованные микроорганизмы оказались жизнеспособными после процесса контактно-сорбционного обезвоживания и сохраняли свои биологические свойства. Выживаемость при высушивании грамотрицательных бактерий составила от 4 до 20% и 8-80% после трехмесячного хранения при положительных температурах. Не вызывает сомнения, что после отработки технологии и оптимизации КСО применительно к грамотрицательным микроорганизмам, эти показатели можно улучшить.

Таким образом, метод КСО музейных штаммов микроорганизмов с целью их длительного хранения является достаточно надежным и удобным, несмотря на то, что подготовка сорбента к высушиванию занимает достаточно длительное время. Однако, заранее подготовленный и расфасованный сорбент может храниться в обычных условиях длительное время (годы). Доступность и удобность метода КСО позволяют его применять при работе в очагах инфекционных заболеваний, когда отсутствует возможность детального изучения и идентификации возбудителя. Имея готовый к высушиванию сорбент, можно легко законсервировать выделенный возбудитель. Флаконы с высушенным возбудителем можно легко транспортировать любым видом транспорта, не создавая специальных температурных условий.

ВЫВОДЫ:

1. Контактно-сорбционное обезвоживание (КСО) является наиболе* доступным и надежным способом консервирования микроорганизмов л условиях обычных бактериологических лабораторий, практическа? деятельность которых требует хранения музейных культу]: микроорганизмов, в частности токсигенных штаммов С. сИрЬШепае.

2. Выживаемость коринебактерий высушенных контактно сорбционным методом зависит от концентрации микроорганизмов в сред( высушивания, возраста культуры, времени экспозиции в сред* высушивания и условий восстановления.

3. Наиболее высокую выживаемость, при максимальном абсолютнои количестве сохранившихся при КСО коринебактерий дифтерии имею' культуры, выращенные в течение 18-24 часов.

4. Для обеспечения наиболее высокой выживаемости С. (НрЫ;Ьепа< при КСО необходимо использовать защитные среды, содержащие 25-35°/ сахарозы. Защитная среда, имеющая в своем составе 30% сахарозы, 1°/ пептона и 1% тиомочевины обеспечивает хорошую выживаемость С (НрМЬепае при высушивании и хранении. Время экспозиции культуры I защитной среде должно быть в пределах 1-2часов.

5. Охлаждение сорбента перед высушиванием повышае: выживаемость С. сНрИШепае на 25-32%. В качестве регидратирующе! жидкости для восстановления роста и размножения высушенных методол КСО культур коринебактерий наиболее приемлемы МПБ и СБ, однакс вполне допустимо использование в этих целях и ФР. Оптимальное врем; регидратации составляет 15 -30 мин.

6. Метод КСО позволяет консервировать и длительно (годы десятилетия) сохранять музейные штаммы дифтерии как в условия; холодильника, так и при комнатной температуре. Восстановленные сухи( культуры полностью сохраняют свои морфологические культурально биохимические и токсигенные свойства независимо от температурь хранения.

7. Метод может быть применен для консервации музейных штаммо] других видов микроорганизмов, а также для сохранения изолято] патогенных бактерий и их последующей транспортировкой в условия: окружающей среды для изучения в вышестоящие бактериологически! лаборатории.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Консервация токсигенного штамма возбудителя дифтерии [роводят с целью обеспечения потребности лаборатории контрольным оксигенным штаммом; транспортировки выделенного возбудителя для [дентификации, при невозможности ее проведения в очаге инфекции; [ередачи (пересылки) в вышестоящие лаборатории штаммов, юдозрительных на принадлежность к патогенным.

2. Подготовка смолы КБ-4П-2. Смолу промывают 1 час проточной одопроводной водой, затем заливают на I час 2-3 объемами истиллированной воды. Смолу высушивают в сухожаровом шкафу (слоем -1,5 см) при температуре 110-120 °С до постоянного веса и фасуют в чистые енициллиновые флаконы по 0,7 г. Флаконы со смолой досушивают 4-6 ас при той же температуре, после чего герметично закрывают. Однажды риготовленная таким образом смола может храниться неограниченно олго. Специальных условий хранения не требуется. Перед спользованием флаконы с сорбентом охлаждают в морозильной камере олодильника1 - 2 час.

3. Приготовление защитной среды. В 68,0 г дистиллированной воды астворяют 30,0 г сахарозы, 1,0 пептона и 1,0 г тиомочевины. Стерилизуют эеду автоклавированием в пробирках по 5 мл при температуре 120 °С в ;чение 20 мин. Защитные среды готовят в день использования.

4. Подготовка культуры. Культуру выращивают сплошным газоном чашке Петри с 10 % сывороточным агаром при температуре 37 °С. Через 5 -24 часа в чашку вносят 5 см3 защитной среды и стеклянным шпателем лывают культуру. Приготовленную таким образом стабилизированную /спензию клеток переносят в пробирку и до высушивания хранят при эмнатной температуре в течение 60 ± 15 мин, но не более 2-х часов.

5. Высушивание культуры. Открывают флаконы и на поверхность шажденного сорбента пипеткой вносят по 0.1 см3 суспензии клеток, после ;го флакон герметично закрывают и оставляют на трое суток при )Мнатной температуре.

6. Для восстановления жизнеспособности высушенной культуры во икон вносят 10 мл охлажденный до температуры 2 - 4 °С мясопептонный шьон, встряхивают и через 15 - 30 мин высевают на сывороточный агар.

7. При необходимости срочной консервации с целью »анспортировки в качестве защитной среды можно использовать юкипяченный 25-35% раствор сахарозы (сахара). Выращенную культуру (ывают 1 мл среды со скошенного агара. Наличие посторонней жрофлоры не является препятствием.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Козуб С.Н., Обгольц A.A., Муратов В.А. Использование мето; контактно-сорбционного обезвоживания для длительного храненк музейного штамма дифтерии. // Воен.-мед. журн. -1997. -№10. С. 57-5£

2. Козуб С. Н. Метод длительного хранения музейного штам\< дифтерии. // Сб. научных работ, посвященных 220-летию Омског гарнизонного госпиталя. Омск.-1997.-С. 151-157.