Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интродуция естественных бактериальных комплексов в ризосферу растений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Интродуция естественных бактериальных комплексов в ризосферу растений"

РГ8 ОД - НОЯ 1995

на правах рукописи

КОРЧМАРУ СЕРГЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

ИНТРОДУКЦИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ В РИЗОСФЕРУ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА- 1995

Работа выполнена на кафедре биологии пота факультета почвоведения Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук П.А.Кожевин

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук В.М.Горленко Кандидат биологических наук В.В.Ильинский

Ведущее учреждение: Московская Сельскохозяйственная Академия им. К.А.Тимирязева

в аседанш

специализированного совета К.053.05.86 МГУ им. М.В.Ломоносова.'

Адрес специализированного совета: 119899, Москва, ГСП, Воробьевы горы, МГУ, факультет почвоведения, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан "_" • 1995г.

Ученый секретарь

специализированного совета

1995г.

И.П.Бабьева

I i

Актуальность проблемы. Интродукция микроорганизмов в ризосферу -одно из направлений почвенной микробиологии, непосредственно связанных как с анализом взаимосвязей растений и микроорганизмов в природе, так и с решением прикладных задач экологического земледелия.

Практика применения микробных удобрений (МУ) до настоящего времени в основном предполагает использование отдельных популяций с определенны биотехнологическим потенциалом (азотфиксация, продукция фито-гсрмонов, антибиотиков, сидерофор и т.д.). На современном этапе данный подход представлен, в Частности, попытками создания микроорганизмов с веданными свойствами с помощью методов генной инженерии. История указанного Подхода насчитывает бее малого 100.лет, однако за это время наглядно проявились не. только его достоинства, но и существенные ограничения, связанные с. нестабильностью аффектов (hioepper et al., 1989).

Примером другого, менее разработанного направления, является интродукция в почву и ризосферу не отдельных популяций, а сложных микробных комплексов. Необходимость такого поиска указана относительно давно Н.А.Красильниковым (1944, 1946) в работах, которые считаются классическими (Kloepjper et al., 1980). О Литературе описано немало попыток Применения так называемых смененных культур, при этом зарегистрированы И6 только положительные, но и отрицательные эффекты (Plazinski, Rolfe, 1886). Иногда перспективность определенной комбинации микроорганизмов мсшо обосновать на основе популяционных исследований (Ключников, Ко-«®вий, 1990). Чаде из природной среды выделают различные микробные ассоциации', а затем проводят отбор наиболее эффективных•по заданному свойству й расшифровывают таксономический состаъ (Глаголева и др»., 1994)..Необходимость более полного изучения потенциала шкробных комплексов очевидна.

Закономерным вагон в данном направлении является анализ интродукции сложных природных комплексов благоприятных микроорганизмов, с точки зрения рассматриваемой задачи наибольвий интерес могут представлять

- г ~

естественные микробные комплексы, извлеченные из ненарушенных высокоплодородных почв (например, чернозема) методами физической экстракция. При правильности исходных допущений интродукция таких комплексов .в случае.их выживаемости в новом местообитании может в той иди иной степени измена!л характеристики микробной системы в почве и ризосфере с созданием усдсвий, более благоприятных для роста растений. Поскольку в этом случае, речь идет не об объектах генной инженерии, а об естественном микробном, населении плодородной почвы, рассматриваемый подход не свяэан с нерешенной до настоящего времени проблемой оценки риска при интродукции трансгенных организмов:

Цаль работа - анализ, интродукции сложных естественных комплексов бактерий в ризосферу растений с оценкой их стимулируючрго потенциала, Основные аадачи щаетшялтш .

1. Оптимизация процесса выделения бактериальных комплексов (ВК) из почв.

2. Определение микробиологических характеристикВК» включая пока-гатели количественных учетов (посев, лшине центиая микроскопия с окрашиванием акридином оранжевым ■. и диацетатом флуоресцеиоа) и. скорости гидродива диацетвта фдуоресцеина.

3. Очистка клеток комплекса от сопутствующего почвенного материала методом разделения в 2-фазбой водной системе декстрвна и полиэти-денгликодя. . • . .. >••■•'

•1. Определение выживаемости микробов послеинтродукцюр комплексов в почву и ривосферу; акацив выгываешх при этом изменений структуры микрооиых сообществ. '

5. Характеристика воздействия ВК на развитие куоатУрных растений.

