Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii

Суханова, Евгения Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii"

/"7

СУХАНОВА Евгения Ивановна

ИНДУКЦИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ДРОЖЖЕЙ 1)1Р00Л$С15 MAGNUSII

Специальность 03.01.04 - «Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 2 МАЙ 2011

МОСКВА-2011

4845875

Работа выполнена в лаборатории биологического окисления

Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

P.A. Звягильская

доктор биологических наук,

профессор

Е.П. Феофилова

доктор биологических наук,

профессор

Г.Д. Миронова

Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «19» мая 2011 г. в «14.00» часов на заседании диссертационного совета

(Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии

им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.

Автореферат разослан «11» апреля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии в клетках высших эукариот, помимо их известной роли в энергизацин клетки и общем клеточном обмене, играют решающую роль в выборе клетки между жизнью и смертью (апоптозом). Апоптоз - это генетически запрограммированный, четко отрегулированный, высококоординированный механизм гибели клеток, направленный на удаление невостребованных, поврежденных, инфицированных, ослабленных, закончивших свой жизненный цикл, потенциально опасных клеток. Согласно рекомендации Номенклатурной комиссии по клеточной гибели (2009), этот вид клеточной смерти отличается от других (некроз, аутофагия, митотическая катастрофа) набором характерных морфологических и биохимических признаков. Интерес к апоптозу огромен, поскольку, по крайней мере, в клетках животных, он выполняет множество функций, от созидательных (морфогенез, онтогенез, антираковая защита и т. д.) до разрушительных (сепсис, инфаркт миокарда, инсульт, нейродегенеративные заболевания и т. д.).

До относительно недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь высшим многоклеточным, поскольку считалось, что одноклеточные организмы не имеют в своем геноме генов, аналогичных тем, которые кодируют апоптотичсские факторы многоклеточных и поскольку существовал скептицизм относительно физиологической целесообразности и эволюционных преимуществ апоптоза у одноклеточных, в том числе и дрожжей. Однако сейчас установлено, что дрожжи в природе живут в виде сообществ (колонии, биопленки). Известны вещества (ароматические спирты), ответственные за коммуникацию клеток. Описаны многочисленные случаи гибели (в основном исследования проводились на дрожжах S. cerevisiae) по механизму апоптоза под действием различных неблагоприятных внешних факторов и внутриклеточных дефектов. Выявлен ряд апоптотических факторов, некоторые из которых (эндонуклеаза G, цитохром с, белок, подобный протеазе HtrA) локализованы, как и в митохондриях животных, в межмембранном пространстве и выход которых при повреждении внешней мембраны означает начало необратимой стадии апоптоза, приводящей в конечном итоге к гибели клетки. Однако вопрос - каким образом осуществляется выход апоптотических факторов из дрожжевых митохондрий до недавнего времени не имел ответа. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов из межмембранного пространства. Один из них включает в себя активацию, конформационную перестройку, встраивание во внешнюю мембрану митохондрий и димеризацию проапоптотического белка Вах, члена семейства белков Вс1-2, в результате чего образуется пора [Sheridan et al., 2008; Yamaguclii et al., 2008]. Другим механизмом выхода

апоптотических факторов из митохондрий является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия ряда пор во внутренней митохондриальной мембране:

1) неспецифической, Са2+/Р„-зависимой, циклоспорин А (ЦсА)-чувствительной поры, мегаканала диаметром 2,6-2,9 нм, способного пропускать вещества с молекулярной массой до 1,5 кДа [см. Bernardi et al., 2006];

2) ЦсА-нечувствительной небелковой поры, образующейся при одновременном добавлении к митохондриям Са2+ и насыщенных жирных кислот и отличающейся от классической Са2+/Р„-зависимой поры отсутствием специфичности по отношению к дивалентным катионам и способностью спонтанно закрываться [Mironova et al., 2001; Sultan and Sokolove, 2001];

3) ЦсА-чувствительной поры, индуцируемой высокими концентрациями неорганического фосфата при кислых значениях рН [Kristian et al., 2001];

4) поры, открываемой в митохондриях животных (и растений) в условиях анаэробиоза [Chavez et al., 1997; Kuzminova et al., 1998; Virolainen et al., 2002].

Открытие пор ведет к снижению мембранного потенциала, дисфункции митохондрий, нарушению ионного гомеостаза, высокоамплитудному набуханию митохондрий и, как следствие, выходу апоптотических факторов из митохондрий.

Дрожжевые клетки лишены белков семейства Вс1-2 (в геноме не найдены гены, кодирующие эти белки). Практически ничего не известно об участии структурной реорганизации крист в выходе апоптотических факторов из митохондрий. Информация же о возможности индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий до сих пор фрагментарна и противоречива. Известно лишь, что митохондрии S. cerevisiae содержат неспецифическую пору (канал) [Prieto et al., 1992; 1995; 1996; Roucou et al., 1997; Manon et al., 1998; Manon and Guerin, 1998; Gutiérrez-Aguilar et al., 2007], закрываемую при дефиците ATP. Она имеет примерно те же размеры [Manon and Guerin, 1998], что и неспецифическая, Са2+/Р„-зависимая, ЦсА-чувствителъная пора млекопитающих и ей приписываются те же функции. В последнее время в нашей лаборатории было показано, что в митохондриях дрожжей Dipodascus (ранее Endomyces) magnusii не индуцируется Са2+/Р„-зависимая, ЦсА-чувствительная пора [Дерябина и др., 2004], а митохондрии Yarrowia ¡ipoíytica лишены всех Са2+-зависимых пор [Kovaleva et al., 2009; Ковалева и др., 2010].

многочисленные, хорошо структурированные митохондрии и полноценную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического обмена, напоминающую по своей структуре дыхательную цепь млекопитающих.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать возможность индукции: а) классической Са2+-фосфат-зависимой, ЦсА-чувствительной поры; б) ЦсА-печувствителыюй поры, индуцируемой низкими концентрациями Са2+ и жирных кислот; в) поры, индуцируемой анаэробиозом; г) поры, запускаемой окислительным стрессом;

2. Исследовать возможность функционирования АТР-зависимого К+-канала.

Научная новизиа. На прочно-сопряженных митохондриях дрожжей D. magnusii впервые проверены все условия индукции проницаемости внутренней митохондрнальной мембраны, известные для митохондрий животных. Показано, что в митохондриях D. magnusii не индуцируется ни Са2+-фосфат-зависимая, циклоспорин А-чувствительная пора, ни циклоспорин А-нечувствительная пора, открываемая в митохондриях животных при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. В отличие от митохондрий животных и растений, анаэробиоз не индуцировал повышенную проницаемость внутренней митохондрнальной мембраны дрожжей D. magnusii. Впервые показана АТР-зависимая энергизация дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза. Прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствии Са2+ ионофора) - вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий дрожжей D. magnusii, без образования мегаканала. Обнаружено «ресопрягающее» действие АТР. Доказано наличие в митохондриях D. magnusii регулируемого К+-АТР-зависимого канала, закрываемого, как и в митохондриях животных (и в митохондриях дрожжей Y. lipolytico) при добавлении АТР. В условиях окислительного стресса селективный К+-АТР-зависимый канал может превращаться в неспецифическую пору.

Практическое значение работы. Обнаруженное нами сходство АТР-зависимого К+-канала (митоКдтр) митохондрий животных и дрожжей D. magnusii позволяет рассматривать дрожжевые митохондрии в качестве перспективной модели для изучения структуры и регуляции активности митоКдтр, которому в настоящее время отводится важная роль в защите миокарда от последствий ишемии и для поиска новых «открывателей» канала.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всероссийской конференции молодых учёных и II школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эммануэля (2006, Москва); Европейских Биоэнергетических Конференциях (ЕВЕС) (2006, Москва; 2010, Варшава); Конгрессах FEBS

(2007, Вена; 2008, Афины; 2009, Прага); 24-й Международной конференции «Yeast Transport and Energetics» (2006, Прага); 2-м Съезде микологов России с международным участием «Современная микология в России» (2008, Москва); XXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2010, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, а также 12 тезисов докладов на конференциях.

Объем и структура работы. Работа изложена на 178 страницах печатного текста, содержит 87 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (глав), выводов и списка цитируемой литературы (333 источника, в том числе 299 на иностранных языках).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Организм и условия выращивания. В работе использовали дрожжи Dipodascus magnusii, штамм ВКМ-261. Клетки выращивали при 28°С на роторной качалке (220 об/мин) на полусинтетической среде [Звягильская и др., 1981], содержащей в качестве источника углерода и энергии 1%-ый глицерин, и собирали в поздней экспоненциальной фазе роста (1012 г сырой биомассы/л).

Выделение митохондрий осуществляли по методу, разработанному в нашей лаборатории.

Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом в ячейке (рабочий объём 1 мл) с закрытым кислородным электродом типа Кларка.

Потенциал, генерируемый на внутренней митохоидриальной мембране, регистрировали на спектрофотометре Beckman coulter DU-650 с сафранином О в качестве потенциал-зависимого зонда [Akerman and Wikstrom, 1976].

Набухание митохондрий регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япопия), по уменьшению оптической плотности митохоидриальной суспензии при 540 нм.

Митохондриальный белок определяли по методу Брэдфорд [Bradford, 1976] с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В митохондриях дрожжей 0.нс индуцируется «классическая» Са247Р„-зависимаи, циклоспорин А-чувствитсльная пора

В работе использовали только прочно-сопряженные митохондриальные препараты. Они сохраняли регуляцию метаболического состояния, окисляли добавленные субстраты с высокими скоростями, высокими (порядка 4-5) величинами дыхательного контроля и величинами АБР/О, близкими к теоретически ожидаемым. Об образовании нор(ы) судили, как это принято в литературе, по совокупности двух параметров - снижению мембранного потенциала (Ду) и высокоамплитудному набуханию митохондрий.

В нашей лаборатории ранее было показано [Дерябина и др., 2004], что митохондрии дрожжей О. т^пизИ лишены классической Са2+/Р„-зависимой, ЦсА-чувствительной поры. Однако в этой работе в качестве окисляемых субстратов использовали ЫАО-зависимые субстраты (пируват + малат), что заметно снижало чувствительность системы к добавлению прооксидантов; высокие (далекие от физиологических) концентрации Са2+ и, что важно, высокие концентрации неорганического фосфата, который, как было показано в самое последнее время [Уата(1а й а1., 2009], является ингибитором поры. Поэтому нам пришлось вновь исследовать вопрос о возможности индукции в митохондриях £>. /л^тш! «классической» поры. Это потребовало усовершенствования метода выделения митохондрий, что позволило получить митохондриальные препараты, стабильные при инкубации в средах, содержащих концентрацию фосфата на порядок более низкую, чем использовалось ранее.

При инкубации митохондрий дрожжей О. magntlsii в присутствии умеренных концентраций Са2+ не было обнаружено снижения мембранного потенциала даже под действием низких концентраций ЭГТА (хелатора Са24), препятствующего выходу накопленного иона и, тем самым, способствующего увеличению [Са2+]м, что индуцирует открытие Са2+/Р „-зависимой поры в митохондриях животных, и гидрофобного прооксиданта фениларснноксида, индуктора ЦсА-чувствительной поры в митохондриях животных [Вегпагй й а1., 2006]. Поскольку, как было показано ранее в лаборатории, митохондрии дрожжей £>. magnusii обладают регулируемыми системами входа и выхода Са2+ [см. Дерябина и др., 2004], полученные данные позволили сделать вывод о том, что наличие митохондриалыюй системы транспорта Са2+ ещё недостаточно для индукции поры. В дальнейших исследованиях мы использовали специфический Са2+ ионофор ЕТН129, который при встраивании в мембраны образует селективный Са2+ канал. Сам ЕТН129 не влиял на

энергетические параметры митохондрий (скорость дыхания, величину мембранного потенциала) и не вызывал набухания органелл. При. одновременном добавлении к митохондриям D. magnusii ионофора и умеренных концентраций Са2+, наблюдалось ускорение дыхания в состоянии 4 и существенное снижение мембранного потенциала (Рис. 1А), свидетельствовавшие о разобщении окисления и фосфорилирования. Мембранный потенциал частично восстанавливался добавлением неорганического фосфата, и полностью -ЭГТА и бычьим сывороточным альбумином (БСА) (Рис. 1А), что указывало на активацию в этих условиях Са1+ЯГ-обмена, зависимого от эндогенных жирных кислот [Bradshaw et aL, 2001]. Са2+-ЕТН-зависимое снижение мембранного потенциала не было чувствительно к действию ЦсА, ADP и Mg2+ - ингибиторов классической ЦсА-зависимой поры животных, но частично ингибировалось АТР (Рис. 1Б). Защитное действие АТР было специфичным, т. к. полностью снималось атрактилозидом, ингибитором транслоказы адениновых нуклеотидов (ТАН) (не показано). Дрожжевые митохондрии не набухали в присутствии ЕТН129 и увеличивающихся концентраций Са2+.

Рис. 1. Влияние Са2+, ЕТН129 (ЕТН), неорганического фосфата (Рн), ЭГТА, БСА и АТР на мембранный потенциал митохондрий D. magnusii.

А) ЕТН129 в присутствии Са2+ снижал мембранный потенциал митохондрий, который частично восстанавливался добавлением Р„ и полностью - добавлением ЭГТА в БСА;

Б). (ЕТН129 + Ca2t) -зависимое снижение мембранного потенциала частично обращалось добавлением АТР;

Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фоефатный буфер, рН 7,2-7,4, 20 мкМ сафранин О, 20 мМ Tris-сукцииат, митохондриальный белок - 0,5 мг/мл. Где указано, добавлен 25 нМ КЦФХ (карбонилцианид-м-хяорфенилгидразон, разобщитель).

Ранее было показано, что деэнергизация митохондрий животных или истощение пула адениновых нуклеотидов [см. Bemardi et al., 2006] делает их более чувствительными к повышенным концентрациям Са2+, вызывая открытие ЦсА-зависимой поры. Для

деэнергизации, дрожжевые митохондрии проинкубировали в течение 1 минуты с аитимицином Л (ингибитором дыхательной цепи на уровне комплекса III) и олигомнцином (ингибитором переноса энергии, для предотвращения образования АТР). Антимицин А и олигомицин полностью ингибировали дыхание в отсутствие добавленных дыхательных субстратов, а также вызывали полный коллапс мембранного потенциала, но не набухание митохондрий в присутствии Са2+ и ETII129 (не показано), что свидетельствовало об отсутствии открытия поры и в этих условиях.

Для истощения внутримитохондриального пула адсниновых нуклеотидов, дрожжевые митохондрии проинкубировали с 10 мМ пирофосфатом (РР), который, как известно, [Asimakis and Sordahl, 1981], транспортируется в митохондрии через ТАН, обмениваясь с АТР и, тем самым, снижая его внутримитохондриальиый уровень. Ответ обработанных пирофосфатом дрожжевых митохондрий на добавление Са2+ отличался от ответа контрольных (необработанных) митохондрий и от митохондрий К lipolylica [Kovaleva et al., 2009] тем, что мембранный потенциал снижался под действием умеренных концентраций Са2+ без использования ЕТН129. Однако, обработанные пирофосфатом дрожжевые митохондрии не набухали под действием умеренных концентраций Са*+, даже в присутствии ЕТШ29. Поэтому мы заключили, что в митохоидриях D. magnusii, обработанных пирофосфатом и, следовательно, имеющих сниженный пул впутримитохондриальных нуклеотидов, в отличие от митохондрий хеивотиых, не индуцируется Са2+-зависимая пора.

В отличие от митохондрий животных [Kristian et al., 2001], митохондрии D. magnusii оказались устойчивы к действию высоких (до 10 мМ) концентраций фосфата при низких (рН 6,0) значениях рН даже в гипотонической среде. В этих условиях не было обнаружено ни снижения величины мембранного потенциала, ни набухания митохондрий под действием умеренных концентраций Са2+ и ионофора ЕТН129.

