Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование клеточных биотехнологий для создания линий тритикале с хозяйственно-ценными признаками

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Использование клеточных биотехнологий для создания линий тритикале с хозяйственно-ценными признаками"

На правах рукописи

Акинина Виктория Николаевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ БИОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ ТРИТИКАЛЕ С ХОЗЯЙСТВЕННО-ЦЕННЫМИ ПРИЗНАКАМИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

К 2013

Саратов-2013

005544170

Работа выполнена в Государственном научном учреждении научно-исследовательском институте сельского хозяйства Юго-Востока Россельхозакадемии (ГНУ НИИСХ Юго-Востока РАСХН)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Дьячук Таисия Ивановна

Першина Лидия Александровна,

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетного учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория хромосомной инженерии злаков, заведующая лабораторией

Ткаченко Оксана Викторовна,

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И.Вавилова», кафедра растениеводства, селекции и генетики, доцент кафедры

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный аграрный университет -Московская сельскохозяйственная академия К.А.Тимирязева»

Защита состоится 25 декабря 2013 г. в 11:00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук по адресу: 410049, Саратов, проспект Энтузиастов, 13.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ и на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnw-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации разослан ил/____2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.Н. Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В прикладной биотехнологии широко используются методы культуры клеток и тканей растений. Применение клеточных технологий в селекции растений позволяет расширять границы отдаленных скрещиваний и получать уникальные генотипы, ускорять селекционный процесс и делать его более эффективным. На сегодняшний день с применением только гаплоидной биотехнологии создано почти 300 сортов сельскохозяйственных культур, половина из которых принадлежит видам сем. Роассас (http://www.scri.sari.ac.uk/assos/COST851 /Default.htm). В Европе почти 50% возделываемых сортов ячменя получены с использованием гаплоидных технологий, а в Канаде три из пяти занимающих наибольшие площади сортов пшеницы класса CWRS (Canada Western Red Spring) получены на основе линий гаплоидного происхождения (DH-сорта) (Dunwell, 2010).

Коммерческий интерес к методам получения гаплоидов подтвержден значительным числом патентов в США и странах Европы (Dunwell, 2009).

В селекции зерновых культур все большее значение приобретает отдаленная гибридизация, значительно расширяющая возможности селекционера в создании трансгрессивных генотипов по продуктивности, зимостойкости, качеству зерна и другим хозяйственно-значимым признакам, которыми должен обладать современный сорт культурного злака. Тритикале (х Triticosecale Wittmack), искусственно созданный амфидиплоид, становится культурой многоцелевого назначения. Мировые площади под тритикале составляют 3,9 млн. га и имеют тенденцию к постоянному росту (http: //faostat.fao.org/site/567).

В мировой практике отсутствуют биотехнологии ускоренного создания засухоустойчивых сортов тритикале и его генетического разнообразия. Подтверждением является отсутствие биотехнологических сортов этой культуры, созданных с применением различных методов культуры тканей, в отличие от многочисленных сортов пшеницы, ячменя и риса, которые успешно возделываются в различных регионах мира.

Генный пул D-генома мягкой пшеницы является основным источником для улучшения тритикале (Gill et al., 2004). Однако использование генетического материала хромосом D-генома мягкой пшеницы сопряжено с рядом трудностей, основными из которых являются слабая завязываемость семян при получении гибридов, низкая фертильность гибридов первого поколения, длительность формообразовательного процесса, требующая дополнительных временных и материальных затрат.

Цель исследований: На основе использования клеточных технологий, создать линии тритикале, с привлечением генного пула D-генома мягкой пшеницы, и оценить их хозяйственно-ценные признаки.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить новые гибридные комбинации тритикале х мягкая пшеница на основе современных сортов этих культур с использованием культуры зародышей in vitro;

2. Оценить параметры основных этапов андрогенеза in vitro у межродовых гибридов тритикале х мягкая пшеница;

3. Выявить долю влияния генотипа, питательной среды и их взаимодействия на основные этапы получения гаплоидных растений межродовых гибридов тритикале * мягкая пшеница;

4. Получить DH-линии в культуре пыльников межродовых гибридов тритикале х мягкая пшеница;

5. Изучить влияние эксплаита на эффективность микроклонального размножения стерильных растений тритикале (отдаленных гибридов и гаплоидов);

6. Оценить полученные DH-линии тритикале по хозяйственно-ценным признакам.

Положения, выносимые на защиту.

1. Эмбриокультура гибридов пшеница * тритикале не только позволяет расширить границы скрещиваний, но и в сочетании с яровизацией in vitro сократить сроки получения семян у гибридов ранних поколений;

2. Доля влияния генотипа, питательной среды и их взаимодействия различается на отдельных этапах андрогенеза in vitro тритикале;

3. Культивирование сегментов колосьев на 5-6 этапе органогенеза позволяет снижать генотипическую зависимость формирования эмбриогенного каллуса и регенерантов при микроклональном размножении растений тритикале;

4. Созданные с использованием биотехнологических методов линии тритикале, обладают хозяйственно-ценными признаками и служат исходным материалом для селекции.

Научная новизна работы. Установлено, что эмбриокультура в сочетании с яровизацией в условиях in vitro позволяет сокращать сроки получения гибридных семян ранних поколений. Получены новые гибридные комбинации тритикале * мягкая пшеница, включающие генофонды современных сортов, адаптированных к Нижне-Волжскому региону. Определены параметры основных этапов андрогенеза in vitro у гибридов тритикале х мягкая пшеница. Впервые выявлено, что доля влияния генотипа, питательных сред и их взаимодействия различается на разных этапах андрогенеза in vitro межродовых гибридов тритикале. Установлено, что культивирование сегментов колосьев на 5-6 этапе органогенеза позволяет снижать генотипическую зависимость формирования эмбриогенного каллуса и регенерантов при микроклональном размножении растений тритикале.

Практическая значимость Получены новые гибридные комбинации тритикале х мягкая пшеница на основе современных адаптированных к условиям Нижнего Поволжья сортов этих культур, которые служат исходным материалом для селекции и пополнения генофонда тритикале. Получены и включены в селекционный процесс DH-линии тритикале, обладающие хозяйственно-ценными

признаками. Выделены линии тритикале, содержащие высокомолекулярные запасные белки мягкой пшеницы.

Личный вклад соискателя. Основная часть экспериментальной работы и обобщение результатов исследований выполнена автором самостоятельно. Биохимические исследования спектра запасных белков (глиадинов и глютенинов) проведены с.н.с. лаборатории клеточной селекции Итальянской Ю.В. БОБ-тест на качество зерна проведен совместно с с.н.с. лаб. клеточной селекции, кандидатом с.-х: наук КибкалоИ.А.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались на следующих научно-практических конференциях и совещаниях: международных — «Вавиловские чтения» (Саратов, 2010,2011,2012), Международная научная конференция по итогам научно-исследовательской и производственной работы за 2010 г. (Саратов, 2011), «Инновационные технологии создания и возделывания сельскохозяйственных растений» (Саратов, 2011), «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011), «Экология, генетика, селекция на службе человечества» (Ульяновск, 2011), «Тритикале и его роль в условиях нарастания аридности климата» (Ростов-на-Дону, 2012); всероссийских - конференция, посвященная 100-летию со дня рождения С.С. Хохлова (Саратов, 2010), «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011), П-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 135-летию А.И. Стебута «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2013), а также 10-я и 13-я молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2010, 2013), конференция 2-ой специализированной агропромышленной выставки «САРАТОВ-АГРО 2011» (Саратов, 2011), Третья школа-конференция молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2012).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 34 работы, из них 6 - в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 204 источника, в т.ч. 106 — на иностранных языках. Работа изложена на 131 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 29 таблицами.