Научная иавиава. В работепредложер новый подход в области создания и применения бактериальных удобрений. Доказана принципиальная воз-

(

модность устойчивого стимулирования растений на основе интродукции сложных естественных ЕК, извлеченных из высокоплодородных novo без подращивания на питательных средах. Предложенное решение учитывает основные экологические закономерности в данной области, включая признание (значимости состояния почвенного микробного сообщества в делом, способность инородных популяций выливать и проявлять активность в почве и.ризосфере после интродукции, а таyxa возможность организации структуры микробных сообществ почвы и ризосферы по правилу геометрического ряда (гипотеза "перехвата" ниш).

С помощью специальных Методов (математическое планирование экспериментов; очистка препаратов ВК от почвенного материала в 2-фазной водной системе декстрана и полиэтиленгликоля; определение скорости гидролиза ФДА; мультисубстратнае тестирование) определены условия для выделения ВК с максимальным уровнем эффективности и выявлены изменения в. почвенном микробном сообществе в результате интродукции. Показано, что исследуемые БК как средство воздействия на растения не уступает по значимости агрохимическим удобрениям, а по степени влияния на.микробиологию прикорневой зоны - существенно их превосходят.

Ярашичвсяая циаое». Реализация предложенного подхода открывает возможность улучшения экологических условий в ризосфере с увеличением Продуктивности растений эа счет повышения биоразнообразия благоприятна мякробйоты, что представляет яаиболывий интерес в ситуации с "ток,-сикозом" почва (Мирчинк, 1988) в современных агроэкосистемах.

ДяроОвдил раСош. Результаты диссертационной работы были доложены на1 IV Всесоюзной конференций "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), на-конференции "Интродукция, микроорганизмов е окружающую Среду"' (Москва, 1994) , на конференциях молодых ученых факультета почвоведения МГУ "Современные проблемы почвоведения и.экологии" (Крас-

новидово, 1993; Москва, 1994), а также на совместном заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МРУ и Российского.общества почвоведов (Москва, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов," списка литературы, включающего 62 отечественных и 95 иностранных работ. Работа изложена на 109 машинописных страницах и включает 9 таблиц и-13 рисунков.

Объекты и методы исследования. БК извлекали из образцов гумусовых горизонтов (0-15 см) почв (типичный чернозем, Курская обл.; обыкновенный чернозем, Воронежская обл.; окультуренная дерново-подзолистая почва, Московская обл.) без подращивания на питательных средах на основе ультразвуковой обработки и центрифугирования. В большинстве случаев выделение проводилось на основе режимов, подобранных с помощью математического планирования экспериментов (Максимов, Федоров, 1969; Максимов, 1980). В отдельных вариантах перед выделением в черноземе инициировали микробную сукцессию: увлажняли воздушно-сухие образцы до 60-70% от полной влагоемкости, а также одновременно увлажняли и вносили дополнительные субстраты - этанол, лактат и глюкозу (1%).

Получаемую клеточную фракцию (БК) очищали от грубых почвенных частиц центрифугированием (3500 об/сек; б мин). Очистку от тонкого почвенного почвенного материала и растворимых веществ проводили в 2-х фазной водной системе декстрана и полиэтиленгликоля (Smith, Stribley, 1994). Для этого 6 г суспензии БК добавляли к 10 г 20% раствора декстрана (мол.масса 600000 Дальтон) и 15 г 40% раствора полиэтиленгликоля (мол.масса 20000 Дальтон), после чего приливали 69 г воды. После тщательного перемешивания (20 циклов переворачивания колбы) система отстаивалось до появления четкой границы мелоду фазами. Верхняя .фаза,, в

f I

которой концентрировались микроорганизмы, удалялась пипеткой, а к оставшейся части прибавляли новую порцию полиэтиленгликоля. В такой последовательности проводили 4 цикла. Перешедшие в полиэтиленгликоль клетки отмывали на мембранном фильтре (0.2 мкм), затем ресуспендирова-ли в стерильную воду ультразвуковой обработкой (5 мка, 30 сек).

Количественный учет микроорганизмов в препаратах БК проводили методами люминесцентной микроскопии после окрашивания акридином оранжевым (АО; 1:10000; 2-4 мин; промывка - 10 мин) и диацетатом флуоресцеи-на (ФДА; 1:5000; 10 мин). Функциональную активность микробов з'препаратах оценивали методом гидролиза ФДА. (Swisher, Carroll, 1980).

