Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибиторы альфа-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ингибиторы альфа-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 577.154.

АКУЛОВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

ИНГИБИТОРЫ а-ШНОЗИДАЗ ИЗ ЗТНЕРТОМУСЕЗ. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА. 03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ »

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саккт-ПетэрОург - 1993

Работа выпалю на в лаборатории ферментов АООТ "Научно-исследовательского Технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения".

Научный руководитель - доктор химических наук, профессор

А.А.Селезнева

Официальные опоненты: доктор биологических наук, профессор

Н.А.Зажаша,

кандидат химических наук Г.Д.бабенко

.Ведущая организация - Институт Высокомолекулярных Соединений Российской Академии Наук

Защита состоится "^/са^Л 1993г. в часов ЛО минут на заседании специализированного совета К 084.63.01. Санкт-Петербургского химико-фармацевтического.института ( 197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова,.14).

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке института (197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 4/6).

Автореферат разослан " 1ээз г.

Ингибитори а-глюкозидаз из Strcptcmyces. Выделение и свойства.

Актуальность темы. В связи с широкой распространенностью различных нарушений углеводного обмена (диабет, ожирение, гигаргликемия, -липидемия и др.) и перспективой эффективного использования для лечения этих заболеваний микробных ингибиторов а-глюкозидвз акту-альннми задачами являются поиск, разработка, исследование и внедрение новых лекарственных препаратов на основе этих Онологически активных веществ (БАВ). Зарубежными исследователями получены дан-гае о природе ингибиторов глюкозидэз, выявлен ряд общих закономерностей и различий в их свойствах» установлены избирательность и механизмы угнетения ферментов из разных источников [Frommer et al, 1979; Mueller, 19891. Это дало возможность использования новых БАВ в медицине, пищевой промышленности, биотехнологии и биохимии. Вместе с тем, сложность технологических схем выделения, недостаточная продуктивность штаммов, нестабильность при хранении и ряд других параметров заставляли исследователей искать новые источники получения глюкоэидазных ингибиторов.

К моменту постановки диссертационной работы в России не проводились работы по созданию лекарственных средств на основе микробных ингибиторов а-глюкозидаз.

Работа выполнена на основании Государственного заказа "Создать ингибитор а-глпкозидвз - вещество, регулирутее углеводный обмен" (.Государственный регистрационный номер 01.89.0 064,466), а также Государственных программ "Диабет" и "Инженерная энзимология". Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение данных об ингибиторах а-глюкозидаз, продуцируемых штаммами Streptomyoea для научного обоснования возможности создания лекарственных средств, предназначенных для лечения различных нарушений углеводного обмена.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

-разработать способ выделения ингибиторов а-глюкозидаз из культу-ральных жидкостей Str.:

-изучить ¿ызико--хишческш свойства ингибиторов а-глюкозидэз; -исследовать шц'ибнрующее действие новых БАВ на а-глюкозидззи различного происхождения и индивидуальной специфичности: -разработать способ получения впсскоочтонного ингибитора и после-

довать его химическую структуру;

-разработать проекты Временных Фармакопейных Статей (ВФС) на субстанцию и Государственный Стандартный Образец (ГСО) ингибитора. Научная новизна. Впервые выделены два новых ингибитора а-глюкози-даз из культуральншс жидкостей Streptomyoes. Простота, экономичность и экологическая защищенность технологической схемы получения обеспечивает выход конечных продуктов 50-60% с удельной активностью готовой субстанции на уровне и выше известного зарубежного аналога - акарбозы. На основании сравнительного изучения физино--химических и каталитических свойств новых БАВ с акарбозой сделаны выводы о том, что вновь выделенные ингибиторы являются оригинальными веществами псевцоолигосахаридаой природы, которые обладают широким спектром и различной эффективностью ингибирования а-глюко-зидаз микробного и животного происхождения. Степень ингибирования новыми БАВ зависит от концентрации ингибитора: при значениях последних менее ID5Q наблюдается хороший ингибируюций эффект, при концентрациях, значительно превышающих п>50. ингибиторы являются субстратами для глкксозидаз. Полученный результат необходимо учитывать при определении терапевтических доз будуадах лекарственных средств.

Практическая ценность. Полученные результаты позволили рекомендовать новые ингибиторы из Str. для медико-биологического исследования в качестве веществ, подавляющих глюкозидазы и используемых как лекарственные средства вместе с диетой для лечения различных форм нарушения углеводного обмена, а также в качестве пищевых добавок к продуктам диетического питания. В практическом плане проведенные исследования явились основой для разработки корректного метода определения ингибиторной активности, лабораторного регламента получения ингибитора, а также проектов ВФС на субстанцию и ГСО. Способ получения ингибитора, защищенный патентом, успешно апробирован в условиях опытной установки Выше-Волоцкого завода ферментных 'препаратов.

Апробация работы. Материалы исследования были доложены на конференциях, симпозиумах и конгрессах: "Современные метода выделения, очистки и идентификации микробных метаболитов" (Пущкно, 15-19 апреля 19Э1 г), "Куклеазы" (Казань, май 1991 г), "Инженерная энзимо-логия" (Москва, 1991 г), "Человек и лекарство" (Москва, 12-16 апреля 1992 г), "Biooatalysis fundamentals and applications" (Москва, 6-11 июня 19ЭЗ г), "Биосинтез ферментов микроорганизмами"

(Москва, 26-27 октября 1993 г).

Публикации. По материалам исследований имеется 8 публикаций. Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 разделов), описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения (3 раздела), заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена }т 138 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков, 21 таблицу. Библиография включает 219 наименований, из них 141 - на иностранных язиках.

