Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсивность свободно-радикального окисления липидов и белков и состояние антиоксидантной системы у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Интенсивность свободно-радикального окисления липидов и белков и состояние антиоксидантной системы у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой"

На правах рукописи

005042895

ДЕРЖИНСКИИ Николай Владимирович

ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ И СОСТОЯНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Тюмень - 2012

005042895

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральский государственный университет физической культуры»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Львовская Елена Ивановна

доктор медицинских наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Бышевский Анатолий Шулимовнч

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России, профессор кафедры биохимии

Лунева Светлана Николаевна

доктор биологических наук, профессор ФГБУ РНЦ ««Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздравсоцразвития России, заведующая биохимической лабораторией

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоите мая 2012 г. в ¿"^часов на заседании диссертационного

совета Д 208.101.02 при ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (625023 г. Тюмень, ул. Одесская, 54).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменской государственной медицинской академии

^^ 9П19 Автореферат разослан« » _2012

Ученый секретарь диссертационного совета

С.А. Орлов

Актуальность проблемы. Медикоциальная значимость тяжелой черепно-мозговой травмы связана с высокой частотой её возникновения, а в последующем длительной нетрудоспособностью, частой инвалидизацией, высокой смертностью, особенно среди лиц молодого и среднего возраста (Яхно H.H., Штульмана Д.Р., 2003; Верещагин Н.В. и соавт., 1996, 1997; Суслина З.А., 1999, 2000; Гусев Е.И. и соавт, 2001; Лебедев В.В., Крылов В.В., Сувалян А.Г., 1997; Агаева, К.Ф., 2001; Halliwell, В., 1981). Среди пострадавших от черепно-мозговой травмы (ЧМТ) 92% составляют люди трудоспособного возраста. Тяжелая ЧМТ требует длительного лечения и больших финансовых затрат.

Для острого периода ЧМТ характерна значительная активация гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы и иммунодепрессия, что расценивается как проявление стресса (Минкин Л.Н., 1988). Стресс, вызванный ЧМТ, развивающаяся ишемия, сопровождаются усилением продукции активных форм кислорода (АФК), интенсификацией процессов свободно-радикального окисления (СРО), что в свою очередь способствует активации антиоксидантной системы (АОС) организма. Соотношение про- и антиоксидантных систем во много определяет дальнейшие адаптивные возможности организма, «цену» адаптации, исходы заболевания (срыв адаптационных механизмов или адаптацию - приспособление к новым условиям).

При ЧМТ создаются условия для активации СРО. Головной мозг восприимчив к окислительному стрессу в связи с высоким потреблением кислорода мозговой тканью. Потенцированию окислительного стресса в тканях головного мозга способствует большое количество катехоламинов, фосфолипидов, олеиновой кислоты, Fe2+, высокое отношение липиды/белки, усиление метаболизма арахидоновой кислоты, образование пероксинитрита, перепроизводство NO\ низкое содержание в ликворе трансферрина и церулоплазмина, низкое количество витамина А, крайне низкая активность глутатионпероксидазы и, почти, полное отсутствие каталазы (Барабой В.А., 2006).

Оксидативное повреждение нервной ткани приводит к дезорганизации клеточных мембран, изменению активности мембраносвязанных ферментов и, в конечном итоге, к апоптозу и гибели клеток (Барабой В.А., 2006; Биленко М.В., 1989; Львовская Е.И., 1998). Окислительная деструкция клеточных мембран рецепторного аппарата, нарушение метаболизма гормонов, нейротрансмиттеров и т.д., прежде всего, связаны со СРО липидов и белков. Активация процессов СРО является общей реакцией мозга на повреждение. Свободно-радикальные процессы (СРП) объективно характеризуют тяжесть патологического процесса и физиологического напряжения травмированного мозга (Никушкин Е.В., 1989; Суткова Д.А., 1992). По мере активации СРП, нарастает степень дезинтегративных преобразований мембранных структур клеток, существенно нарушается их функция, (Никушкин Е.В., 1989) что может являться причиной более тяжелого течения черепно-мозговой травмы (ЧМТ) (Крыжановский Г.Н., 1997).

В большинстве работ посвященных изучению СРО при ЧМТ приводятся данные, касающиеся процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Сумная Д.Б., 2003; Кучин Д.Г., 2005; Садова В.А., 2008), не беря во внимание окислительную деструкцию белков. До настоящего времени практически отсутствуют работы, в которых одновременно исследуются процессы ПОЛ и окислительной модификации белков (ОМБ). что затрудняет оценку соотношения их уровней. Весьма противоречивы данные о липопероксидации при ЧМТ, особенно в первые две недели острого периода. В связи с этим чрезвычайно актуальным становиться рассмотрение параметров липидной пероксидации, окислительной модификации белков, активности про- и антиоксидантных ферментов, изменений фосфолипидного состава, а также их сравнительной характеристики у пациентов разных возрастных групп с тяжелой ЧМТ, исходом которой являлись благоприятные и летальные исходы. Данное исследование позволит повысить точность прогноза и обеспечит более эффективный контроль над течением и терапией тяжелых травм головного мозга.

Цель исследования: определить соотношение уровней процессов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков, активность про- и антиоксидантных ферментов в динамике острого периода тяжелой черепно-мозговой травмы у пациентов разных возрастных групп с разным исходом травмы.