Тесты на прорастаемость и начальные этапы роста ячменя проводили по стандартной методике на фильтровальной бумаге в чашках Петри (Мине-ев Ремпе, 1991). Нанесение БК на семена проводили простым замачиванием на 16-18 часов. После этого семена подсушивались и раскладывались в 3-х кратной повторности по 25 штук в чашку с 10 мл стерильной воды. Определяли процент прорастания, среднюю длину проростков и корешков, суммарную длину вегетативной части 7-дневных растений.

Для оценки выживаемости БК чернозема после интродукции в дерново-подзолистую почву и ризосферу ячменя, выращиваемого, на дерново-подзолистой почвё, • применяли методику мультисубстратного тестирования (Горленко, Кожевин, 1994). В этом случае в ходе предварительной подготовки почвенную суспензию (1:50) из соответствующих вариантов обрабатывали ультразвуком (22 кГц; 4 мкА; 1,мин; УЗДН-2) и центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин) до получения прозрачной надосадочной жидкости.

Интродукцию БК в ризосферу тритикале, льна и люпина исследовали в условиях вегетационных опытов. Тритикале выращивали в 12 почвенных сосудах (на СО кг почвы каждый) на слзбоокультуренпой дерново-подзолистой почве. Исследуемый БК. выделялся из типичного чернозема (на 7 день

- б -

после увлажнения воздушно-сухого образца до 70% ' от полной влагоемкос-ти). Его влияние изучалось на фоне различных минеральных удобрений (N, NK, PK, по 0.1 г действующего вещества [д.в.) на кг почвы). Обработка семян препаратами БК проводилась непосредственно перед посевом замачиванием (примерно 107 клеток на семя) . Контролями служили .опыты с предварительным замачиванием семян в воде и с интродукцией Pseudomonas ''liiorescens BKM-S61.;.

Лен и люпин выращивали в 10-килограммовых сосудах на среднеокуль-туренной дерново-подзолистой почве с единым комплексом внесенных NPK-удобрений (по 0.01.г д.в. на 1 кг почвы). В каждый иа сосудов в вариантах (для льна было предусмотрено по б повторностей, для люпина -цо 10) вносили избыточное число семян, и через некоторое время прореживали проросшие растения до одинакового числа на сосуд,- фиксируя при этом разность в ттрорастаемости. ß случае со льном бактеризацию прово- . дили препаратом БК, выделенным из образца воздушйо-сухого чернозема. При выращивании люпина в качестве дополнительных вариантов использовали интродукцию популяцией Rhlzoblum lupinl 1606 (359аЗ отдельно и совместно с препаратом БК чернозема (60:60).

В нолевых условиях интродукцию ВК проводили в течение 2-х лет на базе агробиостанции "Чатниково" (Московская обл.). Эксперименты включали выращивание бактеризованного (10б-10? кл./семя) и контрольного ячменя (сорт "Дина") в дерново-подзолистой почйе на делянках размером 1.6 х ? м. В 1993 году опыты проводили на 7 агрохимических фонах: 1) вариант бее удобрений; 2) навоз 20 т/га; 3) навоз - 90 т/га; 4) навоз - 10 т/га; аммиачная селитра (N) - 30 кг д.в./га; двойной суперфосфат (Р> и хлористый калий (К) - по 126 кг д.в./га; 5) навоз - 45 т/га; Н - 45 кг д.в./га; Р, К- по 250 кг д.в./га; 6) « - 60 кг д.в./га; . Р, К - по 225 кг д.в./га-, 7) N - 120 кг д.в./га; Р, К - по

500 кг д.в./га. ' Удобрения вносили за неделю до посева. Каждый вариант по числу делянок предусматривал 3-кратную повторность. Всего было - 42 делянки, расположенные вниз по полы в виде двойного ряда. В 1994 году опыт проводили на том же поле и по неизмененной схеме, но без внесения агрохимических удобрений, т.е. ячмень выращивали в условиях последействия удобрений, внесенных годом раньше.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов программ Statex, Stat'graphics.

Автор выражает свою признательность Болышевой Т.Н. и Егорову B.C. за возможность проведения интродукции БК в опытах, которые проводились на кафедре агрохимии факультета почвоведения МГУ.