Материалы и метода исследования.

В качестве объектов исследования использовали нативше растворы штаммов streptomyoea ВКМ Ас 1328-D и 839/64 из коллекции микроорганизмов АООТ "ШТИАФ".

Для выделения активных веществ использовали различные методы фракционирования:

- ультрафильтрацию через ацетилцеллююзные мембраны УАМ ("Влади-пор") с целью освобождения нативных растворов от высокомолекулярных примесей;

- ионообменную хроматографию ультрафильгратов на сильноосновных анионитах ав-17-2, ФАФ - для удаления окрашенных примесей. Степень депигментации контролировали по величине оптической плотности при длине волны 360 нм;

- гель-фильтрацию на колонке (h/d=40) с сефадексом 0-25 - для наработки Государственного Стандартного Образца, необходимого для стандартизации метода определения ингибиторной активности. Отбор фракций осуществляли на коллекторе фирмы LKB (Швеция).

Контроль процесса выделения активных веществ из Str. осуществляли, измеряя:

- иигибиторную активность на стадиях очистки нативных растворов и удельную активность в отношении панкреатической а-амилазы, для чего использовали разработанный наш на основе метода Сайто (Saito, 1982) спектрофэтометрический метод, с помощью которого также изучали стабильность партий субстанции и ГСО ингибитора из Str. ВКМ Ас 1328-D для разработки проектов 8ФС я лабораторного регламента;

- содержание белковых примесей по методу Лоури (Lowry, 1951);

- количество углеводов и редуцирующих Сахаров лиофилизирозанных препаратов соответственно с помощью антрона и модифицированным ме-

тодом Шомоди-Нельсона (Захарова, Носенко, 1982);

При изучении свойств ингибиторов исследовали:

- рН-стабилыюсть в области pH 2,0-12,0 при ведерживании в течение з и 24 ч при температуре (25+1,0)°С с последующим измерением остаточной активности;

- температурную стабильность в интервале температур +(25-2СЮ)°С и термостатировашш на менее 3 часов, после чего измеряли остаточную активность. Лиофилизкрованные препатары растворяли в 0,1 М универсальном буферном растворе для рН-стабильносги и дистиллированной воде - для термостабильности;

- сродство к орх'ашческим растворителям определяли, растворяя лио-фцлизировашше препараты ингибиторов в растворителях (класс точности - х.ч.), перемешивали в течение ю минут и измеряли остаточную активность в растворе;

- оценку молекулярной массы високоочшденних ингибиторов из Str. проводили методом гель-фильтрации на сефадексе* G-25 (Детерман, 1970) с использованием различных маркеров.

Качественный состав высокоочищеиных ингибиторов изучали методом ВБХ на бумаге FN-II фирмы Filtrak в одной из выбранных систем растворителей: н-бутанол - пиридин - вода=1:1:1 с детекцией специ-фичоскими реактивами на различные группы Сахаров (Захарова, Косан-ко, 1982).

С целью изучения химического состава и строеш!Я высокоочишен-ffiiX ингибиторов из sir. проводили полный кислотный гидролиз ЗН серной кислотой при юо°С в течение 15,30,45,60 и 75 минут, а также б часов и ферментативное расщепление больших концентраций ингибиторов (>>>id50) глвкозидазами (мальтазой, глюкоамилазой, саи-разой) с последующими ВБХ и количественным определением редуцирующих Сахаров (глюкозы-Глшозооксидазным методом (Dahlqviat, 1964), фруктозы-реакцией на кетозы (Захарова, Косвнко, 1982). Тип и количество гликозищшх связей определяли пэриодатшм окислением, используя деградацию по Смиту (Захарова, Koceimo, 1982; под ред. Ко-четкова, 1967).

Значения точек плавления определяли на приборе Кофлера (Лосев, Тростянская, I960).

Спектры 13С-,1Н-ЯМР сняты на приборах Бгикег АС-200, Вгикег СХР-30 ( Германия ), Ж-спектры образцов в таблетках с КВг - на "Specord 75 1П" (ГэрмаНИЯ).

Ингибиторное действие оценивали при взаимодействии ингибиторов

с индивидуальными микробными и животными глюкозидазами (а-амилазы Bao. subtilis (метод Iwasa et al., 1974) и панкреатина (разработанный нами проект ВФС 42-, 1991), декстраназа Aap. Inauetus (Прохорова , Туликова , 1965), глюкоамилаза Asp. awamori, сахараза Saooh. oerevielae, мальтаза Asp. nlger (Dahlqvist,1964)), а также с комплексом ферментов слизистой тонкого кишечника (Dahlqvist,1963,1964). Изучали временное, концентрационное влияние ингибиторов на кинетические параметры ферментативного гидролиза (Диксон, Уэбб, 1982).

Статистическую обработку данных проводили в соответствии с ГОСТ 11.004.-74.

Результаты исследований и их обсуждение.

1. Выделение и очистка ингибиторов глюкозидаз из Str.

1.1. Метод определения ингибиторной активности. С целью контроля ингибиторной активности исследуемых БАВ из Str. в нативных растворах и на стадиях их выделения, а также дальнейшего изучения физико-химических характеристик субстанции и ГСО нами разработан метод количественного определения ингибиторной активности. Последний основан на подавлении гидролиза крахмала под действием панкреатина (действующее начало - а-амилаза) и образовании йод-крахмального комплекса, концентрация которого опрделяется спектрофотометрически и пропорциональна активности ингибитора а-глюкозидаз.