Таким образом, нам не удалось индуцировать Са2+/Р„-зависимую пору в митохондриях D. magnusii в условиях, способствующих ее открытию в митохондриях животных (в присутствии низких концентраций ЭГТА, прооксидантов, при деэнергизации митохондрий или истощении пула митохондриальных нуклеотидов, в присутствии высоких концентраций фосфата на фоне сниженного значения рН).

Это сделало актуальным поиск других способов регуляции проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей.

В митохондриях дрожжей D. magnusu не индуцируется Са2+/пальмитат-зависнмая пора

Из литературных данных известно [Sultan and Sokolove, 2001; Mironova et al., 2001], что низкие концентрации Са2+ и насыщенных жирных кислот (пальмитата или стеарата) индуцировали в митохондриях животных, открытие небелковой поры, характеризующейся нечувствительностью к ЦсА и неорганическому фосфату. Поскольку взаимодействие жирных кислот с митохондриями D. magnusii не исследовалось ранее, мы восполнили этот пробел. Мы нашли, что, как и в митохондриях животных, пальмитат (аналогичные данные получены и для других насыщенных жирных кислот - стеариновой и пентадекановой) является эффективным разобщителем дрожжевых митохондрий, активируя дыхание в состоянии 4 (Рис. 2А) и снижая мембранный потенциал (Рис. 2Б), причем, в отличие от митохондрий животных, дрожжевые митохондрии оказались гораздо более чувствительными к действию жирных кислот. Разобщение, вызванное действием пальмитиновой кислоты, полностью ингибировалось ^предотвращалось БСА, связывающего жирные кислоты, и, что обнаружено впервые, - АТР (Рис. 2В).

Это может быть связано, во-первых, с тем, что АТР является хелатором насыщенных кислог, а во-вторых, с повторной энергизацией разобщенных митохондрий за счет энергии гидролиза АТР. Реполяризующее действие АТР почти полностью снималось добавлением атрактилозида и бонгкрековой кислоты.

Разобщающее действие жирных кислот промотировалось митохондриально-направленными мембранофильными катионами. В работе использовали SkQl, SkQ3, С12ТРР и MitoQ, любезно предоставленные сотрудниками НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского. Все они являются положительно заряженными липофильными соединениями с делокализованным зарядом, производными тетрафенилфосфония, два из них (SkQl и SkQî) содержат в качестве редокс-комионента пластохинон (компонент фотосинтетической редокс-цепи), MitoQ - убихинои (компонент дыхательной цепи), а С12ТРР - не содержит хинона.

Мембранофильиые катионы активировали, хотя и в разной степени, скорость окисления пирувата + малата в состоянии 4 (Рис. ЗА), что указывало на их разобщающий эффект. Разобщающее действие липофильных катионов частично или полностью предотвращалось добавлением АТР и БСА. Гораздо более высокие концентрации липофильных катионов требовались для ингибирования дыхания дрожжевых митохондрий в состоянии 3 (не показано).

[Пшьм],

Рис. 2. Влияние пальмитиновой кислота (Пальм), АТР и БСА на митохондрии D. magnusu.

А) Концентрационная зависимость действия пальмитиновой кислоты иа дыхание митохондрий D. magjiusii в состоянии 4. Среда инкубации содержала 0,6 М машшт, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 20 мМ Tris-Шфуват, 5 мМ Tris-малат, митохондриальиый белок - 0,5 мг/мл.

Б) Концентрационная зависимость действия пальмитиновой кислоты на мембранный потенциал митохондрий D. magnusii;

200 Время, с

В) Пальмитиновая кислота вызывала снижение мембранного потенциала, который полностью восстанавливался добавлением АТР шли БСА;

Состав среды инкубации, как на Рис. 1. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.

Все исследуемые мембранофилыше катионы снижали мембранный потенциал дрожжевых митохоидрий (Рис. ЗБ), при этом деполяризация мембраны была нечувствительной к действию антиоксидантов N-ацетилцистеина и тролокса, частично или полностью ингнбировалась и предотвращалась добавлением АТР и БСА. «Ресопрягагощее» действие АТР полностью или в значительной степени снималось добавлением ингибиторов ТАН - атрактилозида и боигкрековой кислоты.

При совместном действии пальмитата (аналогичное действие оказывали стеариновая и пентадекановая кислоты) мембрацофильные катионы в низких, еще неразобщающих концентрациях, значительно усиливали вызываемое жирными кислотами разобщенно митохоидрий: кривые зависимости деполяризации мембраны от концентрации кислоты в присутствии липофильных катионов заметно сдвигались в сторону более низких концентраций (Рис. ЗВ). Разобщение, вызываемое совместным действием жирной кислоты и липофильных катионов, частично или полностью обращалось добавлением АТР и БСА.

2 z

л 20

г»

[липофильные катионы], мкМ^

Рис. 3. Влияние липофильных катионов на митохондрии дрожжей Д. та£пи5И.

А) Концентрационные зависимости действия йкО 1 (кривая /), С12ТРР (кривая 2), SkQЗ (кривая 3) и М1К>С2 (кривая 4) на дыхание митохондрий О. талями в состоянии 4. Состав среды инкубации, как на Рис. 2А;

Б) Концентрационные зависимости действия Бк01 (кривая /), С12ТРР (кривая 2), 5кОЗ (кривая 3) и Ь&оС! (кривая 4) на мембранный потенциал митохондрий Г>. тд§ягш7;

4 S « 7 /

(липофильные катионы], шЦ/

J100-PQ7XW>-CCOO 5* во

10 12 И

[Пальм], мкМ

В) Концентрационные зависимости действия пальмитиновой кислоты на мембранный потенциал митохондрий D. magnusii в присутствии 1,5 мкМ SkQl (кривая 2), 2,5 мкМ С12ТРР (криьая 3), 1,5 мкМ SkQ3 (кривая 4), 1,5 мкМ MitoQ (кривая 5) и в отсутствие липофильных катионов (кривая 7);

Состав среды инкубации, как на Рис. 1.

Не исключено, что наблюдаемое нами и другими исследователями [Антоненко и др., 2008; Skulachev et al., 2009] разобщение митохондрий под действием липофильных катионов может быть объяснено их взаимодействием с эндогенными жирными кислотами, которые содержатся в митохондриях.

В отличие от митохондрий животных, добавление Са2+ к митохондриям дрожжей, обработанных пальмитатом, не вызывало дополнительных изменений в энергетических параметрах митохондрий (Рис. 4А). Лишь в присутствии Са2+ ионофора ЕТН129 имело место еще большее снижение мембранного потенциала, вероятнее всего за счет активации Са2+/1Г-обмсна, предотвращаемое добавлением БСА (Рис. 4Б). ЭГТА, хелатор ингибировал деполяризацию, вызванную совместным действием Са2+ и ЕТН129 (не показано). Инкубация митохондрий с умеренными концентрациями Са2+ и пальмитиновой кислотой не вызывала высокоамплитудного набухания митохондрий ни в отсутствие, ни в присутствии ЕТН129; в присутствии высоких концентраций Са2+ и пальмитиновой кислоты имело место лишь

низкоамплитудное набухание (не показано). Следовательно, митохондрии й. таЁпюИ лишены поры, зависимой от насыщенных жирных кислот и Са2+,

Рис. 4. Влияние пальмитиновой кислоты (Пальм), Со.2*, БСА и ЕТШ29 (ETil) из. мембрашшГг потенциал митохондрий D. magmisii

А) 100 мкМ Са2+ не вызывал дополнительной деполяризации мембраны после действия пальмитиновой кислоты; мембранный потенциал полностью восстанавливался БСА;

Б) Лишь при совместном действии Са2+ и ЕТН129 наблюдалось дополнительное снижение мембранного потенциала, полностью восстанавливаемое БСА;

Состав среды инкубации, как на Рис. 1. Где указано, добавлен 25 нМ ЕСЦХФ.

Анаэробиоз не индуцировал повышенную проницаемость внутренней митохондрналыюн мембраны D. magnusii

В митохондриях, выделенных из корней пшеницы, анаэробиоз и высокие концентрации Са2+ индуцировали образование циклоспорин А-нечувствителыюй неспецифической поры с выходом цитохрома с [Virolamen et al., 2002]. В митохондриях печени крысы в условиях анаэробиоза, достигаемого насыщением среды инкубации азотом, и энершзации митохондрий добавлением сукцината и АТР, 100 мкМ Са2+ вызывал образование циклосплорин А-чувствительной поры [Kuzminova et al., 1998]. На основании полученных данных авторы сделали вывод о том, что кислород не является фактором, необходимым дм открытия поры. Мы проверили возможность индукции неспецифической проницаемости внутренней митохондрнальнон мембраны в условиях анаэробиоза в митохондриях дрожжей D. magnusii. Состояние анаэробиоза достигалось добавлением к митохондриям смеси субстратов -пирувата, малата, сукцината и а-глицерофосфата. Скорость дыхания митохондрий в таких условиях увеличивалась до максимальной (не показано), что должно было приводить к

быстрому исчерпыванию кислорода, т. е. возникновению гипоксии или анаэробиоза. Действительно, при добавлении к дрожжевым митохондриям смеси субстратов, деполяризация мембраны имела место уже на 200-400 с и мембранный потенциал восстанавливался до исходного уровня введением микромолярных концентраций пероксида водорода (Рис. 5А). Пероксид водорода, добавленный к митохондриям на начальной стадии инкубации, предотвращал наступление анаэробиоза (Рис. 5Б).

Рис. 5. Влияние смеси субстратов и пероксида водорода (H2Oj) на мембранный потенциал, генерируемый митохондриями D. magnusn.

Анаэробиоз вызывал деполяризацию мембраны, которая полностью ингиблровалась (А) и предотвращалась (Б) добавлением пероксида водорода;

Состав среды инкубации, как на Рис. 1. + 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, 20 мМ Tris-a-глицерофосфат. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.

Нами впервые обнаружено, что мембранный потенциал, сниженный в результате наступления анаэробиоза (гипоксии), восстанавливался не только добавлением пероксида водорода, но и АТР (Рис. 6А). Добавление АТР на начальной стадии инкубации митохондрий почти полностью предотвращало индуцированную анаэробиозом деполяризацию мембраны (Рис. 6Б). Действие АТР было специфичным, поскольку атрактнлозид и бопгкрековая кислота (ингибиторы ТАН) полностью снимали ззщитное действия АТР (Рис. 6В) и поскольку ADP (в присутствии олигомицина - ингибитора синтеза АТР), в отличие от АТР, не предотвращал деполяризацию, вызванную анаэробиозом, а лишь замедлял её.

Умеренные концентрации в состоянии анаэробиоза (гипоксии) на фоне АТР не вызывали снижения мембранного потенциала, оно имело место только при одновременном добавлении Са:+ и ионофора ЕТН129, за счет активации Са2+/1Г+-обмена, зависимого от эндогенных жирных кислот. Но и в этом случае не наблюдалось высокоамплитудного набухания митохондрий, т. е. образования мегаканала.

СО 0,16

ю Щ2

X 3- циа

о 5 с 0.04

3 X ЦОО-

to Ч A04J

КЦХФ

ATP 1 i:M

0,03

400 600 Время, с

Рис. 6. Влияние смеси субстратов, АТР, перокевда водорода (Н2О2), атраетилозида (Атр) и боигкрековой кислоты (Бонгк) иа мембранный потенциал, генерируемый митохондриями D magnusii.

А) Мембранный потенциал, сниженный в результате наступления анаэробиоза, почти полностью восстанавливался добавлением 1 мМ АТР;

Б) 1 мМ АТР (в среде инкубации) в значительной мере предотвращал снижение мембранного потенциала, вызванного наступлением анаэробиоза;

УЧ

КЦХФ 25,нМ

400 600 Время, с

Вреьп, с

В) 75 мкМ атрактилозвд и 6 мкМ бонгкрековая кислота полностью снимали реполяризующее действие АТР после самопроизвольной деполяризации мембраны в результате наступления анаэробиоза;

Состав среды инкубации, как на Рис. 5. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.

Влияние прооксидангов на митохондрии дрожжей 1). magnusii

Из литературных данных известно [ВегпапН й а!, 2006], что окислительный стресс, вызванный добавлением прооксидангов, способствует открытию Са2+/Р„-зависимой поры в митохондриях животных. Поэтому мы исследовали влияние прооксидантов на возможность индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий О. гпа^т/хИ. Бьши использованы: фениларсиноксид (гидрофобный бифункциональный БН-агепт), менадион (гидрофильный монофункциональный БН-агент), оксалоацетат (окислитель эндогенного пула МАОН), пероксид водорода, /-бугилпероксид и аскорбат в сочетании с Ре2+ - индукторы гидроксид-ион-радикала. В качестве субстрата окисления при измерении мембранного потенциала мы использовали сукцинат, а не систему NAD-зaвиcaмыx

субстратов, продуцирующую антиоксидант NADH, что позволило значительно «очувствить» систему.

Менадиои, фениларсиноксид и оксалоацетат, взятые в низких (эмпирически подобранных) концентрациях вызывали и существенное снижение мембранного потенциала (Рис. 7А), частично иигибируемое восстановленным глутатионом и полностью ингибируемое и предотвращаемое N-ацетилцистеином, БСА и АТР (Рис. 7А). Защитное действие АТР было специфичным и частично снималось добавлением Mg2+. Добавление умеренных концентраций Са2+ на фоне неразобщающих концентраций прооксидантов не приводило к дополнительному снижению мембранного потенциала. Мембранный потенциал снижался только в присутствии ЕТШ29 (Рис. 7Б), как мы теперь понимаем, за счет активации Ca27lГ-обмена, зависимого от эндогенных жирных кислот.

Рис. 7. Влияние менвдиона, оксалоацетата (ОА), фениларсшюксида (ФАО), N-ацетилцисгеина (N-Ац), БСА, АТР, Са2+, ЕТН129 (ЕТН) и ЭГТА на мембранный потенциал митохондрий D. magnusii.

А) Менаднон, ОА и ФАО в низких концентрациях вызывали снижение мембранного потенциала, который полностью восстанавливался добавлением 5 мМ N-ацепшцистеина, 100 мкМ АТР и БСА в концентрации 1 мг/мл;

Б) 5 мкМ ЕТН129 и 50 мкМ Са2+ в присутствии неразобщающих концентраций менадиона, ОА и ФАО вызывали снижение мембранного потенциала, нечувствительное к действию ЭГТА и восстанавливаемое добавлением БСА;

Состав среды инкубации, как на Рис. 1. Где указано, добавлен 25 нМ ЬСЦХФ.

Митохондрии дрожжей D. magnusii не набухали при совместном действии ФАО, менадиона и оксалоацетата в концентрациях, вызывающих снижение мембранного потенциала, не набухали они и при добавлении умеренных концентраций Са2+ и ЕТН129, что свидетельствовало об отсутствии открытия поры. Аналогичные данные были получены при использовании других прооксидантов - пероксида водорода и /-бушлпероксида. Лишь

действие аскорбата в сочетании с FeSOj, в результате чего происходит образование пщроксил анион-радикала, приводило к значительному снижению мембранного потенциала, нечувствительному к действию антиоксидантов и АТР, но и в этом случае не наблюдалось высокоамплитудного набухания митохондрий.

Таким образом, показано, что в митохондриях дрожжей D. magnusii прооксиданты вызывали снижение мембранного потенциала, не увеличивающееся, в отличие от митохондрий животных, от добавления умеренных концентраций Са2+. Снижение мембранного потенциала, вызванное прооксидантами, предотвращалось добавлением антиоксидантов, а также АТР (показано впервые!), в меньшей степени - других иуклеотидов. Интересно, что ресопрягающсе действие АТР проявлялось даже в тех случаях (например, при добавлении высоких концентраций фениларсиноксида), когда классический водорастворимый антиоксидант N-ацетнлцистсин был «бессилен». Полученные данные логичнее всего объяснить тем, что основной мишенью ирооксндантов является транслоказа аденнновых нуклсотидов - основной белок внутренней митохондриалыюй мембраны, содержащий 4 цистеиновых остатка. Можно предположить, что в присутствии АТР белок принимает конформациго, менее чувствительную к действию прооксидантов.