результата и обсуждение. Для повышения полноты выделения микробной биомассы из почв с помощью математического планирования экспериментов построена поверхность отклика функции выделения от 4-х факторов, включая время и мощность ультразвуковой обработки, объем и разведение обрабатываемой почвенной суспензии. Далее с помощью полученных уравнений и дополнительных опытов были подобраны наиболее оптимальные режимы: объем и степень разведения обрабатываемой почвенной суспензии -30 мл и i:5 соответственно, частота, сила тока и время озвучивания на аппарате УЗДН-2 - 22 кГц, 20 мкА и 30 сек.'

Люминесцентная микроскопия полученных клеточных фракций показала наличие в них в основном бактериальных клеток (4*108 и 1.2*107 клеток/г Почвы при выделении из воздушно-сухого образца й учете с красителями АО и ФДА соответствен!»), небольшого количества грибных спор, а также мелкодисперсного почвенного материала. Мицелий грибов и ачтино-мицетов в препаратах не зарегистрирован (режимы ультразвуковой обработки и дальиейаего центрифугирования приводят к разрушению мицелия н его осаждению вместе с почвой).

БК чернозема после нанесения на семена (106-107 клеток на семя) разных растений (пшеница, тритикале, люпин, лен и другие) достоверно повышали прорастаемость и стимулировали развитие растений. Напротив, БК, извлеченный из менее плодородной дерново-подзолистой почвы, оказывал прямо противоположный эффект. В частности, суммарная длина 7-дневных проростков ячменя, обработанных БК дерново-подзолистой почвы, была на 16% меньше чем контрольная (в тестах на фильтровальной бумаге), а в варианте с БК чернозема наоборот - на 14% больше. В дальнейшем анализировались только БК, выделенные из образцов чернозема.

Наличие в препаратах почвенного материала приводило к неопределенностям при изучении природы регистрируемых эффектов. Для отделения микробных клеток от почвенного материала использовали 2-фазную водную систему декстрана и полиэтиленгликоля. Люминесцентная микроскопия подтвердила, что после разделения фракция БК содержит только, клетки, при этом очищенный препарат сохранял свои свойства. Например, БК, выделенный из чернозема на 3 сутки после увлажнения, повысил прорастаемость семян ячменя на 15%, а показатель общей длины вегетативной части - на 40% по' сравнению с контролем, В ходе очистки этого препарата от почвенного материала удалось сохранить примерно 30% от исходной численности клеток, причем структурные показатели БК (ФДА/АО) практически не изменилась. Стимулирующий эффект сохранился с небольшим уменьшением по абсолютной величине, что скорее всего связано с существенно более низким уровнем инокуляции в дачном случае. Кратковременное прогревание препарата на водяной бане, как и ожидалось, привело к резкому снижению числа активных клеток, что резко снижает эффективность от бактеризации (табл. 1, варианты БК1, БК1« и БкЧ; рис. 1).

Таким образом, есть достаточные основания полагать, что благоприятное действие БК чернозема на ячмень определяется именно содержащими-

- .д -

Таблица 1.

Характеристики БК чернозема после инициации разных сукцессии.

Препарат* Учет с АО Г"1 почвы) Учет с ФДА (1вМ. г"Т почвы) ФДА/АО

БК*в** БКН БК* ЕКЗ БК4 8.15 7.60 7.95 9.96 8.80 9.48 8.08' 7.48 7.74 7.74 <6.00 7.73 0.86 0.75 0.17 0.01 <0.01 0.02

* цифрами обозначены субстраты, с помощью которых инициировали сукцессию: 1 - вода; 2 - лактат; 3 - глюкоза; 4 - спирт. Отличия между показателями вариантов статистически достоверны (Р-95Х); .* * БК. очищенный от почвенного материала; »** БК. .прогретый 20 мин на водяной бане.

Таблица 2.

Показатели развития тритикале в вариантах с внесением БК и. Рэец-с1отопаз Ииогеэсегв (Ps.fl.) на равном фоне минеральных удобрений.

Вариант»» Масса колоса Высота растения Общий урожай зерна по

(г) (см) всем повторностям (г)

Контр.+ - 0.254 70.25 23.2

Контр.+ , N 0.590 79.70 25.7

Контр.+ И.К 0.483 88.10 26.7

Контр.+ Р.К 0.559 93.00 . 52.8

БК + - 0.475* 84.60* 38,6

БК + N 0.920* 92.45* 34.0

БК + Ы.К 1.200* 103.00* 87.0

БК + Р,К 0.795* 93,55* 62.6

Рз.П.+ - 0.487* 79.65* 26.0

РЗ.П.+ М .0.615 • 77.85 23.5

Ps.fl.-t- ИД 0.528 81.45 '26.4

Рэ.П.+ Р,К 0.613 88.25 • 53.9

« показатели, достоверна (Р«95%) отличающиеся от контрольных; *» минеральные удобрения вносили по 0.1 г каждого.д.в. на кг почвы.