Проведение исследований. Работа выполнена в ГНУ НИИСХ Юго-Востока Россельхозакадемии и является частью НИР лаборатории клеточной селекции «Разработать усовершенствованную биотехнологию ускоренного создания селекционного материала озимой гексаплоидной тритикале» № гос. регистрации 15070.6111004668.06.8.002.2.

СОДЕРЖАНИЕ И ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В главе I «Клеточные биотехнологии н создание исходного материала для селекции тритикале» приведен обзор литературы по народно-

.хозяйственному назначению тритикале, современному состоянию селекции культуры, значению межродовых гибридов тритикале х мягкая пшеница в создании исходного материала и роли методов клеточной биотехнологии в ускорении и повышении эффективности селекционного процесса.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Изучаемый материал. Исследования проведены в ГНУ НИИСХ Юго-Востока в период 2009-2012гг.

Для получения гибридов тритикале (AABBRR) * мягкая пшеница (AABBDD) использовали сорта и линии селекции НИИСХ Юго-Востока РАСХН, ДЗНИИСХ (г. Ростов-на-Дону), СГАУ им. Вавилова; КНИИСХ (г. Краснодар). Характеристика сортов КНИИСХ представлена в «Сорта пшеницы и тритикале Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукъяненко», 2003; сортов ДЗНИИСХ -«Сорта полевых культур...» - Каталог 2012; сорта селекции СГАУ им. Вавилова -в монографии Орловой Н.С., 2011.

В качестве исходного материала для получения гаплоидных растений использовали пшенично-тритикалевые гибриды ранних поколений (17 гибридных комбинаций), а также четыре расщепляющиеся по высоте растений и окраске колоса перспективные семьи, полученные в скрещиваниях тритикале с мягкой пшеницей.

Методы исследований. Метод эмбриокультуры применяли для получения гибридов мягкая пшеница * тритикале. Цветки кастрировали вручную обычным способом и опыляли через 2-3 дня свежесобранной пыльцой. Зародыши вычленяли на 18-20 день после опыления и помещали на питательную среду Р-8 (Лукьянюк, 1983). Яровизацию растений проводили в условиях in vitro в бытовом холодильнике.

Для получения гаплоидных растений тритикале использовали метод культуры пыльников in vitro. Все работы по культивированию пыльников и микроклоналыгому размножению проводили в асептических условиях ламинар-бокса (Калинин и др., 1980).

Основными индукционными питательными средами в культуре пыльников служили N-6 (Chu, 1978) и С-17 (Wang and Chen, 1986) с добавлением 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) (2,0 мг/л) и кинетина (0,5 мг/л). В качестве источника углеводов применяли сахарозу в концентрации 6%.

Пыльники культивировали в темноте при температуре 26-28°С в течение 4-6 недель. Анализ полученных культур проводили под стереоскопическим микроскопом МБС-2.

Для микроклонального размножения стерильных растений (отдаленных гибридов и гаплоидов) в условиях in vitro получали эмбриогенные каллусные культуры на питательной среде МС с 2,0 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л кинетина. В качестве эксплантов для получения эмбриогенного каллуса использовали фрагменты колосьев длиной 0,5-0,8 см (5-6 этап органогенеза) и побегов (3-й этап органогенеза). Регенерацию растений осуществляли из ранних пассажей на питательной среде Р-8 или Блейдза с ИУК (1,0 мг/л) и кинетином (0,5 мг/л).

Для идентификации генотипов и контроля за генетическими изменениями применялся метод белковых маркеров на основе электрофоретического разделения запасных белков в полиакриламидном геле (Busbuk et al, 1978). После электрофореза белки в геле выявляли методом окрашивания Кумаси G-250 в 10% трихлоруксусной кислоте с последующим вымачиванием гелевых пластин в 7% уксусной кислоте (Гааль и др., 1982).

Анализ различных показателей качества зерна проводили в лаборатории качества зерна НИИСХ Юго-Востока. Число падения определяли на приборе Falling Number по Хагбергу-Пертену, содержание белка - на приборе Inframatic-8100, качество клейковины - на приборе ИДК-1, реологические характеристики — на фаринографе фирмы Brabender. Анализ хлебопекарных свойств проводили безопарным методом лабораторной выпечки хлеба с интенсивным замесом теста по Методике Государственного сортоиспытания (1989).

Для определения качества зерна использовали одну из модификаций метода SDS-седиментации с некоторыми изменениями. В ходе анализа брали 1 г цельномолотого зерна тритикале (шрота) и суспендировали его в пробирке с 4 мл воды. Отстаивали суспензию 15 минут с промежуточным взбалтыванием. После этого в пробирку добавляли 12 мл рабочего раствора (SDS и уксусной кислоты), взбалтывали полученную суспензию и через 10 минут отстаивания регистрировали величину седиментационного осадка (Бебякин, 1987).

Полевые опыты закладывались в селекционном севообороте НИИСХ Юго-Востока по Методике государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур (1989). В качестве стандарта в исследованиях служил сорт тритикале Студент, занесенный в Государственный реестр селекционных достижений и являющийся стандартом на госсортоучастках Нижневолжского региона (Сорта с.-х. культур. ..., 2012).

Полученные данные экспериментальных исследований статистически обрабатывали методом дисперсионного анализа с использованием программы "AGROS-2.10". Для анализа данных микроклонального размножения был проведен дисперсионный анализ качественных признаков по Плохинскому (Плохинский, 1961).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение гибридов тритикале х мягкая пшеница

При получении гибридов обнаружены реципрокные различия по завязываемости семян и их всхожести. В прямых скрещиваниях (пшеница 5) завязываемость зерновок варьировала от 25,0 до 88,5%, однако значительная их часть (8,3-70% в зависимости о гибридной комбинации) были партенокарпическими (Таблица 1). Нарушения охватывают зародыш и эндосперм на разных фазах развития, в результате чего получается большое количество семян, но щуплых и нежизнеспособных. Для получения гибридных растений требуется культура зародышей in vitro.