Задачи исследования

1. Оценить динамику содержания гептан- и изопропанолрастворимых продуктов перекисного окисления липидов в крови и ликворе больных разных возрастных групп с разным исходом острого периода тяжелой черепно-мозговой травмы.

2. Определить уровень окислительной модификации белков плазмы крови больных разных возрастных групп в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы.

3. Оценить изменение уровня аскорбат-индуцированного перекисного окисления липидов в крови и ликворе больных разных возрастных групп с разным исходом острого периода тяжелой черепно-мозговой травмы.

4. Исследовать динамику изменения в крови активности про- и антиоксидантных ферментов у больных разных возрастных групп с разным исходом острого периода тяжелой черепно-мозгой травмы.

5. Изучить фосфолипидный спектр плазмы крови больных в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы.

Научная новизна. Впервые изучено соотношение свободно-радикального окисления липидов и белков, а так же про- и антиоксидантных ферментов у пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой разных возрастных групп и разным исходом травмы. Показано, что в остром периоде тяжелой черепно-мозговой травмы происходит разнонаправленное изменение содержания продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков. Перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков находятся в реципрокных отношениях в острый период тяжелой черепно-

мозговой травмы (на протяжении первых 14 суток). Впервые установлены возрастные различия в содержании окислительно-модифицированных белков при тяжелой черепно-мозговой травме: постепенное нарастание спонтанно карбонилированных белков к 8-14 суткам у пациентов 20-39 лет и волнообразное (снижение на 1-3 сутки с последующим повышением к 4-7 и повторное снижение к 14 суткам) у пациентов 40-59 лет.

Установлено, что острый период тяжелой черепно-мозговой травмы сопровождается повышением индуцированного перекисного окисления липидов. Наиболее выраженное повышение уровня антиокислительной активности у пациентов 20-39 лет выявлено в крови, у пациентов 40-59 лет в ликворе. Впервые установлено, что у пациентов с летальным исходом «среднее» содержание липопероксидов в крови и ликворе ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом.

Впервые показано, что наступлению летального исхода предшествовало снижение содержания гептанофильных липопероксидов в сыворотке крови ниже уровня контрольной группы. Выявлено, что в случае летальных исходов наблюдалось снижение уровня антиокислительной активности в сыворотке крови и антиокислительной активности-2 в ликворе.

Показано, что при тяжелых черепно-мозговых травмах происходит повышение активности антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы и каталазы) на фоне снижения активности супероксиддисмутазы. Впервые показано, что в случае летальных исходов наблюдался более выраженный прирост активности глутатионпероксидазы, более выраженное снижение активности каталазы и супероксиддисмутазы. Выявлен значительный рост активности ксантиноксидазы при тяжелой черепно-мозговой травме. Установлено, что прирост активности ксантиноксидазы на 4-7 сутки более чем в 3,7 раза, а на 8-14 сутки более чем в 4,3 раза является прогностически неблагоприятным признаком.

Установлено, что изменение фосфолипидного спектра плазмы крови на I -3 сутки при тяжелой черепно-мозговой травме проявляется снижением содержания общих фосфолипидов, фосфатидилхолина, на фоне увеличения сфингомиелина, фосфатидилсерина, кардиолипина, лизофосфатидилхолина.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость данного исследования, прежде всего, заключается в том, что оно пополняет существующее научное знание об особенностях процессов липопероксидации, окислительной модификации белков, их соотношении, уровнях индуцированных ПОЛ и ОМБ, активности про- и антиоксидантных ферментов при тяжелой черепно-мозговой травме. Полученные в работе данные могут применяться с целью оценки эффективности проводимой терапии, прогноза исхода, контроля за состоянием пациентов.

Внедрение результатов в практику. Основные положения данной работы используются при обучении студентов на кафедрах биохимии УралГУФК и ЧелГМА, кафедре травматологии и ортопедии ЧелГМА. Результаты данных исследований внедрены в практику работы отделений НУЗ ДКБ на станции Челябинск ОАО РЖД, ОКБ №3 и ОКБ №1.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Первые две недели тяжелой черепно-мозговой травмы характеризуются реципрокными отношениями между перекисным окислением липидов и окислительной модификацией белков.

2. Усиление перекисного окисления липидов сопряжено с увеличение окисляемости липидов.

3. Повышение активности ксантиноксидазы ассоциировано с приростом липопероксидов и является маркером тяжести состояния пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой.

4. Параллельное определение продуктов свободно-радикального окисления липидов и белков на базальном и индуцированном уровнях, активности ксантиноксидазы и супероксиддисмутазы позволит повысить эффективность контроля за проводимой терапией, улучшит прогнозирование исходов тяжелой черепно-мозговой травмы.

Апробация работы. Основные положения доложены на: Восьмой научно-практической конференции молодых ученых УралГУФК (Челябинск, 2009); Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лившица, приуроченной к 65-летию Челябинской государственной медицинской академии «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); Седьмой международной научно-практической конференции «Новые достижения европейской науки» (София, 2011); Российской научно-практической конференции «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы», (Челябинск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ.

Личный вклад автора. Материал, предоставленный в диссертации, обработан и проанализирован лично автором. Автор принимал непосредственное участие в проводимых обследованиях и динамическом наблюдении большинства пациентов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Полный объем диссертации - 155 страниц печатного текста, иллюстрирована 43 рисунками, 17 таблицами. Указатель литературы содержит 241 публикацию, из них 136 отечественных и 105 зарубежных.