Митохоидриальньш АТР - зависимый калиевый канал в митохондриях дрожжей D. magnusii

В митохондриях S. cerevisiae был обнаружен неспецнфический канал (YMUC - yeast mitochondrial unspeciflc channel), открываемый, в противоположность митоК+атр каналу митохондрий животных, в ответ на добавление АТР и закрываемый при дефиците АТР. Ранее в нашей лаборатории (Ковалевой М.В., кандидатская диссертация) в митохондриях дрожжей Y. lipolytica был обнаружен АТР-зависимый К+-канал, закрываемый, как и в .митохондриях животных, при добавлении АТР. Поскольку дрожжи D. magnusii и К. lipolytica, в отличие от дрожжей S. cerevisiae, обладают аэробным типом обмена, зависимым от функционирования митохондрий, было интересно узнать, является ли функционирование мнтоКатр «животного типа» общим свойством митохондрий дрожжей с аэробным типом обмена.

Найдено, что в изотонической среде, приготовленной на основе маннита, как основного осмотического стабилизатора, набухания митохондрий не происходило. В среде, содержащей КС1, имело место высокоамплшудное набухание митохондрий D. magnusii, ингибируемое добавлением АТР (Рис. 8А, кривая I). Ингибирующий эффект АТР частично снимался Mg2+

(Рис. 8А, кривая 2) и полностью - неорганическим фосфатом (Рис. 8А, кривая 3). Действие АТР было специфичным.

Аналогичные данные были получены при измерении мембранного потенциала. Добавление к слегка гипотонической среде 50 мМ KCl вызывало снижение мембранного потенциала (Рис. 8Б), а последующее добавление АТР способствовало восстановлению величины мембранного потенциала до исходного значения (Рис. 8Б). Однако, в отличие от митохондрий У. lipolytica [Kovaleva et al., 2009], для получения ответа на KCl к суперсопряженным митохондриям D. magnusii необходимо было добавить низкие (пикомолярпые), еще неразобщающие концентрации КЦХФ (Рис. 8Б). Концентрация АТР, вызывающая полумаксимальпый ресопрягающий эффект при добавлении 50 мМ KCl была равна 90 мкМ (Рис. 8В). Ресопрягающее действие АТР было специфичным, поскольку в значительной мере снималось атрактилозидом, а также пирофосфатом. АТР не мог быть заменен другими нуклеотидами.

Рис. 8. Влияние KCl, АТР, Mg2+, неорганического фосфата (Р„) и КЦХФ на митохондрии D. magnusii

A) 2 мМ АТР полностью ингибировал (кривая /), АТР на фоне 2 мМ Mg2+ частично ингибировал (кривая 2), АТР в присутствии 3 мМ Ри совсем не ингибировал (кривая 3) набухание митохондрий в KCl-среде; Среда инкубации содержала 0,2 М KCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,2-7,4, митохондриальный белок - 0,5 мг/мл.

Б) 50 мМ KCl в присутствии 30 пМ КЦХФ вызывал деполяризацию мембраны, полностью ингибируемую добавлением 150 мкМ АТР;

B) Реполяризующий эффект АТР после деполяризации, вызываемой совместным действием KCl и 30 пМ КЦХФ;

Состав среды инкубации, как на Рис. 1. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.

Поскольку эквнмолярные концентрации NaCl, LiCl, ТЕАС1 и TrisCl не снижали мембранный потенциал даже в относительно высоких концентрациях (100 мМ и выше), был сделан вывод о том, что обнаруженный нами ингибируемый АТР капал является селективным для ионов К+.

Деполяризующий эффект KCl (на фоне 30 пМ КЦХФ) зависел от его концентрации (Рис. 9А). Концентрация KCl, оказывающая полумаксимальиын деполяризующий эффект, составляла 40 мМ. «Ресопрягающий» эффект АТР строго зависел от концентрации добавленного KCl (Рис. 9Б). Чем выше была концентрация добавленного к митохондриям KCl, тем более высокие концентрации АТР были необходимы для реполяризацин мембраны. В присутствии физиологической концентрации KCl, равной 100 мМ, концентрация АТР, вызывающая полное ресопряжсние, составляла величину 3 мМ, что находится в пределах физиологических концентраций. Ресопрягающий эффект АТР зависел и от степени энергизации митохондрий (Рис. 9В). Чем выше был уровень мембранного потенциала (уровень энергизации митохондрий), тем более эффективней было реполяризугощее действие АТР.

[КС(1, мМ

20 40 60 80 100 120 140

\____[КСП, м.Ч

Рис. 9. Влияние КС1, КЦХФ и АТР на мембранный потенциал митохондрий D. magnusii.

A) Зависимость величины уровня мембранного потенциала от концентрации добавленного КС1;

Б) Зависимость концентрация АТР, необходимой для полного восстановления мембранного потенциала (реполяризацин), от концентрации добавленного КС1;

B) Зависимость реполяризующего эффекта АТР от величины мембранного потенциала (% от максимума). Мембранный потенциал снижали, добавляя увеличивающиеся концентрации разобщителя КЦХФ. Состав среды инкубации, как на Рис. 1.

Мембранный потенциал, % макс

Реполяризующий эффект ATP зависел от присутствия ионов Mg"* (Рис. 10А) и неорганического фосфата (Рн) (Рис. 10Б). Чем выше была концентрация этих агентов, тем более высокие концентрации АТР были необходимы для реполяризации мембраны после ее деполяризации, вызываемой KCl. В среде инкубации с ионной средой, имитирующей состав цитоплазмы (5 мМ Mg2+, 5 мМ Рн и 1 мМ Na+), мембранный потенциал восстанавливался лишь на 70% от максимальной величины, а концентрация АТР, необходимая для достижения этого эффекта, увеличивалась (Cso составила 100 мкМ) (Рис. 10Б, кривая 5).

Рис. 10. Влияние KCl, КЦХФ, Mg3*, неорганического фосфата (Р„), Na+ и АТР на мембранный потенциал митохондрий D. magfiusii.

А) Реполяризующий эффект АТР (кривая I, С50 = 90 мкМ) и АТР в присутствии 1 мМ (кривая 2, С^о = 0,45 мМ), 2 мМ (кривая 3, С50 = 0,45 мМ) и 5 мМ Mg14" (кривая 4, С50 = 0,6 мМ) после деполяризации, вызываемой совместным действием KCl и 30 пМ КЦХФ;

Б) Реполяризующий эффект АТР (кривая 1, Cso = 90 мкМ) и АТР в присутствии 1 мМ Ра (кривая 2, С50 = 75 мкМ) и 5 мМ Р» (кривая 3, Ci0 = 70 мкМ), 5 мМ MgI+ и 5 мМ Р, (кр[юая 4, С50 = 70 мкМ), 5 мМ Mg2+, 5 мМ Р„ и 1 мМ Na+ (кривая 5, Cs0 = 100 мкМ) после деполяризации, вызываемой совместным действием KCl и 30 пМ КЦХФ.

Состав среды инкубации, как на Рис. 1.

Поскольку действие АТР на дрожжевые митохондрии было очень сходным с тем, что было описано для митохондрий животных [Mironova et al., 2004] и дрожжей Y. tipolytica (см. диссертацию Ковалёвой М.В.), нашим следующим шагом было исследование влияния на митохондрии D. magnusii веществ, известных как регуляторы митоКат?- Диазоксид, один из самых известных открывателей митоКдтр митохондрий животных, индуцировал высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий в среде, содержащей KCl и 1 мМ АТР уже в низких (микромолярпых) концентрациях (Рис. 11А).

Таким образом, в митохондриях дрожжей аэробного типа обмена - У. lipolytica и D. magnusii достоверно обнаружен АТР-зависимый К+-кацал «животного типа», закрываемый АТР.

Мы проверили действие некоторых прооксидантов: менадиона, ФАО и пероксида водорода на повторную деполяризацию мембраны после ее реполяризации АТР. Эти прооксиданты, особенно ФАО, вызывали повторную деполяризацию мембраны, которая была нечувствительной к действию аитиоксиданта N-ацетилцистеина и БСА, но незначительно обращалась повторным добавлением АТР, и, что важно - повторное набухание дрожжевых митохондрий, заингибированное добавлением АТР (Рис. ЦБ). Это означает, что в присутствии прооксидантов АТР-зависимый К* канал может превращаться в неспецифический канал (пору), через которую могли бы выходить апоптотические факторы, локализованные в межмембранном пространстве.

Рис. 11. Влияние КС1, АТР, диазоксида и фешгларсиноксида (ФАО) на набухание митохондрий D. magnusii.

А) Диазоксид и Б) ФАО, добавленные после АТР, вызывали повторное набухание митохондрий в KCl-среде. Состав среды инкубации, как на Рис. SA.

Поскольку принимается, что концентрация цитоплазматического АТР составляет примерно I мМ (большинство АТР-зависимых ферментов имеют величину К„ для АТР, лежащую именно в этом диапазоне), это означает что в «нормальных условиях» АТР-зависимый К+-канал митохондрий дрожжей аэробного типа обмена, ингибируемый микромолярными концентрациями АТР, должен находиться в закрытом состоянии. Однако, как нами было найдено, ингибирующий эффект АТР частично снимался Mg2+ и неорганическим фосфатом, что позволяет предположить то, что в физиологических условиях

(при внутриклеточных концентрациях Mg2+ и Р„, равных примерно 5-10 мМ), АТР может реально выступать в качестве возможного модулятора АТР-зависимого К+-канала. Снижение внутриклеточной концентрации АТР под действием разных неблагоприятных факторов может служить сигналом для открытия канала (в зависимости от степени тяжести - мягкое разобщение или превращение канала в неспецифическую пору, через которую могли бы выходить апоптотические факторы). Последнее предположение требует дополнительных исследований.

Прямо противоположный ответ на АТР у дрожжей S. cerevisiae, с одной стороны, и у У. lipolytica и D. magnusii, с другой стороны, может быть объяснен глобальной разницей в способах энергообеспечения этих дрожжей. Первые являются факультативными анаэробами, вторые - дрожжами аэробного типа обмена (D. magpusii - облигатный аэроб), обмен которых полностью зависит от функционирования митохондрий. У факультативных анаэробов снижение внутриклеточного уровня АТР, напротив, будет способствовать закрытию канала, тем самым, обеспечивая возможность перехода на более эффективный - митохондриальный способ запасания энергии.

выводы

1. В митохондриях D. magnusii не индуцируется Са2+/Р„-зависимая, циклоспорин А-чувствительная пора в условиях, способствующих ее открытию в митохондриях животных. В присутствии специфического Са2+ ионофора ЕТН129 имела место активация Са2+/Н+-обмена, зависимого от эндогенных жирных кислот.

2. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий, без образования мегаканала. Разобщающее действие жирных кислот лромотировапось низкими концентрациями мембранофильных катионов. Совместное действие насыщенных жирных кислот и Са2+ не индуцировало открытие поры.

3. Анаэробиоз (гипоксия) не индуцировал повышенную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны D. magnusii. Впервые показана АТР-зависимая энергизация дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза.

4. В митохондриях дрожжей D. magnusii прооксиданты вызывали лишь снижение мембранного потенциала, не зависимое от Са2+, без образования мегаканала. Отмечено ресопрягающее действие АТР при деэнергизации мембраны всеми использованными прооксидантами.

5. В митохондриях D. magnusii показано наличие регулируемого АТР-зависимого К+-канала, закрываемого, как и в митохондриях животных, при добавлении АТР. Прооксиданты (в том числе и мембранофильные катионы, действующие в микромолярных концентрациях как прооксиданты) повторно открывали канал, вызывая высокоамплитудное набухание митохондрий, т. е. превращали специфический К+-АТР-зависимый канал в неспецифическую пору, через которую могли бы выходить апоптотические факторы. Последнее предположение требует дополнительных исследований.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva Т.А., Zyl'kova M.V., Ural'skaya L.A., Popova K.M., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A. «Induction of a non-specific permeability transition in mitochondria from Yarrowia lipofyiica and Dipodascus (Endomyces) magnusii yeasts» J. Bioeners. Biomembr.. 2009, v. 41(3), p. 239-249.

2. Суханова Е.И., Тренделева T.A., Звягильская P.A. «Взаимодействие дрожжевых митохондрий с жирными кислотами и митохондриально-направленными липофильными катионами» Биохимия, 2010, т. 75(2), С. 169-176.

3. Ковалёва М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Попова К.М., Зылькова М.В., Уральская J1.A., Звягильская Р.А. «Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей. Мини-обзор» Биохимия, 2010, т. 75 (3), С. 365-372.

4. Skulachev V.P., Antonenko Y.N., Cherepanov D.A., Chernyak B.V., Khailova L.S., Korshunova G.A., Lyamzaev K.G., Roginsky V.A., Rokitskaya T.I., Severin F.F., Severina I.I., Simonyan R.A., Skulachev M.V., Sumbatian N.V., Sukhanova E.I., Tashlitsky V.N., Trendeleva T.A., Vyssokikh M.Yu., Zvyagilskaya R.A. «Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs). Review» Biochim. Biophvs. Acta.. 2010, v. 1797(6-7), p. 878-889.

Тезисы докладов:

1. Ковалёва M.B., Суханова Е.И., Зылькова М.В., Романовская М.А. «Окислительный стресс и индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipofyiica» Труды Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. академика Н.М. Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты». Тезисы докладов. Москва, 2006, с. 173-174.

2. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Ural'skaya L.A., Guseva E.S. and Zvyagilskaya R.A. «Prooxidant-induced low-conductance channel in mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast» Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC. Short Reports. Moscow, 2006, v. 14, p. 332.

3. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I. «An mPTP-like pore in yeast mitochondria» Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC. Short Reports. Moscow, 2006, v. 14, p. 336.

4. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.T., Uralskaya L.A., Guseva E.S.

«Mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast does not undergo a typical permeability transition (mPTP). Prooxidans induced only a low-conductance channel for H+» 24th Small Meeting on Yeast Transport and Energetics. Program and Abstracts. 2006, p. 38A.

5. Zvyagilskaya R.A., Zyl'kova M.V., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. «Mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in different yeast species is dissimilarly regulated» Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 15th EBEC. Short Reports. Moscow, 2008, p. 32.

6. Zylkova M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva T.A., Kovaleva M.V., Zvyagilskaya R.A. «More on permeability transition in Yarrowia lipolytica mitochondria» Abstr. Ban Intern, Symposium on «Mitochondrial physiology and pathology» JUBMB Sympos. SI. Satellite events of the 33 th FEBS Congress and 11th 1UBMB, Athens. 2008, SC2.38.

7. Зылькова M.B., Ковалева M.B., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин С.А., Звягильская Р.А. «Индукция неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий» Труды 2-го Съезда микологов России с международным участием «Современная микология в России». 2008, т. 2, с. 127-128.

8. Zvyagilskaya R.A., Sukhanova E.I. «Permeability transition in mitochondria from the Endomyces magnusii yeast» The FEBS J. Abstracts of 33th FEBS Congress and ll'h 1UBMB Conference. 2008, p. 266.

9. Zvyagilskaya R.A., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. «Pathways for release of apoptotic factors from yeast mitochondria» The FEBS J. Abstracts of 34th FEBS Congress «life's Molecular Interactions». Prague, Czech Republic, 2009, v. 4-143, p. 229.

10. Звягильская P.A., Суханова Е.И., Тренделева T.A., Леин С.А. «Действие прооксидантов на митохондрии дрожжей» Труды конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Судак, Украина, 2009, с. 25.

11. Trendeleva Т.A., Sukhanova E.I., Zvyagilsklaya R.A. «Effect of fatty acids and mitochondri-targeting lipophilic cations on yeast mitochondria» Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, Short Reports 16,h EBEC. 2010, p. 63-64.

12. Суханова Е.И. Влияние митохондриально-направленных липофильных катионов на дрожжевые митохондрии. XXII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 8-11 февраля 2010. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 88.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты 06-04-49687 и 09-0401238), Программы РАН по клеточной и молекулярной биологии и Института митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Подписано в печать 07 апреля 2011 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 80 экз. Заказ № 266 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суханова, Евгения Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Апоптоз и пути выхода апоптотических факторов из митохондрий.