Таблица 1 - Формирование гибридных зерновок в скрещиваниях мягкая _пшеница х тритикале ____

№ Скрещивание Опыленных Получено Получено

п/ цветков зерновок зерновок с

п зародышем

шт. % шт. %

1 Губернатор Дона х Святозар 26 16 61,5 5 31,3

2 Губерния х [(Новинка х Саратовская 6) х Мудрец] х Студент 28 7 25,0 1 14,3

3 Губернатор Дона х (Прикумчанка х Красноколоска) х Святозар 59 20 33,9 5 25,0

4 Губернатор Дона х (Полесский х АДП-2) 32 10 31,3 7 70,0

5 Губерния х Святозар 27 8 29,6 3 37,5

6 Губерния х (Полесский х АДП-2) 26 19 73,1 13 68,4

7 Губерния х Рондо 20 13 65,0 5 38,5

8 Жемчужина Поволжья х (Newton х Саргау) х KS88T 26 23 88,5 8 34,8

9 Губерния х Масловский 28 8 28,6 3 37,5

10 Губернатор Дона х [(АД окто х АД гекса) х (Newton х Саргау)] х Кентавр 30 19 63,3 9 47,4

11 Губернатор Дона х (АД15184 х Красноколоска) х Святозар 24 10 41,7 6 60,0

12 Жемчужина Поволжья х АДМ-7 20 12 60,0 1 8,3

13 Губерния х (Студент х Водолей) 26 23 88,5 10 43,5

14 Губерния х (Студент х Союз) 32 21 65,6 5 23,8

15 Жемчужина Поволжья х (Новинка х Саратовская 6) * к-3942 24 17 70,8 2 11,8

16 Губерния х (Леукурум 1701 h 389 х Саратовская 6) 28 20 71,4 12 60,0

17 Губерния х (Студент х АДП-2) 32 17 53,1 5 29,4

18 Губерния х Алтайская 4 22 7 31,8 4 57,1

19 Жемчужина Поволжья х (Студент х АДП-2) 30 21 70,0 10 47,6

20 Жемчужина Поволжья х Леукурум 1701 h 389 х Саратовская 6) 32 12 37,5 4 33,3

21 Губерния х Фламинго 30 11 36,7 5 45,5

22 Виктория 95 х Водолей 20 14 70,0 2 14,3

23 Губерния х Саргау 42 17 40,5 3 17,6

Всего 664 345 52,0 128 37,1

Г Факт. 5,1* 2,1*

HCPos 24,7 34,1

В реципрокных скрещиваниях (пшеница <$) завязываемость зерновок была значительно ниже, чем в прямых (4,2-27,1%) (Таблица 2). Характерная особенность обратных скрещиваний, в отличие от прямых — отсутствие нартенокарпических зерновок. Полученные данные свидетельствуют о том, что в зависимости от направления скрещивания при получении гибридов между тритикале и мягкой пшеницей несовместимость проявляется на разных этапах развития семян, что согласуется с литературными данными (Ходорцева, 1987; Chaudhary at el., 2005; Hills et al., 2007).

В скрещиваниях мягкой пшеницы с гексаплоидными тритикале нет различий в числе хромосом у формирующихся зародышей. Разница существует в геномной конституции эндосперма (тритикале х мягкая пшеница — AAABBBDRR, мягкая пшеница х тритикале - AAABBBDDR) и типе цитоплазмы. В одном случае цитоплазма амфидиплоида, в другом - пшеничная. Важное значение имеет взаимодействие геномов пшеницы и ржи.

Таблица 2 - Формирование гибридных зерновок в скрещиваниях тритикале х

мягкая пшеница

№ Скрещивание Опыленных Получено Получено

п/п цветков зерновок зерновок с

зародышем

шт. % шт. %

1 Святозар х Губерния 42 4 9,5 4 100

2 (Полесский х АДП-2) х Губерния 46 2 4,4 2 100

3 Святозар хГубернатор Дона 24 1 4,2 1 100

4 Студент х Прохоровка 35 7 20,0 7 100

5 Саргау х Саратовская 90 34 4 11,8 4 100

6 Студент х Губерния 47 8 17,0 8 100

7 БН№12 х Аткара 40 5 12,5 5 100

8 ОН№13 х Аткара 44 9 20,5 9 100

9 Студент х Жемчужина Дона 48 9 18,8 9 100

10 БН№ 13 х Эльвира 48 5 10,4 5 100

11 БН№12 х Губерния 40 6 15,0 6 100

12 Святозар х Ермак 40 2 5,0 2 100

13 ЭН№13 х Губерния 48 13 27,1 13 100

Всего 536 75 14,0 75 100

Г (Ьаісг. 1,7*

НСР05 15,2

Для пополнения генофонда тритикале с использованием эмбриокультуры in vitro получены новые межродовые гибриды тритикале х мягкая пшеница по 36 реципрокным комбинациям скрещивания — 13 прямых и 23 обратных на основе современных адаптивных сортов и перспективных линий этих культур.

Эффективность использования метода культуры зародышей выше в тех скрещиваниях, где мягкая пшеница служит материнским родителем.

Метод эмбриокультуры позволяет не только расширять границы скрещиваний, но и ускорять селекционный процесс без применения энергозатратных климатических камер. Для этого культура незрелых зародышей в ранних половых поколениях сопровождается яровизацией полученных растений условиях in vitro. Кроме ускорения селекционного процесса, этот прие обеспечивает и другие преимущества: яровизацию растений с озимым типо развития в условиях in vitro (для этой цели пригоден бытовой холодильник); возможность «депонирования» отдельных генотипов и их последующег использования в селекционно-генетических исследованиях в нужное время.

Гаплоидпя в культуре пыльников гибридов тритикале х мягкая

пшеница

Одним из узких методов традиционной селекции растений являете необходимость выращивания большого числа гибридных поколений дл получения гомозиготных форм, поиск и отбор среди них элитных растений д. будущих сортов. Применение гаплоидной биотехнологии приводит к сокращени сроков селекционного процесса (в среднем на 4-5 лет) и повышает ег эффективность. Массовое получение гаплоидных растений стало возможны благодаря развитию различных методов культуры тканей in vitro.

Для получения гаплоидных растений тритикале применяются два основны метода: культура пыльников и культура изолированных микроспор. Известнь лишь единичные факты получения гаплоидных растений тритикале методо селективной элиминации хромосом при использовании в качестве опылите, кукурузы (Aditya et al., 2006; Pratap et al., 2008) и злаковой травы Imperat cylindrica (Chaudhary, 2005).

Метод культуры пыльников обладает рядом преимуществ по сравнению методом селективной элиминации хромосом (Pershina, 2000; Дьячук, 2003).

Частота эмбриогенных пыльников в наших опытах варьировала в разны гибридных комбинациях тритикале х мягкая пшеница от 6,7 до 46,3% новообразований (каллусов и эмбриоидов) - от 9,1 до 78,2%, растений регенерантов — от 1,0 до 31,4%.

При сравнении морфогенетической активности пыльников н индукционных питательных средах N-6 и С-17 в среднем по 7 гибридам выхо эмбриогенных пыльников составил 18,9 и 15,7%, новообразований 39,8 и 29,5% регенерация растений 12,4 и 10,1% соответственно.

Установлена различная доля влияния генотипа, состава питательных сред их взаимодействия на отдельные параметры андрогенеза in vitro тритикале Наибольший вклад на показатель «индукция эмбриогенных пыльников» «индукция новообразований» оказал генотип (58,1 и 75,0% соответственно). До влияния питательной среды на этом этапе была незначительной (2,1 и 3,2%), н статистически достоверной. Влияние сочетания этих факторов составило 29,2

20,1%. На показатель «регенерация растений» доля влияния генотипа и взаимодействия генотип х питательная среда была примерно одинаковой (45,5 и 51,7%). Влияние питательной среды было статистически недостоверным. Регенерация зеленых растений обусловлена, главным образом, взаимодействием генотип х питательная среда (69,8%) (Таблица 3).