Материалы и методы

Обшая характеристика обследованных больных. В исследование было включено 202 пациента в остром периоде тяжелой ЧМТ двух возрастных групп: 20-39 и 40-59 лет мужского и женского пола, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии №1 ГКБ №3 г.Челябинск. Из исследования были исключены пациенты с явной сопутствующей патологией, а также с повторной ЧМТ в анамнезе. У всех пациентов травматическое повреждение головного мозга было подтверждено компьютерной томографией.

Исследуемым материалом являлась кровь и ликвор. Исследовано ПОЛ-ОАЗ: у 72 пациентов с благоприятным исходом заболевания и у 32 пациентов с летальным исходом. У 41 пациента с благоприятным исходом исследовалась ОМБ. У 28 пациентов с благоприятным и у 15 пациентов с летальным исходом исследовали глутатионпероксидазу, каталазу, супероксиддисмутазу. Ксантиноксидазу определяли у 73 пациентов с благоприятным исходом и у 29 пациентов с летальным. У 28 пациентов с благоприятным исходом исследовали фосфолипидный спектр крови. Группу сравнения (контроля) составили 57 человек в возрасте от 20 до 59 лет, 32 человека жалоб на самочувствие не предъявляли, ЧМТ в анамнезе не имели (являлись сотрудниками ГКБ №3). Оставшиеся 25 - были пациентами, проходившими обследование в ГКБ №3, с вегетативной дистонией, остеохондрозом, алкогольным опьянением.

В работе применялись следующие методики исследования:

Для изучения параметров системы «ПОЛ-АОЗ» использовались следующие методы:

1. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых сред по методике Волчегорского И.А. и др. (1989). Результаты выражали в виде так называемого индекса окисления, для чего рассчитывали соотношение E232/E22U и Е278/Е220 (Волчегорский И.А., 1989).

2. Для определения конечных продуктов перекисного окисления липидов использовали спектрофотометрический метод по Львовской Е.И. с соавт.(1991).

3. Определение интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ проводили по методу Львовской Е.И. (1998)

4. Окислительную модификацию белков оценивали по уровню образования динитрофенилгидразонов по методу Е.Е. Дубининой (1995).

5. Активность СОД определяли по методу Чевари С. и соавт (1985).

6. Определение активности ксантиноксидазы в сыворотке крови производилось по методу Hashimoto, 1974 г., спектрофотометрически при длине волны 292 нм по образованию мочевой кислоты из ксантина.

7. В сыворотке крови определяли каталазную активность по методу Королюк М.А. и соавт. (1988).

8. Определение активности глутатионпероксидазы в эритроцитах проводили по методу, описанному Власовой С.Н., Шабуниной Е.И., Переслегиной И.А. (1990).

9. Для определения фосфолипидного спектра плазмы крови использовался набор Sentinel (Италия)- тонкослойная хроматография.

Результаты обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990). Применялись критерии непараметрической статистики (Гублер Е.В., Генкин А.А 1969): Манна - Уитни (U) и Вальда-Вольфовица (WW). Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (rs).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Соотношение продуктов СРО липидов и белков в крови и ликворе у больных с тяжелой ЧМТ. При ЧМТ грубо нарушается гомеостаз нейронов, быстро расходуются запасы глюкозы, развивается ишемия. Усиленный метаболизм арахидоновой кислоты, ксантиноксидазная реакция, утечка электронов из дыхательной цепи митохондрий, перепроизводство N0" и образование пероксинитрита. а при кровоизлияниях - гем-протеины, освобождение ионов железа из депо ферритина становятся источниками активных форм кислорода (АФК), приводящих к интенсификации СРО. Головной мозг является органом с высокой предрасположенностью к индукции свободно-радикального окисления.

Согласно полученным данным в течение 14-ти дневного лечебного процесса, как представлено в таблицах 1 и 2, у пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой содержание всех категорий липопероксидов в сыворотке крови и ликворе превышали значения контрольной группы уже с 1-3 суток.

Изменения содержания изопропанолрастворимых диеновых коньюгатов (ИРДК) сыворотки крови и ликвора у пациентов, как 20-39 лет, так и 40-59 лет во многом сходны: содержание ИРДК ликвора было выше соответствующих показателей в сыворотке крови.

Максимальные значения ИРДК были в ликворе у пациентов 20-39 лет на 4-7 сутки, а минимальное превышение, зафиксированное в сыворотке крови, выявлено у пациентов 40-59 лет на 8-14 сутки после травмы и было достоверно выше значений контрольной группы в 1,98 раза. Максимально большие, достоверные, значения ИРДК в сыворотке крови зафиксированы у пациентов 20-39 лет на 4-7 сутки после травмы. Они превышали значения контрольной группы в 2,72раза. В ликворе наибольшие значение ДК были зафиксированы у пациентов 20-39 лет в гептановой фазе на 4-7 сутки, превысив значения контрольной группы в 6,91 раза.

Наиболее выраженное увеличение концентрации изопропанолрастворимых кетодиенов и сопряженный триенов (ИР КТ и СТ) сыворотки крови выявлено на 4-7 сутки у пациентов 20-39 лет и составило 421% (р<0.05и) по сравнению с контролем. Наибольший прирост КД и СТ в ликворе был определен на 4-7 сутки в гептановой фазе у пациентов 20-39 лет - 703%. Наибольшее количество конечных продуктов зафиксировано в ликворе на 1-3 сутки у пациентов 40-59 лет в гептановой фазе - 662% (р<0,05Ц).