Глава II. Структура дыхательной цепи дрожжевых митохондрий.

Глава ПЛ. Комплекс 1.

Глава II.2. Комплекс II.

Глава II.3. Комплекс III.

Глава II.4. Комплекс IV.

Глава II. 5. Комплекс V.

Глава II.6. Лактатдегидрогеназы.

Глава II.6.1. Цитохром Ъ2 (L-лактатдегидрогеназа).

Глава II.6.2. D-лактат-ферроцитохром с оксидоредуктаза (Dлактатдегидрогеназа).

Глава II.7. а-глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (FAD-зависимая).

Глава II.8. Альтернативная NADH-дегидрогеназа (NDH-2).

Глава II.9. Альтернативная терминальная оксидаза.

Глава III. Митохондриальные ионные каналы.

Глава III. 1. Ионные каналы внешней митохондриальной мембраны.

Глава III. 1.1. Потенциал-зависимый анионный канал (VDAC).

Глава III. 1.2. Митохондриальный апоптоз-индуцируемый канал.

Глава III. 1.3. Транслоказа внешней мембраны.

Глава III.2. Ионные каналы внутренней митохондриальной мембраны.

Глава III.2.1. Митохондриальные К+-каналы.

Глава III.2.1.1. Митохондриальный АТР-регулируемый калиевый канал (митоКдтр).

Глава IIL2.1.2. Системы транспорта калия в митохондриях дрожжей.

Глава III.2.2. Протонная утечка и «разобщающий» белок (Proton Leak and Uncoupling Protein).

Глава III.2.3. Митохондриальный Са2+ унипортер.

Глава Щ.2.4. Анионные каналы.

Глава Ш.2.5. Са2+-зависимая, циклоспорин А - чувствительная пора (РТР

Permeability Transition Pore).

Глава III.2.5.1. Неспецифическая проницаемость митохондрий дрожжей.

Л . ч

Глава П1.2.6. Са -зависимая циклоспорин А-нечувствительная пора, индуцируемая жирными кислотами.

Глава IV. Ионы «Скулачёва».'.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 1. Материалы и методы исследования.

Глава 1.1. Реагенты.

Глава 1.2. Организм.

Глава 1.3. Условия выращивания.

Глава 1.4. Выделение митохондрий из дрожжей D. magnusii.

Глава 1.5. Аналитические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. В митохондриях дрожжей D. magnusii не индуцируется классическая» Са2+/Рн- зависимая, циклоспорин А-чувствительная пора.

Глава 2. В митохондриях дрожжей D. magnusii не индуцируется

Са2+/пальмитат-зависимая пора.

Глава 3. Анаэробиоз не индуцировал повышенную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны дрожжей D. magnusii. Впервые показана АТР-зависимая энергизация дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза.

Глава 4. Изучение влияние прооксидантов на митохондрии дрожжей

D. magnusii.

Глава 5. Митохондриальный АТР - зависимый калиевый канал в митохондриях дрожжей!), magnusii.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii"

Актуальность проблемы. Митохондрии в клетках высших эукариот, помимо их известной роли в энергизации клетки и общем клеточном обмене, играют решающую роль в выборе клетки между жизнью и смертью (апоптозом). Апоптоз - это генетически запрограммированный, четко отрегулированный, высококоординированный механизм гибели клеток, направленный на удаление невостребованных, поврежденных, инфицированных, ослабленных, закончивших свой жизненный цикл, потенциально опасных клеток. Согласно рекомендации Номенклатурной комиссии по клеточной гибели (2009), этот вид клеточной смерти отличается от других (некроз, аутофагия, митотическая катастрофа) набором характерных морфологических и биохимических признаков. Интерес к апоптозу огромен, поскольку, по крайней мере в клетках животных, он выполняет множество функций, от созидательных (морфогенез, онтогенез, антираковая защита и т. д.) до разрушительных (сепсис, инфаркт миокарда, инсульт, нейродегенеративные заболевания и т. д.).

До относительно недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь высшим многоклеточным, поскольку считалось, что одноклеточные организмы не имеют в своем геноме генов, аналогичных тем, которые кодируют апоптотические факторы многоклеточных и поскольку существовал скептицизм относительно физиологической целесообразности и эволюционных преимуществ апоптоза у одноклеточных, в том числе и дрожжей. Однако сейчас установлено, что дрожжи в природе живут в виде сообществ (колонии, биопленки). Известны вещества (ароматические спирты), ответственные за коммуникацию клеток. Описаны многочисленные случаи гибели (в основном исследования проводились на дрожжах 5. сегеушае) по механизму апоптоза под действием различных неблагоприятных внешних факторов и внутриклеточных дефектов. Выявлен ряд апоптотических факторов, некоторые из которых (эндонуклеаза С, цитохром с, белок, подобный протеазе ШгА) локализованы, как и в митохондриях животных, в межмембранном пространстве и выход которых при повреждении внешней мембраны означает начало необратимой стадии апоптоза, приводящей в конечном итоге к гибели клетки. Однако вопрос - каким образом осуществляется выход апоптотических факторов из дрожжевых митохондрий до недавнего времени не имел ответа. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов из межмембранного пространства. Один из них включает в себя активацшо, конформационную перестройку, встраивание во внешнюю мембрану митохондрий и димеризацию проапоптотического белка В ах, члена семейства белков Вс1-2, в результате чего образуется пора (Sheridan et al., 2008; Yamaguchi et al., 2008). Другим механизмом выхода апоптотических факторов из митохондрий является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия ряда пор во внутренней митохондриальной мембране:

2) ЦсА-нечувствительной небелковой поры, образующейся при одновременном добавлении к митохондриям Са2+ и насыщенных жирных кислот и отличающейся от классической Са2+/Р„-зависимой поры отсутствием специфичности по отношению к дивалентным катионам и способностью спонтанно закрываться (Mironova et al., 2001; Sultan and Sokolove, 2001a и б);

3) ЦсА-чувствительной поры, индуцируемой высокими концентрациями неорганического фосфата при кислых значениях рН (Kristian et al., 2001);

4) поры, открываемой в митохондриях животных (и растений) в условиях анаэробиоза (Chavez et al., 1997; Kuzminova et al., 1998; Virolainen et al., 2002).

Дрожжевые клетки лишены белков семейства Вс1-2 (в геноме не найдены гены, кодирующие эти белки). Практически ничего не известно об участии структурной реорганизации крист в выходе апоптотических факторов из митохондрий. Информация же о возможности индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий до сих пор фрагментарна и противоречива. Известно лишь, что митохондрии S. cerevisiae содержат неспецифическую пору (канал) (Prieto et al., 1992; 1995; 1996; Roucou et al., 1997; Manon et al., 1998; Manon and Guerin, 1998; Gutiérrez-Aguilar et al., 2007), закрываемую при дефиците ATP. Она имеет примерно те же размеры (Manon and Guerin, 1998), что и неспецифическая, Са2+/Р„-зависимая, ЦсА-чувствительная пора млекопитающих и ей приписываются те же функции. В последнее время в нашей лаборатории было показано, что в митохондриях дрожжей Dipodascus (ранее Endomyces) magnusii не индуцируется Са2+/Р„ -зависимая, ЦсА-чувствительная пора (Дерябина и др., 2004), а митохондрии Yarrowia lipolytica лишены всех Са2+-зависимых пор (Kovaleva et al., 2009; Ковалева и др., 2010).

Цель работы. Работа направлена на поиск условий индукции неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Dipodascus magnusii. Выбор объекта исследования не случаен. Дрожжи D. magnusii, в отличие от дрожжей S. cerevisiae, характеризуются ярко выраженным аэробным типом обмена, содержат многочисленные хорошо структурированные митохондрии и полноценную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического обмена, напоминающую по своей структуре дыхательную цепь млекопитающих.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать возможность индукции: а) классической Са2+-фосфат-зависимой, ЦсА-чувствительной поры; б) ЦсА-нечувствительной поры, индуцируемой низкими концентрациями Са2+ и жирных кислот; в) поры, индуцируемой анаэробиозом; г) поры, запускаемой окислительным стрессом;

2. Исследовать возможность функционирования АТР-зависимого К+-канала;

Научная новизна. На прочно-сопряженных митохондриях дрожжей D. magnusii впервые проверены все условия индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, известные для митохондрий животных. Показано, что в митохондриях D. magnusii не индуцируется ни Са2+-фосфат-зависимая, циклоспорин А-чувствительная пора, ни циклоспорин А-нечувствительная пора, открываемая в митохондриях животных при одновременном добавлении Са и жирных кислот. В отличие от митохондрий животных и растений, анаэробиоз не индуцировал повышенную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны дрожжей D. magnusii. Впервые показана АТР-зависимая энергизация дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза. Прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствии Са2+ ионофора) -вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий дрожжей D. magnusii, без образования мегаканала. Обнаружено «ресопрягающее» действие АТР. Доказано наличие в митохондриях D. magnusii регулируемого К+-АТР-зависимого канала, закрываемого, как и в митохондриях животных (и в митохондриях дрожжей Y. lipolytica) при добавлении АТР. В условиях окислительного стресса селективный К+-АТР-зависимый канал может превращаться в неспецифическую пору.

Практическое значение работы. Обнаруженное нами сходство АТР-зависимого К+-канала (митоКАтр) митохондрий животных и дрожжей D. magnusii позволяет рассматривать дрожжевые митохондрии в качестве перспективной модели для изучения структуры и регуляции активности митоКатр, которому в настоящее время отводится важная роль в защите миокарда от последствий ишемии и для поиска новых «открывателей» канала.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Суханова, Евгения Ивановна

выводы

1. В митохондриях D. magnusii не индуцируется Са2+/Рн-зависимая, циклоспорин А-чувствительная пора в условиях, способствующих ее открытию в митохондриях животных. В присутствии специфического Са2+ ионофора ЕТН129 имела место активация Са2+/Н+-обмена, зависимого от эндогенных жирных кислот.

2. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий, без образования мегаканала. Разобщающее действие жирных кислот промотировалось низкими концентрациями мембранофильных катионов. Совместное действие насыщенных жирных кислот и Са2+ не индуцировало открытие поры.

5. В митохондриях D. magnusii показано наличие регулируемого АТР-зависимого К+-каиала, закрываемого, как и в митохондриях животных, при добавлении АТР. Прооксиданты (в том числе и мембранофильные катионы, действующие в микромолярных концентрациях как прооксиданты) повторно открывали канал, вызывая высокоамплитудное набухание митохондрий, т.е. превращали специфический К+-АТР-зависимый канал в неспецифическую пору, через которую могли бы выходить апоптотические факторы. Последнее предположение требует дополнительных исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До относительно недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь высшим многоклеточным, поскольку считалось, что одноклеточные организмы не имеют в геноме генов, аналогичных тем, которые кодируют апоптотические факторы многоклеточных, и поскольку был непонятен смысл альтруистической смерти одноклеточных организмов, в том числе и дрожжей. Сейчас уже ясно, что природные микроорганизмы, в том числе и дрожжи, в природе живут в многоклеточных сообществах (биопленки, колонии) (Webb et al., 2003; Palkova et al., 2009; Vachova et al., 2009a и б) и подвергаются подобию дифференциации, связанной с апоптозом. Описаны и механизмы (образование ароматических спиртов, аммиака), способствующие социальному взаимодействию между клетками дрожжей. Получены многочисленные доказательства смерти дрожжевых клеток по механизму апоптоза, обусловленного внутриклеточными дефектами и разными внешними стимулами (см. Almeida et al., 2007; 2008; Eisenberg et al., 2007; Madeo and Fröhlich, 2008; Schmitt and Reiter, 2008; Severin et al., 2008). Показана важнейшая роль митохондрий в проведении апоптогенного сигнала. Получены указания на то, что программа апоптоза дрожжей и животных может иметь общие элементы, поскольку экспрессия проапоптотического белка млекопитающих Вах индуцировала апоптоз не только в дрожжах Saccharomyces cerevisiae (Hanada et al., 1995; Greenhalf et al., 1996; Priault et al., 2003; Manon, 2004), но и в Schizosaccharomyces pombe (Ink et al., 1997; Jurgensmeier et al., 1997), Pichia pastoris (Martinet et al., 1999), Kluyveromyces lactis (Poliakova et al., 2002) и Candida albicans (De Smet et al., 2004). Выявлен ряд апоптотических факторов, некоторые из которых (эндонуклеаза G, цитохром с, белок, подобный протеазе HtrA) локализованы, как и в митохондриях животных, в межмембранном пространстве и выход которых при повреждении внешней мембраны означает начало необратимой стадии апоптоза, приводящей в конечном итоге к гибели клетки. Однако вопрос — каким образом осуществляется выход этих и других апоптотических факторов из дрожжевых митохондрий до недавнего времени не имел ответа. Дрожжи не имеют в своем геноме генов, кодирующих белки типа Вах, а информация об индукции неспецифической проницаемости была фрагментарна и противоречива.

Поэтому, в соответствии с основной целью исследования, с помощью стандартных тестов (измерения величины мембранного потенциала, скорости дыхания, набухания) мы исследовали возможность индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей D. magnusii.

Выбор объекта исследования был не случаен. В отличие от S. cerevisiae, клетки D. magnusii обладают ярко выраженным аэробным типом обмена и содержат крупные ветвящиеся митохондрии, что значительно облегчает их выявление в клетке с помощью флуоресцентных красителей и делает их удобной моделью для прослеживания проведения апоптотического сигнала на уровне митохондрий. Именно с D. magnusii связаны первые указания на то, что дрожжевые митохондрии могут содержать полноценную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического сопряжения (Котельникова и Звягильская, 1963; 1973; Kotelnikova and Zvjagilskaya, 1965; Zvyagilskaya and Kotelnikova, 1989; Звягильская и Котельникова, 1991); D. magnusii -это первый и до сих пор единственный вид дрожжей, для которого было описано функционирование эффективных, регулируемых природными модуляторами, независимых митохондриальных систем для поглощения и выхода Са2+ (Votyakova et al., 1990; 1993; Дерябина и др., 1996; Баженова и др., 1997; Bazhenova et al., 1998а и б; Дерябина и Звягильская, 2000; Дерябина и др., 2000; Deryabina et al., 2001; Дерябина и др., 2004). Инвариантное функционирование всех трех пунктов энергетического сопряжения, отсутствие в норме альтернативных путей окисления позволяет выделять их них прочно-сопряженные и супер-сопряженные митохондрии.

В соответствии с задачами исследования, мы проверили на прочно-сопряженных митохондриях D. magnusii практически все условия, известные как вызывающие индукцию увеличенной проницаемости митохондрий животных (и растений), а именно - разные концентрации Са2+ в комбинации с неорганическим фосфатом (Р„), жирными кислотами, прооксидантами, ингибиторами ТАН, а также истощение внутримитохондриального пула адениновых нуклеотидов и деэнергизация митохондрий, влияние высоких концентраций фосфата при кислых значениях рН, анаэробиоз. Совокупность полученных данных позволила сделать вывод, что в митохондриях дрожжей D. magnusii не индуцируется классическая Са2+/Рн -зависимая циклоспорин А-чувствительная пора в условиях, способствующих ее открытию в митохондриях животных (в присутствии низких концентраций ЭГТА, прооксидантов, при деэнергизации митохондрий или истощении пула митохондриальных нуклеотидов, в присутствии высоких концентраций фосфата на фоне сниженного значения рН). В присутствии специфического Са ионофора ЕТН129 имела место активация Са2+/Н+-обмена, зависимого от эндогенных жирных кислот, деполяризация частично снималась добавлением АТР и неорганического фосфата, который, как известно, потенциирует открытие Са2+-зависимой поры в митохондриях животных. Был сделан вывод о том, что наличие регулируемых систем транспорта Са2+ еще не является основанием для индукции Са2+ -зависимой поры и что способы (механизмы) регуляции повышенной неспецифической проницаемости у митохондрий животных и дрожжей существенно различаются.