На основании данных по изучению концентрационных и временных зависимостей ферментативного гидролиза оптимальными условиями оценки ингибиторного действия выбраны: рабочее время - 10 минут, Область ОПТИЧеСКОЙ плотности 0,7 гфи ДЛИНе волны 660НМ (ФС42-2639--89, "а-Амилаза - стандартный образец") для Q,2% раствора панкреатина при гидролизе 1% раствора крахмала (рис. 1). Поскольку рН--оптимум действия панкреатической а-амилазы на ^субстрат находится в области pH от 5,0 до 8,5 согласно (Babin et al., 1978) и нашим исследованиям, и БАВ из Str. стабильны при указанных значениях pH (pH-стабильность ингибиторов из Str. и их нативных растворов соответствует 2-li,5 и 3,5-12), предложено проводить реакцию при pH 7,0. Выбранная температура проведения реакции 37°С соответствует температуре действия панкреатической а-амилазы в физиологических условиях и находится з области температурной стабильности БАВ из Str. (25-70 °С - для очищенных ингибиторов и 20-50°С - для их на-швных растворов).

Активность ингибитора была независима от его концентрации, когда степень ингибироьашя составляла 30~60$ (рис.2, ни примере ГСО БЛВ из str. ВКМ Ас 1328--D).

Степень ингибирования (Ы) в процентах вычисляли но формуле!

—jLx 100,

Р.,

гль vvon.

"I "2

ветчины оптической плотности соответственно

контрольных проб по субстрату, ферманту и опытного раствора с ингибитором.

А д Д

Рис. 1. Зависимость оптической плотно с: та, соответствующей гидроли-зовашюму крьхыалуй 1)660, от:

А - концентрации субстрата (Э) (щ'/мл) при контролируемом во времени гидролизе 1% крахмала;

Б - времени ферментативной реакции t (мин.) 1 - без ингибитора, 2,3 - соответственно без и с предварительной

инкубацией ингибитора и фермента

За единицу ингибиторяой активности принимали такое количество ингибитора, которое при 37°С, рН 7,0 в течение 10 минут подавляет 1ВД панкреатической а-амилази на бой.

1.2. Способ выделения и очистки ингибиторов из Str. Способ выделения и очистки ингибиторов глюкозидаэ из Str. разрабатывали на основе свойств наганных растворов продуцентов. Последние обладали одинаково высокими термо- и рИ-стаоильностями в течение длительного периода времени, содержали небольшое количество белковых веществ, в том числе и ггротоолктические ферменты, были сильно окрашены (табл. 1.).

Поскольку в кислой среде наблюдалось частичное осаадение окра-

гаяшшх и белковых примесей из натившх растворов со 100%-ннм сохранением ингибитсрной активности, для получения более прозрачных

100 80 60 40 20

!-300

----100

ш

О О 0.002 0,004 0,006 0,008 0,010

Рис. 2. Зависимость степени ингибировяния N (%) я активности А (ИЕ/»т) ингибитора из Str. ВКМ Ac 1328-D (для препарата с А=300 ИЕ/мг) от концентрации последнего [I] (мг/мл) - кривые 1 и 2, сответственно.

растворов кулътуралъше жидкости подкисляли до оптимального гшаче-ния pH (3,6+0,1) и центрифугировали, что привело к увеличению прозрачности и снижению содержания белковых примесей в а раза.

Таблица 1.

Сравнительная характеристика свойств нативных растворов высокоактивных штаммов Streptomyoea.

N

Штаммы

Характеристики ВКМ Ac 132S-D 839/64

1. Ингибиторная активность, ИЕ/мл 3000-200 6500-500

2. Содержание белковых веществ, мг/мл 1.Т 0,8

з. Интенсивность окраски при длина волны 360 нм 3,6 1.6

¿. pH-стабильность 3,5-12 3,5-12

5. Термостабильность, °с 20-50 20-50

Сохранение ингибиторной активности нативных растворов при высоких значениях температуры и в широком диапазоне рН, характерное хля известных псевдосахаркдных ингибиторов, навело на мысль о са-:аридной природе новых ЕАВ. Поскольку известные псевдосахаридные гнгибиторы глюкозидаз имеют небольшие молекулярные массы, нами исцелована возможность использования мембранных методов очистки зк-■ивных веществ от высокомолекулярных белковых примесей. Из ряда

испытанных мембран наиболее эффективной била ацетилцеллюлозная мембрана УАМ-зоо: при достаточно высоких скорости фильтрации и выходе ингибиторов содержание белка в растворе уменьшалось в среднем на 70%, а протеолитические ферменты практически полностью оставались в концентрате (табл. 2). При этом оптимальный рехим работы мембраны наблюдался при давлешга (2,5-3,0) атм.: достигалась высокая скорость фильтрации, и выход целевых продуктов составил (86-87)% (табл. 3).

Однако полученные ультрафильтраты так хе, как и нативные растворы, были сильно пигментированы, что определило дальнейший этап выделения и очистки БAB из Str.: освобождение растворов от окрашенных примесей.

Таблица 2.

Характеристика процесса улътрафилътрации нативных растворов Str. через ацетилцеллюлозные мембраны различной пористости.*

Показатели? о *« Марка и диаметр пор(А)меыбравд

УАМ-150 УАМ-2СЮ УАЫ-ЗОО УШ-5СЮ

125+25 175+25 250+50 450+50

Степень задерживания н,

-ВКМ Ас 1328-0 26+2 20+2 14+2 0

-839/64 '22+1 15+3 10+5 0

-Белковые вещества 75+5 70+2 70+5 25+5

-Протеолитические ферменты 98+1 99+1 6+1 40+5

Скорость фильтрации, мл/час 120+10 200+10 310+10 500+iO

Выход по активности, % 76+2 80+5 86+4 100

-Давление 2,5 an».., **-(Ро$анская и др., 1976).