Таким образом, на протяжении всего исследования наиболее выраженное увеличение всех категорий продуктов ПОЛ наблюдалось в ликворе. Это, возможно, обусловлено тем, что данная гуморальная среда наиболее приближена к месту «катастрофы».

На протяжении 14 суток после ЧМТ содержание продуктов липоперокси-дации у пациентов с благоприятным исходом, независимо от возраста превышало показатели контрольной группы, что говорит об отсутствии стабилизации процесса.

Таблица 1

Содержание продуктов ПОЛ изопропанольной фазы сыворотки крови у больных различных возрастных категорий в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы

Группы 1 1 2 | 3 | 4

Возраст 20-39 лет

Показатель Контроль (N=21) 1-3 сутки (N=40) 4-7 сутки (N=32) 8-14 сутки (N=32)

Диеновые конъюгаты 0,475±0,02 1,137±0,108 Pi.2<0,05U 1,294±0,157 P,.3<0,05U 0,919±0,052 P,.4<0,05U

Кетодиены и сопряжённые триены 0,299±0,01 1,140±0,122 PI.2<0,05U 1,261 ±0,090 P,.3<0,05U 0,627±0,050 Pi-4<0,05U P3.4<0,05WW

Шиффовы основания 0,040±0,003 0,060±0,012 PI-2>0,05U 0,065±0,011 Pi.3<0,05U 0,045±0,013 Pi-4<0,05U

Возраст 40-59 лет

Показатель Контроль (N=16) 1-3 сутки (N=32) 4-7 сутки (N=26) 8-14 сутки (N=22)

Диеновые конъюгаты 0,485±0,028 1,223±0,11 P,.2<0,05U 1,102±0,146 P,.3<0,05U 0,961±0,115 Pi.4<0,05U

Кетодиены и сопряжённые триены 0,337±0,002 1,033±0,127 P,.2<0,05U 1,025±0,123 P,.3<0,05U 0,877±0,16 Pi_4<0,05U

Шиффовы основания 0,042±0,002 0,066±0,011 P,.2>0,05U 0,070±0,016 P,.3>0,05U 0,052±0,009 PI-4>0,05U

Примечание: Диеновые коньюгаты - первичные продукты ПОЛ (Е 232/Е220). Кетодиены и сопряженные триены - вторичные продукты ПОЛ (Е278/Е220).

Шиффовы основания - конечные продукты ПОЛ (Е 400/Е232). U - Mann Whitney U test; WW - Wald-Wolfowitz runs test. Различия во всех группах достоверны (р<0,05), кроме: ДК Р2.3; Р3-4; КДиСТ Р2.3 ШО Р12; Р2.3; Рз-4 У пациентов 20-39 лет и ДК Р2.3; Р2.3; Р3.4; КДиСТ Р2.3; Р3.4 и ШО РЬ2; Р,.3; Ры; Р2. 3; P3^t у пациентов 40-59 лет.

Данная картина может объяснить прогредиентное течение тяжелой черепно-мозговой травмы и свидетельствует о необходимости проведения коррекционной терапии. При анализе динамики содержания изопропанолрастворимых продуктов ПОЛ в сыворотке крови и ликворе у пациентов с летальным исходом выявлена схожая тенденция с выжившими пациентами (повышение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ), за исключением конечных продуктов изопропанольной фазы (ИПФ), где летальному исходу предшествовало увеличение Шиффовых оснований (ШО). В динамике изменения содержания гептанрастворимых продуктов ПОЛ более отчетливо видны различия между пациентами с благоприятным и летальным исходами (рис. 1).

Таблица 2

Содержание продуктов ПОЛ изопропанольной фазы ликвора у больных различных возрастных категорий в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы

Группы 1 | 2 | 3 I 4

Возраст 20-39 лет

Показатель Контроль (N=9) 1-3 сутки (N=22) 4-7 сутки (N=22) 8-14 сутки (N=20)

Диеновые конъюгаты 0,356±0,038 1,474+0,108 P,.2<0,05U 1,482±0,106 P,.3<0,05U 1,168±0.010 P,.4<0,05U P3^<0,05U

Кетодиены и сопряжённые триены 0,30±0.026 1,290±0,108 P,.2<0,05U 1,473±0,113 P,.3<0,05U 0,974±0.008 P,.4<0,05U P3^<0,05U

Шиффовы основания 0.022±0,003 0,085±0,012 P,.2<0,05U 0,112±0.024 P,_3<0.05U 0.089±0,011 P,^<0.05U

Возраст 40-59 лет

Показатель Контроль (N=9) 1 -3 сутки (N=18) 4-7 сутки (N=16) 8-14 сутки (N=18)

Диеновые конъюгаты 0,377±0,043 1,240±0,066 P,.2<0,05U 1.324+0.050 P,_3<0,05U 1,013±0,044 PM<0,05U P3_4<0,05U

Кетодиены и сопряжённые триены 0,346±0,029 1,146+0,077 PI.2<0,05U 1,147+0,034 P,_3<0,05U P2.3<0,05WW 0,922±0,029 Ры<0,05и P3.4<0,05U

Шиффовы основания 0.026±0.003 0,093±0,004 P,.2<0,05U 0,083±0,008 P,.3<0,05U 0,076±0.015 P,^<0,05U

Примечание: Диеновые коньгогаты - первичные продукты ПОЛ (Е 232/220). Кетодиены и сопряженные триены - вторичные продукты ПОЛ (Е 278/220).