Была исследована возможность индукции в митохондриях дрожжей D. magnusii поры, нечувствительной к действию циклоспорина А, открываемой в митохондриях животных при одновременном добавлении низких концентраций Са2+ и жирных кислот. Поскольку действие жирных кислот на митохондрии D. magnusii практически не исследовалось, мы восполнили этот пробел. Было найдено, что, как и в митохондриях животных, жирные кислоты (насыщенные и ненасыщенные) вызывали разобщение дрожжевых митохондрий, но, в отличие от митохондрий животных, совместное добавление жирных кислот и Са2+ (в присутствии Са2+ ионофора ЕТН129) не индуцировало образования мегаканала. Разобщающее действие жирных кислот промотировалось добавлением мембранофильных катионов — производных SkQ (SkQl, С12ТРР, SkQ3 и MitoQ), которые в зависимости от использованных концентраций оказывали разобщающее, ингибирующее, антиоксидантное, прооксидантное и детергентное действие. Потенциирующим действием обладали лишь мембранофильные катионы с делокализованным зарядом. Есть основания полагать, что само разобщающее действие мембранофильных катионов может быть обусловлено в значительной мере их взаимодействием с эндогенным пулом жирных кислот. Полученные данные указывают на правомерность и целесообразность использования дрожжевых митохондрий при изучении механизма действия митохондриально-направленных липофильных катионов.

Мы проверили возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны митохондрий D. magnusii в условиях анаэробиоза (гипоксии). Нам не удалось индуцировать повышенную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны дрожжей D. magnusii в состоянии анаэробиоза (гипоксии), что была характерно для митохондрий растений. Впервые показана АТР-зависимая энергизация дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза.

Впервые было детально исследовано влияние прооксидантов на энергетические параметры дрожжевых митохондрий, а также изучена возможность индукции поры в дрожжевых митохондриях в условиях окислительного стресса. Показано, что в митохондриях дрожжей D. magnusii прооксиданты: менадион, оксалоацетат и фениларсиноксид, как совместно, так и по отдельности; пероксид водорода и t-бутилпероксид, - вызывали снижение мембранного потенциала, не увеличивающееся, в отличие от митохондрий животных, от добавления умеренных концентраций Са2+. Снижение мембранного потенциала, вызванное прооксидантами, предотвращалось добавлением антиоксидантов, а также АТР (показано впервые!), в меньшей степени -других нуклеотидов. Интересно, что ресопрягающее действие АТР проявлялось даже в тех случаях (например, при добавлении высоких концентраций фениларсиноксида), когда классический водорастворимый антиоксидант N-ацетилцистеин был «бессилен». Ресопрягающее действие АТР снималось и предотвращалось Mg2+, атрактилозидом и бонгкрековой кислотой - ингибиторами транслоказы адениновых нуклеотидов. Есть основания полагать, что АТР в митохондриях дрожжей D. magnusii является универсальным «ресопрягающим» агентом и это может быть связано с фиксацией в присутствии АТР такой конформации транслоказы адениновых нуклеотидов, которая менее чувствительна или совсем нечувствительна к действию прооксидантов (например, в результате экранирования одной или двух SH-rpynn).

В митохондриях D. magnusii нами показано наличие регулируемого К+-АТР-зависимого канала, закрываемого, как и в митохондриях животных, при добавлении АТР. Ингибирующий эффект АТР частично снимался Mg2+ и неорганическим фосфатом. Канал оказался селективным по отношению к ионам К+, т.к. другие одновалентные катионы не индуцировали открытие канала. К+-канал закрывался только АТР, но не другими нуклеотидами. Поскольку «открыватели» и «закрыватели» К+-АТР-зависимого канала митохондрий животных оказывали такое же действие и на митохондрии дрожжей, причем в концентрациях, сопоставимых с теми, что действовали на митохондрии животных, был сделан вывод о том, что митохондрии D. magnusii содержат К+-АТР-зависимый регулируемый канал «животного типа». Напомним, что канал подобного типа был обнаружен ранее в нашей лаборатории в митохондриях облигатного аэроба Y. lipolytica (Kovaleva et al., 2009; Ковалева и др., 2010), поэтому есть основания полагать, что это может быть общим свойством митохондрий дрожжей аэробного типа обмена.

Прямо противоположный ответ на АТР у дрожжей S. cerevisiae, с одной стороны, и у Y. lipolytica и D. magnusii, с другой стороны, может быть объяснен глобальной разницей в способах энергообеспечения этих дрожжей. Первые являются факультативными анаэробами, вторые - дрожжами аэробного типа обмена, обмен которых полностью зависит от функционирования митохондрий. В «нормальных» условиях АТР-зависимый К+-канал митохондрий дрожжей аэробного типа обмена, ингибируемый микромолярными концентрациями АТР, должен находиться в закрытом состоянии. Однако снижение внутриклеточной концентрации АТР под действием разных неблагоприятных факторов (окислительного стресса, в частности) может служить сигналом для приоткрытая канала, что будет эквивалентно «мягкому» разобщению и, в конечном итоге, борьбе с окислительным стрессом. У факультативных анаэробов снижение внутриклеточного уровня АТР, напротив, будет способствовать закрытию канала, тем самым, обеспечивая возможность перехода на более эффективный - митохондриальный способ запасания энергии.

Наконец, нами получены новые сведения о способности прооксидантов (в том числе и мембранофильных катионов, действующих в микромолярных концентрациях как прооксиданты) повторно открывать канал дрожжей D. magnusii, вызывая высокоамплитудное набухание митохондрий, т.е. превращать специфический К+-АТР-зависимый канал в неспецифическую пору, через которую могли бы выходить апоптотические факторы. Последнее предположение требует дополнительных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суханова, Евгения Ивановна, Москва

1. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков A.A. (2005) Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия, 70: 246-264.

2. Баженова E.H., Дерябина Ю.И., Звягильская P.A. (1997) Стимулирующее действие АДФ на систему транспорта ионов кальция митохондрий дрожжей. ДАН СССР, 353: 13.

3. Бакеева Л.Е., Барсков И.В., Егоров М.В., Исаев Н.К., Капелько В.И., Казаченко A.B., Кирпатовский В.И., Козловский C.B., Лакомкин В.Л., Левина C.B., Писаренко О.И., Плотников Е.Ю., Сапрунова В.Б., Серебрякова Л.И., Скулачев М.В., Стельмашук

4. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Миронова Г.Д. (2005) Возможный механизм образования и регуляции пальмитат-индуцируемой циклоспорин А-нечувствительной митохондриальной поры. Биохимия, 70 (7): 815-821.

5. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Миронова Г.Д. (2008) Роль митохондриальной пальмитат/Са2+-активируемой поры в пальмитат-индуцируемом апоптозе. Биофизика,.53 (6): 967-971.

6. Белослудцева Н.В., Белослудцев К.Н., Агафонов А.В., Миронова Г.Д. (2009) Влияние холестерина на образование пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях и липосомах. Биофизика, 54 (3): 464-470.

7. Грабельных О.И. (2005) Энергетические функции митохондрий растений в стрессовых условиях. J. Stress Physio & Biochemistry, 1: 37-54.

8. Гриценко Е.Н., Катушенко В.П., Сарис Н.Е., Вахлстен М., Жокела Ж., Миронова Г.Д. (2010) Очистка митохондриального кальциевого унипортера из сердца быка и характеристика его свойств. Биофизика, 55 (5): 803-808.

9. Дедов В.Н., Демин О.В., Черняк В.Ю., Черняк Б.В. (1999) Индукция неселективной проницаемости внутренней мембраны в деэнергизованных митохондриях. Биохимия, 64 (7): 809-816.

10. Дерябина Ю.И., Баженова Е.Н., Звягильская Р.А. (1996) Регуляция транспорта ионов кальция в митохондриях дрожжей Endomyces magnusii. Биохимия, 61 (9): 17041713.

11. Дерябина Ю.И. и Звягильская Р.А. (2000) Са2+-транспортирующая система митохондрий дрожжей Endomyces magnusii: независимые пути для поглощения и выхода иона. Биохимия, 65: 607-1611.

12. Дерябина Ю.И., Баженова Е.Н., Звягильская Р.А. (2000) Пути выхода ионов кальция из митохондрий дрожжей Endomyces magnusii. Биохимия, 65 (10): 1380-1388.

13. Дерябина Ю.И., Исакова Е.П., Шурубор Е.И., Звягильская Р.А. (2004) Кальций-зависимая неспецифическая проницаемость внутренней митохондриальной мембраны не индуцируется в митохондриях дрожжей Endomyces magnusii. Биохимия, 69: 1261

14. Звягильская P.A., Зеленщикова В.А., Уральская Л.А., Котельникова A.B. (1981) Изучение дыхательной системы Endomyces magnusii. Свойства митохондрий из клеток, выращенных на глицерине. Биохимия, 46 (1): 3-10.

15. Звягильская P.A., Лейкин Ю.Н., Кожокару Н.Л., Котельникова A.B. (1983) Транспорт ионов кальция дрожжевыми митохондриями. ДАН СССР, 269: 1238-1240.

16. Звягильская P.A. и Котельникова A.B. (1991) Структура и функциональная активность дрожжевых митохондрий (монография). М.: ВИНИТИ, сер. Биол. Хим., Т. 36, 172 сс.

17. Звягильская P.A. (1995) Митохондрии дрожжей: отличительные свойства, вклад в решение общих проблем биоэнергетики (обзор). Прикл. биохим. микробиолог., Т. 31, N.I., с. 50-60.

18. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Архангельская A.A., Хряпенкова Т.Г. (2007) Митохондрия как двуликий янус. Биохимия, 72 (10): 1371-1394.

19. Ковалёва М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Попова K.M., Зылькова М.В., Уральская Л.А., Звягильская P.A. (2010) Мини-обзор. Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей. Биохимия, 75 (3): 365-372.

20. Котельникова A.B. и Звягильская P.A. (1963) Окислительное фосфорилирование в субклеточных препаратах из дрожжей Endomyces magnusii. Биохимия, 28 (3): 879-887.

21. Котельникова A.B. и Звягильская P.A. (1973) Биохимия дрожжевых митохондрий (монография). Наука, М., 239 сс.

22. Лейкин Ю.Н., Вотякова Т.В., Баженова E.H., Звягильская P.A., Котельникова A.B. (1987) Взаимодействие ионов кальция с митохондриями дрожжей Endomyces magnusii. Биохимия, 52: 676-682.

23. Мейсель М.Н. Функциональная морфология дрожжевых организмов. (1950) М.-Л. Из-во АН СССР., 368 сс.

24. Миронова Г.Д., Федотчева Ii.И., Макаров П.Р., Проневич Л.А., Миронов Г.П. (1981) Белок из митохондрий сердца быка индуцирует проводимость калиевого канала в билипидных мембранах. Биофизика, 26 (3): 451-457.

25. Миронова Г.Д., Качаева Е.В., Копылов А.Т. (2007) Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал. I. Структура канала, механизм его функционирования и регуляция. Вестник РАМН, 2: 44-50.

26. Мохова Е.Н. и Хайлова JI.C. (2005) Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот. Биохимия, 70: 197202.

27. Самарцев В.Н., Кожина О.В., Рыбакова С.Р. (2010) Зависимость разобщающего действия пальмитиновой кислоты в митохондриях печени от массы тела крыс разного возраста. Ж. Эволюц. Биохим. физиол., 46 (2): 164-166.

28. Скулачев В.П. (2007) Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «Мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы. Биохимия, 72: 1700-1714.

29. Фихман Б.А. и Заичкин Э.И. (1972) Микробиология, 41: 168.

30. Хайлова и др. Персональное сообщение.

31. Abdrakhmanova A., Zickermann V., Bostina M., Radermacher M., Schagger H., Kerscher S., Brandt U. (2004) Subunit composition of mitochondrial complex I from the yeast Yarrowia lipolytica. Biochim. Biophys. Acta, 1658: 148-156.

32. Akerman K.E. and Wikstrom M.K. (1976) Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. FEBS Lett., 68: 191-197.

33. Albury M.S., Elliott C., Moore A.L. (2009) Towards a structural elucidation of the alternative oxidase in plants. Physiologia Plantarum, 137 (4): 316-327.

34. Al-Dhaheri R.S. and Douglas L.J. (2010) Apoptosis in Candida biofilms exposed to amphotericin B. J. Med. Microbiol., 59 (Pt 2): 149-157.

35. Almeida B., Buttner S., Ohlmeier S., Silva A., Mesquita A., Sampaio-Marques B., Osório N.S., Kollau A., Mayer B., Leao C., Laranjinha J., Rodrigues F., Madeo F., Ludovico P.2007) NO-mediated apoptosis in yeast. J. Cell. Sci., 120 (Pt 18): 3279-3288.

36. Almeida B., Silva A., Mesquita A., Sampaio-Marques B., Rodrigues F., Ludovico P.2008) Drug-induced apoptosis in yeast. Biochim. Biophys. Acta, 1783: 1436-1448. Antonsson B., Conti F., Ciavatta A., Montessuit S., Lewis S. et al. (1997) Inhibition of

37. Bax channel-forming activity by Bcl-2. Science, 277: 370-372.

38. Aoshima H., Kadoya K., Taniguchi H., Satoh T., Hatanaka H. (1999) Generation of free radicals during the death of Saccharomyces cerevisiae caused by lipid hydroperoxide. Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (6): 1025-1031.

39. Arcangioli B. and Ben.Hassine S. (2009) Unrepaired oxidative DNA damage induces an ATR/ATM apoptotic-like response in quiescent fission yeast. Cell Cycle, 8 (15): 2326-2331.

40. Ardehali H. (2005) Cytoprotective channels in mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 37 (3): 171-177.

41. Asimakis G.K. and Sordahl L.A. (1981) Intramitochondrial adenine nucleotides and energy-linked functions of heart mitochondria. Am. J. Physiol., 241 (5): H672-678.

42. Baeza M.E., Sanhueza M.A., Cifuentes V.H. (2008) Occurrence of killer yeast strains in industrial and clinical yeast isolates. Biol. Res., 41 (2): 173-182.

43. Bajgar R., Seetharaman S., Kowaltowski A.J., Garlid K.D., Paucek P. (2001) Identification and properties of a novel intracellular (mitochondrial) ATP-sensitive potassium channel in brain. J. Biol. Chem., 276 (36): 33369-33374.

44. Balcavage W.X., Lyoyd J.L., Mattoon J.R., Ohnishi T. and Scarpa A. (1973) Cation movements and respiratory response in yeast mitochondria treated with high Ca2+ concentrations. Biochim. Biophys. Acta, 305: 41-51.

45. Bazhenova E.N., Deryabina Y.I., Eriksson O., Zvyagilskaya R.A., Saris N.E. (1998a) Characterization of a high capacity calcium transport system in mitochondria of the yeast Endomyces magnusii. J. Biol Chem., 20 (273): 4372-4377.

46. Bazhenova E.N., Saris N-E., Pentilla T., Zvyagilskaya R.A. (19986) Stimulation of the mitochondrial calcium uniporter by hypotonicity and ruthenium red. Biochim. Biophys. Acta, 1371: 96-100.

47. Beavis A.D. (1989) On the inhibition of the mitochondrial inner membrane anion uniporter by cationic amphiphiles and other drugs. J. Biol. Chem., 264: 1508-1515.

48. Beavis A.D. (1992) Properties of the inner membrane anion channel in intact mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 24: 77-90.

49. Beavis A.D. and Powers M. (2004) Temperature dependence of the mitochondrial inner membrane anion channel: the relationship between temperature and inhibition by magnesium. J. Biol. Chem., 279: 4045-4050.

50. Bednarczyk P., Kicinska A., Kominkova V., Ondrias K., Dolowy K., Szewczyk A. (2004) Quinine inhibits mitochondrial ATP-regulated potassium channel from bovine heart. J. Membr. Biol., 199: 63-72.

51. Bednarczyk P., Dolowy K., Szewczyk A. (2005) Matrix Mg2+ regulates mitochondrial ATP-dependent potassium channel from heart. FEBS Lett., 579: 1625-1632.