Таблица з.

Характеристика процесса ультрафильтрации нативных растворов

ингибиторов глюкозидаз из Str. череомембрану УАЫ-ЗОО при различных

значениях давления.

Показатели Давление, атм.

2.0 2,5 3,0 3,5

Скорость фильтрации, мл/час Выход продукта на стадии, % 200+10 80+2 300+10 86+4 320+10 87+3 380+10 50+5

В связи с этим исследованы возмокности осветления ультрафильтратов сорбциойными методами на различных носителях. При исгтользо-

вании катионитов КУ-28 и КМТ в широкой области рН процесс сорбция не наблюдался ни для ингибиторов из Бгг., ни для пигмента. Значительная депигментация ультрафильтратов выявлена при ионообменной хроматографии на солевых формах сильноосновных анионитов АВ-17 п ФАФ в кислой области рН. При этом кратность очистки от пигмента и белков зависела от типа смол: в случае поликонденсационной смолы ФАФ таковая уменьшалась с увеличением коэффициента набухания, тогда как для полиыеризационного ионита АВ-17 наблюдалась обратная картина (табл. 4.). Оптимальными условиями депигментации ультрафильтратов БАВ из Б гг. явились значения рН (3,6+0,2) и (4,0+0,2) для.ФАФ и ав-17-2, соответственно, что приводило к уменьшению содержания белка в 2-3,5 раза и увеличению осветления в 12-15 раз.

Таблица 4.

Сравнительная характеристика процесса депигментации

ультрафильтратов ингибиторов глпкоздаз из эгг. на анионитах АВ-17-2 и ФАФ (с1~форма).

Анионит Выход по акивноста в элюате, % Кратность очистки от

белков пигмента

марка к* ВКЫ Ас 1328-0 839/64 ВКМ Ас 1Э28-0 839/64

АВ-П-2 2,0 85+5 2,5+0,2 3,3+0,3 13+1 14+1

АВ-17-8 1 ,2 80+2 2,0+0,2 2,6+0,2 6,0+0,5 2,0+0,2

ФАФ 1.7 86+4 2,0+0,2 2,9+0,2 12+1 12+1

1.9 84+2 1,7+0,2 2,8+0.2 10+1 12+1

2.1 87+2 2,0+0,2 2,6+0,2 12+1 13+1

2,5 82+2 1.0+0,1 1,0+0,1 0,0+0,5 3,0+0,5

3.1 80+4 1 ,0+0,1 0,50+0,05 4,0+0,5 2,0+0,2

к-коэффициент набухания

Лиофилизированные фильтраты содержали (95+2)% углеводов и различались удельной активностью по отношению к панкреатической а-амилазе (табл.. 5е.).

По вышепредставленной схеме разработан способ получения субстанции ингибиторов глскозкдаз (рис. 3.), защищенный патентом и успешно апрйфовэгашй на Вышне-Волсцком заводе ферментных препаратов (ВВЗФП).. Разработанный способ позволяет получить (10-20)г и (30-40)г субстанции из 1 л нативного раствора соответственно ЕАВ БКМ Ас 1328-1) и 329/64, что в 2-4 раза превышает выход для извест-

ТэСлипа Б.

Срвнительная характеристика процесса получения ингибиторов глшозидаз из Экг.

Ингиби-

торная

актив-

кость

ИЕ/мл,

ИЕ/иг

Белок

Цветность

Стадии

кг/мл

Кратность очистки, раз

"360

Кратность осветления, раз

Выход по активности, I

Натквный

раствор;

ВКМ Ас 1328-0 839/64

Ультрафильтрация:

ВКМ Ас 1328-0 839/64

Депигментация:

ВКМ Ас 1328-Ю 839/64

Лиофили-

зация:

ВКМ Ас 1328-0 839/64

Субстанция

Гелъ-

3000+200 6500+500

3000+200 6500+500

N

3000+200 6500+500

130+1ф 250+2ф

1,7+0,1 0,80+0,05

0,50+0,01 0,50+0,01

0,20+0,02 0,15+0,01.

0,070+0,005 0,040+0,002

3,4+0,1 1,6+0,1

2,5+0,1 3,3+0,1

2,9+0,1 3,8+0,1

3,60+0,01 1,60+0,01

1,80+0,01 0,70+0,01

0,14+0,01 0,05+0,01

2,0+0,1 2,3+0,1

13+1 14+1

-фильтра"7 ция »лио-

филизация

ВКМ Ас 1328-0 839/64

Суммарный выход: ВКМ АС 1328-0 839/64

340+70 280+20

0,007 0,005

10+2 8+1

Высокоактивные

Суммарный выход: . ВКМ Ас 1328-0 |839/64

- Нативный раствор получен подкислением с последующим центрифугированием культуральной жидкости; озео - оптическая плотность при длине волны 360 нм

Культуральная жидкость

Подкислениэ до рН (3,6+0,1) I Н соляной кислотой с последующим центрифугированием Супернатант

Ультрафильтрация на аиетилиеллюлозной мембране УАМ-зоо (полых волокнах) при давлении (2,5-з,о) атм. Ультрафильтрат

(депигментация но анионитэ АВ-17-2 (рН а,0+0,1) или ФАФ (рК 3,7+0,2) в С1-форме

Лиофилизация фильтрата

Не. 3. Схема получения субстанции ингибиторов из Str.

их ингибиторов глхмозидаз, представляющих собой комплекс вешеств (1-э)г с 1 л нативного раствора (патент Л0107Ю6, ФРГ; ЖЭ995026, 3995026. США; Oeding , 1978)).

