Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индуцированный эмбриоидогенез в культуре ткани винограда

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Индуцированный эмбриоидогенез в культуре ткани винограда"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ АН СССР

МАРЧЕНКО Александр -Олегович

УДК (634.8:631.527.8):581.143.6.085 (043.3)

ИНДУЦИРОВАННЫЙ ЗМБРИОИДОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ ВИНОГРАДА

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Казань - 1590 г

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте винограда и продуктов его переработки "Магарач", в Отделении клеточной биологии и инженерии института ботаники им. Н, Г. Холодного АН УССР,

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Голодрига П. Я., кандидат биологических наук Пивень Н. М.

Официальные оппоненты:доктор биологических наук, профессор

Батыгина Т. Б„, доктор биологических наук, профессор Лозовая В. В.

Ведуо|ее предприятие - Государственный Никитский

ботанический сад (г. Ялта)

Защита диссертации состоится " % *__1990 г. в чай

на заседании специализированного Совета при Казанском институте биологии КНЦ АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского института биологии КНЦ АН СССР.

,—^

Автореферат разослан " У 1990 г.

Ученый секретарь специализированного -

Совета, кандидат биологических наук -^/СосеЬ н.л. Лосева

ОБШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Основным путем улучшения сортов в растениеводстве является селекционный процесс. Однако, несмотря на достигнутые успехи,дальнейший прогресс в селекции винограда по созданию новых сортов должен быть связан с разработкой принципиально новых подходов. Клеточные технологии, появившиеся в процессе исследований культуры тканей и клеток растений, уже сейчас позволяют использовать их потенциал для ускорения селекционного процесса. Основными компонентами этих технологий в большинстве случаев являются воспроизводимые методы-регенерации растений в культуре тканей. Одним из путей реализации морфогенетической программы клеток in vitro является эмбриоидоге-нез. Однако, для широкого внедрения этого метода в практику имеется целый ряд трудностей как фундаментального, так и методического характера. 3 связи с этим актуальными являются исследования углубляющие наше понимание явления эмбриоидогенеза.

Цель и задачи исследований^ Целью наших исследований являлось изучение процесса индукции эмбриоидогенеза у винограда для решения имеющихся проблем при создании клеточных технологий. Задачи исследований: изучить зависимость эмбриоидогенеза у винограда от содержания регуляторов роста в питательных средах, генотипа и типа эксплантов; разработать методику получения растений через эмбриоидогенез из листьев и стебля произвольного генотипа винограда; исследовать пути возможного использования эмбриоидогенеза для решения некоторых фундаментальных вопросов физиологии и биологии развития винограда in vitro и создание клеточных технологий для практической селекции.

Научная новизна. Впервые определены факторы питательной среды специфичные для каждого генотипа и типа эксплантов при индукции эмбриоидогенеза у винограда. Впервые выявлена дискретность по концентрациям действия цитокининов на растительные ткани и клетки. Впервые показано, что увеличение содержания 2,4-Д в средах первого этапа приводит к расширению области значений концентрации БАП в средах для получения эмбриогенных каллусов. Впервые для культуры винограда получены растения из стебля и листьев путем эмбриоидогенеза со специфически измененными относительно исходной формы морфофизиологическими признаками: морфология листа и образование соцветий in vitro. На защиту выносятся следующие положения:

'- разработанный метод индуцированного эмбриоидогенеза у отечественных сортов винограда и форм ценных для практической селекции; - разработанный метод, позволяющий получать растения из стебля и

листьев винограда путем эмбриоидогенеза со специфически измененнь относительно исходной формы морфофизиологическими признаками: морф логия листа, образование соцветий в условиях in vitro;

- новые особенности действия 2,4-Д и БАП в процессе индукции эк риоидогенеза: расширение спектра эффективных для получения эмбриог ных каллусов концентраций БАП при увеличении содержания 2,4-Д; дис ретность по концентрациям действия цитокининов на ткани и клетки винограда.