52. Bednarczyk P., Barker G.D., Halestrap A.P. (2008a) Determination of the rate of K+ movement through potassium channels in isolated rat heart and liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1777: 540-548.

53. Bednarczyk P., Dolowy K., Szewczyk A. (20086) New properties of mitochondrial ATP-regulated potassium channels. J. Bioenerg. Biomembr., 40: 325-335.

54. Bednarczyk P. (2009) Potassium channels in brain mitochondria. REVIEW. Acta Biochim. Pol., 56 (3): 385-392.

55. Bernardi P., Krauskopf A., Basso E., Petronilli V., Blachly-Dyson E., Di Lisa F., Forte M.A. (2006) The mitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target. FEBS J., 273: 2077-2099.

56. Bogucka K. and Wojtczak L. (1971) Intramitochondrial distribution of magnesium. Biochem. Biophys. Res. Commun., 44 (6): 1330-1337.

57. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: 248254.

58. Bradshaw P.C., Jung D.W., Pfeiffer D.R. (2001) Free Fatty Acids Activate a Vigorous Ca2+:2H+ Antiport Activity in Yeast Mitochondria. J. Biol. Chem., 276: 40502-40509.

59. Brand M.D., Chien L.F., Ainscow E.K., Rolfe D.F., Porter R.K. (1994) The causes and functions of mitochondrial proton leak. Biochim. Biophys. Acta, 1187: 132-139.

60. Braun R.J., Zischka H., Madeo F., Eisenberg T., Wissing S., Büttner S., Engelhardt S.M., Biiringer D., Ueffmg M. (2006) Crucial mitochondrial impairment upon CDC48 mutation in apoptotic yeast. J. Biol. Chem., 281 (35): 25757-25767.

61. Büttner S., Eisenberg T., Carmona-Gutierrez D., Ruli D., Knauer H., Ruckenstuhl C., Sigrist C., Wissing S-, Kollroser M., Fröhlich K.U., Sigrist S., Madeo F. (2007) Endonuclease G regulates budding yeast life and death. Mol. Cell., 25: 233-246.

62. Cancherini D.V., Trabuco L.G., Reboucas N.A., Kowaltowski AJ. (2003) ATP-sensitive K+ channels in renal mitochondria. Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 285: F1291-F1296.

63. Capano M. and Crompton M. (2002) Biphasic translocation of Bax to mitochondria. Biochem. J., 367: 169-178.

64. Carafoli E. (1987) Intracellular calcium homeostasis. Ann. Rev. Biochem., 56: 395-433.

65. Castrejón V., Peña A., Uribe S. (2002) Closure of the yeast mitochondria unspecific channel (YMUC) unmasks a Mg2+ and quinine sensitive K+ uptake pathway in Saccharomyces cerevisiae. J. Bioenerg. Biomembr., 34 (4): 299-306.

66. Chahomchuen T., Akiyama K., Sekito T., Sugimoto N., Okabe M., Nishimoto S., Sugahara T., Kakinuma Y. (2009) Tributyltin induces Ycalp-dependent cell death of yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Toxicol. Sei., 34 (5): 541-545.

67. Chance B. and Williams G.R. (1955) A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature, 175 (4469): 1120-1121.

68. Chavez E., Moreno-Sánchez R., Zazueta C., Rodriguez J.S., Bravo C., Reyes-Vivas H. (1997) On the protection by inorganic phosphate of calcium-induced membrane permeability transition. J. Bioenerg. Biomembr., 29 (6): 571-577.

69. Cheng W.C., Leach K.M., Hardwick J.M. (2008) Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Review. Biochim. Biophys. Acta, 1783 (7): 1272-1279.

70. Chernyak B.V., Dedov V.N., Chernyak V.Ya. (1995) Ca(2+)-triggered membrane permeability transition in deenergized mitochondria from rat liver. FEBS Lett., 365 (1): 75-78.

71. Chernyak B.V. and Bernardi P. (1996) The mitochondrial permeability transition pore is modulated by oxidative agents through both pyridine nucleotides and glutathione at two separate sites. Eur. J. Biochem., 238 (3): 623-630.

72. Chernyak B.V. (1997a) Cyclosporin A-sensitive release of Ca2+ from mitochondria in intact thymocytes. FEBS Lett., 418(1-2): 131-134.

73. Chernyak B.V. (19976) Redox regulation of the mitochondrial permeability transition pore. Biosci. Rep., 17 (3): 293-302.

74. Circu M.L. and Aw T.Y. (2008) Glutathione and apoptosis. Free Radic. Res., 42 (8): 689706.

75. Colin J., Garibal J., Mignotte B., Guenal I. (2009) The mitochondrial TOM complex modulates bax-induced apoptosis in Drosophila. Biochem. Biophys. Res. Commun., 379: 931943.

76. Costa A.D. and Garlid K.D. (2008) Intramitochondrial signaling: interactions among mitoKATP, PKCepsilon, ROS, and MPT. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol., 295 (2): H874-882.

77. Costa A.D. and Krieger M.A. (2009) Evidence for an ATP-sensitive K(+) channel in mitoplasts isolated from Trypanosoma cruzi and Crithidia fasciculate. Int. J. Parasitol., 39 (9): 955-961.

78. Costantini P., Chernyak B.V., Petronilli V., Bernardi P. (1995) Selective inhibition of the mitochondrial permeability transition pore at the oxidation-reduction sensitive dithiol by monobromobimane. FEBS Lett., 362 (2): 239-242.

79. Covian R. and Trumpowera B.L. (2008) Regulatory interactions in the dimeric cytochrome bcl complex: The advantages of being a twin. Biochim. Biophys. Acta, 1777 (9): 1079-1091.

80. Cymerman I.A., Chung I., Beckmann B.M., Bujnicki J.M., Meiss G. (2008) EXOG, a novel paralog of Endonuclease G in higher eukaryotes. Nucleic Acids Res., 36: 1369-1379.

81. Daff S., Manson F.D., Reid G.A., Chapman S.K. (1994) Strategic manipulation of the substrate specificity of Saccharomyces cerevisiae flavocytochrome b2. Biochem. J., 301 (Pt 3): 829-834.

82. Dahlem Y.A., Horn T.F., Buntinas L., Gonoi T., Wolf G., Siemen D. (2004) The human mitochondrial KATP channel is modulated by calcium and nitric oxide: a patchclamp approach. Biochim. Biophys. Acta, 1656: 46-56.

83. Dahlem Y.A., Wolf G., Siemen D., Horn T.F. (2006) Combined modulation of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel and the permeability transition pore causes prolongation of the biphasic calcium dynamics. Cell Calcium., 39: 387-400.

84. Dai B.D., Cao Y.Y., Huang S„ Xu Y.G., Gao P.H., Wang Y„ Jiang Y.Y. (2009) Baicalein induces programmed cell death in Candida albicans. J. Microbiol. Biotechnol., 19 (8): 803809.

85. De Pablo M., Susin S., Jacotot E., Larocette N., Costantini P., Ravagnan L., Zamzani N. and Kroemer G. (1999) Palmitate induces apoptosis via a direct effect on mitochondria. Apoptosis, 4: 81-87.

86. De Smet K., Eberhardt I., Reekmans R., Contreras R. (2004) Bax-induced cell death in Candida albicans. Yeast, 21: 1325-1334.

87. Debska G., May R., Kicinska A., Szewczyk A., Elger C.E., Kunz W.S. (2001) Potassium channel openers depolarize hippocampal mitochondria. Brain Res., 892: 42-50.

88. Debska G., Kicinska A., Skalska J., Szewczyk A., May R., Elger C.E., Kunz W.S. (2002) Opening of potassium channels modulates mitochondrial function in rat skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta, 1556 (2-3): 97-105.

89. Dejean L.M., Martinez-Caballero S., Kinnally K.W. (2006) Is MAC the knife that cuts cytochrome c from mitochondria during apoptosis? Cell Death Differ., 13: 1387-1395.

90. Del Carratore R., Delia Croce C., Simili M., Taccini E., Scavuzzo M„ Sbrana S. (2002) Cell cycle and morphological alterations as indicative of apoptosis promoted by UV irradiation in S. cerevisiae. Mutat. Res., 513 (1-2): 183-191.

91. Denton R.M. (2009) Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim. Biophys. Acta, 1787 (11): 1309-1316.

92. Deryabina Y.I., Bazhcnova E.N., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A. (2001) Ca(2+) efflux in mitochondria from the yeast Endomyces magnusii. J. Biol. Chem., 276: 47801-47806.

93. Devenish R.J., Prescolt M., Boyle G.M., Nagley P. (2000) The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J. Bioenerg. Biomembr., 32 (5): 507-515.

94. Du L., Su Y., Sun D., Zhu W., Wang J., Zhuang X., Zhou S., Lu Y. (2008) Formic acid induces Ycalp-independent apoptosis-like cell death in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res., 8 (4): 531-539.

95. Duan S., Hajek P., Lin C., Shin S.K., Attardi G., Chomyn A. (2003) Mitochondrial outer membrane permeability change and hypersensitivity to digitonin early in staurosporine-induced apoptosis. J. Biol. Chem., 278: 1346-1353.

96. Dudkina N.V., Sunderhaus S., Boekema E.J., Braun H.P. (2008) The higher level of organization of the oxidative phosphorylation system: mitochondrial supercomplexes. J. Bioenerg. Biomembr., 40 (5): 419-424.

97. Eisenberg T., Büttner S., Kroemer G., Madeo F. (2007) The mitochondrial pathway in yeast apoptosis. Review. Apoptosis, 12 (5): 1011-1023.

98. Fabrizio P., Battistella L., Vardavas R., Gattazzo C., Liou L.L., Diaspro A., Dossen J.W., Gralla E.B. and Longo V.D. (2004) Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol., 166: 1055-1067.

99. Fabrizio P. and Longo V.D. (2008) Chronological aging-induced apoptosis in yeast. Review. Biochim. Biophys. Acta, 1783 (7): 1280-1285.

100. Fahrenkrog B., Sauder U., Aebi U. (2004) The S. cerevisiae HtrA-like protein Nmalllp is a nuclear serine protease that mediates yeast apoptosis. J. Cell. Sei., 117: 115-126.

101. Fannjiang Y., Cheng W.C., Lee S.J., Qi B., Pevsner J., McCaffer J.M., Hill R.B., Basanez G., Hardwick J.M. (2004) Mitochondrial fission proteins regulate programmed cell death in yeast. Genes Dev., 18: 2785-2797.

102. Fearnley I.M., Carroll J., Walker J.E. (2007) Proteomic analysis of the subunit composition of complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase) from bovine heart mitochondria. Methods Mol. Biol., 357: 103-125.

103. Fleischmann G., Lederer F., Müller F., Bacher A., Rüteijans H. (2000) Flavin-protein interactions in flavocytochrome b2 as studied by NMR after reconstitution of the enzyme with 13C- and 15N-labelled flavin. Eur. J. Biochem., 267 (16): 5156-5167.

104. Foger N., Rangell L., Danilenko D.M. and Chan A.C. (2006) Requirement for coronin 1 in T lymphocyte trafficking and cellular homeostasis. Science, 313: 839-842.

105. Fontanesi F., Soto I.C., Horn D., Barrientos A. (2006) Assembly of mitochondrial cytochrome c oxidase, a complicated and highly regulated cellular process. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 291: 1129-1147.

106. Fontanesi F., Soto I.C. and Barrientos A. (2008) Cytochrome c Oxidase Biogenesis: New levels of Regulation. IUBMB Life, 60 (9): 557-568.

107. Gao W., Pu Y., Luo K.Q. and Chang D.C. (2001) Temporal relationship between cytochrome c release and mitochondrial swelling during UV-induced apoptosis in living He La cells. J. Cell Sci., 114: 2855-2862.

108. Garlid K.D. and Beavis A.D. (1986) Evidence for the existence of an inner membrane anion channel in mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 853: 187-204.

109. Garlid K.D., Costa A.D., Quinlan C.L., Pierre S.V., Dos Santos P. (2009) Cardioprotective signaling to mitochondria. J. Mol. Cell Cardiol., 46 (6): 858-866.

110. Gateau-Roesch O., Pavlov E., Lazareva A.V., Limarenko E.A., Levrat C., Saris N.E., Louisot P., Mironova G.D. (2000) Calcium-binding properties of the mitochondrial channel-forming hydrophobic component. J. Bioenerg. Biomembr., 32: 105-110.

111. Giannattasio S., Guaragnella N., Corte-Real M., Passarella S., Marra E. (2005) Acid stress adaptation protects Saccharomyces cerevisiae from acetic acid-induced programmed cell death. Gene, 354: 93-98.

112. Godon C., Lagniel G., Lee J., Buhler J.M., Kieffer S., Perrot M., Boucherie H., Toledano M.B., Labarre J. (1998) The H202 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 273 (35): 22480-22489.

113. Goglia F. and Skulachev Y.P. (2003) A function for novel uncoupling proteins: antioxidant defense of mitochondrial matrix by translocating fatty acid peroxides from the inner to the outer membrane leaflet. FASEBJ., 17 (12): 1585-1591.

114. Gogvadze V., Robertson J.D., Enoksson M., Zhivotovsky B., Orrenius S. (2004) Mitochondrial cytochrome c release may occur by volume-dependent mechanisms not involving permeability transition. Biochem. J., 378: 213-217.

115. Gondry M., Dubois J., Terrier M., Lederer F. (2001) The catalytic role of tyrosine 254 in flavocytochrome b2 (L-lactate dehydrogenase from baker's yeast). Comparison between the Y254F and Y254L mutant proteins. Eur. J. Biochem., 268 (18): 4918-4927.

116. Gourlay C.W., Carpp L.N., Timpson P., Winder S.J. and Ayscough K.R. (2004) A role for the actin cytoskeleton in cell death and ageing in yeast. J. Cell. Biol., 164: 803-809.

117. Gourlay C.W. and Ayscough K.R. (2005a) The actin cytoskeleton: a key regulator of apoptosis and ageing? Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6: 583-589.

118. Gourlay C.W. and Ayscough K.R. (20056) Identification of an upstream regulatory pathway controlling actin-mediated apoptosis in yeast. J. Cell Sci., 118 (Pt 10): 2119-2132.

119. Gourlay C.W., Du W., Ayscough K.R. (2006) Apoptosis in yeast—mechanisms and benefits to a unicellular organism. Mol. Microbiol., 62 (6): 1515-1521.

120. Gourlay C.W. and Ayscough K.R. (2006) Actin induced hyperactivation of the Ras signaling pathway leads to apoptosis in S. cerevisiae. Mol. Cell Biol., 26: 6487-6501.

121. Grane F.L. (2007) Discovery of ubiquinone (coenzyme Q) and an overview of function. Mitochondrion, S2-7.

122. Green D. (1974) The electromechanochemical model for energy coupling in mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 346: 27-78.

123. Greenhalf W., Stephan C., Chaudhuri B. (1996) Role of mitochondria and C-terminal membrane anchor of Bcl-2 in Bax induccd growth arrest and mortality in Saccharomyces cerevisiae. FEBSLett., 380: 169-175.

124. Greenwood M.T. and Ludovico P. (2010) Expressing and functional analysis of mammalian apoptotic regulators in yeast. REVIEW. Cell Death Differ., 17 (5): 737-745.

125. Grigoriev S.M., Muro C., Dejean L.M., Campo M.L., Martinez-Caballero S., Kinnally K.W. (2004) Electrophysiological approaches to the study of protein translocation in mitochondria, hit. Rev. Cytol., 238: 227-274.

126. Grover G. and Garlid K. (2000) ATP-sensitive potassium channels: a review of their cardioprotective pharmacology. J. Mol. Cell Cardiol., 32: 677-695.

127. Guérin B., Bunoust O., Rouqueys V., Rigoulet M. (1994) ATP-induced unspecific channel in yeast mitochondria. J. Biol. Chem., 269 (41): 25406-25410.

128. Guérin R., Beauregard P.B., Leroux A., Rokeach L.A. (2009) Calnexin regulates apoptosis induced by inositol starvation in fission yeast. PLoS One, 4 (7): e6244.