Таблица 3.

Показатели развития льна, обработанного БК чернозема.

Показатель Варианты

контроль БК*

Доля проросших растений (%) Вес растения (г) Высота растения (см) Суммарная масса коробочек в повторносТях (г) Масса.тысячи семян (г) Суммарная масса растений в повторностях (г) 79.0 2.3 92.3 1.2 1.0 210.1 87.0 2.7 103.0 7.9 2.1 256.0

«.- »се отличия от контроля статистически достоверны (Р-95%).

Рис. 1. Число жизнеспособных клеток о инокулятв (БК) и его действие на прорастание ячменя.

IgN (М — число кл./ил)

контроль

6Кт - ОЧИЩЕННЫЙ от ПОЧВЕННОГО МАТЕРИАЛА; 6Kt - ПОСЛЕ ПРОГРЕВА.

Рис. 2. Эффективность и ФДА-актизность 5К чернозема в зависимости от вида микробной сукцессии.

ОБЩАЯ ДЛИНА ПРОРОСТКОВ ЯЧМЕНЯ (СМ) и КГ «РЛУОРЕСЦСИНАДМ СУСПЕНЗИИ БК

- 10

контроль

вода лактат глскоэа

СУКЦЕССИОННЬЕ ВАРИАНТЫ

спирт

ся в препарата бактериями.

В табл. 1 и на рис. 2 представлены данные по изукнию ВК, извлеченных из чернозема через 2-3 дня после инициации различных сукцессии. Выделенные из разных сукцессий БК оказали разное воздействие на начальный рост растений, причем наблюдаемый згЕфект коррелировал с отношением показателей численности (ФДА/АО) и со способностью препарата гидролизовать ФДА при инкубации (коэффициенты корреляции характеристик с длиной растений превышают 0.9).

•Внесение спирта, глюкозы и лактата по сравнению с простым'увлажнением существенно изменяло характеристики получаемых БК. В этих препаратах на несколько порядков увеличивалась число окрашиваемых АО клеток, снижались показатель прямого учета с Щ\ и способность к гидролизу ФДА. Две последние характеристики в литературе предлагаются как достаточно чувствительные для оценки численности активных клеток в сообществе (Lundgren, 1981) и общей метаболической активности сообщества в целом (Swisher,' Carroll, I960). В нашем же случае на фоне возрастания общей численности бактерий (а значити активности) связанные с ФДА показатели не растут, а наоборот, убывают. Поскольку, как следует из представленных данных (табл.1, рис. 2). не все активные почвенные бактерии выявляются с ФДА (что вполне согласуется с другими работами, например, Lundgren [1981]), можно предположить, что внесение субстратов- в почву снизило значимость"ФДА-активных" популяций в развивающихся сообществах. Таким образом, отношение ФДА/АО по аналогии с коэффициентом "К" (Кожевин, 1989) и гидролиз ФДА в данном случае выступают как интегральные характеристики структуры, а значит, и биоразнообразия микробных сообществ. Известно, что в ходе сукцессии, инициируемой подобными субстратами, На 2-3 сутки происходит так называемое "омоложение" микробной системы (Кожевин, 1989). и поэтому закономерно, что в

напем случае максимумы по учету с АО не обязательно сопровождаются ростом связанных с ФДА характеристик.

Таким образом, микробный комплекс из одной и той же почвы может совершенно по-разному влиять на растения, причем эффект зависит от структурных характеристик сообщества й их динамики. В нашем случае растения лучше развивались в вариантах, где зарегистрированы высокие значения гидролиза ФДА и индекса ФДА/АО, что подтверждает правомерность применения в качестве биоудобрений микробных комплексов с высоким уровнем разнообразия. Очевидно также, что указанные показатели могут использоваться для контроля качества и- стандартизации препаратов сложных природных БК.