Практическая ценность. Отработаны условия индукции эмбриоидоген за и получены растения-регенеранты из стебля и листьев отечественных сортов и форм винограда, которые могут представлять ценность к исходный материал для практической селекции. Это открывает возможность для широкого применения этого метода при создании клеточных технологий в практической селекции винограда. Методика получения растений винограда с измененными фенотипами позволяет создавать ма сив измененных регенерантов сортов винограда и отбирать среди них новые сорта и формы. Явление дискретности по концентрациям действи БАП и НУК на ткани и клетки винограда может быть использовано как метод для определения относительной физиологической активности дру гих аналогов этих регуляторов роста.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Всесоюзно научно-техническом совещании "Перспективы генетики и селекции вино рада на фитоиммунитет" (Симферополь, 1986), Международном симпозиу по виноградарству, виноделию, экономике и связанным с ними основны предметами (Кечкемет, Венгрия, 1986), Международной конференции "Биология культивируемых клеток" (Новосибирск, 1988), Всесоюзном совещании "Методы отбора по комплексам признаков в селекции растений (Симферополь, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста (включая 17 таблиц и 36 рисунков) и состоит и введения, обзора литературы, методической части, результатов иссле дований, обсуждения, выводов. Список литературы включает 228 найме нований, в том числе 192 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В качестве исходного материала использовали растения, выращиваемые in vitro следующих генотипов винограда: сорт Подарок Мага-рача - межвидовой гибрид Vitis ; сорт Крымская жемчужина - Vitis vinifera L. сорт Антей магарачский - межвидовой гибрид vitis,

сорт Каберне-Совиньон - vitis vinifera ъ. ; сеянец Магарач № I00-74-1-5 - один из сеянцев, выделенных из семенного потомства гибридов ДРХ-60-24 х V.vinifera L. ; Vitis monticola Buokl. -американский вид. Все опыты по индукции эмбриоидогенеза проводились в одинаковых условиях до образования эмбриоидов либо до полного некроза каллусов: в темноте при температуре 28°С. использовали модифицированную среду Мурасиге и Скуга с добавлением 2,4-Д и БАП - среда первого этапа MMCI, или НУК и БАП - среда второго этапа ММС2. Опыты по индукции эмбриоидогенеза проводили в два этапа по следующей схеме:

1 этап: лист, стебель —> 14Ж1(2,4-Д'^гБАП) —каллусы,

2 этап: каллусы —МЖ2(НУК + БАП).

Каллусы с каждого варианта среды MMCI переносили на разные варианты среды ММС2. Комбинации регуляторов роста, исследованные для каждого генотипа винограда, представлены в таблице I. Каждая комбинация сред MMCI и ММС2 проверялась в более чем 2х независимых опытах на эксплактах всех мещоузлий и/или всех листьях не менее чем 3х растений in vitro в каждом опыте. Результаты оценивали визуально по наличию или отсутствию зон проэмбриоидкых структур и эмбриоидов на каллусах. Результат считали положительным, если наблюдали образование хотя бы одной зоны проэмбриоидных структур или одного эмбриоида на каллусах одного из эксплантов. Для получения растений эмбриоиды переносили на безгормональную среду и культивировали на свету при температуре 25-27°С, Для повышения выхода нормальных растений применяли холодовую обработку эмбриоидов в течение 2х и 4х недель при температуре +5°С. Также изучали влияние НУК и БАП на развитие эмбриоидов.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Влияние регуляторов роста на ризогенез и каллусогенез

у разных сортов винограда Выбор критерия оценки результатов проводили на сорте Подарок Магарача. В качестве контролируемого признака использовали сырой вес каллусов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что вариабельность интенсивности каллусогенеза обусловлена в большей степени гетерогенностью по физиологическому состоянию эксплантов и исходных растений, нежели различием питательных сред по содержанию 2,4-Д и БАП. Различие растений по этой функциональной зависимости свидетельствует о том, что при изучении влияния регуляторов роста на проявление этого признака использование средних вели-

б

Таблица I

Комбинации регуляторов роста в средах, использованных в опытах по эмбриоидогенезу у разных сортов и форм винограда