129. Gunter T.E. and Sheu S.S. (2009) Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim. Biophys. Acta, 1787 (11): 1291-1308.

130. Gutiérrez-Aguilar M., Pérez-Vázquez V., Bunoust O., Manon S., Rigoulet M., Uribe S. (2007) In yeast, Ca2+ and octylguanidine interact with porin (VDAC) preventing the mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta, 1767 (10): 1245-1251.

131. Gutiérrez-Aguilar M., Pérez-Martínez X., Chávez E., Uribe-Carvajal S. (2010) In Saccharomyces cerevisiae, the phosphate carrier is a component of the mitochondrial unselective channel. Arch. Biochem. Biophys., 494 (2): 184-191.

132. Guzy R.D. and Schumacker P.T. (2006) Oxygen sensing by mitochondria at complex III: the paradox of increased reactive oxygen species during hypoxia. Exp. Physiol., 91 (5): 807819.

133. Halestrap A.P. (2009) What is the mitochondrial permeability transition pore? J. Mol. Cell Cardiol, 46: 821-831.

134. Halestrap A.P. and Pasdois P. (2009) The role of the mitochondrial permeability transition pore in heart disease. Biochim. Biophys. Acta, 1787: 1402-1411.

135. HanadaM., Aime-Sempe C., Sato T., Reed J.C. (1995) Structure-function analysis ofBcl-2 protein. Identification of conserved domains important for homodimerization with Bcl-2 and heterodimerization with Bax. J. Biol. Chem., 270: 11962-11969.

136. Hanley P.J. and Daut J. (2005) K(ATP) channels and preconditioning: a re-examination of the role of mitochondrial K(ATP) channels and an overview of alternative mechanisms. J. Mol. Cell. Cardiol., 39 (1): 17-50.

137. Harman D. (1956) Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J. Gerontol, 11: 298-300.

138. Hauptmann P., Riel C., Kunz-Schughart L.A., Fróhlich K.U., Madeo F., Lehle L. (2006) Defects in N-glycosylation induce apoptosis in yeast. Mol. Microbiol, 59 (3): 765-778.

139. Heaton G.M., Wagenvoord R.J., Kemp A.J., Nicholls D.G. (1978) Brown-adipose-tissue mitochondria: photoaffinity labeling of the regulatory site of energy dissipation. Eur. J. Biochem., 82: 515-521.

140. Herker E., Jungwirth H., Lehmann K.A., Maldener C., Frohlich K.U., Wissing S., Buttner S., Fehr M., Sigrist S., Madeo F. (2004) Chronological aging leads to apoptosis in yeast. J. Cell Biol, 164: 501-507.

141. Hong J., Zhang J., Liu Z., Qin S., Wu J., Shi Y. (2009) Solution structure of S. cerevisiae PDCD5-like protein and its promoting role in H(2)0(2)-induced apoptosis in yeast. Biochemistry, 48 (29): 6824-6834.

142. Hosier J.P., Ferguson-Miller S., Mills D.A. (2006) Energy transduction: proton transfer through the respiratory complexes. REVIEW. Annu. Rev. Biochem., 75: 165-187.

143. Huard S., Chen M., Burdette K.E., Fenyvuesvolgyi C., Yu M., Elder R.T., Zhao R.Y. (2008) HIV-1 Vpr-induced cell death in Schizosaccharomyces pombe is reminiscent of apoptosis. Cell Res., 18 (9): 961-973.

144. Hunte C., Solmaz S., Palsdottir H., Wenz T. (2008) A structural perspective on mechanism and function of the cytochrome be (1) complex. Results Probl. Cell Differ., 45: 253-278.

145. Jezek P. (1999) Fatty acid interaction with mitochondrial uncoupling proteins. J. Bioenerg. Biomembr., 31: 457-466.

146. Jung D.W., Bradshaw P.C., Pfeiffer D.R. (1997) Properties of a cyclosporin-insensitive permeability transition pore in yeast mitochondria. J. Biol. Chem., 272: 21104-21112.

147. Jurgensmeier J.M., Krajewski S., Armstrong R.C., Wilson G.M., Oltersdorf T., Fritz L.C. (1997) Bax- and Bak-induced cell death in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol. Biol. Cell., 8: 325-339.

148. Kang M.S., Lee S.K., Park C.S., Kang J.H., Bae S.H., Yu S.L. (2008) Expression of death receptor 4 induces caspase-independent cell death in MMS-treated yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 376 (2): 305-309.

149. Keppetipola N., Jain R., Meineke B., Diver M., Shuman S. (2009) Structure-activity relationships in Kluyveromyces lactis gamma-toxin, a eukaryal tRNA anticodon nuclease. RNA, 15 (6): 1036-1044.

150. Kern A., Hartner F.S., Freigassner M., Spielhofer J., Rumpf C., Leitner L., Fröhlich K.U., Glieder A. (2007) Pichia pastoris «just in time» alternative respiration. Microbiology, 153: 1250-1260.

151. Kerscher S., Dröse S., Zwicker K., Zickermann V., Brandt U. (2002) Yarrowia lipolytica, a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. Biochim. Biophys. Acta, 1555 (1-3): 83-91.

152. Kerscher S., Dröse S., Zickermann V., Brandt U. (2008) The three families of respiratory NADH dehydrogenases. REVIEW. Results Probl Cell Differ., 45: 185-222.

153. Keyhani E. and Keyhani J. (2004) Plasma membrane alteration is an early signaling event in doxorubicin-induced apoptosis in the yeast Candida utilis. Ann. N. Y. Acad. Sei., 1030: 369376.

154. Keyhani E., Khavari-Nejad S., Keyhani J., Attar F. (2009) Acriflavine-mediated apoptosis and necrosis in yeast Candida utilis. Ann. N. Y. Acad. Sei., 1171: 284-291.

155. Kihira Y., Ueno M., Terada H. (2007) Difference between yeast and bovine mitochondrial ADP/ATP carriers in terms of conformational properties of the first matrix loop as deduced by use of copper-o-phenanthroline. Biol. Pharm. Bull., 30 (5): 885-890.

156. King M.S., Sharpley M.S., Hirst J. (2009) Reduction of hydrophilic ubiquinones by the flavin in mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I) and production of reactive oxygen species. Biochemistry, 48 (9): 2053-2062.

157. Klassen R. and Meinhardt F. (2005) Induction of DNA damage and apoptosis in Saccharomyces cerevisiae by a yeast killer toxin. Cell. Microbiol., 7: 393-401.

158. Kong J. and Rabkin S. (2000) Palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes is mediated through alterations in mitochondria: prevention by cyclosporin A. Biochim. Biophys. Acta, 1485: 45-55.

159. Kotelnikova A.V. and Zvjagilskaya R.A. (1965) On the efficiency of oxidative phosphorylation in yeast mitochondria. Life Science, 4: 1651-1655.

160. Kowaltowski A.J., Vercesi A.E., Rhee S.G., Netto L.E. (2000) Catalases and thioredoxin peroxidase protect Saccharomyces cerevisiae against Ca2+-induced mitochondrial membrane permeabilization and cell death. FEBSLett., 473: 177-182.

161. Krasnikov B.F., Kuzminova A.E., Zorov D.B. (1997) The Ca2+ -induced pore opening in mitochondria energized by succinate-ferricyanide electron transport. FEBS Lett., 419 (1): 137140.

162. Kristian T., Bernardi P., Siesjo B.K. (2001) Acidosis promotes the permeability transition in energized mitochondria: implications for reperfusion injury. J. Neurotrauma, 18 (10): 10591074.

163. K.H., Mayer M., Lederer F. (2003) Epitope mapping for the monoclonal antibody that inhibits intramolecular electron transfer in flavocytochrome b2. Biochem. J., 373 (Pt 1): 115123.

164. Madeo F., Fröhlich E„ Ligr M„ Grey M., Sigrist S.J., Wolf D.H., Fröhlich K.U. (1999) Oxygen stress: a regulator of apoptosis in yeast. J. Cell Biol., 145 (4): 757-767.

165. Madeo F., Herker E., Maldener C., Wissing S., Lächelt S., Herlan M., Fehr M., Lauber K., Sigrist S.J., Wesselborg S., Fröhlich K.U. (2002) A caspase-related protease regulates apoptosis in yeast. Mol. Cell, 9: 911-917.

166. Madeo F., Herker E., Wissing S., Jungwirth H., Eisenberg T., Fröhlich K.U. (2004) Apoptosis in yeast. Curr. Opin. Microbiol., 7 (6): 655-660.

167. Madeo F. and Fröhlich K.U. (2008) Apoptosis in yeast. Preface. Biochim. Biophys. Acta, 1783: 1271.

168. Maeta K., Mori K., Takatsume Y., Izawa S., Inoue Y. (2005) Diagnosis of cell death induced by methylglyoxal, a metabolite derived from glycolysis, in Saccharomyces cerevisiae. FEMSMicrobiol. Lett., 243 (1): 87-92.

169. Magherini F., Tani C., Gamberi T., Caselli A., Bianchi L., Bini L., Modesti A. (2007) Protein expression profiles in Saccharomyces cerevisiae during apoptosis induced by H202. Proteomics, 7 (9): 1434-1445.

170. Manon S. (2004) Utilization of yeast to investigate the role of lipid oxidation in cell death. Antioxid. Redox Signal., 6 (2): 259-267.

171. Manon S., Roucou X., Rigoulet M., Guerin M. (1995) Stimulation of oxidative phosphorylation by electrophoretic K+ entry associated to electroneutral K+/H+ exchange in yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1231 (3): 282-288.

172. Manon S. and Guerin M. (1997) The ATP-induced K+-transport pathway of yeast mitochondria may function as an uncoupling pathway. Biochim. Biophys. Acta, 1318 (3): 317321.

173. Manon S. and Guerin M. (1998) Investigation of the yeast mitochondrial unselective channel in intact and permeabilized spheroplasts. Biochem. Mol. Biol. Int., 44 (3): 565-575.

174. Manon S., Roucou X., Guerin M., Rigoulet M., Guerin B. (1998) Characterization of the yeast mitochondria unselective channel: a counterpart to the mammalian permeability transition pore? J. Bioenerg. Biomembr., 30 (5): 419-429.

175. Marinov B.S., Grigoriev S.M., Skarga Yu.Yu., Olovjanishnikova G.D., Mironova G.D. (2001) Effects of pelargonidine and a benzocaine analogue p-diethylaminoethyl benzoate on mitochondrial K(ATP) channel. Membr. Cell Biol., 14 (5): 663-671.

176. Martinet W., Van den Pias D., Raes H., Reekmans R., Contreras R. (1999) Bax-induced cell death in Pichia pastoris. Biotechnol. Lett., 21: 821-829.

177. Mazzoni C., Herker E., Palermo V., Jungwirth H., Eisenberg T., Madeo F. and Falcone C. (2005) Yeast caspase 1 links messenger RNA stability to apoptosis in yeast. EMBO Rep., 6: 1076-1081.

178. Medentsev A.G., Arinbasarova A.Y., Golovchenko N.P., Akimenko V.K. (2002) Involvement of the alternative oxidase in respiration of Yarrowia lipolytica mitochondria is controlled by the activity of the cytochrome pathway. FEMS Yeast Res., 2 (4): 519-524.

179. Michalecka A.M., Agius S.C., Moller I.M., Rasmusson A.G. (2004) Identification of a mitochondrial external NADPH dehydrogenase by overexpression in transgenic Nicotiana sylvestris. Plant. J., 37 (3): 415-425.

180. Mironova G.D., Skarga Yu.Yu., Grigoriev S.M., Negoda A.E., Kolomytkin O.V., Marinov B.S. (1999) Reconstitution of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel into bilayer lipid membrane. J. Bioenerg. Biomembr., 31: 157-161.

181. Mironova G.D., Belosludtsev K.N., Belosludtseva N.V., Gritsenko E.N., Khodorov B.I., Saris N.E. (2007) Mitochondrial Ca2+ cycle mediated by the palmitate-activated cyclosporin A-insensitive pore. J. Bioenerg. Biomembr., 39 (2): 167-174.

182. Mitsui K., Nakagawa D., Nakamura M., Okamoto T., Tsurugi K. (2005) Valproic acid induces apoptosis dependent of Ycalp at concentrations that mildly affect the proliferation of yeast. FEBSLett., 579 (3): 723-727.

183. Mogi T., Matsushita K., Murase Y., Kawahara K., Miyoshi H., Ui H., Shiomi K., Omura S., Kita K. (2008) Identification of new inhibitors for alternative NADH dehydrogenase (NDH-II). FEMS Microbiol. Lett., 291 (2): 157-161.

184. Morgner N., Zickermann V., Kerscher S., Wittig I., Abdrakhmanova A., Barth H.D., Brutschy B., Brandt U. (2008) Subunit mass fingerprinting of mitochondrial complex I. Biochim. Biophys. Acta, 1777: 1384-1391.

185. Mourier A., Vallortigara J., Yoboue E.D., Rigoulet M., Devin A. (2008) Kinetic activation of yeast mitochondrial D-lactate dehydrogenase by carboxylic acids. Biochim. Biophys. Acta, 1777 (10): 1283-1288.

186. Murphy M.P. and Smith R.A.J. (2007) Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 47: 629-656.

187. Nakae Y., Kwok W.M., Bosnjak Z.J., Jiang M.T. (2003) Isoflurane activates rat mitochondrial ATP-sensitive K+ channels reconstituted in lipid bilayers. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 284: H1865-H1871.

188. Narasimhan M.L., Damsz B., Coca M.A., Ibeas J.I., Yun D.J., Pardo J.M. et al. (2001) A plant defense response effector induces microbial apoptosis. Mol. Cell, 8: 921-930.

189. O'Rourke B. (2004) Evidence for mitochondrial K+ channels and their role in cardioprotection. Circ. Res., 94 (4): 420-432.

190. O'Rourke B. (2007) Mitochondrial ion channels. Annu. Rev. Physiol., 69: 19-49.

191. Ozhovan S.M., Knorre D.A., Severin F.F., Bakeeva L.E. (2009) Yeast cell ultrastructure after amiodarone treatment. Tsitologiia, 51 (11): 911-916.

192. Palermo V., Falcone C., Mazzoni C. (2007) Apoptosis and aging in mitochondrial morphology mutants of S. cerevisiae. Folia Microbiol. (Praha), 52 (5): 479-483.

193. Palkova Z., Vachova L., Gaskova D., Kucerova H. (2009) Synchronous plasma membrane electrochemical potential oscillations during yeast colony development and aging. Mol. Membr. Biol., 26: 228-235.

194. Park C. and Lee D.G. (2010) Melittin induces apoptotic features in Candida albicans. Biochem. Biophys. Res. Commun., 394 (1): 170-172.

195. Pastore D., Stoppelli M.C., Di Fonzo N., Passarella S. (1999) The existence of the K(+) channel in plant mitochondria. J. Biol. Chem., 274: 26683-26690.

196. Pastore D., Tronto D., Laus M. N., Di Fonzo N. and Flagella Z. (2007) Possible plant mitochondria involvement in cell adaptation to drought stress. A case study: durum wheat mitochondria. J. Exp. Bot., 58: 195-210.

197. Pavlov E.V., Priault M., Pietkiewicz D., Cheng E.H., Antonsson B. et al. (2001) A novel, high conductance channel of mitochondria linked to apoptosis in mammalian cells and Bax expression in yeast.Cell Biol, 155: 725-731.

198. Poliakova D., Sokolikova В., Kolarov J., Sabova L. (2002) The antiapoptotic protein Bcl-x(L) prevents the cytotoxic effect of Bax, but not Bax-induced formation of reactive oxygen species, in Kluyveromyces lactis. Microbiology, 148 (Pt 9): 2789-2795.

199. Pozniakovsky A.I., Knorre- D.A., Markova O.V., Hyman A.A., Skulachev V.P., Severin F.F. (2005) Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. J. Cell Biol, 168 (2): 257-269.