Изучение микробной интродукции в почву и ризосферу невозможно без анализа вопросов выживаемости объекта в новом местообитании (Красиль-ников, 1945). Так как в данном случае объектом служит не отдельная популяция, а сложный природный комплекс бактерий, традиционные популяци-онные методы (иммуиофлуоресценция, генетическая.маркировка) Неэффективны. Поэтому, для оценки выживаемости БК чернозема в дерново-подзолистой почве и ризосфере, Ш Применяли метод мультисубстратного тестирования. Метод позволяет получать как бы многомерные портреты исследуемых микробных сообществ в зависимости от их способности потреблять широкий спектр источников углерода, с помощью статистического анализа получаемых характеристик можно сравнивать.подобные "портреты" и судить с заданной степенью достоверности о структурно-функциональных особенностях разных микробных Сообществ, сходствах и различиях между ними, а также о происходящих в них изменениях.

Многомерный анализ данных показал, что как в ризосферной, так и в неризосферной дерново-подзолистой почве после инокуляции. БК структура микробного сообщества достоверно отличается от контрольной (бев интро-

дукции), причем в спектре потребляемых ресурсов проявляется большая часть признаков, специфичных для чернозема. Выделеньаз из чернозема микробиота наиболее резко отличалась от дернсво-подзолистого варианта активным потреблением малеината, октаноата, лизина и креатина, и менее активным потреблением цитрата, аминопропионата, гистидина, серина и глутамина. Пять дифференцирующих признаков (цитрат, аминопропионат, гистидин, серии и креатин) в полной мере проявились как ключевые и дл^ дерново-подзолистой почвы с внесенным БК чернозема. Аналогичная картина прослеживалась при сопоставлении данных по ризосферной почве.

Полученные результаты позволяют утверждать, что интродуцированные в дерново-подзолистую почву и ризосферу элементы БК чернозема не только сохраняются и весьма активны в новом местообитании, но и перестраивают исходные микробные сообщества с проявлением функциональных характеристик микробиоты более плодородной почвы.

Влияние интродукций БК в условиях вегетационных опытов изучалось на тритикале, льне и люпине. В большинстве случаев были получены достоверные положительные эффекты. ' У, растений существенно улучшались среднестатистические показатели и в первую очередь развитие репродуктивных органов (табл. 2-4). По сравнению с контролем урожайность зерна тритикале в лучшем случае возросла более чем в 3 раза, средняя масса и высота льна увеличилась на 17% и 10 см, а урожай зеленой массы и средняя масса бобов люпина на 31% и 59% соответственно. При этом эффективность БК проявлялась и в тех случаях, когда интродукция традиционных монопопуляционных бактериальных удобрений была неэффективна.

На рис. 3 показаны данные микробиологического учета в риэоплане зрелого тритикале. Как видно, на фоне азота и калия в контроле и в варианте с псевдомонадой прослеживаются существенные и сходные изменения: возрастает численность учитываемых на МПД бактерий и снижается

показатель "К". В случае с БК картина иная: как количественные,, так и структурные показатели остались неизменными. Сходная тенденция прослеживалась '. по грибам. Следовательно, вызванные БК изменения в прикорн-

Таблица 4.

Показатели развития люпина в вариантах с внесением БК, Rhizobitim lupin} (Rh.sp.) и смеси МУ (БК+Rh.sp.).

Показатель Варианты

контроль ВК Rh.sp. БК+Rh.sp.

Доля проросших растений (£) Вес бобов на растении (г) Масса тысячи семян (г) Высота растения (см) Общий урожай бобов (г) Урожай зеленой массы (г) (без бобов) 75.0 9.8 741.0 71.1 403.7 808.7- 93.0" 14.3" 945.0" 74.8' 639.3 1060.0 88.0* 9.9 777.0 70.7 434.8 958.0 96.0* 11.0 73.9 551.7 1025.0

* показатели, статистически достоверно (Р-95%) отличающиеся от контрольных; ** представлены расчетные величины, учитывающие неходкую раз-

ницу по прорастаемости в разных вариантах.

Таблица 5.

Показатели развития ячменя на разном фоне агрохимических удобрений в контроле и в вариантах с внесением БК чернозема.

Вариант Масса* колоса(г) Высота*растения(см) Урожай верна(ц/га)

Контр.-1** 0.70 74.0 19.5***

Контр.-2 0.64 75.0 25.3

Контр.-3 0.66 84.7 37.8

Контр.-4 0.78 • 94.1 33.5

Контр.-5 0.69 89.7 39.1

Контр.-6 0.67 94.0 37.6

Контр.-7 0.85 91.2 43.2

БК -1 1.01 у 86.8 35.2

БК -2 0.87 84.9 39.2

БК -3 0.95 95.4 40.9

■БК -4 1.07 112.5 55.6

БК -5 1.02 106.3 67.9

БК -6 0.94 108.3 63.5

БК -7 1.10 98.3 48.9

* отличия всех показателей БК-1 от соответствующего контроля статистически достоверны (Р=95%);

** - цифрами обозначены удобрения, на фоне которых изучали интродукцию: 1- без удобрений; 2- навозго; 3- навоздо; 4- навозил,N30,^125, Кг25; 5- навозу,N45.Р250.К250; 6- Ибо. Р225.К225; 7- N120.P500.R500;

*** - представлена расчетная величина. ■

Рис. 3. Учет бактерия в риэоплана тритикале.

1д N (Н — число кл./1г почвы)

АО/МПА

кон>р,- контр.+N4 БК - БК +ЫК Рз.Зр.- Рв.вр.+ЫК все отличия от контроля статистически достоверны (Р=95%)

Рис. 4: Учет бактерий з риэоплонв льна а середине (*) и конце.(**) вегетации.

9.0

1д N (АО)

N - число кл./1г корня

1д N (ША)

7.э

КОНТР.» ■ БК « . КОНТР.«« БК

все отличия от контроля стотиотич«ски достоверны (Р~

95Х)

евой микробиоте тритикале оказались достаточно устойчивыми, чтобы сохраниться даже на дестабилизирующем фоне высоких доз минеральных удобрений. Именно на таком фоне были получены наивысшие показатели по развитию растений.

Наличие изменений в прикорневой микробиоте в результате внесения БК отмечалось и в двух других экспериментах. На рис. 4 это показано на примере льна в середине и конце вегетации: на обоих этапах было характерно повышенное содержание бактерий в вариантах с БК. Известно, что традиционные бактериальные удобрения в основном оказывают стимулирование на начальных этапах развития растений. В нашем случае со льном обработанные БК растения первую половину вегетации (если не считать данных по ризоплане) ничем от контрольных не отличались. Таким образом, эффективность БК может проявляться не только на начальных, но и на более поздних этапах вегетации.

Кластерный анализ микробиологических характеристик ризопланы люпина показал, что в результате интродукции БК в структуре сообщества происходят более существенные изменения по сравнению с внесением клубеньковых бактерий как традиционного бактериального удобрения. По степени отличия от контроля все варианты расположились в следующем порядке: вариант "КИ.зр." (наименьшие отличия по всем признакам-, обозначения соответствуют табл. 4), "БК+РЬ.зр.", "БК" (максимальные отличия).

• Испытания БК в полевых условиях в основном подтвердили результаты вегетационных опытов. В частности, в эксперименте за 1993 год в вариантах с интродукцией вне зависимости от агрохимического фона высота ячменя достоверно превзошла контроль в среднем на 13 см, а средняя масса колоса и урожай зерна - примерно в полтора раза (табл.Б, рис.6). Та же тенденция сохранилась и в 1994 году.

На рис. 5 в сжатом виде отражены основше микробиологические ха-

рактеристики ризспланы ячменя в конце нолевого опыта. Как и в случае с тритикале, здесь можно говорить об определенной устойчивости, которую на фоне разных удобрений проявляет прикорневая микробиота у инокулиро-ванных растений: варианты с интродукцией в координатах двух главных компонент явно обособлены и концентрируются в верхней части, тогда как контрольные распределены по всему остальному полю. Действие БК в первую очередь отражается на увеличении показателей скорости гидролиза ФДА (рис. 6) и индекса разнообразия (ФДА/АО), что подтверждает корреляцию между эффективностью БК и биоразнообразием. Учитывая это, а также ■ принимая во внимание результаты мультксубстратного и вегетационных тестов, можно с высокой степенью вероятности предполагать, что по крайней мере часть внесенных на семена микроорганизмов активно сохранилась в ризоплане до самого конца вегетации, передав тем самым прикорневому сообществу свои специфические и благоприятные для растений черты. Дисперсионный анализ итоговых показателей по ячменю показал, что как фактор воздействия на урожай и микробиологическую характеристику ризопланы интродукция БК сравнима с таким мощным средством как органо-минеральные удобрения.

Таким образом, интродукция сложных естественных микробных комплексов, извлеченных без подращивания из плодородных почв, компостов и иных местообитаний, может стать вероятным путем оптимизации микробиологических параметров ризосферы. Не исключено, в частности, что давно и хорошо известное благоприятное действие компостов на растения определяется не только имеющимися - там питательными веществами, но преимущественным влиянием интродуцированного обильного микробного сообщества. При достаточном уровне внесения элементы сложных естественных комплексов должны выживать не хуже популяций традиционных МУ. В этом

- 18 -

Рис. 5. Факторный анализ показателей ячменя.