Для наработки стандартных партий субстанции ингибитора из Str. КМ Ас 1328-D разработаны проект ВФС и лабораторный регламент.

По результатам ВБХ субстанции содержали несколько компонентов 7-8 для БАВ ИЗ ВКМ АС 1328-D И 5-6 - ДЛЯ БАВ ИЗ ШТ. 039/64), ОДИН з которых обладал ингибиторной активностью по отношению к энкреэтической а-амилэзе и сахараэе.

Для отделения высокоактивных компонентов исследовали' возмок-эсги использования органических растворителей и гель-фильтрации а сефадексе.

■ Изучение сродства новых БАВ к различным растворителям выявило l выраженный гидрофильный характер. Результаты исследований пока-1ли, что высокоактив!ше компоненты можно выделить хлороформ-эта->лышм осаждением, а тэкжэ гель-фильтрацией на .сефадексе G-25. »скольку применение органических растворителей экологически вред-| и трудоемко, гель-фильтрация использована наш для наработки ртий ГСО ингибитора из Str. ВКМ Ас 1328-D, для которых разрабо-н проект ЕФС. Известные патентные данные о выходе гомогенных ве-ств говорят об их незначительных величинах:от 15 мг до . 300-800 с 1 л нативного раствора (патенты :Ш972ЭЗ,- США: .ЧЮ173Э50, Еп-па; Frommer ez аI., 1979; Mureo et al., £S80). Разработанный на-экологически безвредный. мэлотрудоемкиЯ способ получения гомо-' иных ингибиторов позволяют получать их в количествах (5+1)г и

IY * i ) г о X л ннтивного раствора и ьисокими ¡/дольними антиьностнми (340+70) и (260+20) ИЕ/мг (табл. 5) для БАВ из Str. ВКМ Ac 1326 D и шт. ооогььтстьояно.

2. Дшико химический свойства ингибиторов из Sir.

2.1. pli- и тормостабильность. Ризультаты исследовании pH- и тормо-стнбилыюсти показали, что БАВ из Str. обладают высокой устойчивостью к действию крайних значений pH и высоких температур в течении длительного периода времени (табл. 6,7).

Сравнение указанных характеристик с таковыми для изпйстний акароозц ("Bayer", ФРГ) показало, что при одинаковой pH-стабильности новые ингибиторы более термоустойчивы (акарбоза сохраняет ипгибиторнуы активность по отношению к панкреатической а-амилазе в облисти температур 25-5С)°С). Полученные данные согласуются о из-

Таблица 6.

Зависимость остаточной ингибиторной активности (%) БАВ из Str.

от pH среда.

рн 2,0 2.5 3,0 4,0 5,0 6.0 7,0 8.0 9,0 10,0 11,0 11,5 12,0

ВКМ 94 96 98 100 100 100 100 98 97 96 9ô 96 45

Ас 1328-1) + 5 + 7 + 4 Î5 -Г2 +2 ♦ 3 + 2 +3 ♦3 + 4 + 5 +5

839/¿4 95 97 96 90 98 100 ÎOO 100 98 98 97 9Ь 42

»5 Гз + 4 + 2 is + 1 + 4 + 1 +2 + 3 +3 + 4 +2

Таблица 7.

Зависимость остаточной ингибиторной активности (Я) БАВ из Str. от температуры (t, °С)Г

t°C 37 50 70 100 150 200

BKM Ac 1328-D 839/64 98+2 96 + 4 96+4 95+5 98+2 98+1 94+5 93+5 56+6 60+3 5271 5 5 48+2 50+1

-время инкубирования 3 часа.

вестными из литератур» общими свойствами микробных псевдосахарид-HUX БАВ и существенны для наработки, хранения и применения новых ингибиторов глыкозидаз как потенциальных лекарственных средств. 2.2. Оценка молокулярной мосс.н. Мотодами гель-фильтрации и ВБХ с

использовттем маркеров (рибофлавин, никотинадениндинуклеотид, витамин ВТЙ и полиэтилоноксиды - для первого метода и мальтотриозы, -тетрозы, -понтозы, -гоксозы, -гептозы - для второго метода) установлено, что БАВ из Str. ВКМ Ас 1328-D обладает в 1,5 раза большей молекулярной массой, чем вещество из шт. 839/64: 2100+100 и 1500+ +100 дальтон длл первого и второго ингибиторов, соответственно. При этом молекулярные массы новых ингибиторов превышают таковуп для акарбозы (700+100Д - по нашим данным; 645,61Д - согласно From-mmer et al., 1979).

2.3. Химическая природа активных воществ. Результаты ВБХ с детекцией специфическими красителями на различные классы сахаридов показали слабое проявление активных компонентов при взвимодействии с кислим фталптом анилина, что характерно для олигосахаридов, и яркой окрашивание на котооы и амшосахара при использовании соответствующих реактивов (Захарова, Косенко, 1982). При этом значения удельных активностей элюированных компонентов соответствовали та-копим для ГСО ингибитора из ВКМ Ас 1328-D и высокоочищенного препарата из шт. 839/С4: (360+50) и (280+20)ИЕ/мг, соответствешю.

Сравнительное изучение химического состава новых БАВ и акарбозы показало, что при ioos-ном содержании углеюдов, ингибиторы из Str. содержат больше остатков редуцирующих Сахаров н глдкозы, имеют более разнообразный качественный состав и отличные точки плавления (тпбл. 8.).