Содержание регуляторов роста, иг/л

Среды для получения каллусов ЛЖ1

__(первый этап)_

Среды ММС2 для культивирования каллусов (второй этап)___

из междоузлий

из листьев

Сорт Подарок Магарача -1;2 + Б-0,1;0,5;1;Л " Н-1;2;3 + Е-1;2;3;

1> 5;2;2,5;3

Д--1. +

Б-2

Д-1,5 + Б-1 Д-2 + Б-1 Д-2 + Б-2

Д-1 + Б-3,5;4;4,5;5; э,5;6

7. Д-3 + Б-0,1;0,5;1;1,5;

?•? я-Э'З 5-Ч-

—»72» ^ > ^ > >

4,5;5

3.

5.

6.

8. Д-

■3 + Б-2 4 + Б-2;3

4;5

Н—I;2 + Б-0,5

Н-0,5;1,5; + Б-1 2,5

Н-2 + Б-1

Н-2 + Б-1 Н-2 + Б-1

Н-2 + Б-0,5;2;3; 4; 5

ю.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

I;2 + Б-1,7;2,2

2 + Б-0,7;0,9;1,2;1,9

1;2;3;4 + Б-2 + Н-2 Н-2 + Б-0,5

■I + Б-2 "

2 + К-0,5;1;2;4;6;8

I + Б-1,5 + Х-2

" ■ Сорт Крымская жемчунина

-I + Б-0Д;0,Э;1;1 5; 2;2,5;3;3_,5;4;

Н—0,5; Т; + Б-1 I,5;2;

2,5-3

• ■ Сеянец Магарач » 100-74-]

17. Д-1 + Б-0,1;0,5;1;1,5;

2;2,5;3 3,5;4; 5; 5; 5) 5; б

18. Д-1 + Б-4,5

19. Д-1 + Б-4,3;4,7

20. Д-2 + Б-4,5

Н-1;2;3 + Б-1;2;3 Ч; 5

Н-1;2 + Б-0,5

Н-0,5;1,5; + Б-1; 2 5

Н-2 + Б—7;8;9 Н-2 + Б-5 Н-2 + Б-7 Н-2 + Б-7;8;9 Н-2 + Б-5

Н-2 + Б-5

Н-2 + Б-0,5;I;2;

Н-0,1,5; + Б-2;2,5;3

Н-2 + Б-5

Н-2 + Б-5

Д-1 + Б-2 Н-2 + Б-5 Н-2 + Б-5

Н-0,5;I; + Б-5 1,5; 2;

2,5;3

-5

Н-0,5;1; + Б-5 1,5;2;

2,5;3

Н-1,5 + Б-1;2;3;' Н-1,5 + Б-5 Н-1,5 + Б-5

Продолжение таблицы I

т . 2 : 3 1 4

21. Д-1 + Б—0, Т . ^ ,5; ■ 7 -Т 5;2;2,5;3; н-о, 5;X;1, 5; + Б-5

з, 5. ь. Л 15; 5; 5,5;6 2; 2. 5;3

Примечание: Д - 2,4-д; Н - НУК; Б - БАП; К - кинетин. "-" - не исследовались.

чин для оценки результатов неэффективно. Все попытки получить эмб-риоиды из исходных эксплантов (листьев, черешков листьев, стебля) разных сортов винограда на средах, содержавших НУК и БАП оказались неудачными. Однако в этих опнтах наблюдали одновременно с каллусо-генезом также и ризогенез. Результаты показали, что по интенсивности образования корней в процессе каллусообразования на различных (по содержанию НУК и БАП) средах, разные сорта винограда проявляют свою специфичность, в то время как экспланты■разного происхождения одного и того же сорта - тканеспецифичность. Эффект действия регуляторов роста на ткани и клетки винограда зависит от исходных абсолютных значений их концентраций в питательных средах, а не от .соотношения ауксин/ цитокинин.

2.2. Влияние регуляторов роста и зитаминов на эмбриоидогенез

у разных сортов и форм винограда 2.2.1. Получение эмбриоидов у сорта Подарок Магарача Содержание регуляторов роста в средах, необходимое для получения эмбриогенных каллусов и эмбриоидов у сорта Подарок Магарача, приведены в таблице 2 и отражены на рисунке I. Образование зон про-эмбриоидных структур и эмбриоидов из каллусов наблюдали спустя 2040 дней от начала культивирования на среде второго этапа (ММС2). Результаты воспроизводились в каждом опыте на некоторых эксплантах каждого растения при выполнении следующих условий: использование растений с травянистым стеблем и оптимальной продолжительностью первого этапа культивирования (на среде с 2,4-Д) - 25-35 дней. Количество эксплантов, из которых были получены эмбриогенные каллусы, произвольно варьировало от опыта к опыту в пределах от 5 до 20 % в случае междоузлий, и от 10 до 60 % в случае листьев. Результаты опыта по определению зависимости эмбриоидогенеза от происхождения эксплантов на растении позволии сделать вывод: чтобы обеспечить достоверность оценки питательной среды на соответствие условиям

Таблица 2

Содержание регуляторов роста в питательных средах, на которых получены эмбриоиды у разных сортов и форм винограда

; С оде рЖан ШГ"рёгуляторов~роста7~мг/л

: Среды ММС1 для получе- : Среды ММС2 для формирования : ния эмбриогенных каллусу эмбриоидов из каллусов $ : ных культур ;----------

: : мевдоузлий : листьев

Сорт Подарок Магарача

I. Д-1 + Б-2 Н-2 + Б-0,5;Г Н-2 + Б-3;5; 7;8;

2. Д-2;3 + Б-2 Н-2 + Б—0,5; I Н-2 + Б-3;5; 7

3. Д-1. 5 + Б-1 Н-2 + Б-1 Н-2 + Б-5

4. Д-2 + Б-1 Н-2 + Б-0,5;Г Н-2 + Б-3;5; 7

5. д-з + Б-0,5; 3 5- -'г 1! 5* 5; ;2, 5; Н-2 + Б-1 Н-2 + Б-5

б. Д-4 + Б-2 - Н-1, 5;2 + Б- ■5

7. Д-4 + Б-3 - Н-1,5 + Б-5

8. д-1 + Б-1,7 - Н-2 + Б-5

9. Д-2 + Б-0,1; 0, 5; I, |2; -»9; 3 - Н-2 + Б-5

10. Д-З; 4 + Б-2 + Н- •2 Н-2 + Б-0,5 -

II. Д-1 + Б-2 - Д-1 + Б-2

12. Д-2 + К-4;8 - Н-2 + Б-5

13. т т Д--1- + Б-1,5 + к- ■2 - Н-2 + Б-5

Сорт Крымская жемчужина

14. д-- + Б-3 Н-0,5; 2 + Б-1 Н-0,5;2 + Б- •5

сеянец Магарач 1'е 100-74-1-5

15. д-1 + Б-4,5 - Н-1,5 + Б-3; 5

16. д-1 + Б-4,3; 7 - Н-1,5 + Б-5

17. Д-2 + Б-4,5 - Н-1,5 + Б-5

+"1 <5 тгюл-М по! Р. Чиск1.

18. д-1 + Б-2,5- - - Н-3 + Б-5

Примечание: Д - 2,4-Д; Н - Н7К; Б - БАП; К - кинетин. "-" - варианты сред не исследовались.

индукции эмбриоидогенеза у исследуемого генотипа необходимо .для каждой комбинации сред первого и второго этапов культивирования использовать экспланты всех междоузлий, или все листья хотя бы ного растения.

Р=Г 1

-а-

4 -

3 -

2 -

п п п—гт—п—п—п - п—п

п - п

I I

п

(А)

- п

п

о 0,1 0,5 I из стебля

2 3 4

Содержание БАП, мг/л

ч

X

ё 3 -

2 -

5 Г

из листьев

б

СБ)

п п

п п1

0,5 I ~

8

3 4 5 7

Содержание БАП, мг/л Рис, I. Змбриоидогенез у сорта Подарок Магарача в зависимости от содержания 2,4-1, Н7К и БАП з средах первого (А) и второго (Б)

этапов культивирования П - комбинации регуляторов роста, содержание которых обеспечивало получение эмбриогенных каллусов (А) и эмбриоидов (Б); "-" - полученные каллусы оказались неэмбриогеиными (А) и эмбриоиды не образовывались (Б); 1 - эмбриоиды были получены только из каллусов, сформировавшихся на средах с 2.4-Д-4 мг/л.

Исследование различных сочетании 2,4-17'НУ'К' Я" БАП'показали, что: I) для получения эмбриогенных каллусов содержание БАП з средах перзого этапа.(1БАП), при использовании 2,4-1-1 мг/л, в концентрации 2 мг/л является единственной для данного сорта. Повышение содержания 2,4-Д з средах первого этапа приводило к расширение области концентраций БАП, необходимых для получения эмбриогенных каллусов. При этом наблюдалась дискретность по концентрациям действия 1БАП на'ткани и клетки зинограда, обеспечизающих получение эмбриогенных каллусоз. Интервал эффективных концентраций 1БАП при

то

использовании 2,4—Л—I; 2 мг/л не превышает 0,4-0,5 мг/л; 2) из всех исследованных концентраций НУК для формирования эмбриоидов из эмбриогенных каллусов полезной оказалась только одна - 2 мг/л (при использовании 2,4-Д в концентрации до 3 мг/л). Однако имеется возможность обойти необходимость использования НУК в процессе индукции эмбриоидогенеза - применение повторного субкультивирования -на среде с 2,4-Д и БАП; 3) определенные концентрации БАП в средах для формирования эмбриоидов (2БАП) оказались специфичными для каллусов разного происхождения. В опытах с кинетином было показано, что: I) содержание кинетинь в концентрациях 4 мг/л и 8 мг/л приводит к такому же~морфогенетическому ответу культурыу как и содержание БАП в концентрациях I мг/л и 2 мг/л соответственно; 2) содержание кинетика в средах для получения каллусов также имеет дискретный спектр значений. Опыт с витаминами показал, что результат - будут или не будут полученные каллусы эмбриогеиными - существенно зависит от содержания витаминов и, особенно, тиамина в питательных средах. Поэтому, результаты, полученные при использовании сред с разным содержанием витаминов, по-видимому, некорректно сопоставлять между собой по содержанию регуляторов роста, необходимому для получения эмбриоидов даже для одного и того же генотипа.

2.2.2. Индукция эмбриоидогенеза у сорта Крымская жемчужина, сеянца Магарач й 100-74-1-5 и vitis monticola Buckl.

Для получения эмбриоидов из каллусов сорта Крымская жемчужина продолжительность первого этапа культивирования в 30-40 дней оказалась достаточной. омбриоиды образовывались через 20-30 дней после переноса каллусов на среду ММС2 (табл. 2, рис. 2). Образование эмбриоидов из каллусов сеянца Магарач j 100-74-1-5 было достигнуто при продолжительности первого этапа как в 30 дней, так и в 50 дней. В опытах по индукции эмбриоидогенеза у Vitis montícola Buckl. эмбриоиды были получены только в случае применения повторного субкультивирования каллусов на тех же средах MMGI (продолжительность первого этапа в общей сложности составила 60 дней), с последующим переносом их на среду ММС2 (табл. 2, рис. 2 ). Все выводы, сделанные для сорта Подарок Магарача полностью подтвердились и.для других генотипов винограда.

2.2.3. Формирование эмбриоидов и .получение растений

Результаты проведенных опытов показали, что одними из возможных путей повышения интенсивности эмбриоидогенеза является: во-первых, улучшение контактов эмбриогенных клеток со средой, и, во-

QJr=C <r> I t=t-=3" о -OOJ

0,1 0,5 I из стебля'

!» 2 -

3= ----

<0 ""

§ I -

C3

iK _

o.

a>

Fi

о о

2 3 4

Содержание БАП, мг/л из листьев

б

(Б)

К

к_ с

"к

7

12 3 5

Содержание БАП, мг/л Рис. 2. Змбриоидогенез у разных *орм винограда в зависимости от содержания 2,4-Д, НУК и БАП в средах первого (А) и второго (Б) этапов культивирования Буквами отмечены комбинации регуляторов роста, содержание которых обеспечивало получение эмбриогенных каллусов (А) и эмбриоидов (Б) соответственно у: К - сорта Крымская жемчужина, С - сеянца Магарач 's 100-74-1-5, М - Vitis monticola Buckl. . ± - комбинации 2,4-Д, НУК и БАП исследовались только для сеянца. "-" - полученные каллусы оказались неэмбриогенными (А) и эмбриоиды не образовывались (Б).

вторых, применение комплексного культивирования эмбриогенных каллусов на средах с различным содержанием БАП. Полученные эмбриоиды проходили все стадии развития, характерные для зиготических зародышей: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную. Формирующиеся из эмбриоидов растения имели семядоли и характеризовались так называемыми ювенильными признаками, присущими сеянцам.

Не все образовавшиеся эмбриоиды формировали растения. Показано, что применение обработки холодом, а также использование НУК и БАП в средах для получения растений из эмбриоидов существенно повышает выход растений (до 70 Результаты дают основание считать что одной из причин наблюдаемых отклонений от нормального развития эмбриоидов и низкого выхода растений является нарушение в гормональной регуляторной системе. Поэтому для обеспечения нормального

развития эмбриоидов и достижения высокого процента регенерации них растений необходимо приводить в соответствие гормональный с питательных сред с потребностями в них разных стадий развития эмбриоидов.

По сравнению с растениями,полученными из пазушных почек ме1 дани микроклонального размножения,определенная часть растений-регенерантов сорта Подарок Магарача (до 30 % в отдельных опытах полученных из эмбриоидов отличается от исходной формы. Наиболее контрастными из измененных признаков являлись морфология листа i образование соцветий в условиях in vitro . Полученные результа' подтвердили выводы многих исследователей о том, что одним из ис чников возникновения генетической и эпигенетической изменчивост! при культивировании in vitro является применение регуляторов роста. Разработанный способ получения растений с измененными те! типами может быть взят за основу при постановке серийных экспер! ментов по клеточной селекции к различного рода факторам (засоле! токсинам, температурам и т. д.), а также для постановки опытов i трансгенозу на уровне эмбриоидов.

3. ИНДУЦИРОВАННЫЙ ЭЖРИОидОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ ВИНОГРАД!

(ОБСУЖДЕНИЕ)

Опыты по эмбриоидогенезу показали, что для индукции этого процесса у разных сортов и форм винограда достаточно подобрать i лько состав и содержание 2,4-Д, НУК и БАП в средах на каждом эте культивирования. На примере сорта Подарок Магарача была продемо* стрировака возможность получения эмбриоидов у винограда при испс льзовании разных способов применения этих регуляторов роста: I) 2,4-Д + БАП НУК + БАП, 2) 2,4-Д + БАП + НУК НУК + БАГ 3) 2,4-Д + БАП —2,4-Д + БАП. Принципиальным условием получен» эмбриоидов во всех случаях было применение 2,4-Д в средах для пс лучения каллусов и БАП на обоих этапах культивирования. Первый способ является наиболее общим, так как допускает независимое и; чение действия 2,4-Д и НУК на разных этапах эмбриоидогенеза и, следовательно, позволяет определять их функции при индукции этог явления. Поэтому этот способ был положен в основу экспериментов. Проведенные исследования показали, что для получения эмбриоидов у произвольного генотипа винограда принципиальное значение имеет определение содержания БАП в средах для получения каллусов (1БАЕ НУК и БАП в средах для формирования эмбриоидов (2БАП). При испол зовании 2,4-Д в концентрации I мг/л разные сорта и формы хорошо

различаются по содержанию 1БАП и НУК, необходимому для получения эмбриогенных каллусов и эмбриоидов (рис. 3 А). Это позволяет сде-

| 2,4-Д-1 мг/л (А)

ч 3 -j ----- М ------ -

"^-i- - -- -- - - ------

= 2-]- - - - П - К ----- -

I

g -f

(О т I EH I -t О I

с

С-1

о о. о Ен Ю

I 1

X о 1 Й 2 -t t=t I

а I

п I ЕС 3 1 I _! I

<D о I

Si 1

I 1

<3 -I

NS I

РчТ '

<D J- П

^ ! О Ч

о I

1- ----- К

!•• .......-

I

oil 0',5 I 2 3 4 5 б

Содержание БАП в средах первого этапа, мг/л

1 1 2,4-Д- 3 мг/л (Б)

| - П---П---П— 1 -П- —П - П—П - П

0,1 0,5 I 2 3 4 5

Содержание БАП в средах первого этапа, мг/л

1 1 1 1 2,4~Д-4 мг/л (3)

[ 1 1 1 1 П -

1______,______

2 3

Содержание БАП в средах первого этапа, мг/л Рис.3. Зависимость эмбриоидогенеза у разных генотипов винограда от содержания БАП в среде первого этапа и НУК в среде второго этапа культивирования при использовании-2,4-Д в концентрациях (А) - I мг/л, (Б) - 3 мг/л, (В) - 4 мг/л Буквами отмечены (в соответствии с рис. I, 2) комбинации БАП и НУК, использование которых обеспечивало получение эмбриогенных каллусов и эмбриоидов соответственно у разных генотипов винограда. "-" - появление эмбриоидов не наблюдалось.

лать вывод о том, что содержания 1БАП и НУК являются сортоспеци-фическими факторами питательной среды при индукции эмбриоидогенеза. Независимо от исследуемого генотипа винограда эмбриоиды из

экбриогенных каллусоз стебля нормировались на среде с 2БАП меньше 2 мг/л, а из эмбрногенных каллусов листьев - на среде с 2БАП больше 2 мг/л (рис. I Б, 2 Б), ото позволяет сделать вывод о том, что содержание 2БАП является специфичным для каллусов разного происхождения при формировании эмбриоидов. Обобщение результатов, получеь ных на разных генотипах винограда, позволяет сформулировать методи ку определения содержания 1БАП и НУК, адекватных условиям индукции эмбриоидогенеза из листьев и стебля произвольного сорта винограда:

1 этап: лист, стебель —2,4-Д-1 мг/л + БАП —каллусы,

2 этап: каллусы НУК + БАП-1;"5'мг/л. Увеличение содержания 2,4-Д в средах первого этапа приводило к сту ранию сортовых различии по необходимому для получения эмбриогенных каллусов содержанию 1БАП (рис. 3 Б, В). Зто свидетельствует о том, что повышение содержания 2,4-Д в средах для получения каллусов может быть одним из возможных путей стандартизации методики индукц^ эмбриоидогенеза у разных генотипов винограда. На основании полученных результатов, хорошей их воспроизводимости, а также принимая во внимание имеющиеся литературные данные формулируется вывод: имеет место достаточно строгое соответствие между содержанием регуляторов роста в питательных средах и экспрессией определенных участков генома. Принимая во внимание результаты, демонстрирующие возможность индуцировать, по крайней мере, некоторые признаки (образование красного пигмента на каллусах винограда (Голодрига и др., 1986), формирование корней и эмбриоидов) при помощи только 2,4-Д, НУК и БАП, на основании сделанного зывода представляется возможным сделать следующее утверждение: некоторую структуру генома винограда можно отобразить в 3х мерном пространстве, координатные оси которого связаны с 2,4-Д, НУК и БАП, по продуктам генов. Такое представление генома, а также особенности влияния этих регуляторов роста на индукцию эмбриоидогенеза у винограда могут быть взяты за основу при разработке системы методов по изучению структ5 ры, принципов организации и динамики генома растительных клеток.

ВЫВОДЫ

I. Разработан способ регенерации растений путем эмбриоидогене за из междоузлий и листьев двух хозяйственно важных сортов виногрг и двух форм ценных для практической селекции. Экспериментально продемонстрирована возможность использования сорта Подарок Магара-ча в качестве модельного для изучения индуцированного эмбриовдогеь за.