Шиффовы основания - конечные продукты ПОЛ (Е 400/232). U - Mann Whitney U test; WW - Wald-Wolfowitz runs test. Различия во всех группах достоверны (р<0,05), кроме: ДК Р2.3; КДиСТ Р2.3; ШО Р2.3 :Рз-4 У пациентов 2039 лет и ДК Р23; ШО Р2.3 ;РМ у пациентов 40-59 лет.

У пациентов с летальным исходом содержание гептанофильных липопероксидов в сыворотке крови было ниже контрольных значений. В ликворе концентрация всех гептанрастворимых продуктов ПОЛ у пациентов с летальным исходом превышала значения контроля, но была ниже чем у пациентов с благоприятным исходом. Обращал на себя внимание тот факт, что содержание всех категорий липопероксидов у пациентов с летальным исходом во все сроки исследования и во всех исследуемых средах было ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом (за исключением конечных изопропанолрастворимых продуктов).

Свободные радикалы повреждают не только липиды. по и белковые молекулы, но в подавляемом большинстве работ, посвященных изучению СРО при ЧМТ. исследование ограничивается только определением процессов ПОЛ без определения ОМБ. Вместе с тем. одновременная оценка ПОЛ и ОМБ позволяет дать полную характеристику повреждающему действию СРО. более адекватно оценить эффективность ДОС. что в свою очередь предоставляет большие возможности для оценки степени тяжести пациентов, прогнозирования течения и исхода травмы, контроля за течением заболевания и эффективностью терапии.

Диеновые коньюгаты

-«^выжившие -^-»умершие

Контрольная группа

1-3 сут

4-7 сут

250 200 150 100 50 0

Шиффовы основания

выжившие —И—умершие

Контрольная группа

1-3 сут

4-7 сут

Кетодиены и сопряженные триены

™#»*-выжившие >™*в*~умершие

Контрольная группа

1-3 сут

4-7 сут

Рис. 1. Сравнительное содержание гептанофильных липопероксидов сыворотки крови в острый период тяжелой черепно-мозговой травмой у пациентов с летальным и благоприятным исходом

В ходе исследования установлено, что в остром периоде ЧМТ, на 1-3 сутки от момента получения травмы, происходит снижение содержания карбонилированных белков (КБ) в ответ на индукцию в системе Н202. Данный факт сопровождается снижением карбонилирования белков и на базальном уровне. Эта тенденция устанавливается с первых суток от момента получения травмы и сохраняется в течение всего острого периода (до 14 суток от момента получения травмы). При этом к 14 суткам от момента получения травмы

показатели ОМБ постепенно приходят к уровню контрольной группы. Подобная динамика карбонилирования белков может быть объяснена при сопоставлении её с данными, касающимися процесса липопероксидации в сыворотке крови в динамике ЧМТ (рис. 2).

крови у пациентов разных возрастных групп с тяжелой ЧМТ.

Белки и липиды, как объекты свободно-радикального окисления состоят в, своего рода, конкурирующих отношениях за активные формы кислорода. Поэтому в случае выраженной атаки АФК на ацильные остатки липидов и выраженной активации липопероксидации, происходит ограничение карбонилирования белков. Указанная взаимосвязь особенно отчетливо заметна в первые сутки получения травмы: в данном временном интервале расхождение между карбонилированием белков и липопероксидацией максимально. Наличие реципрокных отношений между ПОЛ и ОМБ при ЧМТ подтверждается коэффициентом корреляции Спирмена. Так, у больных 20-39 лет при тяжелой ЧМ'Г коэффициент корреляции между ШО ГФ и КБсп на 1-3 сутки после ЧМТ составил к8= -0,700 (р<0,05), коэффициент корреляции между КД и СТ ГФ и КБсп Г<й= -0,943 (р<0,05) на 4-7 сутки после ЧМТ.

На более отдаленных сроках, при включении в схему лечения антиоксидантных препаратов, происходит постепенная и синхронная нормализация показателей ПОЛ и ОМБ, коэффициент корреляции КД и СТ ИПФ и КБсп у больных 40-59 лет на 8-14 сутки Яя = 0,665 (р<0.05).

Уровень яскорбатнндуцированного ПОЛ в крови и ликворе больных с ЧМТ. Интенсификация свободнорадикальных процессов в тканях может быть следствием гиперпродукции АФК и свободных радикалов и/или дефицита антиоксидантов и снижения активности других защитных систем клетки, включая антиоксидантные ферменты.

Несмотря на хорошую сбалансированность про- и антиоксидантных систем и стабильность окислительного равновесия, постоянно сохраняется опасность сдвига этого равновесия за счет перекисного окисления липидов и аутокаталитического возрастания его продуктов. Активность антиокислительной системы во многом является тем адаптационным механизмом, который позволяет ограничивать активность СРО при травматическом повреждении головного мозга.

Исследование уровня индуцированного ПОЛ, позволяющего косвенно судить о суммарной антиокислительной активности (АОА) показало, что острый период тяжелой ЧМТ сопровождается повышением уровня АОА. Наиболее выраженное увеличение уровня АОА (как АОА-1, так и АОА-И) у пациентов с благоприятным исходом в сыворотке крови выявлено в возрастной группе 20-39 лет, а в ликворе АОА - у пациентов 40-59 лет.