Различия в структурном составе БАВ из Str., выявлешме полным кислотным гидролизом с последующей ВБХ и качестввштм анализом (ингибитор из ВКМ Ас 1328-D содержит лактон 2-кетокислоты) подт-веркдо™ ПК- и ЯМР- спектроскопией.

Таким образом, установлено разлзгчие в структурах новых микробных ггеевдоолигосахаришгых ингибиторов глшозидаз с известными БАВ аналогичного действия.

з. Взаимодействие ингибиторов из Str. с глскозидазпми различного происхождения.

3.1. Взаимодействие ингибиторов из Str. с изолированными глккози-дазпми. Выявленные индивидуальные структуры новых ингибиторов из Str. и различная специфичность их действия и акарбозы в отношении панкреатической а-пмилппи (удолшпп активность составила (340+70),

Данше сравнительного изучения химического состава ингибиторов из Str. и акарбозы.

Таблица а.

БАБ из ЬКМ Ac 1328-D

БАБ из шт. 839/64

Свойства, методы

Акарбоза

Содержание углеводов,%

Содержание остатков редуцирующих Сахаров,%

Компонентный состав: -полный кислотный гидролиз с последующей

ПР'Г .

компонент 1

компонент 2 компонент 3 компонент 4'

компонент 5

-реакция присоединения брома

-реакция образования индиго и Оромнитрозо-соединения (Губен-Вейль, 1963) Содержание глюкозы. М: -кислотны!! гидролиз -ферментативный гидролиз: *

а) глюкоамилаза Asp. awamori

б) мальтаза Asp. niger Содержание фруктозы, М

-кислотный гидролиз -ферментативный гидролиз : *

-сахараза БассЬ. оег. Тип связи: -фермент ативный гидролиз глюкозвдазами: * -периодатное окисление: 1,4 и (или) 1,2-связи Точка плавления, о^

100

65+1

6-дез-окси-, метил-, аминогруппы

глюкоза фруктоза 2-дезокси-альдоза 2-кетолактон

-с=с-

I I

-с=о .1

100 55+1

6-дез-окси-, метил-, аминогруппы

действие не обнаружено

1

а-1,4-

Ö-S, 8-9 192-194

глюкоза фруктоза 2-дезокси-альдоза

-с=с-

I I

не дает реакции

7 7 1

1

а-1,4-

26-7 159-162

100

51+1

Frommer et al.,

1979.* "ядро"-акарвио-зин: ненасыщенный циклитол и 4-ашшо-4,6-да-дезокси-0-глю-коза, имеющий метил-группу в положении Cg

глюкоза

-с-с-

I I

не дает реакции

2 2

действие не обнаружено

а-1,4-'

2(Frommer et al. 1979)

210-213

- ферментативный гидролиз концентраций ингибиторов >>>ID5Q

7

2

(2В0+20) И (80+10) ИЕ/МГ ДЛЯ БАВ ИЗ эгг. ВКМ Ас 1328-0, 339/64 и акарбозы, соответственно) вызвали интерес к изучению взаимодействия этих ингибиторов с другими глюкозвдазами.

Результата исследований показали, что новые БАВ обратимо в высокой мере подавляют активность микробных сахаразы, глюкоамилазы, декстраназы, а-вмилазы при гидролизе высоко- и низкомолекулярных субстратов, не угнетая мальтазу и проявляя наибольшую избирательность к полисахаридазам (табл.э.). В силу структурных особенностей вещества из Stг.обнаружили различия в типах ингибирования исродс-

Таблица 9.

Сравнительная характеристика типов и констант ингибирования (К,)

БАВ из Str. и акарбозы.

Формант, субстрат

Глюко-

Тт {М ,м17Ш1)" "п тий" йнМСйрсЬМния

"Ингибиторы из st~

ВКМ Ас 1328-D

1

2

839/64

Акарбоза

ьмилаза

крахмал растворимый

мальтоза Свхараза

сахароза Мвльтаза

6,0x10 мг/ил= 3,7x10

(П)

1,9x10

(К) 7,4x10

(К)

-4

7 б -б

6,0ll0 мг/мл= 3,7x10

(н) 2,0x10

гк; 7,4x10 CKJ

6,0x10 мг/мл =« Л,0x10

<К) 3,3x10

(К)

2,3x10 <п)

6,0x10

ЫГ/МЛ:

4,2x10

(К)

3,5x10

(к) 2,8x10

аи

1,0x10 3 иг/ил-1,6x10

(к) _г 2,3x10 '

-А

1,5x10 0 CK)

мальтоза а-аглила-

не интибирует

за

панкреа-

тическая

крахмал растворимый

сырой

мальто-тетрозэ а-амиля-

3,2x10 мг/мл-_ 1,6x10 '

(Н) 0,68 = мг/мл =3,4x10

(П) 7,0x10

(К)

-5

-в

-за

мальто" гептоза Дэкстра-нпза

12,1x10 (Н)

декстран М.м.