Таблица 3 - Доля влияния генотипа, состав питательных сред и их взаимодействия на различные этапы андрогенеза иг vitro.

Признак Доля влияния, %

Генотип Питательная среда Взаимодействие генотип х питательная среда

Индукция эмбриогенных пыльников 58,1 2,1 29,2

Индукция новообразований 75,0 3,2 20,1

Регенерация растений 45,5 - 51,7

Регенерация зеленых растений 17,5 7,7 69,8

В общей сложности в культуре пыльников перспективных семей тритикале, расщепляющихся по высоте растений и окраске колоса, и межродовых гибридов ранних поколений получено 209 зеленых гаплоидных растений и 907 альбиносных. Соотношение зеленых растений к альбиносам 1:5(Таблица 4).

Таблица 4 - Соотношение зеленых и альбиносных растений в культуре пыльников тритикале

Годы исследований Общее число растений, шт. Зеленые растения, шт.(%) Альбиносные растения, шт.(%)

2010 338 68(20,1) 270(79,9)

2011 312 77(24,7) 235(75,5)

2012 466 64(13,7) 402(86,3)

Всего 1116 209(18,7) 907(81,3)

Микроклональное размножение стерильных растений тритикале in

vitro

Проблема сохранения уникальных генотипов является важной в селекционно-генетических исследованиях. Получение семян отдаленных гибридов и гаплоидов сопряжено с рядом трудностей и не всегда заканчивается успешно, в связи с чем важное значение имеет сохранение стерильных растений, их последующее размножение и дальнейшее использование в работе.

Наиболее подходящими эксплантами, формирующими эмбриогенный каллус у злаков, в том числе и тритикале, являются незрелые и зрелые зародыши. Зрелые зародыши являются идеальным эксплантом для индукции соматического эмбриогенеза, т.к. они могут использоваться для работы в течение круглого года. Зрелые зародыши тритикале с кусочками эндосперма в качестве ткани-«няньки» были наиболее подходящим эксплантом для индукции соматического эмбриогенеза у тритикале (Birsin and Ozgen, 2004). В связи с отсутствием у стерильных растений зародыша необходимо подобрать эксплант, способный формировать тотипотентные клеточные культуры.

В наших исследованиях в качестве эксплантов были выбраны фрагменты побегов в стадии кущения (2-3 этап органогенеза), а также фрагменты колосьев (5-6 этап органогенеза).

Каллусообразование в культуре сегментов колоса происходит с частотой от 17,7 до 100%. Регенерация растений наблюдалась у всех изученных генотипов с различной частотой (8,3-100%) (Таблица 5). При использовании в качестве эксплантов сегментов побегов каллусогенез происходит с такой же эффективностью, как и в культуре сегментов колоса, однако регенерация растений наблюдалась всего у трех генотипов (Таблица 6). За годы исследований при использовании микроклонального размножения тритикале in vitro получено 253 растения.

Биотехнология микроклонального размножения включает использование фрагментов колосьев на 5-6 этапе органогенеза в качестве эксплантов для получения тотипотентных клеточных культур (у стерильных растений отсутствует зародыш - эксплант, традиционно используемый для получения эмбриогенного каллуса), их культивирование на питательной среде, содержащей 2,4-Д (2мг/л) и сахарозу в качестве источника углеводов (2%) для получения эмбриогенного каллуса и последующую регенерацию растений на питательной среде с ИУК (1 мг/л). Оптимизированная биотехнология позволяет сохранять и размножать уникальные генотипы тритикале (отдаленные гибриды и гаплоиды) (Рисунок 1).

а - введение сегментов колоса в культуру, б - начало каллусообразования, в — каллус с очагами морфогенеза, г — проростки, д - размноженные клоны

Рисунок 1 - Основные этапы микроклонального размножения тритикале

Таблица 5 - Эффективность микроклоналыюго размножения тритикале в

культуре in vitro сегментов колосьев.

Генотип Кол-во Частота каллусо Получено Получено

эксплантов, образования каллусов за растений

шт. шт. % 1 -2 пассаж шт. %

399' 9 6 66,7 17 2 11,8

403' 17 3 17,7 49 49 100

4042 7 4 57,1 15 10 66,7

405,4062 22 20 90,9 52 10 19,2

4082 4 4 100 24 2 8,3

411,412,4132 17 14 82,4 43 20 46,5

4142 18 12 66,7 31 17 54,8

4442 8 5 62,5 18 4 22,2

Всего 102 78 76,5 249 116 41,2

Гфакт. 5,19* 23,9*

НСР05 33,5 20,0

Примечание: 1 - гибриды: 399 — Прикумчанка х Красноколоска, 403 — Гелиос х Красноколоска,2 - гаплоиды: ПТГ оз. пш. Л15 х АД гекса (Леукурум 1701h389 х Саратовская 6).

Таблица 6 - Эффективность микроклонального размножения тритикале в культуре in vitro сегментов побегов

Генотип Кол-во эксплантов, ПІТ. Частота каллусо-образования Получено каллусов за 12 пассаж, шт. Получено растений

шт. % шт. %

5832 9 7 77,8 18 2 11,1

5962 9 7 77,8 22 0 -

5882 4 2 50,0 7 0 -

5842 5 3 60,0 4 0 -

5781 9 4 44,5 11 9 81,8

6062 И 7 63,6 20 0 -

5822 11 9 81,8 25 1 4,0

559' 14 6 42,9 21 0 -

5711 8 6 75,0 16 0 -

564' 11 5 45,5 17 0 -

549' 6 5 83,3 10 0 -

Всего 97 61 62,9 171 12

Рфакт. 1,0*

HCPos 46,3

Примечание: - гибриды: 578, 559 - Прикумчанка х Красноколоска, 571, 564, 549 - Гелиос х Красноколоска, 2 - гаплоиды: ПТГ оз. пш. Л15 х АД гекса (Леукурум 1701h389 х Саратовская 6).

Селекционная ценность БН-линий тритикале

В настоящее время тритикале является культурой многоцелевого назначения. Использование муки тритикале для целей хлебопечения позволяет расширить сырьевую базу и увеличить ассортимент продукции с повышенной питательной ценностью. Поскольку главную роль в обеспечении хороших хлебопекарных качеств играет Ш хромосома мягкой пшеницы, усилия большинства исследователей были направлены на интрогрессию в кариотип гексаплоидных тритикале именно этой пшеничной хромосомы или ее отдельных локусов. Успех создания конкурентноспособных гексаплоидных тритикале с хромосомами генома Б во многом зависит от подбора родительских форм и создания разнообразной генетической среды для хромосомной селекции (Куркиев, 2010).

Среди различных методов оценки качества зерна БОБ-седиментация является одним из наиболее простых и надежных методов оценки потенциала генотипа. Отличительной особенностью метода, комплексно отражающего качество зерна, является простота, небольшой набор химических реагентов, высокая производительность и небольшая навеска образца (Бебякин, 2009).