1 гл. компонента (+масеа колоса; +пр.учет о 9 ДА; +ч>да/ао; +гидролиз ФДА)

20

Б1 • к

10 -

Бк-З

О -

-10 -

кдмгр

-я

БК-6 *

бк—а * бк-7

* 6К-1 Ж

комгр-7

О

контр-1

о

БК-З

контр—4 О

(обозначения соответствуют табл. в)

-20 -

контр-2 О

контр-З

-60

-40

-20 О 20 40 60 80

2 Сл. компонента (-пр.уч»т о АО; -учат на МПА)

Рис. 6. Сравнительная оценка БК как фактора воздействия на развитие ячменя и состояний его прикорневой микробноты. СТЕПЕНЬ ВЛИЯНИЯ №1

ср. высота ср. моееа урожаи пмфолиа *ДД

рост*иип колоса мрма »риаоплон»

(результаты дмепвреяоинагв аналнва)

О

случа^ исходя ив допущений, включающих гипотезы геометрического захвата иии, аддитивности механизмов сборки микробного сообщества ризосферы и полифуикциональности интродуцируемого сообщества ми1фоорганизмов, Можно ожидать стимулирование роста растений.

В м ■ о щ:

1. Доказана принципиальная возможность устойчивого стимулирования растений на основа интродукции сложных комплексов естественных микроорганизмов , навлеченных из высокоплодородных почв без подращивания на питательных средах,

2, Подобраны оптимальные режимы и методы выделения и очистки препаратов бактериальных комплексов чернозема на основе ультразвуковой обработки» центрифугирования и дальнейшего разделения в 2-фазной водной системе декстрана и полиэтиденгликоля.

3". Показало, что стй<улирующий эффект в первую очередь определяется микробной структурой (биораанообразием) используемых комплексов. На основе показателей индекса гидролиза ФДА и отношения данных двух методов Прямого учета бактерий (ФДА/АО) определены подходы к стандартизации и оценке степей» благоприятности биопрепаратов.

4. С помощью методу иультисубстратного тестирования установлено, что извлеченные из черноаема микроорганизмы после интродукции сохраняются и проявляют активность, в новых местообитаниях (дерново-подзолистая почва, ризосфера), микробные сообщества которых при этом усложняются к приобретают черты, свойственные микробйоте чернозема.

Б. В ходе вегетационных опытов о различными растениями установлено, что действие внесенных комплексов устойчиво проявляется на протяжении всего Вегетационного периода как в благоприятных, так и а неблагоприятных агрохимических условиях. Наблюдаемый при этом стимулирующий эффект имеет место в том числе и тогда, когда традиционные б-пк.териать-

ные удобрения малоэффективны.

6. В полевых условиях на разном агрохимическом фоне БК чернозема не уступал органо-минеральным удобрениям по степени влияния на разбитие ячменя и микробиологические параметры ризоплакы.

Материала диссертации опубликована а работая:

1. неопределенности при применении инородных популяций в качестве бактериального удобрения. В сб. Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тез. докл. IV Всесоюзной конференции микробиологов (8 соавт. с П.А. Кожевиным, Т.Н. Майоровой, М.В. Горленко, Н.Г. Соевой). Пуиино, 1992.

2. Нетрадиционные подходы в бактериальном стимулировании растений. В сб. .Современные проблемы почвоведения и экологии. Tee. докл.

s • ' • •

конференции молодых ученых факультета почвоведения №У. Красноввдово,

1993. • • ' . \ . ' ■

3. Почвенные микробные комплексы - стимуляторы развития растений. В сб. Современные проблемы почвоведения и Экологии. Тез. докл. конференции молодых ученых факультета почвоведения МГУ. Москва, 1994.

4. Интродукция микробных комплексов в ризосферу растений. В сб. Интродукция микроорганизмов' в окружающую среду, fee. докл. конференции (В соавт. с Т.Н. Волыиевой, B.C. Егоровым, П.А. Кожевиным). Москва,

1994.

5. На пути к теории применения микробных удобрений. (В соавт, с П.А. Кожевиным). Вестник Московского университета. Сер, Почвоведение,

N 2, с. 52-61, 1995.