50000Q

4,7x10 (П)

-9

3,4x10 5 мг/мл=_„ 1,7x10 °

(И) 0,68 « иг/ил _. 3,4x10 4

7,0x10 а (к)

не интибирует

5,2x10 6 мг/мл= _ 3,4x10"

(П) 0,78 = иг/ип =5,2x10

1,6x10 f

(К)

,-.1

9,4x10 (н)

4,4x10

flU

2,2x10

-4

9,3x10 (К)

1,2x10 (К)

гб

п<; 2,6x10

(К)

1,3x10 (К)

1.7x10

(К)

4,0x10" ■б 1,4x1О"3

иг/мд= го* tо" ■7 ыт/ил=» _ 2,2x10 г

(») (К)

0,78 0,9иг/мл

мг/мл -3 1,4x10 3

5,0x10" •4

ГЮ 1,7x10" ■7 1,8x10 f

(К) (Ю

1,1x10 мг/мл= 1,8x10 гк>

2,0x10

(HJ

-S

8,7x10

(К)

-9

6.2x10

(К)

ингибирования нет

*

1- по ЛаЯкуиверу-Верку; 2- по Диксону; литературные данные; (к) - коше,у рентный тип ингибирования; сн) - некош.урентныЯ тип ингибирования

tbö к глшозидазам. Большее предпочтение к утетению дисахаридаз для БАВ из шт. 839/64 с меньшим содержанием ■ глюкозных единиц и - амилаз -для ингибитора из ВКМ Ас 1328-D коррелирует с литературной пропорциональной зависимостью специфичности действия от количества остатков глюкозы (Frommer et al., 1979). Последенее танке подтверждено результатами контролируемого во времени кислотного гидролиза о измерением сахаразной активности. Полученные результаты выгодно отличают новые ингибиторы глшозидаз от известной акарбозы (действующее начало антидиабетического средства Глюкобай, "Bayer". ФРГ), конкурентной и проявляющей большую специфичность к дисахаридазам (Frommer et al., 1979), что также подтверждено нами в опытах по сравнительному изучению ее избирательности действия (табл. э.ь

Вышеуказанное открывает более широкие перспективы применения новых ингибиторов как в качестве лекарственных средств, так и специфических реагентов в биохимии и -технологии.

Однако в концентрациях, значительно превышающих Ю50. новые ингибиторы из str. и акарбоза сами подвергались гидролизу глхжози-дазами, но были менее предпочтительны, чем специфические для этих ферментов субстраты: значения Кт для ингибиторов как субстратов на порядок выше к^ для сахарозы и мальтозы, за исключением случая щдролиза БАВ из str. микробной мальтазой (табл. 10.). Вероятно, этим и объясняется отсутствие их действия на указанную глюкозвдазу. Одной из причин различия в селективности действия ингибиторов может быть индивидуальность их структур. •

3.3.Взаимодействие ингибиторов из Str. с глюкозидазами слизистой тонкого кишечника (СТК). Поскольку полный гидролиз углеводов пищи происходит в тонком кишечнике под действием а-глдаозидаз его слизистой (глюко- и а-амилаза, сахараза, мальтаза) (Lemboke, 1978), и действие акарбозы как антидиабетического средства основано на угнетении комплекса указашшх ферментов, целесообразным являлось сравнительное изучение взаимодействия БАВ из Str. и акарбозы с кишечными сахаридазами. Учитывая возможность гидролиза самих ингибиторов (в концентрациях >>>id5Q) индивидуальными глюкозидазами, ис-слодованы концентрационные зависимости в системах ингибитор-ферменты СТК.

При сравнении способов введения ингибиторов в реакционную смесь, иммитирующих условия их приема в качестве лекарственных

Таблица IQ.

Константы Михаэлиса для гидролиза ингибиторов из Str.. акарбозы и низкомолекулярных Сахаров различными индивидуальными глюкозидазами.

Субстрат, фермент

Ингибитор из Str. ВКМ ÄC1328-D -сахараза Saooh. oereviaiae -мальтаза Asp. niger -глюкоамилаза Asp. awamorl 7,8xlj0~? l.OxlO""43 не гидролизует

Ингибитор из Str. 839/64 -сахараза Saooh. oereviaiae -мальтаза Aep. niger -глюкоамилаза Asp. awamorl 5,5x10"? 1,2x10 5 1,5rlO

Акарбоза -мальтаза Aap. nigar -глюкоамилаза Asp. awanori •2,7x10"? 5,1x10

Мальтоза -мальтаза Asp. niger -глюкоамилаза Aep. awamorl 6,9xlO~5 3,1x10

Сахароза -сахарвза Saooh. oerevleiae 4,OxlO~3

средств, можно отметить, что степень ингибирования не зависит от того, подвергался или нет ингибитор предварительной инкубации с субстратом. Это свидетельствует об отсутствии взаимодействия ингибиторов с используемыми субстратами. Иная картина наблюдается при предварительной инкубации ингибитора с комплексом ферментов СТК: в зависимости от вида субстрата это приводит либо к увеличению степени подавлега1Я ферментативной активности (для крахмала), либо к ее снижению (для низкомолекулярных субстратов). Полученные данные свидетельствуют о различном характере взаимодействия изучаемых ингибиторов с ферментами, гидролизущими эти субстраты.

Специфичность действия на ферменты СТК у исследуемых ингибиторов проявляется по-разному: в концентрациях, меньших ID50. ингибиторы из Str. наиболее активно подавляют активность амилаз и саха-раз и в значительно меньшей степени, чем акарбоза ингибируют маль-тазную активность СТК. Обращает внимание тот факт, что в отношении ингибирования' амилолитической и сахаролитиче ской активности ингибиторы из Str. в равной степени превышают действие акарбозы независимо от источника получения фермента (микробное или животное сырье) а отношении мальтазной активности наблюдается иная картина -ингибиторы из Str. не ингибируют микробную ыальтазу, но угнетают мальтазную активность ферментного комплекса СТК, правда, в значи-

-18- «

тельно больших концентрациях, чем акарбози (табл.11.).

Таблица 11,

Значения концентраций BAD из Str. и акороози в качестве субстратов и lD50npii их взаимодействии с комплексом ферментов СТК.

Концентрации, М/л ингибиторы из Str. Акарбоза

ВКМ Ас 1328-0 ЙЗЭ/64

1иьо: -крахмал -сахароза -мальтоза БАВ-субстраты 4,5х1СГ8 4,5x10 ^ 2,7х10~3 1,0x10 6,0x10 7 6,0x1О"6 1,0x10* 1,0x10 ^ 7,7х10~5 1,0x10"* 7,7х10~6 2,5х10~2

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о различной избирательности дайстпия ингибиторов на а-глшозидазы.

Исследования взаимодействия комплекса СТК с концентрациями ингибиторов, >>>ID60, выявили гидролиз БАВ из Str. и акарбозы ферментами СТК (рис.4), что совпадает с данными по индивидуальным глюко-зидазам. При этом все ингибиторы били менее предпочтительны для ензимов СТК, чем мальтоза и сахароза.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что вновь выделенные ингибиторы из str. и акарбоза различаются не только ао физико-химическим свойствам, но и по своему подавляющему действию на глюкозвдазы, что позволяет отнести их к новым оригинальным БАВ. Указанное позволяет рекомендовать новые ингибиторы из Str. в качестве лекарственных средств против различных нарушений

I)

430 2,0

5 4

2 1

О 0,05

О, 15

0,0в o\so"

S S

Ингибиторы из Str.

Акарбоза, мальтоза, сахароза

РИС. 4.

Гидролиз БАВ из Str. ВКМ Ас 1328-D (1), шт.839/64 (2) и акарбозы (3) комплексом СТК в сравнении с мальтозой (4) и сахарозой (5).

D 1Q - значение оптической плотности при длинэ волны 430 им, соответствующее количеству выделившейся при гидролизе глюкозы (Dahlqvist, 1964). S - концентрация указанных веществ в М/л

угловодного обмена, что пслттрждоно результатами гипогликемичес-кого действия новых BAD In vivo (Селезнова и др., 1991).

шведы.

1. Впервые рыжшэны ингибиторы а. глюкопидаз из Str. ВКМ Ac 1328-D и 8:J9/G4, на осново которых является перспективным создание отечественных антидиабетических средств. Разработана научно--обоснованная и заишщонля патентом схема выделения ингибиторов из культуральнмх жидкостей, с выходами, значительно провышапщи-ми известные способы. Схема успешно апробирована на Вншне-Во-лопком заводе ферментных препаратов.

2. Определены основные физико-химические свойства ингибиторов: об-.ласть pH- и тормостябилыгости, сродство к органическим растворителям, хроматографическив и спектральный свойства.

3. Показана псовдоолигоспхяридная природа новых ингибиторов.

4. Разработан спектрофотометричоский метод определения удельной ингибиторной активности для партий субстанции и PCO, полученных и исследованных согласно разработанному нами лабораторному регламенту и проекту ВФС.

5. Показан обратимый характер взаимодействия ингибиторов из Str. с индивидуялышми глшозидазами различного происхождения: новые БАВ 1гроявляют высокую специфичность действия как в отношении амилаз, ток и дисахаридаз при гидролизе высоко- и низкомолекулярных субстратов.

6. Выявлена возможность гидролиза новых БАВ индивидуальными микробными глюкозидязпми и комплексом ферментов СТК в концентрациях, значительно препыипющих величину 1ПЦ(Г Последнее должно учитываться irpn определении терапевтических доз ингибитора.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Selezneva A.A.. Akulova N.Yu. Inhibitors of a-gluoosidases Of microbial origin.// Russian Biochemistry anil Biotechnology.- 1991. -Vol.1., Ж2/3.-Р.41.

2. Селезнова A.A., Акулова Н.Ю. Ингибиторы а-глшозидаз микробного происхождения.//Инженерная энзимология (Получение и применение би-окатапнзаторов в народном хозяйстве и медицине).: Тез. докл. VII Вс»;с. симпозиума, Москва, 1991.-С.-3G.

-203. Селезнева A.A., Акулова Н.Ю. Ингибиторы а-глюкозидаз микробного происхождения.//Ферменты микроорганизмов (Нуклеазы): Тез. докл. IX конференции межвузовского (межотраслеюго) проекта, Казань, 1991.-С.12-14.

4. Селезнев» A.A., Акулова Н.Ю. Ингибиторы а-глюкозидаз микробного происхождения.//Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других БАВ микробного происхождения: Тез. докл. Iii Всесоюз. конф., Степногорск, 1991.-С.12.

5. Селезнева A.A., Гринберг Г.Е., Акулова Н.Ю. и др. Новый ингибитор а-глюкозидаз - потенциельное гипогликемическое лекарственное средство.//Человек и лекарство: Тез. докл. I Росс. Нац. конгресса, Москва, 1992.-С.268.

6. Селезнева A.A., Акулова Н.Ю. Ингибиторы а-глюкозидаз микробного происхождения.//Виол, науки.-1992, Xß.-С.25-32.

7. Акулова Н.Ю., Аверьянова Е.В., Большакова М.Д., Селезнева A.A. Инактивация глюкозидаз под действием биологически активного вещества из Aotlnoplanes вр.//Прикл. биохим. и микробиол.-1992.-Т.28, ЖЗ.-С.375-379.

8. Патент J41816379 , ' СССР; С12 *9/26//(С12 J»9/26, С12 П 1:465), "Способ получения ингибитора а-глюкозидаз"./Акулова Н.Ю., Большакова М.Д., Аверьянова Е.В., Селезнева A.A. (ВНИТИАФ,)* приоритет от 17.12.90.

9. Акулова ;Н.Ю., Казанина Г.А., Селезнева A.A. Новые ингибиторы а-глюкозидаз - потенциальные лекарственные средства.// Тезисы -конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами": Москва, октябрь 1993.