2. Наиболее эффективной является схема двухэтапкой индукции: этап (каллусогенез) - 2,4-Д + БАП, 2 этап (образование эмбриоидов)

■ НУК + БАП. Важнейшим условием получения эмбриоидов у произвольно-о генотипа винограда является подбор регуляторов роста и их кон-ентраций на каждом этапе эмбриоидогенеза. Зпервые показано, что ля разных генотипов винограда специфичными оказались содержание АП в средах для получения эмбриогенных каллусов и НУК в средах для ормирования эмбриоидов. Для каллусов разного происхождения (из лиса, стебля) специфичным оказалось содержание БАП в среде для форми-ования эмбриоидов.

3. Результат действия регуляторов роста на ткани и клетки виног-ада зависит от их исходных абсолютных концентраций в питательных редах, и не зависит от соотношения ауксин/цитокинин. Зпервые пока-ано, что повышение содержания 2,4-Д в средах для каллусогенеза асширяет область эффективных концентраций БАП, необходимых для поучения эмбриогенных каллусов (на первом этапе). Впервые выявлена искретность по, концентрациям действия цитокининов на ткани и клети винограда.

4. Эффективность эмбриоидогенеза у винограда может быть повышена утем применения комплексного культивирозания эмбриогенных каллусов а средах с различным содержанием БАП, а также за счет улучшения онтакта эмбриогенных клеток с питательной средой.

5. Для обеспечения нормального развития растений из эмбриоидов целью нарушения их физиологического покоя необходимо использовать

ериод охлаждения и/или воздействие ауксинов и цитокининов.

6. Зпервые для культуры винограда показано, что получение рас-зний через эмбриоидогенез с использованием концентраций БАП не спе-ифичных для данного генотипа винограда позволяет увеличивать разах фенотипического разнообразия среди регенератов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

. Марченко А. 0., Голодрига П. Л. Гормонально-генетический подход в решении задач по диагностике генотипической специфичности винограда // Перспективы генетики и селекции винограда на фитоим-мунитет: Тез. докл. Всесоюзн. науч.-технич. совет. - Симферополь, 1986. - С. 97.

. Марченко А. 0., Голодрига П. Я., Купсик Е. Г. Ивдукция соматического эмбриоидогенеза как важный этап в селекции на селективных средах // Там же. - С. 44.

3. Марченко А. 0., Голодрига П. Л., Клименко 3. П., Пивень К. М. Соматический эмбриоидогенез в культуре ткани винограда // Физиология и биохимия культ, растений. - 1987. - Т. 19. - Н, -С. 408-Ш.

М. Марченко А. 0., Голодрига П. Я., Купсик Е. Г. Гормонально-генетический подход в решении задач по диагностике генотипической специфичности винограда и индукции соматического эмбриоидогене-за // Перспективы генетики и селекции винограда на иммунитет: Тр. Всесоюз. науч.-тзхнич. совек. - Киев: Наукова думка, 1988. -С. 133-135.

5. Марченко А. 0. Использование эмбриоидогенеза для разработки методов отбора в селекции винограда // Методы отбора по комплексам признаков в селекции растений: Тез. докл. Всесоюзн. совещ. -Симферополь, 1989. - С. 65-66.

6. Пивень Н. М., Куксова В. Б., ЮзефовичЛ. В., Марченко А. 0. Биотехнологическке аспекты культуры ткани винограда // Биология культивируемы:; клеток :: биотехнология: Тез. докл. Мевдународн. конф. - Новосибирск, 1958. - С. 275-276.

.7» Piven К. U., .Vnrcheniro А. О., Kuksova V. Б. Somatic embryogenesis and plant regeneration of Vitis vinifera in vitro // Summaries Intern, symp. on viticulture, enology, economy and related basic subjects for young researchers 8-12 September, 1986, Kecskemet.- P. 48.

Подписав о к печати 15.10.90 г. Форма! 60 у. Ьч I/I6. Объем 1,0 л. л. 1мрак 100 экз. Заказ & г US' . Бесплагкэ

Печатная группа ВЕКИ ЗиПП "¿¡згарач". Ялга, vz. Кирова, 31.