При изучении взаимосвязей отдельных параметров качества зерна были обнаружены статистически значимые корреляции между: содержанием белка и клейковины (г=0,55**), содержанием белка и индексом деформации клейковины (ИДК) (г=0,46*), содержанием клейковины и ИДК (г=0,53**), величиной осадка БОБ седиментации и ИДК (г=-0,71**). Выявлена достоверная взаимосвязь пористости хлеба и ИДК (г—0,44*), БОБ седиментацией (г=0,69**) и объемом хлеба (г=0,44*).

Учитывая, с одной стороны, наличие тесных связей между величиной осадка БОБ-седимептации и такими важными показателями качества как ИДК и пористость хлеба, а с другой - высокую производительность метода и возможность проведения анализа при малом количестве зерна, этот показатель может использоваться на ранних этапах селекции для оценки качества зерна тритикале.

По величине осадка БОБ-седиментации, как экспресс-методу оценки качества зерна тритикале, выделены Л 2, 3, 8, 9, 12 и 13, которые отличались по этому показателю, как от стандарта, так и родительских линий тритикале.

Отобраны ОН-линии (№ 3, 8, 10, 11 и 13), содержащие высокомолекулярные запасные белки мягкой пшеницы как маркеры качества зерна. Учитывая тот факт, 'что величина БОБ-осадка указанных линий статистически значимо отличается от «традиционных» тритикале, они могут служить исходным материалом в селекции на качество зерна.

По массе 1000 зерен в колосе отобраны линии Л 7, 9, 12 и 16 (51-56г), массе зерна с колоса Л 2, 9, 12 (2,5-3,0г) и числу зерен в колосе Л 2, 9, 12 и 13. По комплексу хозяйственно-ценных признаков Л № 8 и 9 переведены в контрольный питомник для дальнейшего селекционного изучения (Таблица 7).

Полученные ОН-лишш тритикале проходят дальнейшие селекционные испытания, а также вовлекаются в скрещивания для создания нового цикла гибридов.

Таблица 7 - ОН-линии тритикале с селекционно-ценными признаками

№ линии Высота Длина Число Число Масса Масса 1000

растении, колоса колоссов . зерен в зерна с зерен

см колосе колоса

Студент 109,0 9,2 22,5 35,0 1,8 50,0

№16 112,5 9,5 26,3 40,1 2,1 51,0

№2 130,0 12,0 28,8 49,8 2,5 49,1

№4 102,5 8,3 26,9 35,8 1,5 40,4

№6 87,5 9,5 26,4 . 37,2 1,4 35,7

№7 130,0 9,9 25,9 39,0 2,0 50,0

№8 91,5 11,6 28,0 49,2 1,9 : 37,7

№9 132,5 10,8 27,5 ■ ■ 51,2 3,0 57,8-

№10 87,5 9,2 25,8 31,2 1,3 40,2

№11 115,0 10,9 22,8 39,6 1,8 44,4

№12 120,0 12,2 27,2 45,6 2,6 56,0

№13 112,5 11,9 25,1 46,0 2,2 47,6

Рфакт 70,8* 8,2* 3,8* 3,6* 3,5* 3,5*

HCPos 6,0 1,4 2,6 9,4 0,9 11,6

ВЫВОДЫ

1. На основе использования эмбриокультуры in vitro получены новые межродовые гибриды тритикале х мягкая пшеница по 36 реципрокным комбинациям скрещивания - 13 прямых и 23 обратных на основе современных адаптивных сортов и перспективных линий этих культур.

2. Частота эмбриогенных пыльников варьировала в разных гибридных комбинациях тритикале * мягкая пшеница от 6,7 до 46,3%, новообразований (каллусов и эмбриоидов) - от 9,1 до 78,2%, растений-регенерантов - от 1,0 до 31,4%. Соотношение зеленых растений к альбиносам составило 1:5.

3. Доля влияния генотипа, состава питательной среды и их взаимодействия различается на отдельных этапах андрогснеза in vitro у тритикале. Наибольший вклад на этапе «индукция эмбриогенных пыльников» и «индукция новообразований» оказал генотип (58,1 и 75,0% соответственно). Для этапа «регенерация растений» доля влияния генотипа и взаимодействия генотип х питательная среда была примерно одинаковой (45,5 и 51,7%). Регенерация зеленых растений обусловлена, главным образом, взаимодействием генотип х питательная среда (69,8%).

4. Культивирование сегментов колосьев на 5-6 этапе органогенеза позволяет снижать генотипическую зависимость формирования эмбриогенного

каллуса и регенерантов и может быть использовано при мнкроклональном размножении стерильных гибридов и гаплоидов.

5. Выявлены DH-линии тритикале Л 3, 9, 10, 11 и 33, содержащие высокомолекулярные запасные белки мягкой пшеницы.

6. Выделены линии с величиной осадка SDS-седиментации, как экспресс-метода оценки качества зерна тритикале, промежуточной между традиционными тритикале и мягкой пшеницей. Наибольшая величина осадка отмечена для DH-лишш JI2, 3, 8, 9, 12, 13.

7. Создана и включена в селекционный процесс коллекция DH-лишш, различающихся комплексом хозяйственно-ценных признаков на основе гибридов тритикале х мягкая пшеница. В контрольный питомник включены JI№8 и Л№9, характеризующиеся высокой урожайностью зерна, массой 1000 зерен, промежуточной между тритикале и пшеницей величиной SDS-осадка.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для пополнения генофонда тритикале на основе скрещиваний мягкая пшеница х тритикале применять метод культуры зародышей in vitro.

2. Для размножения стерильных растений тритикале (гаплоиды и отдаленные гибриды) использовать сегменты колосьев на 5-6 этапе органогенеза.

3. В селекции, биотехнологии и генетике тритикале исиользовать полученные DH-линии тритикале.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук

1. Акинина В.Н. Клеточные биотехнологии в создании исходного материала для селекции тритикале // Вестник СГАУ. 2011. № 11. С. 3-5.

2. Дьячук Т.И., Хомякова О.В., Акинина В.Н., Итальянская Ю.В., Сафронова Н.Ф., Медведева Л.П. Клеточные биотехнологии и создание исходного материала для селекции тритикале // Вестник РАСХН. 2011. №4. С. 32-34.

3. Дьячук Т.И., Акинина В.Н., Поминов A.B. Отдаленная гибридизация как метод получения гаплоидов зерновых злаков // Вестник РАСХН. №4. 2012. С.43-46.

4. Дьячук Т.И., Акинина В.Н., Хомякова О.В., Поминов A.B. Гаплоидия в селекции тритикале // Зерновое хозяйство России. 2012. №2. С. 25-29.

5. Дьячук Т.Н., Кибкало И.А., Андреева Л.В., Акинина В.Н., Поминов A.B., Итальянская Ю.В., Сафронова Н.Ф. Исходный материал для селекции тритикале на хлебопекарные качества // Вестник СГАУ. 2012. №10. С. 38-40.

6. Кибкало И.А., Дьячук Т.И., Акинина В.Н., Поминов A.B., Итальянская Ю.В., Сафронова Н.Ф., Медведева Л.П. Дифференциация сортов и линий тритикале по объему осадка SDS - седиментации // Зерновое хозяйство России, 2013, № 4(28). С. 12-15.

П. Статьи и тезисы, опубликованные в сборниках международных конференций

7. Khomyäkova O.V., Akinina V.N., Dyatchouk T.I., Stolyarova S.V., Italianskaya Yu.V., Saitonova N.F., Medvedeva L.P. Haploid plants production in triticale-wheat hybrids // Annual Wheat Newsletter Kansas State University (USA).

2010.-V. 56.-P. 214.

8. Хомякова O.B., Акинина B.H. Культура пыльников и микроклоналыгое размножение пшенично-тритикалевых гибридов // Вавиловские чтения 2010: матер, междунар. науч.- практ. конф. в 3 томах - Саратов. — 2010. Т. 1.-С.7.

9. Дьячук Т.И., Хомякова О.В., Акинина В.Н., Столярова C.B., Итальянская Ю.В., Сафронова Н.Ф., Медведева Л.П. Клеточные биотехнологии в создании перспективных линий тритикале в НИИСХ Юго-Востока // Роль тритикале в стабилизации и увеличении производства зерна и кормов: матер, междунар. науч.-практ. конф. — Ростов-н/Д, 2010. С.79-83.

10. T.I. Dyatchouk O.V. Khomyakova, V.N.Akinina, Yu.V. Italianskaya, N.F. Safironova, L.P. Medvedeva. Anther culture method of creating initial breeding stocks for triticale selection in AR1SER // Annual Wheat Newsletter. Kansas State University (USA). 2011. - V.57. - P. 260.

11. Акинина B.H., Дьячук Т.И., Хомякова O.B. Микроклональное размножение стерильных гибридов и гаплоидов тритикале // Инновационные технологии создания и возделывания сельскохозяйственных растений: матер, междунар. науч.-практ. конф. 2011. — С 3-4.

12. Хомякова О.В., Акинина В.Н. Пшенично-тритикалевые гибриды -исходный материал для селекции тритикале // Исследования молодых ученых в биологии и экологии: матер. 3-ей междунар. науч. конф. - Саратов, Изд-во СГУ

2011.-С.З-5.

13. Дьячук Т.И., Хомякова О.В., Акинина В.Н., Итальянская Ю.В., Сафронова Н.Ф., Медведева Л.П. Клеточные биотехнологии в создании перспективных линий тритикале в НИИСХ Юго-Востока // Экология, генетика, селекция на службе человечества: матер, междунар. науч. конф. 2011 - С 12-18.

14. Акинина В.Н., Поминов A.B. Роль методов клеточной биотехнологии в создании исходного материала озимого тритикале // Вавиловские чтения-2011: матер, междунар. научно-практической конф. Саратов. 2011. - С.13.

15. Дьячук Т.Н., Акинина В.Н., Суханбердина Л.Х., Турбаев А.Ж. Клеточные биотехнологии в селекции тритикале // Наука и образование респ. Казахстан (Гылым жэне бшм). Орал. 2011. №3(24). С.7-13.

16. Поминов A.B., Акинина В.Н. Современная селекция тритикале // Вавиловские чтения-2011: матер, междунар. научно-практ. конф. Саратов. - 2011. -С.53.

17. Дьячук Т.И., Акинина В.Н., Кибкало И.А. Ускоренное создание гомозиготных линий озимой тритикале // Проблемы и перспективы инновационного развития мирового сельского хозяйства: матер. II междунар. науч.-практ. конф. Саратов 2011. - С 180-181.

18. Мурлякова Д.А., Вертикова Е.А., Акинина В.М. Изучение методов культивирования in vitro клеток и тканей тритикале // Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях: матер. 2-ой междунар. школа-конф. молодых ученых Москва-Звенигород. 2012. — С.58.

19. Akinina V.N., Dyatchouk Т.I., Pominov A.V. The microclonal propagation of sterile triticale plants // Annual Wheat Newsletter Kansas State University (USA). 2012. - V.58.P. 209.

20. Акинина B.H., Дьячук Т.И., Кибкало И.А., Поминов A.B., Итальянская Ю.В., Медведева Л.П., Сафронова Н.Ф Исходный материал для селекции тритикале в Поволжье // Тритикале и его роль в условиях нарастания аридности климата: матер, междунар. научно-практ.конф., Ростов-н/Д, 2012.С.12-16.

21. Акинина В.Н. Гаплоидия в культуре пыльников тритикале // Биомика - наука XXI века: матер. 3-ей школы-конф. молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии, Уфа. 2012. — С. 10-11.

22. Акинина В.Н. Гаплоидия и микроклональное размножение — методы ускорения селекционного процесса // Инновационное развитие АПК в России: матер, междунар. научно-практ. конф. молодых ученых и специалистов, Саратов. -2013.-С. 8-12.

III. Статьи в аналитических сборниках, трудах, тезисах Всероссийских и региональных конференций

23. Хомякова О.В, Акинина В.Н. Спорофитное развитие микроспор в культуре пыльников тритикале без холодового воздействия // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: матер. 10-ой молодеж. науч. конф.,-М,-2010.-С. 5-6.

24. Хомякова О.В, Акинина В.Н. Методы клеточной биотехнологии для создания исходного материала в селекции тритикале // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии 10-я молодежная научная конф., -М,-2010.-С. 58-60.

25. Акинина В.Н. Микроклональное размножение тритикале в условиях in vitro // Биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: 12-я молодежная научная конф., М. 2012. - С.8.

26. Акинина В.Н. Культура тканей тритикале in vitro для создания исходного материала в селекции // 13-я молодежная научная конференция. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. - М. - 2013. -С. 5-6.

27. Дьячук Т.И., Хомякова О.В., Акинина В.Н., Столярова В.Н., Итальянская Ю.В., Сафронова Н.Ф., Медведева Л.П. Гаплоидия у зерновых злаков: возможности совершенствования методов и практика // Апомиксис и репродуктивная биология: матер. Всерос. науч. конф., посвященной 100-летию со дня рождения С.С. Хохлова. - Саратов. 2010. - С.145-148.

и др.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акинина, Виктория Николаевна, Саратов

ГНУ Научно-исследовательский институт сельского хозяйства

Юго-Востока РАСХН

На правах рукописи

042014 5 5497

Акинина Виктория Николаевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ БИОТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ ТРИТИКАЛЕ С ХОЗЯЙСТВЕННО-ЦЕННЫМИ ПРИЗНАКАМИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Дьячук Т.И.

Саратов-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Список сокращений, условных обозначений и символов..............................................3

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. КЛЕТОЧНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ И СОЗДАНИЕ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ТРИТИКАЛЕ

(обзор литературы)..........................................................................................................................................10

1.1 .Тритикале как перспективная зерновая культура......................................................10

1.2.Генетический материал для селекции тритикале..........................................................13

1.3.Клеточные биотехнологии тритикале......................................................................................28

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................45

2.1. Изучаемый материал............................................................................................................................45

2.2. Методы исследований........................................................................................................................46

2.3. Условия проведения полевых исследований..................................................................52

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ РЕЦИПРОКНЫХ ГИБРИДОВ

ТРИТИКАЛЕ X МЯГКАЯ ПШЕНИЦА........................................................................................54

ГЛАВА 4. ГАПЛОИДИЯ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ ГИБРИДОВ

ТРИТИКАЛЕ X МЯГКАЯ ПШЕНИЦА......................................................................................61

4.1. Гаплоидия в культуре пыльников перспективных семей....................................62

4.2. Гаплоидия в культуре пыльников гибридов тритикале..........................................66

4.3. Сравнительная эффективность индукционных питательных сред N-6 иС-17..............................................................................................................................................................................69

ГЛАВА 5. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ТРИТИКАЛЕ

IN VITRO..................................................................................................................................................................79

ГЛАВА 6. СЕЛЕКЦИОННАЯ ЦЕННОСТЬ ЛИНИЙ ТРИТИКАЛЕ.... 88

6.1.Урожай зерна и элементы его структуры у БН-линий тритикале............89

6.2.8Б8-седиментация как экспресс-метод оценки качества зерна

тритикале......................................................................................................................................................................94

6.3.Характеристика запасных белков БН-линий тритикале........................................102

ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................107

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................110

Список сокращений, условных обозначений и символов

АД - амфидиплоид (пшенично-ржаной гибрид)

DH (doubled haploid) - линии - потомства диплоидизированных гаплоидов 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота ИУК - индолилуксусная кислота

Fi, F2 - гибриды первого, второго и последующих поколений НСР - наименьшая существенная разность ПТГ - отборы из гибридов пшеница х тритикале * -р<0,05, в соответствии с F-критерием

ВВЕДЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В прикладной биотехнологии широко используются методы культуры клеток и тканей растений. Применение клеточных технологий в селекции растений позволяет расширять границы отдаленных скрещиваний и получать уникальные генотипы, ускорять селекционный процесс и делать его более эффективным. На сегодняшний день с применением только гаплоидной биотехнологии создано почти 300 сортов сельскохозяйственных культур, половина из которых принадлежит видам сем. Роасеае (http://www.scri.sari.ac.uk/assos/COST851/Default.htm). В Европе почти 50% возделываемых сортов ячменя получены с использованием гаплоидных технологий, а в Канаде три из пяти занимающих наибольшие площади сортов пшеницы класса CWRS (Canada Western Red Spring) получены на основе линий гаплоидного происхождения (DH-сорта) (Dunwell, 2010).

Коммерческий интерес к методам получения гаплоидов подтвержден значительным числом патентов в США и странах Европы (Dunwell, 2009).

В селекции зерновых культур все большее значение приобретает отдаленная гибридизация, значительно расширяющая возможности селекционера в создании трансгрессивных генотипов по продуктивности, зимостойкости, качеству зерна и другим хозяйственно-значимым признакам, которыми должен обладать современный сорт культурного злака. Тритикале (х Triticosecale Wittmack), искусственно созданный амфидиплоид, становится культурой многоцелевого назначения. Мировые площади под тритикале составляют 3,9 млн. га и имеют тенденцию к постоянному росту (http: //faostat.fao.org/site/567).

В мировой практике отсутствуют биотехнологии ускоренного создания засухоустойчивых сортов тритикале и его генетического разнообразия. Подтверждением является отсутствие биотехнологических сортов этой культуры,

созданных с применением различных методов культуры тканей, в отличие от многочисленных сортов пшеницы, ячменя и риса, которые успешно возделываются в различных регионах мира.

Генный пул D-генома мягкой пшеницы является основным источником для улучшения тритикале (Gill et al., 2004). Однако использование генетического материала хромосом D-генома мягкой пшеницы сопряжено с рядом трудностей, основными из которых являются слабая завязываемость семян при получении гибридов, низкая фертильность гибридов первого поколения, длительность формообразовательного процесса, требующая дополнительных временных и материальных затрат.

Цель исследований: На основе использования клеточных технологий, создать линии тритикале, с привлечением генного пула D-генома мягкой пшеницы, и оценить их хозяйственно-ценные признаки.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить новые гибридные комбинации тритикале х мягкая пшеница на основе современных сортов этих культур с использованием культуры зародышей in vitro',

2. Оценить параметры основных этапов андрогенеза in vitro у межродовых гибридов тритикале х мягкая пшеница;

3. Выявить долю влияния генотипа, питательной среды и их взаимодействия на основные этапы получения гаплоидных растений межродовых гибридов тритикале х мягкая пшеница;

4. Получить DH-линии в культуре пыльников межродовых гибридов тритикале х мягкая пшеница;

5. Изучить влияние экспланта на эффективность микроклонального размножения стерильных растений тритикале (отдаленных гибридов и гаплоидов);

6. Оценить полученные DH-линии тритикале по хозяйственно-ценным признакам.

Положения, выносимые на защиту.

1. Эмбриокультура гибридов пшеница х тритикале не только позволяет расширить границы скрещиваний, но и в сочетании с яровизацией in vitro сократить сроки получения семян у гибридов ранних поколений;

2. Доля влияния генотипа, питательной среды и их взаимодействия различается на отдельных этапах андрогенеза in vitro тритикале;

3. Культивирование сегментов колосьев на 5-6 этапе органогенеза позволяет снижать генотипическую зависимость формирования эмбриогенного каллуса и регенерантов при микроклональном размножении растений тритикале;

4. Созданные с использованием биотехнологических методов линии тритикале, обладают хозяйственно-ценными признаками и служат исходным материалом для селекции.

Научная новизна работы. Установлено, что эмбриокультура в сочетании с яровизацией в условиях in vitro позволяет сокращать сроки получения гибридных семян ранних поколений. Получены новые гибридные комбинации тритикале х мягкая пшеница, включающие генофонды современных сортов, адаптированных к Нижне-Волжскому региону. Определены параметры основных этапов андрогенеза in vitro у гибридов тритикале х мягкая пшеница. Впервые выявлено, что доля влияния генотипа, питательных сред и их взаимодействия различается на разных этапах андрогенеза in vitro межродовых гибридов тритикале. Установлено, что культивирование сегментов колосьев на 5-6 этапе органогенеза позволяет снижать генотипическую зависимость формирования эмбриогенного каллуса и регенерантов при микроклональном размножении растений тритикале.

Практическая значимость Получены новые гибридные комбинации тритикале х мягкая пшеница на основе современных адаптированных к условиям Нижнего Поволжья сортов этих культур, которые служат исходным материалом для селекции и пополнения генофонда тритикале. Получены и включены в селекционный процесс DH-линии тритикале, обладающие хозяйственно-ценными признаками. Выделены линии тритикале, содержащие высокомолекулярные запасные белки мягкой пшеницы.

Личный вклад соискателя. Основная часть экспериментальной работы и обобщение результатов исследований выполнена автором самостоятельно. Биохимические исследования спектра запасных белков (глиадинов и глютенинов) проведены с.н.с. лаборатории клеточной селекции Итальянской Ю.В. 808-тест на качество зерна проведен совместно с с.н.с. лаб. клеточной селекции, кандидатом с.-х. наук Кибкало И.А.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались на следующих научно-практических конференциях и совещаниях: международных - «Вавиловские чтения» (Саратов, 2010, 2011, 2012), Международная научная конференция по итогам научно-исследовательской и производственной работы за 2010 г. (Саратов, 2011), «Инновационные технологии создания и возделывания сельскохозяйственных растений» (Саратов, 2011), «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011), «Экология, генетика, селекция на службе человечества» (Ульяновск, 2011), «Тритикале и его роль в условиях нарастания аридности климата» (Ростов-на-Дону, 2012); всероссийских - конференция, посвященная 100-летию со дня рождения С.С. Хохлова (Саратов, 2010), «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011), П-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 135-летию А.И. Стебута «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2013), а также 10-я и 13-я молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2010, 2013), конференция 2-ой специализированной агропромышленной выставки «САРАТОВ-АГРО 2011» (Саратов, 2011), Третья школа-конференция молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2012).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 34 работы, из них 6 - в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы,

включающего 204 источника, в т.ч. 106 - на иностранных языках. Работа изложена на 131 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 29 таблицами.

Проведение исследований. Работа выполнена в ГНУ НИИСХ Юго-Востока Россельхозакадемии и является частью НИР лаборатории клеточной селекции «Разработать усовершенствованную биотехнологию ускоренного создания селекционного материала озимой гексаплоидной тритикале» № гос. регистрации 15070.6111004668.06.8.002.2.

ГЛАВА 1. КЛЕТОЧНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ И СОЗДАНИЕ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ТРИТИКАЛЕ

(обзор литературы)

1.1. Тритикале как перспективная зерновая культура

В селекции зерновых культур все большее значение приобретает отдаленная гибридизация, значительно расширяющая возможности селекционера в создании трансгрессивных генотипов по продуктивности, зимостойкости, качеству зерна и другим хозяйственно-значимым признакам, которыми должен обладать современный сорт культурного злака.

В последнее время в теоретическом и селекционно-практическом отношениях особую роль приобретает тритикале (X Triticosecale Wittmack) -новый ботанический вид злакового растения (пшенично-ржаные амфидиплоиды). В термине тритикале объединены латинские названия родов родительских компонентов Triticum (пшеница - мать) и Seeale (рожь - отец).

В 2011 г площади под тритикале в мире составили 3,9 млн. га. В сравнении с 1998 г. увеличение составило 1,6 млн. га (FAO http://faostat.fao.org). Основными странами, в которых культивируется тритикале, являются Польша, Беларусь, Германия, Франция, Австралия и Китай. В РФ тритикале возделывается на площади 222 тыс. га (таблица 1). В Приволжском ФО площади составляют 92,1 тыс.га, в Саратовской области - 4,4 тыс.га (Пономарев, 2012).

В зерне тритикале накапливается значительное количество белка высокой биологической ценности. По содержанию незаменимых аминокислот белки этой культуры более полноценны, чем белки пшеницы. Количество незаменимой аминокислоты - лизина - в белках зерна, муки и отрубей выше, чем у пшеницы. Тритикале характеризуется также минеральной и витаминной

сбалансированностью зерна. Урожай зерна некоторых сортов составляет 1011 т/га. Ценное качество зерновых сортов - способность формировать высокую

долю зерна в накопленной биомассе, по сравнению с другими сельскохозяйственными культурами. Культура хорошо отзывается на внесение удобрений и окупает их затраты (Орлова, 2011).

Народно-хозяйственное значение этой культуры можно рассматривать в трех основных направлениях. Прежде всего, это использование в кормлении сельскохозяйственных животных - тритикале используется как главный компонент комбикормов. В Польше разработана технология переработки зерна тритикале, позволяющая использовать его до 80% в рационе при откорме свиней и бройлеров. В системе организации кормления животных в летний период важная роль принадлежит зеленому конвейеру, неотъемлемой частью которого является тритикале. Кормовая направленность тритикале обусловливается высоким биологическим потенциалом урожайности зеленой массы. Биологическая ценность зерна тритикале в целом выше, чем у пшеницы и ржи. При включении в рацион зерна тритикале среднесуточный привес животных выше, чем при скармливании зерна пшеницы, ячменя и кукурузы, а затраты корма на единицу привеса ниже (Возделывание и использование..., 2004).

В России тритикале используют в производстве комбикормов для свиней и бройлеров и спирта (его выход из зерна тритикале на 3-5% больше, чем из зерна пшеницы и других зерновых культур).

Мука из зерна тритикале служит как основной компонент сырья в кондитерском производстве (бисквиты, печенье, кексы, крекеры), при приготовлении быстрых завтраков. Широкое применение получают хлебобулочные изделия из муки нескольких злаков с участием тритикале.

Объединение в одном организме генетических потенциалов пшеницы и ржи привело к созданию культуры, которая по урожаю зерна и питательной ценности превосходит обоих родителей. Однако тритикале не лишено недостатков, главный из которых - низкие хлебопекарные качества. Они могут быть устранены с помощью методов хромосомной инженерии за счет введения в кариотип гексаплоидных тритикале хромосом Б-генома мягкой пшеницы.

Таблица 1 - Производство зерна тритикале в мире (БАО http://faostat.fao.org)

№ Страна Посевная Урожайность, Валовый

п/п площадь, тыс.га ц/га сбор, тыс. т

1 Польша 1269,3 33,4 4235,3

2 Беларусь 413,7 32,0 1324,2

3 Франция 391,0 50,8 1986,0

4 Германия 383,4 52,3 2004,3

5 Китай 250,0 18,1 453,0

6 Российская Федерация 222,0 23,5 522,6

7 Австралия 187,2 19,0 355,1

8 Венгрия 119,5 31,1 371,9

9 Литва 110,8 22,1 245,0

10 Испания 64,0 21,7 138,7

11 Австрия 47,8 48,2 230,5

12 Бразилия 46,6 25,2 117,5

13 Чешская Республика 45,9 37,3 171,2

14 Румыния 40,7 30,3 123,1

15 Швеция 37,4 44,1 164,9

16 Дания 36,5 48,6 177,4

17 Сербия 36,3 31,3 113,4

18 Турция 26,8 34,7 93,3

19 Португалия 24,5 10,6 25,9

20 Канада 22,2 29,7 65,9

Всего 3850,8 13384,9

1.2. Генетический материал для селекции тритикале

Первичные тритикале (амфидиплоиды, 2п=3х=42) являются важным исходным материалом для селекции. Основным преимуществом скрещиваний большого числа форм пшеницы с рожью заключается в расширении генетического потенциала тритикале и возможности его использования для получения новых форм путем внутривидовой гибридизации. Разработка и использование метода колхицинирования и эмбриокультуры в 50-60-х годах XX века явились важной вехой в синтезе гексаплоидных тритикале. Вместо поиска редких спонтанных амфидиплоидов и использования таких низкоэффективных методов, как доопыление стерильных гибридов Бь генетики и селекционеры получили возможность сравнительно легко и быстро синтезировать новые амфидиплоиды (ААВВКК.) практически в неограниченном количестве. Последние цитологически более стабильны и фертильны по сравнению с октаплоидами (ААВВБВКЯ). Практическая селекция доказала перспективность их использования. Прогресс, достигнутый в разработке методов колхицинирования, стимулировал в 50-60-х годах XX века синтез гексаплоидных тритикале. Процесс создания первичных гексаплоидных тритикале с помощью метода эмбриокультуры при скрещивании тетраплоидной пшеницы с ди- и тетраплоидной рожью состоит из трех основных этапов.

1. Скрещивание пшеницы (АВ) с рожью (Я) и получение пшенично-ржаных гибридов.

2. Получение амфигаплоид