На протяжении всего исследования уровень АОА у всех пациентов с благоприятным исходом превышал значения контрольной группы, в то время как у 3-х из 32-х пациентов с летальным исходом АОА снижалась до нулевых значений, что свидетельствует о невозможности индукции ПОЛ, вероятнее всего, вследствие исчерпания субстратных систем. У остальных пациентов с летальным исходом содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ после индукции Ре2+/аскорбатом в сыворотке крови имели однонаправленную тенденцию к нарастанию при поступлении с последующим снижением перед летальным исходом.

Выявленное, раннее у пациентов с летальным исходом снижение содержания липопероксидов и уменьшение уровня АОА является неблагоприятным прогностическим критерием, свидетельствующим о необратимости повреждений. Возможно, что в острый период тяжелой ЧМТ, интенсификация СРО носит адаптивный характер, облегчая работу мембраносвязанных ферментов, однако в дальнейшем компенсаторное увеличение АОА оказывается неэффективным для предотвращения активации СРО.

Активность антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы (ГП), каталазы и супероксиддисмутазы (СОД), а также прооксидантного фермента- ксантиноксидазы при тяжелой ЧМТ. У пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой, было отмечено, что при поступлении происходит повышение активности ГП до 112%. относительно контрольной группы. К 14 суткам у пациентов с благоприятным исходом продолжался рост (р<0.005)

активности ГП, которая к 8-14 суткам достигала 176% по отношению к контрольной группе. У пациентов с летальным исходом активность ГП на 1-3 сутки была значительнее выше, чем у пациентов с благоприятным исходом ЧМТ, превысив значения контроля в 1,44 раза. Анализируя данный факт, можно предположить о том, что резкое повышение активности ГП в 1-3 сутки от момента получения ЧМТ является прогностически неблагоприятным фактором. Статистически значимой межвозрастной разницы в динамике изменения активности глутатионпероксидазы выявлено не было.

В динамике изменения активности каталазы выявлено следующее: в первые сутки у пациентов резко повышалась активность каталазы до 443%. К

8-14 суткам у пациентов с благоприятным исходом отмечалось снижение активности каталазы до 403%, по отношению к контрольной группе. У пациентов с летальным исходом активность каталазы на 1-3 сутки была ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом -420% от уровня контроля. Статистически значимой межвозрастной разницы в динамике изменения активности каталазы выявлено не было.

Динамика изменения активности СОД у пациентов с тяжелой ЧМТ выявила снижение активность СОД на 47,5% на 1-3 сутки с дальнейшим снижением до 55,6% на 8-14 сутки от уровня контрольной группы. При летальных исходах (которые происходили чаще на 1-3 сутки) снижение СОД было более выраженным - до 53%. В исследуемых возрастных группах наблюдалась разная динамика СОД. Так, в группе пациентов 20-39 лет падение активности СОД на 1-3 сутки было более выраженным по сравнению с пациентами 40 -59 лет и составляло 40% относительно контрольной группы, с незначительным повышением к 14 суткам до 42%. У пациентов 40-59 лет активность СОД составляла 70% от контроля на 1-3 сутки с дальнейшим снижением к 8-14 суткам до 48% от уровня контроля.

Анализируя «среднюю» активность СОД у пациентов с благоприятным исходом и летальным исходом, можно отметить, что у пациентов с неблагоприятным исходом активность СОД была ниже, чем у выживших. Выявленное нами снижение активности СОД происходило на фоне увеличения активности каталазы. Данный факт можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на элиминацию избытка Н1О2 за счет роста каталазной активности и накопления церулоплазмина, обладающего СОД-подобным действием (Санина О.Л., Берлинских Н.К., 1996), концентрация которого возрастала в крови при ЧМТ в 1,5-2 раза, в ликворе в

9-11 раз (Кучин Д.Г., 2005, Садова В.А., 2007). Если компенсаторного прироста каталазы и церулоплазмина недостаточно, возникающий дисбаланс в системе ПОЛ-АОЗ является важным фактором интенсификации ПОЛ и нарастания чувствительности к оксидативному стрессу.

Активность прооксидантного фермента - ксантиноксидазы в крови исследуемых групп пациентов с тяжелой ЧМТ увеличивалась вне зависимости от возраста пациентов (табл. 3). На 8-14 сутки, на фоне проводимой терапии, включающей антиоксиданты и антигипоксанты, активность ксантиноксидазы у пациентов 20-39 лет уменьшалась до значений близких к контрольным.

В том случае, если в исходе заболевания развивалось критическое состояние, приводящее к летальному исходу на 8-14 сутки от момента получения травмы, уровень ксантиноксидазной активности увеличивался до 420%. Таким образом, значения активности ксантиноксидазы в венозной крови достоверно выше у умерших впоследствии пациентов. Данный факт может быть связан с активацией пуринового катаболизма и активацией анаэробных процессов в предагональный и атональный периоды.

Таблица 3

Активность ксантиноксидазы крови в остром периоде ЧМТ

Период ЧМТ Активность ксантиноксидазы (ти/т1/пнп)

Пациенты 20-39 лет Пациенты 40-59 лет Пациенты с летальным исходом

Контроль 0.233±0,018 (п=24) 0.254+0,023 (п=17) 0,243±0.021 (п=41)

1-3 сутки 0.616±0,045* (п=38) 0.817±0.055* (п=34) 0.763±0,114* (п=29)

4-7 сутки 0.598±0,0116 (п=36) 0.632±0.032* ** (п=35) 0.896±0.097* (п=21)

8-14 сутки 0,262±0,033 (п=35) 0.402±0,044 (п=35) 1.034+0,154* (п=11)

Примечание: активность фермента исследовалась в цельной, стабилизированной гепарином крови. Данные представлены в виде средней и ей стандартной ошибки (М+т). Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни и Вальда - Вольфовица для независимых групп. * - статистически значимые отличия от значений контрольной группы (р<0.05). ** -межвозрастные различия (р<0,05).

Полученные данные указывают на перспективность исследования активности ксантиноксидазы при ЧМТ с прогностической целью. Активация ксантиноксидазы в первые сутки от момента травмы ассоциирована с приростом большинства продуктов ПОЛ и тяжестью состояния пациентов, что подтверждает весомый вклад фермента в активацию свободно-радикальных процессов при ЧМТ. Так, выявлена корреляция между активностью ксантиноксидазы и ДК ИПФ - 1^= 0,559 (р<0,005). с ШО ГФ - 0.670 (р<0,005) и степенью тяжести - 0.786 (р<0,005).

Фосфолнпидный состав плазмы крови при тяжелой ЧМТ. Активация ПОЛ при тяжелой ЧМТ сопряжена с изменением липидного состава плазмы крови. Исследование фосфолипидного спектра плазмы крови позволило нам выделить некоторые особенности изменений различных фосфолипидных фракций в динамике ЧМТ. Не обнаружено статистически значимых отличий по содержанию фосфолипидных фракций плазмы крови при ЧМТ в

зависимости от возраста пациентов. Изменения фосфолипидного спектра при тяжелой ЧМТ на 1-3 сутки характеризовались снижением общих фосфолипидов на 24%, фосфатидилхолина на 40%, увеличением сфингомиелина на 30%, фосфатидилсерина на 100%, кардиолипина на 17%, лизофосфатидилхолина на 20%, что свидетельствует об усилении микровязкости и ригидности клеточных мембран. К 8-14 суткам была выявлена отчетливая тенденция к возвращению показателей фосфолипидного спектра плазмы к контрольным значениям.

Таким образом, с первых по 14 сутки при тяжелой ЧМТ наблюдались реципрокные отношения между липопероксидацией и ОМБ. С 1 по 7 сутки тяжелой ЧМТ происходило увеличение уровня суммарной АОА, сопровождающееся ростом активности ГП, каталазы на фоне снижения активности СОД, наиболее выраженного на 1-3 сутки у пациентов 20-39 лет. Изменения ФЛ состава крови свидетельствовали об увеличении ригидности, жесткости клеточных мембран. У пациентов с последующим развитием летальных исходов «среднее» содержание липопероксидов в крови и ликворе было ниже по сравнению с благоприятными исходами. Наступлению летальных исходов предшествовало снижение гептанофильных липопероксидов в сыворотке крови ниже контрольного уровня, а так же снижение уровня АОА в крови и ликворе, ассоциированного с резким падением активности СОД и выраженным приростом активности ксантиноксидазы.

ВЫВОДЫ

1. Тяжелая ЧМТ сопровождается повышением всех категорий липопероксидов в крови и ликворе во всех исследованных возрастных группах. Наиболее выраженным был прирост гептанофильных продуктов ПОЛ в ликворе у пациентов 20-39 лет: ДК возрастали до 691%, КТ и СТ до 703%. Максимальный прирост ШО определен в гептановой фазе ликвора на 1- 3 сутки после тяжелой ЧМТ у пациентов 40-59 лет (662% от контрольной группы).

2. Содержание всех категорий липопероксидов у пациентов с летальным исходом во все сроки исследования и во всех исследуемых средах ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом (за исключением ШО ИПФ сыворотки крови).

3. В динамике 14 суток острого периода тяжелой ЧМТ наблюдается усиление ПОЛ в крови и ликворе на фоне снижения базального уровня ОМБ.

4. Динамика карбонилирования белков плазмы крови у пациентов с тяжелой ЧМТ имеет различия в зависимости от возраста: у пациентов 20-39 лет происходит постепенное нарастание КБсп с 69% на 1-3 сутки до 160% на 8-14 сутки, относительно контрольной группы, а у пациентов 40-59 лет карбонилирование белков имеет волнообразное течение: на 1-3 сутки отмечается снижение КБсп до 53%, с последующим увеличением на 4-7 сутки до 95% и с повторным снижением до 80% на 8-14 сутки.

5. Острый период тяжелой ЧМТ сопровождается повышением уровня АОЛ. Возрастная группа пациентов 20 - 39 лет с тяжелой ЧМТ характеризовалась более выраженным увеличением уровня АОА (как АОА-1, так и АОА-П) в сыворотке крови. Возрастная группа пациентов 40-59 лет с тяжелой ЧМТ характеризуется более выраженным увеличением уровня АОА (как АОА-1, так и АОА-П) в ликворе. Перед наступлением летального исхода наблюдается снижение АОА (АОА-1 и АОА-2) в сыворотке крови и АОА-2 в ликворе.

6. У пациентов с благоприятным исходом тяжелой ЧМТ активность антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы и каталазы максимально повышалась: глутатионпероксидазы до 176% на 8-14 сутки; каталазы до 443% на 1-3 сутки от уровня контроля. Данные изменения происходили на фоне резкого снижения СОД (до 55,6% на 8-14 сутки после ЧМТ). В случае летальных исходов наблюдалось более выраженное увеличение активности ГП (выше на 32% по сравнению с благоприятным исходом), более выраженное снижение активности каталазы (ниже на 23% по сравнению с благоприятным исходом) и СОД (до 53% от уровня контроля).

7. При тяжелой ЧМТ происходит прирост активности прооксидантного фермента - ксантиноксидазы, наиболее выраженный в возрастной группе 4059 лет (на 1-3 сутки - 321%, на 8-14 сутки - 430%). Активность ксантиноксидазы в случае развития летальных исходов достоверно выше по сравнению с благоприятными исходами (с 7-14 суток).

8. Изменение фосфолипидного спектра плазмы крови при тяжелой ЧМТ на I-3 сутки характеризовалось: снижением содержания общих фосфолипидов (на 24%), фосфатидилхолина (на 40%), увеличением сфингомиелина (на 30%). фосфатидилсерина (на 100%), кардиолипина (на 17%), лизофосфатидилхолина (на 20%), что свидетельствует об усилении микровязкости, ригидности клеточных мембран.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется определять содержание продуктов ПОЛ и ОМБ. уровень АОА, активность ГП, СОД. КО у больных с тяжелой ЧМТ для контроля за течением заболевания и эффективностью терапии.

2. Высокий уровень липопероксидов на фоне снижения ОМБ является показанием для назначения препаратов с антиоксидантной активностью.

3. Продолжающееся нарастание активности ксантиноксидазы на 7 сутки у больных с тяжелой ЧМТ свидетельствует о высокой вероятности развития летального исхода у пациента.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Садова, В.А. Мозговая межполушарная асимметрия и иммуно-биохимические показатели в остром периоде сочетанных травм / В.А. Садова. Д.Г. Кучин, И.Ю. Сорвилов. Н.В. Держинский, М.Ю. Воронков, В.Г. Дрягин.

Д.Б. Сумная, Е.И. Львовская // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2009. -№ 2 (25) С. 126-127.*

2. Садова, В.А. Содержание молекулярных продуктов перекисного окисления липидов при тяжелой черепно-мозговой травме в разных биологических средах. / В.А. Садова, Е.И. Львовская, Н.В. Держинский, Д.Б. Сумная // Вестник Южно-Уральского государственного университета Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура» . - 2009. - №27 (160) -С. 81-83.*

3. Львовская, Е.И. Состояние процессов липидной пероксидации в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы. / Е.И. Львовская, В.А. Садова, Д.Б. Сумная, Н.В. Держинский. // Вестник Южно-Уральского государственного университета Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». -2010. -№6(182)-С. 82-84*

4. Львовская, Е.И. Система "Перекисное окисление липидов -антиоксидантная защита" в острый период тяжелой ЧМТ / Е.И. Львовская,В.А. Садова, Д.Б. Сумная, Н.В. Держинский // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии. Российская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. Челябинск. - 2009. С.57-60.

5. Держинский, Н.В. Липидная пероксидация и фосфолипидный состав в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы / Н.В. Держинский, Е.И. Львовская // Сборник научных трудов молодых ученых УралГУФК №8. Челябинск. - 2009. С.243-246.

6. Держинский, Н.В. Изменение ксантиноксидазной активности крови в остром периоде тяжелой ЧМТ / Н.В. Держинский, Е.И. Львовская, А.И. Синицкий И Седьмая международная научно-практическая конференция «Новые достижения Европейской науки - 2011». Том 31. Лекарство. София. «Бял Град-БГ» ОДД - 2011. С 100-102.

7. Львовская, Е.И. Процессы перекисного окисления липидов в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы / Е.И. Львовская, Н.В. Держинский, В.А. Садова, Д.Б. Сумная // Вестник международной академии наук экологии и безопасности жизнедеятельности. Том 16 №3. Санкт-Петербург. - 2011. С.145-147.

8. Держинский, Н.В. Соотношение процессов свободно-радикального окисления липидов, белков, изменение содержания фосфолипидов у пациентов с тяжелой ЧМТ. / Н.В. Держинский, Е.И. Львовская. // Вестник уральской медицинской академической науки 2012,- № 2 С. 106-108.*

*- издания из перечня ВАК РФ

Список использованных сокращений

АОА - антиокислительная активность

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

ГП - глутатионпероксидаза

ГР - гептанрастворимый

ГФ - гептановая фаза

ДК - диеновые коньюгаты

ИПФ - изопропанольная фаза

ИР - изопропанолрастворимый

КБсп - карбонилированные белки,

спонтанные

КДиСТ - кетодиены и сопряженные триены

КО - ксантиноксидаза

ОМБ - окислительная модификация белков

ПОЛ - перекисное окисление липидов СРО - свободно-радикальное окисление

СРП - свободно-радикальные процессы

СОД - супероксиддисмутаза ЧМТ - черепно-мозговая травма ШО - Шиффовы основания ЦНС - центральная нервная система ЭХО-ЭГ - эхоэнцефалография N0 - оксид азота

ДЕРЖИНСКИЙ Николай Владимирович

ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ И СОСТОЯНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ

03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 1.03.2012 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная.

Усл.печл. 1.0. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «Печатник» Лицензия ПД№ 17-0027