200. Priault M., Camougrand N., Kinnally K.W., Vallette F.M., Manon S. (2003) Yeast as a tool to study Bax/mitochondrial interactions in cell death. FEMS Yeast Res., 4: 15-27.

201. Prieto S., Bouillaud F., Ricquier D., Rial E. (1992) Activation by ATP of a proton-conducting pathway in yeast mitochondria. Eur. J. Biochem., 208 (2): 487-491.

202. Prieto S., Bouillaud F., Rial E. (1995) The mechanism for the ATP-induced uncoupling of respiration in mitochondria of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem. J., 307 (Pt 3): 657-661.

203. Prieto S., Bouillaud F., Rial E. (1996) The nature and regulation of the ATP-induced anion permeability in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Arch. Biochem. Biophys., 334 (1): 43-49.

204. Qiu J., Yoon J.H., Shen B. (2005) Search for apoptotic nucleases in yeast: role of Tat-D nuclease in apoptotic DNA degradation. J. Biol Chem., 280 (15): 15370-15379.

205. Radermacher M., Ruiz Т., Clason Т., Benjamin S., Brandt U., Zickermann V. (2006) The three-dimensional structure of complex I from Yarrowia lipolytica: a highly dynamic enzyme. J. Struct. Biol., 154 (3): 269-279.

206. Rak M., Zeng X., Briere J.J., Tzagoloff A. (2009) Assembly of F0 in Saccharomyces cerevisiae. REVIEW. Biochim. Biophys. Acta, 1793 (1): 108-116.

207. Rauchova H., Drahota Z., Rauch P., Fato R., Lenaz G. (2003) Coenzyme Q releases the inhibitory effect of free fatty acids on mitochondrial glycerophosphate dehydrogenase. Acta Biochim. Pol., 50 (2): 405-413.

208. Raval A.P., Dave K.R., DeFazio R.A., Perez-Pinzon M.A. (2008) epsilonPKC phosphorylates the mitochondrial K(+)(ATP) channel during induction of ischemic preconditioning in the rat hippocampus. Brain Res., 1184: 345-353.

209. Reed D.W. and Hartzell P.L. (1999) The Archaeoglobus fulgidus D-lactate dehydrogenase is a Zn(2+) flavoprotein. J. Bacteriol., 181 (24): 7580-7587.

210. Reiter J., Herker E., Madeo F., Schmitt M.J. (2005) Viral killer toxins induce caspase-mediated apoptosis in yeast. J. Cell Biol., 168 (3): 353-358.

211. Remade C., Barbieri M.R., Cardol P., Hamel P.P. (2008) Eukaryotic complex I: functional diversity and experimental systems to unravel the assembly process. REVIEW. Mol. Genet. Genomics, 280 (2): 93-110.

212. Ricquier D. and Bouillaud F. (2000) Mitochondrial uncoupling proteins: from mitochondria to the regulation of energy balance. J. Physiol, 529 (Pt 1): 3-10.

213. Roche M., Rondeau P., Singh N.R., Tarnus E., Bourdon E. (2008) The antioxidant properties of serum albumin. Review. FEBSLett., 582 (13): 1783-1787.

214. Rojo E.E., Guiard B., Neupert W., Stuart R.A. (1998) Sorting of D-lactate dehydrogenase to the inner membrane of mitochondria. Analysis of topogenic signal and energetic requirements. J. Biol. Chem., 273 (14): 8040-8047.

215. Rostovtseva T.K., Antonsson B., Suzuki M., Youle R.J., Colombini M., Bezrukov S.M. (2004) Bid, but not Bax, regulates VDAC channels. J. Biol. Chem., 279: 13575-13583.

216. Rostovtseva T.K., Tan W., Colombini M. (2005) On the role of VDAC in apoptosis: fact and fiction. J. Bioenerg. Biomembr., 37: 129-142.

217. Roucou X., Manon S., Guerin M. (1997) Modulation of the electrophoretic ATP-induced K(+)-transport in yeast mitochondria by delta pH. Biochem. Mol. Biol. Int., 43 (1): 53-61.

218. Ruy F., Vercesi A.E., Andrade P.B., Bianconi M.L., Chaimovich H., Kowaltowski AJ. (2004) A highly active ATP-insensitive K+ import pathway in plant mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 36: 195-202.

219. Sapienza K., Bannister W., Balzan R. (2008) Mitochondrial involvement in aspirin-induced apoptosis in yeast. Microbiology, 154 (Pt 9): 2740-2747.

220. Schauer A., Knauer H., Ruckenstuhl C., Fussi H., Durchschlag M., Potocnik U., Frohlich K.U. (2009) Vacuolar functions determine the mode of cell death. Biochim. Biophys. Acta, 1793 (3): 540-545.

221. Schein S J., Colombini M., Finkelstein A. (1976) Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from Paramecium mitochondria. J. Membr. Biol., 30: 99-120.

222. Schendel S.L., Xie Z., Montal M.O., Matsuyama S., Montal M., Reed J.C. (1997) Channel formation by antiapoptotic protein Bcl-2. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 5113-5118.

223. Schmitt M.J. and Reiter J. (2008) Viral induced yeast apoptosis. Biochim. Biophys. Acta, 1783:1413-1417.

224. Schonfeld P., Sayeed I., Bohnensack R., Siemen D. (2004) Fatty acids induce chloride permeation in rat liver mitochondria by activation of the inner membrane anion channel (IMAC). J. Bioenerg. Biomembr., 36: 241-248.

225. Severin F.F. and Hyman A.A. (2002) Pheromone induces programmed cell death in S. cerevisiae. Curr. Biol., 12: R233-R235.

226. Severin F.F., Meer M.V., Smirnova E.A., Knorre D.A., Skulachev V.P. (2008) Natural causes of programmed death of yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta, 1783: 1350-1353.

227. Sharp R.E., Chapman S.K., Reid G.A. (1996) Modulation of flavocytochrome b2 intraprotein electron transfer via an intcrdomain hinge region. Biochem. J., 316 (Pt 2): 507513.

228. Sheridan C., Delivani P., Cullen S.P., Martin S.J. (2008) Bax- or Bak-induced mitochondrial fission can be uncoupled from cytochrome C release. Mol. Cell, 31: 570-585.

229. Shirtliff M.E., Krom B.P., Meijering R.A., Peters B.M., Zhu J., Scheper M.A., Harris M.L., Jabra-Rizk M.A. (2009) Farnesol-induced apoptosis in Candida albicans. Antimicrob. Agents. Chemother., 53 (6): 2392-2401.

230. Silva R.D., Sotoca R., Johansson B., Ludovico P., Sansonetty F., Silva M.T., Peinado J.M., Cörte-Real M. (2005) Hyperosmotic stress induces metacaspase- and mitochondria-dependent apoptosis in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol., 58: 824-834.

231. Singh K., ICang P.J., Park H.O. (2008) The Rho5 GTPase is necessary for oxidant-induced cell death in budding yeast. Proc. Natl. Acad. USA, 105: 1522-1527.

232. Skulachev V.P., Anisomov V.N., Antonenko Yu.N., Bakeeva L.E., Chernyal B.V., Erichev V.P., Filenki O.F., Kalinina N.I., Rapelko V.l., Kolosova N.G., Kopnin B.P.,

233. Sobrado P. and Fitzpatrick P.F. (2003) Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavages are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism. Biochemistry, 42 (51): 15208-15214.

234. Sollner S., Durchschlag M., Fröhlich K.U., Macheroux P. (2009) The redox-sensing quinone reductase Lotöp acts as an inducer of yeast apoptosis. FEMS Yeast Res., 9 (6): 885891.

235. Sottocasa G., Sandri G., Panfili E., De Bernard B., Gazzotti P. et ah (1972) Isolation of a soluble Ca2+ binding glycoprotein from ox liver mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun., 47: 808-813.

236. Sparagna G., Hickson-Bick D., Buja L. and McMillin J. (2000) A metabolic role for mitochondria in palmitate-iinduced cardiac myocyte apoptosis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 279: 2124-2132.

237. Srivastava S. and Chan C. (2007) Hydrogen peroxide and hydroxyl radicals mediate palmitate-induced cytotoxicity to hepatoma cells: relation to mitochondrial permeability transition. Free Radie. Res., 41 (1): 38-49.

238. Stiburek L., Hansikova H., Tesarova M., Cerna L., Zeman J. (2006) Biogenesis of eukaryotic cytochrome c oxidase. REVIEW. Physiol. Res., 55 Suppl2: S27-41.

239. Strauss M., Hofhaus G., Schröder R.R., Kühlbrandt W. (2008) Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J., 27 (7): 1154-1160.

240. Sultan A. and Sokolove P. (2001a) Palmitic acid opens a novel cyclosporin A-insensitive pore in the inner mitochondrial membrane. Arch. Biochem. Biophys., 386: 31-51.

241. Sultan A. and Sokolove P. (20016) Free fatty acid effects on mitochondrial permeability: an overview. Arch. Biochem. Biophys., 386: 52-61.

242. Sun F., Huo X., Zhai Y., Wang A., Xu J., Su D., Bartlam M., Rao Z. (2005) Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell, 121 (7): 1043-1057.

243. Szeto S.S.W., Reinke S.N., Sykes B.D. and Lemire B.D. (2007) Ubiquinone-binding Site Mutations in the Saccharomyces cerevisiae Succinate Dehydrogenase Generate Superoxide and Lead to the Accumulation of Succinate. J. Biol. Chem., 282 (37): 27518-27526.

244. Szewczyk A., Jarmuszkiewicz W., Kunz W.S. (2009) Mitochondrial potassium channels. IUBMB Life., 61 (2): 134-143.

245. Tegoni M. and Cambillau C. (1994) The 2.6-A refined structure of the Escherichia coli recombinant Saccharomyces cerevisiae flavocytochrome b2-sulfite complex. Protein. Sci., 3 (2): 303-313.

246. Thomas D., Bron P., Weimann T., Dautant A., Giraud M.F., Paumard P., Salin B., Cavalier A., Velours J., Brethes D. (2008) Supramolecular organization of the yeast FiF0-ATP synthase. Biol. Cell, 100 (10): 591-601.

247. Thomas S.G., Huang S., Li S., Staiger CJ. and Franklin-Tong V.E. (2006) Actin depolymerization is sufficient to induce programmed cell death in self-incompatible pollen. J. Cell Biol., 174: 221-229.

248. Tsai C.L., Gokulan K., Sobrado P., Sacchettini J.C., Fitzpatrick P.F. (2007) Mechanistic and structural studies of H373Q flavocytochrome b2: effects of mutating the active site base. Biochemistry, 46 (26): 7844-7851.

249. Vachova L. and Palkova Z. (2005) Physiological regulation of yeast cell death in multicellular colonies is triggered by ammonia. J. Cell Biol., 169 (5): 711-717.

250. Vachova L., Kucerova H., Devaux F., Ulehlova M., Palkova Z. (20096) Metabolic diversification of cells during the development of yeast colonies. Environ. Microbiol., 11: 494-504.

251. Vandenbosch D., Braeckmans K., Nelis H.J., Coenye T. (2010) Fungicidal activity of miconazole against Candida spp. biofilms. J. Antimicrob. Chemother., 65 (4): 694-700.

252. Vanlerberghe G.C., Cvetkovska M. and Wang J. (2009) Is the maintenance of homeostatic mitochondrial signaling during stress a physiological role for alternative oxidase? Physiologia Plant arum, 137 (4): 392-406.

253. Veiga A., Arrabaca J.D., Loureiro-Dias M.C. (2000) Cyanide-resistant respiration is frequent, but confined to yeasts incapable of aerobic fermentation. FEMS Microbiol. Lett., 190: 93-97.

254. Veiga A., Arraba9a J.D., Loureiro-Dias M.C. (2003) Cyanide-resistant respiration, a very frequent metabolic pathway in yeasts. FEMS Yeast Res., 3 (3): 239-245.

255. Videira A. and Duarte M. (2002) From NADH to ubiquinone in Neurospora mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1555: 187-191.

256. Virolainen E., Blokhina O., Fagerstedt K. (2002) Ca2+-induced high amplitude swelling and cytochrome c release from wheat (Triticum aestivum L.) mitochondria under anoxic stress. Ann. Bot., 90 (4): 509-516.

257. Votyakova T.V., Bazhenova E.N., Zvyagil'skaya R.A. (1990) Polyamines improve Ca2+ transport system of the yeast mitochondria. FEBS Lett., 261: 139-141.

258. Votyakova T.V., Bazhenova E.N., Zvyagil'skaya R.A. (1993) Regulation of the yeast mitochondrial Ca2+ uptake by polyamines and Mg2+. J. Bioenerg. Biomembr., 25: 569-574.

259. Webb J.S., Givskov M., Kjelleberg S. (2003) Bacterial biofilms: prokaryotic adventures in multicellularity. Curr. Opin. Microbiol, 6: 578-585.

260. Weinberger M., Ramachandran L., Feng L., Sharma K., Sun X., Marchetti M. et al. (2005) Apoptosis in budding yeast caused by defects in initiation of DNA replication. J. Cell Set, 118: 3543-3553.

261. Wieckowski M., Brdiczka D. and Wojtczak L. (2000) Long-chain fatty acids opening of the reconstituted mitochondrial permeability transition pore. FEBS Lett., 484: 61-64.

262. Wojtovich A.P., Burwell L.S., Sherman T.A., Nehrke K.W., Brookes P.S. (2008) The C. elegans mitochondrial K+(ATP) channel: a potential target for preconditioning. Biochem. Biophys. Res. Commun., 376 (3): 625-628.

263. Wu X.Z., Chang W.Q., Cheng A.X., Sun L.M., Lou H.X. (2010) Plagiochin E, an antifungal active macrocyclic bis(bibenzyl), induced apoptosis in Candida albicans through a metacaspase-dependent apoptotic pathway. Biochim. Biophys. Acta, 1800 (4): 439-447.

264. Yamaki M., Umehara T., Chimura T., Horikoshi M. (2001) Cell death with predominant apoptotic features in Saccharomyces cerevisiae mediated by deletion of the histone chaperone ASF1/CIA1. Genes Cells, 6 (12): 1043-1054.

265. Yang H., Ren Q., Zhang Z. (2008) Cleavage of Mcdl by caspase-like protease Espl promotes apoptosis in budding yeast. Mol. Biol. Cell., 19 (5): 2127-2134.

266. Yeh J.I., Chinte U., Du S. (2008) Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105 (9): 3280-3285.

267. Zadrag R., Wojnar L., Bartosz G. and Bilinski T. (2006) Does yeast shmooing mean a commitment to apoptosis? Cell Biol. Int., 30: 205-209.

268. Zara V., Conte L., Trumpower B.L. (2007) Identification and characterization of cytochrome bc\ subcomplexes in mitochondria from yeast with single and double deletions of genes encoding bcl subunits. FEBSJ., 274: 4526-4539.

269. Zara V., Conte L., Trumpower B. L. (2009) Evidence that assembly of the yeast cytochrome bcl complex involves formation of a large core structure in the inner mitochondrial membrane. FEBSJ., 276 (7): 1900-1914.

270. Zickermann V., Kerscher S., Zwicker K., Tocilescu M.A., Radermacher M. and Brandt U. (2009) Architecture of complex I and its implications for electron transfer and proton pumping. REVIEW. Biochim. Biophys. Acta, 1787 (6): 574-583.

271. Zorov D.B., Juhaszova M., Yaniv Y., Nuss H.B., Wang S„ Sollott S.J. (2009) Regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc. Res., 83: 213-225.

272. Zvyagilskaya R.A. and Kotelnikova A.V. (1989) Yeast energy metabolism at the cellular and mitochondrial levels. In: Sov. Sci. Rev. Physocochem. Biol., 18: 63-109.

273. Zvyagilskaya R.A. (1996) Isolation of mitochondria of yeast. In: Manual of Membrane Lipids (Ed. R. Prasad), Springer Verlag., p. 28-30.

Информация о работе

Суханова, Евгения Ивановна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суханова, Евгения Ивановна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Суханова, Евгения Ивановна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суханова, Евгения Ивановна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Dipodascus magnusii
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия