Индукторы вылупления личинок цистообразующих нематод сем. Heteroderidae (Skarbilovich) и перспективы их использования для защиты растений

Приданников, Михаил Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Индукторы вылупления личинок цистообразующих нематод сем. Heteroderidae (Skarbilovich) и перспективы их использования для защиты растений
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Индукторы вылупления личинок цистообразующих нематод сем. Heteroderidae (Skarbilovich) и перспективы их использования для защиты растений"

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ФИТОПАТОЛОГИИ

На правах рукописи Приданников Михаил Викторович

Индукторы вылупления личинок цистообразующих нематод сем. Не1егос1епс1ае (вкагЬПоукЬ) и перспектива их использования для защиты растений.

Специальность 06.01 11 - «Защита растений» 03 00 19 - «Паразитология»

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ 159ВЭ5

Большие Вязёмы - 2007

003159695

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН в 2001-2006 гг

Научные руководители- кандидат биологических наук

Виталий Георгиевич Джавахия

доктор биологических наук Николай Демьянович Романенко

Официальные оппоненты зам директора Центра паразитологии

ИПЭЭ РАН, Москва доктор биологических наук, Светлана Васильевна Зиновьева

заведующий кафедрой микологии и альгологии МГУ, Москва доктор биологических наук, профессор Юрий Таричанович Дьяков

Ведущая организация Российский Государственный

Аграрный Университет -МСХА им. К А. Тимирязева

Защита диссертации состоится « № » 2007 г. в /V часов на

заседании диссертационного совета К-006-064-01 при Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу 143050, Московская обл, Одинцовский район, п/о Б Вяземы, ул Институт, ВНИИФ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института и на сайте ВНИИФ www phytonet ru

Автореферат разослан « » сентября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И. Н. Яковлева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Седентарные цистообразующие нематоды семейства Heteroderidae - облигатные паразиты корневой системы растений - относятся к отряду Tylenchida Эти нематоды принадлежат к числу наиболее серьезных и экономически значимых патогенов сельскохозяйственных культур во всем мире Особо опасными патогенами на территории Российской Федерации, вызывающими большие потери урожая зерновых, овощных культур и картофеля, являются пшеничная цистообразукмцая нематода (Heterodera jihpjevi), свекловичная цистообразукмцая нематода (Н schachtii), соевая цистообразующая нематода (Н glycines), и золотистая картофельная нематода (Globodera rostochiensis) Эта нематода является возбудителем глободероза картофеля — очень широко распространенного и наиболее вредоносного заболевания этой культуры на территории России Картофельная нематода -карантинный объект Она не только причиняет прямой вред картофелеводству, но и дезорганизует семеноводство картофеля и препятствует развитию внутренних и международных торговых связей

Традиционный химический метод регулирования численности нематод дорог и малоэффективен К тому же, все наиболее эффективные нематициды обладают высокой токсичностью для человека и теплокровных животных Основным методом регулирования численности и вредоносности цистообразующих нематод в почве в настоящее время является применение систем севооборота с использованием видов растений, не являющихся хозяевами этих паразитов, и возделывание устойчивых сортов растений

Единственным слабым звеном в развитии паразита с точки зрения борьбы следует считать вторую личиночную стадию, т е стадию инвазионных личинок, только что вылупившихся из яиц и вышедших из-под защиты оболочек цист, но еще не успевших внедриться в корни растений Такие личинки легко подвергаются воздействию внешних факторов и в случае отсутствия растения-хозяина быстро погибают

Вылупление личинок из яиц - это исходный пункт активной жизни паразита Изучение активности природных стимуляторов и ингибиторов

процессов вылупления является предпосылкой для разработки новых методов борьбы с цистообразующими нематодами, связанных с использованием естественных, эволюционно-выработанных механизмов взаимоотношений в системе растение - нематоды

Цели и задачи исследований. Основной целью данных исследований был поиск и исследование природных регуляторов процессов, связанных с вылуплением личинок цистообразующих нематод и изучение возможности применения этих веществ для защиты растений В связи с этим в задачи этой работы входило

1 Исследование действия эндогенных факторов (компонентов цист) на вылупление личинок цистообразующих нематод (G rostochiensis и Н glycines)

2 Изучение природы веществ, выделенных из водных экстрактов гомогенатов яиц G rostochiensis и Н glycines и стимулирующих вылупление личинок этих нематод,

3 Исследование действия биологически активных соединений (компактина, аминофосфинатов, хитозана) на вылупление личинок G rostochiensis и Н glycines,

4 Проверка водных экстрактов гомогената яиц G rostochiensis на способность индуцировать защитный ответ растений табака к ВТМ

Научная новизна исследований.

1 Впервые показано, что водные экстракты гомогената яиц G rostochiensis способны активизировать процессы вылупления личинок этой нематоды из яиц,

2 Впервые показана способность фосфиновых аналогов аспарагиновой кислоты индуцировать вылупление личинок G rostochiensis из яиц

3 Впервые показана способность водных экстрактов гомогената яиц G rostochiensis индуцировать устойчивость табака к ВТМ, Практическая значимость работы.

1 Модифицирована методика проведения лабораторного эксперимента по изучению действия различных веществ в качестве индукторов или ингибиторов

вылупления личинок нематод, что позволило быстро и с достаточно высокой достоверностью определять активность влияния тех или иных веществ на процесс вылупления личинок цистообразующих нематод из яиц,

2 Полученные данные об индукторах вылупления, содержащихся в цистах G. rostochiensis и Н glycines, могут послужить основанием для начала разработки принципиально новых подходов контроля цистообразующих нематод, таких как индукция вылупления анабиотических личинок в отсутствии растения - хозяина,

3 Показано, что вещества, содержащиеся в экстрактах яиц G rostochiensis, обладают антивирусной активностью, что может быть важным для дальнейшего их изучения с целью разработки вирулицидов

4 Показана активность фосфиновых аналогов аспарагиновой кислоты, как индукторов вылупления личинок G rostochiensis из яиц

5. Продемонстрированы способности компактна и хитозана снижать активность индукторов вылупления

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на "Первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям", С.-Петербург, 2002г, на 3-ей и 6-ой научных конференциях "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (зоонозами)", Москва, 2002 и 2005гг, на Всероссийском совещании "Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии", Голицыно, 2003, на XXVII и XXVIII международных симпозиумах Европейского Общества Нематологов в Риме, 2004г и Благоевграде, 2006г

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Материал изложен на 105 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 23 рисунка Список литературы включает 140 работ, из которых 110 на иностранном языке

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Приготовление инокулюма Globodera rostochiensis. Растения картофеля сорта Удача выращивали в камере искусственного климата в очищенном речном песке в качестве субстрата Клубни картофеля высаживали в пластиковые вазоны объемом 10 л Через три недели после появления ростков картофеля, субстрат инокулировали суспензией яиц G rostochiensis Нагрузка была 300 ООО яиц на вазон Растения выращивали в течение 90 суток при 16 часовом дне (22 °С), 8 часовой ночи (20 °С) и относительной влажности 60 %

Приготовление инокулюма Heterodera glycines. Растения сои сорта Светлая выращивали в камере искусственного климата в очищенном речном песке Нагрузка была 300 000 яиц Н glycines на вазон Растения выращивали в течение 45 суток при 16 часовом дне (27 °С), 8 часовой ночи (24 °С) и относительной влажности 60 %

Экстракция цист из субстрата. Из субстрата цисты экстрагировали, используя метод бумажных фильтров. Навеску слегка подсушенного песка или почвы (100-150 г) помещали в пластиковый стакан с водой и тщательно перемешивали в течение одной минуты Через 10-15 секунд, после осаждения тяжелых частиц, воду с мелкими частицами и цистами процеживали через сито с размером ячеек 0,16 мм, осадок на сите несколько раз промывали водой и затем смывали небольшим количеством воды на бумажный фильтр, вложенный в воронку Цисты с фильтра собирали вручную под микроскопом

Стерилизация цист и приготовление суспензии яиц. Цисты промывали пять раз стерильной дистиллированной водой, затем пять минут в 70 % этиловом спирте для дезинфекции Для удаления остатков спирта цисты промывали пять раз стерильной дистиллированной водой Воду удаляли, а цисты слегка подсушивали в стерильных условиях, после чего хранили при 4 °С

Для извлечения яиц и приготовления суспензии яиц цисты разрушали с помощью стеклянного пестика в микропробирке Суспензию разрушенных цист и яиц разделяли путем процеживания через стальные сита с размером ячеек

54 мкм и 25 мкм Яйца собирали с сита с размером ячеек 25 мкм и пять раз промывали стерильной дистиллированной водой Затем суспензию яиц доводили до концентрации 500-800 яиц на ил я использовали в дальнейших экспериментах

Приготовление корневых диффузатов. Растения картофеля или сои выращивали в 100 мл вазонах на песчаном субстрате в течение 3 недель Растения вынимали из субстрата, корневые системы отмывали от песка Корни пяти растений помещали в 50 мл воды в 250 мл пластиковые стаканы Стаканы с растениями помещали на 24 часа при температуре 22 °С в камеру искусственного климата Затем растения извлекали, корневые диффузаты центрифугировали при 3 000 g в течение 20 минут Осадок удаляли, а полученный раствор стерилизовали путем фильтрования через целлюлозно-ацетатный бактериальный фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Приготовление гомогената цист. 100 стерильных цист каждого вида нематод помещали в микро-пробирки объемом 1,5 мл с 1,0 мл стерильной дистиллированной воды и гомогенизировали с помощью стеклянного пестика Гомогенат центрифугировали при И 300 g в течение 10 минут Супернатант отбирали с помощью автоматической пипетки, помещали в стерильные 1,5 мл пробирки и хранили при -20 °С

Приготовление гомогената яиц. Яйца нематод, выделенные из 100 цист, отделяли от фрагментов цист путем фильтрования через сита с размером ячеек 54-мкм и 25-мкм Яйца собирали с 25-мкм сита, помещали в 1,5 мл пробирки с 1,0 мл стерильной дистиллированной воды, гомогенизировали, центрифугировали и хранили, как описано выше

Приготовление гомогената оболочек цист и смывов с яиц и цист. 100 цист разрушали в 1,5 мл микро-пробирке стеклянным пестиком для освобождения яиц Полученную суспензию фильтровали через стальные сита с размером ячеек 54 мкм и 24мкм Фрагменты стенок цист собирали с сита 54 мкм и гомогенизировали стеклянным пестиком Полученный гомогенат центрифугировали 5 минут при 11 300 g Надосадочную жидкость отбирали и хранили при -20 °С

Один миллилитр стерильной дистиллированной воды добавляли к разрушенным стерильным цистам и свободным яйцам и личинкам Суспензию перемешали несколько раз с помощью пипетки и затем центрифугировали 5 минут при 11 300 g Надосадочную жидкость (ринзат) отбирали и хранили при -20 °С

Разделение водного экстракта гомогената яиц с помощью ультрафильтрации. По десять миллилитров гомогената цист или гомогената яиц, полученных, как описано выше, были фракционированы путем центрифугирования с использованием Centrifugal Filter Devices на центрифуге Jonan MR23I

Были использованы следующие мембраны и параметры центрифугирования MWCO 100, 1 100 g, 10 мин (фракция MWs >100кДа); MWCO 30, 2 000 g, 10 мин (фракция MWs 30 кДа -100 кДа), MWCO 5, 4 500 g, 10 мин (фракции MWs 5 кДа -30 кДа и MWs < 5 кДа)

Кроме того, исходные водные экстракты гомогената яиц (пробы 3 мд) были диализованы с использованием Spectra/Por® Float-A-Lyzer™ (MWCO 0,5) для удаления из гомогената веществ молекулярного веса менее 0,5 кДа Образцы гомогената были диализованы против 1 литра дистиллированной воды при температуре 22 °С в течение 24 часов Объем воды меняли два раза

Оценка индукторов вылупления. Для эксперимента брали по одному миллилитру суспензии стерильных яиц нематод в стерильной дистиллированной воде и помещали в ячейки 24-луночных полистироловых планшетов В каждой ячейке под стереомикроскопом МБС-10 подсчитывали количество яиц и личинок Между подсчетами планшеты инкубировали в термостате при 20 °С Личинки подсчитывали каждые три дня для установления исходного количества вылупившихся личинок на начало эксперимента.

В экспериментах по 100 мкл тестируемых веществ добавляли в ячейки на 7-10 день, после того как в ячейки помещали суспензию яиц Корневые диффузаты картофеля (КДК), сои (КДС) или водный раствор ZnS04 (ЗмМ) добавляли как положительный контроль, а стерильную дистиллированную воду

(СДВ) как отрицательный контроль Вылупившиеся личинки подсчитывали каждые 3-4 дня в течение одного месяца после внесения веществ

Суспензионная культура клеток табака Суспензионную культуру Nicotiana tabacum L (сорт Wisconsin 38, штамм 217) выращивали при 25°С с постоянным освещением на качалке (R = 2,5 см; 100 об/мин), в 250 мл колбах (70 мл суспензии клеток) в жидкой среде, содержащей соли Мурасиге и Скуга; витамины Нитча, сахарозу - 30 г/л, мио-инозитол - 400 мг/л, а-нафтален-уксусную кислоту, НАА - 1мг/л; N-бензиладенин - 230 мкг/л; рН - 5,5 Для опытов использовали клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста (5, 6 и 7 дней после отсева) Для получения свежей суспензионной культуры 8 мл десятидневной культуры добавляли к 60 мл питательной среды

Реакция защелачивания питательной среды. Для измерения защелачивания питательной среды аликвоту суспензионной культуры объемом 8 мл помещали в открытые 20 мл пузырьки на роторный шейкер (150 об/мин) Значение рН измеряли и фиксировали данные при помощи самописца

Оценка способности водных экстрактов гомогеиата яиц G. rostochiensis индуцировать устойчивость табака к вирусу табачной мозаики (ВТМ). Растения табака (N tabacum cv Xanthi (NN)) были выращены до стадии шестого листа (в течение 3 недель) в вазонах с почвой в камере искусственного климата при относительной влажности 60 % и при температуре 24 °С в дневной и ночной периоды (12 часов каждый) По пять отделенных от растения листьев табака для каждого варианта обрабатывали водными экстрактами гомогената яиц (одна половина листа) и водой (другая половина листа) натиранием с карборундом. Одновременно обе половины листьев инокулировали водной суспензией ВТМ (сок инфицированного растения предварительно разводили в 20 000 раз и наносили в количестве 30 мкл на каждую половину листа) Листья помещали во влажную камеру при температуре 22 °С Число инфекционных пятен подсчитывали через три дня после инокуляции

Инфильтрация водного экстракта гомогената яиц G. rostochiensis в листья табака. Растения табака выращивали при вышеуказанных условиях

Исследуемые образцы водного экстракта гомогената яиц инфильтровали в листья при помощи медицинского шприца без иглы.

Анализ данных. Процент вылупления рассчитывали как отношение разницы количества исходных личинок и личинок на день учета к общему количеству яиц в ячейке на начало эксперимента умноженное на 100.

Достоверность различий между отдельными вариантами опытов оценивали по Т - критерию Student при 5 % уровне значимости.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение влияния эндогенных факторов на вылупление личинок

В данной работе было изучено влияние различных компонентов цист нематоды G rostochiensis на вылупление личинок из яиц Кроме того, было изучено влияние компонентов цист этой нематоды на вылупление личинок другой цистообразующей нематоды Н glycines

Компоненты цист как индукторы вылупления. Для проведения экспериментов цисты разделяли на следующие компоненты оболочки цист, яйца и водные смывы с поверхности стенок цист и яиц Затем стенки цист и яйца гомогенизировали в воде отдельно друг от друга и получали водные экстракты гомогенатов Нерастворившиеся компоненты всех полученных водных суспензий отделяли центрифугированием Надосадочные жидкости испытывали на способность индуцировать или ингибировать вылупление личинок нематод из яиц (Табл 1). В качестве отрицательного контроля использовали стерильную дистиллированную воду, а для контроля жизнеспособности нематод - корневые диффузаты картофеля, корневые диффузаты сои и индуктор вылупления ZnS04

Было показано, что компоненты цист с разной эффективностью влияют на вылупление личинок нематод из яиц Так на 20 день после внесения в суспензию яиц водного экстракта из неразделенных на компоненты цист G rostochiensis и Н glycines общее количество вылупившихся личинок как одного, так и второго вида составило около 13 % (Табл 1) Количество личинок

в варианте с водным экстрактом из гомогената яиц обоих видов нематод существенно не отличалось от этого показателя

Таблица 1 Влияние водных экстрактов из различных компонентов цист на вылупление личинок G. rostochiensis и Н glycines

Компоненты цист Вылупление личинок (% от

количества яиц в исходной суспензии)

G rostochiensis Н glycines

Стерильная дистиллированная вода 1,7 ±1,2 2,2 ±1,7

Водный экстракт из гомогената цист 13,1 ±1,8 13,2 ±5,5

Водный экстракт из гомогената яиц 15,4 ±7,2 13,2 ± 3,2

Водные смывы с поверхности цист и яиц 8,8 ±1,3 5,1 ± 1,4

Водный экстракт гомогената стенок цист 8,3 ± 2,6 4,7 ± 1,1

Корневые диффузаты 52,7 ± 8,3 15,1 ± 4,8

Водный раствор 2п804 (ЗмМ) 9,7 ±3,6 32,2 ± 6,7

t<0 05

При этом водные смывы с поверхности стенок цист и водные экстракты из гомогената стенок цист G rostochiensis индуцировали вылупление более эффективно (около 9 %), чем те же варианты Н glycines (около 5 %) Вылупление личинок обоих видов нематод было в 1,5-2 раза меньше, чем при внесении водных экстрактов их гомогенатов яиц

Влияние концентрации водного экстракта гомогенатов яиц на вылупление личинок. При оценке зависимости уровня вылупления личинок G rostochiensis и Н glycines от количества цист (от 10 до 200 цист на один миллилитр воды), использованных для приготовления экстрактов, наибольшее количество вылупившихся личинок G rostochiensis наблюдалось при использовании экстракта в концентрации 50 цист/мл (Рис 1) При дальнейшем увеличении концентрации уровень вылупления выходил на плато и снижался

Рисунок 1 Зависимость вылупления личинок G rostochiensis и Н glycines от концентрации внесенного в суспензию яиц водного экстракта из гомогената

Для Н glycines наиболее эффективной оказалась концентрация экстракта 100 цист/мл, при дальнейшем увеличении концентрации наблюдалось лишь несущественное увеличение уровня вылупления При этом было отмечено совпадение уровней вылупления личинок обоих видов нематод при использовании водных экстрактов гомогенатов яиц из 100 цист

Влияние температурного воздействия на активность водных экстрактов из гомогенатов яиц. Для определения стабильности водных экстрактов гомогената яиц G rostochiensis и Н glycines был проведён опыт с воздействием на них низких и высоких температур Экстракт яиц G rostochiensis не потерял способность индуцировать вылупление личинок как после многократного замораживания-оттаивания, так и после кипячения (Рис. 2)

Замораживание-оттаивание экстракта яиц Н glycines так же не снижало его способность индуцировать вылупления В то же время нагревание экстракта яиц этой нематоды привело к снижению его активности как индуктора вылупления, более чем в 2 раза Полученные данные дают основание полагать, что устойчивость к тепловым воздействиям индукторов вылупления G rostochiensis и Н glycines различна

замораживания кипячения вода

Рисунок 2 Вылупление личинок G. rostochiensis it Н. glycines на 20 день после внесения в суспензию яиц водного экстракта гомогената яиц, экстракта после многократного замораживания и размораживания и экстракта после кипячения.

Молекулярный вес индукторов выл у плени я. Для того чтобы Определить молекулярный аес индукторов »ы луп л синя. водные экстракты из гомогенатов яиц G. rostochiensis и Н. glycines разделяли путем центрифугирования с использованием Centrifugal Filler Devices Millipore.

СДВ >100«Да ЭСИСЮкДе 5-ЗОкДа <5*Дэ Посг,е Исходный кдк

диализа экстраст

Рисунок 3. Влияние фракций водного экстракта из гомогената яиц с различным молекулярным весом водорастворимых веществ на вылупление личинок

С. ro.stochiefi.5i5.

Фракции водного экстракта из гомогената яиц б. гШосЫеша с молекулярным весом водорастворимых веществ 50О0Да и ниже показали наибольшую индуцирующую вылупление личинок активность (Рис. 3). Фракции с молекулярным весом водорастворимых веществ более 5000 Да индуцировали вылупление личинок на уровне отрицательного контроля.

Очистка исходного водного экстракта из гомогената яиц б. ro.4tochien.sis с помощью диализа от веществ с молекулярным весом менее 500 Да не повлияла на активность последнего, как индуктора вылупления (Рис. 3). Таким образом, можно предположить, что молекулярный вес индукторов вылупления находится в пределах от 500 до 5000Да.

Определение природы индуктора вылупления. Обработка водных экстрактов из гомогената яиц протеин аз ой К. Обработка водного экстракта из гомогената яиц протеиназой К вдвое снизила его активность как индуктора вылупления личинок (7. гоз^сМепяЬ из яиц по сравнению с исходным экстрактом (Рис. 4). Таким образом, можно предположить, что некоторые индукторы вылупления в водном экстракте из гомогената яиц имеют белковую природу, поскольку активность водного экстракта после протеолиза существенно снизилась.

40 4-

| 30-1-

I 1 ^ 20 ■

1ЙГ

сдв

Исходный Экстракт + РгК экстракт

н.

,«

■щ-

кдк

Рисунок 4 Вылупление личинок (?. го51ос}иеж1Х при внесении в суспензию яиц водных экстрактов из гомогената яиц, обработанных протеиназой К.

Определение содержания белков во фракциях. После того, как было установлено, что индукторы вылупления, возможно, имеют белковую природу, было определено суммарное количество белка (по Бредфорду) в каждой фракции водного экстракта из гомогената яиц G rostochiensis и Н glycines (Табл 2).

Таблица 2 Содержание общего белка в водных фракциях водного экстракта гомогената яиц б гоШсУлепь^

№ Вариант А 595 концентрация белка (мкг/мл)

1 Гомогенат яиц 100 цист/мл 0,28 1,75

2 Смывы с поверхности яиц 0,13 0,55

3 Гомогенат стенок цист 0,15 0,65

4 Фракция >100 кДа 0,33 2,70

5 Фракция 30-100 кДа 0,18 0,80

6 Фракция 5-30 кДа 0,22 1,10

7 Фракция < 5 кДа 0,10 0,40

Максимальное содержание белка было отмечено в исходном гомогенате яиц и во фракции с весом более 100 кДа Фракция весом ниже 5 кДа, показавшая наибольшую активность в тестах по изучению вылупления личинок, содержала очень низкое количество белков Таким образом, можно предположить, что если индукторы, содержащиеся в данной фракции действительно белковой природы, то они действуют в очень низких концентрациях

Влияние компонентов цист G. rostochiensis и Н. glycines на вылупление личинок G. rostochiensis. Вылупление личинок G rostochiensis при внесении экстрактов яиц этой нематоды составило около 15 %, а при внесении экстрактов яиц Н glycines в два раза ниже (Рис 5) Такую же картину наблюдали при внесении водных смывов с поверхности яиц этих двух нематод 5 % и 3 % соответственно

Влияние компонентов цист G. rostochiensis и Н. glycines на вылупление личинок Н. glycines. Вылупление личинок Н glycines при внесении экстрактов яиц и смыва с поверхности яиц G rostochiensis составило

около 2 % (Рис, 6). Вылупление личинок И. glycines при внесении экстрактов яиц и смыва с поверхности яиц Н. glycines составило около 13% и 5%, соответственно.

'Г

Гочогвпати*

G. rostochfonsis

| 15 - .........

Воя*

вмМи ижвипч, ,

т Cvb.fir.

|Ч. ДОМ*

■

Рисунок 5. Вылупление личинок G. rostochiensis при внесении в суспензии яиц экстрактов из гомогената ниц или смывов с поверхности яиц G. rostochiensis и II. glycines на 20 день после внесения.

InSOi

Рисунок 6 Вылупление личинок Н, glycines при внесении в суспензии яиц экстрактов из гомогената яиц или смывов с поверхности яиц G. rostochiensis и Н. glycines на 20 день после внесения.

На основании представленных данных можно сделать вывод, что действие экстрактов яиц двух видов нематод на родственный вид является специфичным. Экстракты яиц G. rostochiensis не являются индукторами вылупления для II. glycines, а экстракты яиц Н. glycines значительно менее

эффективны в качестве индукторов вылупления для G rostochiensis, чем экстракты яиц этой нематоды То есть механизмы вылупления этих двух видов нематод отличаются, по крайней мере, рецепторами, взаимодействующими с индукторами

Изучение индукции защитных ответов растений

Индуцирование устойчивости табака к ВТМ с использованием водного экстракта из гомогената яиц G. rostochiensis. После инокуляции листьев растений табака сорта Xanthy NN ВТМ через 3 дня в местах проникновения вирусных частиц образуются некротические пятна При обработке листьев индукторами устойчивости реакция растения на вирус ускоряется, и некротические пятна образуются более мелкие, иногда не различимые невооруженным глазом

В опыте половинки отсеченных листьев табака одновременно обрабатывали водным экстрактом из гомогената яиц G rostochiensis и суспензией ВТМ (одна половина листа), а другие половинки служили контролем, их обрабатывали водой и ВТМ Контрольные листья инокулировали только ВТМ (обе половинки листа) Количество некротических пятен, образовавшихся через три дня, было значительно ниже на половинках листьев, обработанных гомогенатом яиц G rostochiensis, по сравнению с контрольными половинками листьев, а также контрольными листьями (Рис 7)

Оценка способности водных экстрактов из гомогеиатов яиц разных видов нематод индуцировать реакцию сверхчувствительности (СВЧ) у табака. Для того чтобы определить распознается ли элиситор (элиситоры) из гомогената яиц G rostochiensis (20 цист/мл) табаком как видоспецифический элиситор, были проведены опыты по инфильтрации его в листья табака Также были проведены опыты по инфильтрации в листья табака гомогенатов яиц Н glycines (непатоген табака) и М incognita (патоген табака) в такой же концентрации, что и для гомогената из G rostochiensis (20 цист/мл) Ни один из исследуемых гомогенатов не приводил к развитию СВЧ реакции на листьях

табака. Такие результаты предполагают не специфичность действия элиситора из гомогената яиц этих нематод по отношению к табаку.

140 120 §1<Я

Iе0

I ео

3 40

го

О Опыт {ВТМ + Гомогензт) I ■ Контроль -v Вода)

]

НЙ^Н

Рисунок 7 Влияние обработки листьев водным экстрактом из гомогената яиц G. rostochiensis на заражение ВТМ,

Оценка элиситорной активности водных экстрактов из гомогенатов яиц нематод в случаях как совместимого, так и несовместимого взаимодействий. Была проведена оценка ответов суспензионной культуры клеток табака на водные экстракты из гомогената яиц трех видов нематод М. incognita (патоген табака), G. rostochiensis (непахотен табака) и Н. glycines (непатоген табака).

Концентрации экстрактов из гомогенатов, добавляемых к клеткам табака, были одинаковы для всех изучаемых видов нематод. Для контроля способности клеток табака отвечать на элиситоры зашелачиванием среды использовали пептид, состоящий из 15 аминокислотных остатков (csplS) представляющий собой консенсусную последовательность бактериальных белков холодового шока в области РНК-связывающих мотивов RNP-1 и RNP-2. Этот пептид стабильно вызывает классический ответ а виде зашелачиванмя среды в суспензионной культуре клеток табака.

Было показано, что элиситорная активность водных экстрактов из гомогенатов G. rostochiensis и Н. glycines сходна с активностью пептида cspl 5 и даже выше. Тем не менее, скорость ответа на пептид cspI5 была выше (на

четвертой минуте), чем на экстракты из гомогенатов яиц (на восьмой минуте) Различие в скорости ответа может быть обусловлено различной доступностью для элиситоров гипотетических рецепторов клеток Элиситорная активность гомогенатов G rostochiensis из яиц или цист находилась на сходном уровне Клетки табака реагировали сильнее на водные экстракты из гомогената непатогенных нематод (G rostochiensis и Н glycines) Ответ клеток табака на водные экстракты из гомогената М incognita был гораздо слабее (Рис 8)

Время, мин

Рисунок 8 Элиситорная активность водных экстрактов гомогенатов яиц различных нематод

Зависимость элнснторной активности водного экстракта из гомогената яиц С. гоя/осйгеиш от его концентрации. В эксперименте были исследованы три концентрации водного экстракта из гомогената яиц С? «м/ос/неи^ы 10,25 и 50 мкл на 8 мл суспензионной культуры клеток табака Было показано, что степень защелачивания зависит от концентрации гомогената из яиц С гоя^сЫетк и высокие концентрации гомогената вызывают более быстрый и сильный ответ, чем низкие концентрации

Изучение стабильности элиситора в водном экстракте из гомогената яиц <7. гоБ^сЫетк. Элиситорная активность экстрактов из гомогената яиц С гох^сЫетгз после нагревания в течение 10 минут на кипящей водяной бане лишь незначительно снижалась после термической обработки Такие результаты указывают на термостабильность элиситора (элиситоров) Однако

наблюдалась потеря элиситорной активности экстракта после нескольких циклов замораживания-размораживания

Определение фракций водного экстракта гомогената яиц & гоя^сН1епя1$ обладающих элиситорной активностью. Из водного экстракта гомогената цист О говЬосЫепвгз при помощи ультрафильтрации через мембранные фильтры были получены фракции с различными молекулярными весами водорастворимых веществ: > 100 кДа, 30-100 кДа, 5-30 кДа и < 5 кДа Элиситорной активностью обладала только фракция с молекулярным весом более 100 кДа, но эта активность была ниже, чем у исходного гомогената яиц

Обработка исходного экстракта протеиназой К не приводила к существенному снижению его активности, как индуктора защитных ответов в суспензионной культуре клеток В то же время обработка протеиназой К фракции с молекулярным весом более 100 кДа привела к значительному увеличению ее элиситорной активности

Эти данные позволяют предположить, что индуктор защитных ответов не белковой природы. С чем связано увеличение элиситорной активности высокомолекулярной фракции после протеолиза пока остается не выясненным, вероятно, протеиназа К расщепляет белки маскирующие активные центры элиситоров в этой фракции

Изучение экзогенных регуляторов вылупления личинок

Компактин. В процессе работы было показано, что компактен подавлял процесс вылупления личинок в гоз^сЫетш сам по себе и на фоне применения индукторов вылупления При добавлении компактина к водному экстракту из гомогената яиц или к корневым диффузатам картофеля их активность снижалась в полтора-два раза по сравнению с исходными растворами (Рис 9) Вылупление личинок из яиц в воде и при внесении компактина было статистически одинаковым

Фосфонистые производные аминокислот и хитозан. ФПА способны ингибировать ацетил-СоА зависимые пути биосинтеза, например, образование поликетидов Была показана эффективность совместного использования этих

веществ и сгатинов в качестве фунгицидов, возможно, действующих за счёт торможения биосинтеза стеринов, В данной работе ФПА были испытаны в качестве индукторов вылупления личинок нематоды G, rostochiensis и И\ glycines.

□ Без добавления компактина ■ С добавлением компактана

Дистиллированная вода

Экстракты гомогената яиц

кдк

Рисунок 9 Влияние компактна на вы луп пение личинок G. rostochiensis из яиц на 25 день после внесения.

Было показано, что на 20 день после внесения А1а-Рн, Asp-Ран, Ser-Рн и Leu-Рн вылупленне личинок G. rostochiensis из яиц в варианте с применением ФПА аспарагиновой кислоты (Asp Рн) составило 12% от начального количества яиц в суспензии. ФПА аланина (Ala Рн), лейцина (Leu Рн) и серина (Ser Рн) не оказывали существенного влияния на процесс вылупления личинок G. rostochiensis из я ни (Рис. 10). В контроле вылупленне личинок составило 45 % от исходного числа яиц.

Хитозан (17кДа) при применении в чистом виде не индуцировал вылупленне личинок из яиц. В то же время при добавлении хитозана к ФПА аспраги новой кислоты активность последней снизилась в 1,5 раза.

Следующим шагом по изучению действия ФПА и хитозана стало определение их влияния на вылупление личинок из яиц Н. glycines. Не смотря на то, что G. rostochiensis и Н. glycines являются близкородственными видами, их реакции на одни и те же индукторы вылупления оказались различными. IIa 20 день после внесения веществ процент вылупления личинок Н. glycines

составил от 6,5 до 32 %, Суммарное вылупление при внесении в суспензию яиц фосфонистого производного аспарагиновой кислоты Asp Рн составило около 6% (Рис. II). Вылупление при внесении производных других аминокислот, таких как Ala Рн, Leu Рн и Ser Рн составило 13 %, 20 % и 10 % соответственно. Наибольшую активность показало фосфонистое производное лейцина Leu Рн

При добавлении к суспензии яиц фосфонистых производных аминокислот и хитозана 17 кДа активность производных аминокислот снижалась не значительно, то есть хитозан ни индуцирующего, ни ингибирующего воздействия на вылупление личинок Н. glycines не оказывал.

еда

Asp Рм

КДК

Рисунок 10 Влияние препаратов на основе ФПА и их смеси с хитозаном на вылупление личинок G. rostochiensis из яиц.

Рисунок И Влияние препаратов на основе ФПА и их смеси с хитозаном на вылупление личинок Н, glycines из яиц.

При изучении влияния ФП аспарагиновой кислоты на вылупление личинок G rostochiensis из цист в вегетационных экспериментах были подтверждены данные, полученные в условиях т vitro Максимальное вылупление личинок и заражение корней картофеля было в вариантах с применением фосфонистых производных аспарагиновой кислоты

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные результаты позволяют заключить, что в водных экстрактах из гомогената яиц цистообразующих нематод G rostochiensis и Н glycines присутствуют вещества, способные индуцировать вылупление личинок этих нематод из яиц Эти индукторы являются специфичными для каждого вида нематод Индукторы вылупления из яиц G rostochiensis способны сохранять активность после кипячения и многократного замораживания В то же время нагревание до 100°С экстрактов из яиц Н glycines снижает их индуцирующую вылупление активность в два раза

Снижение активности экстрактов яиц G rostochiensis после проведения ферментативного гидролиза с использованием протеиназы К, позволяет предположить, что в состав индуктора (или индукторов) вылупления входит термостабильная белковая составляющая Было показано, что индуцирующей активностью обладала фракция экстракта яиц с молекулярной массой водорастворимых веществ менее 5 кДа

Было показано, что активные соединения на основе фосфиновых аналогов природных аминокислот и компактина могут выступать в качестве потенциальных противонематодных агентов

Экстракты из гомогенатов яиц содержат так же вещества, способные защищать растения табака от ВТМ Противовирусная активность компонентов цист не была показана ранее и интересна для дальнейшего исследования

5. ВЫВОДЫ

1 При изучении эндогенных факторов вылупления личинок из яиц цистообразующих нематод (оболочки цист, яйца и водные смывы с поверхности стенок цист и яиц) впервые показана индуцирующая активность всех исследованных компонентов Наибольшей индуцирующей активностью обладали водные экстракты гомогенатов яиц;

2 Индукторы вылупления личинок, выделенные из экстрактов яиц цистообразующих нематод G rostochiensis и Н glycines видоспецифичны Опыт по перекрестному испытанию их на вылупление личинок показал отсутствие индуцирующей активности в отношении тестируемых видов,

3 Индукторы вылупления в экстрактах яиц G rostochiensis термостабильны После кипячения и многократного замораживания их индуцирующая активность сохраняется Индуцирующая активность экстрактов яиц Н glycines при нагревании 100 °С снижается в два раза,

4 Молекулярная масса индуцирующей фракции в водном экстракте гомогената яиц менее G rostochiensis 5 кДа,

5 На модельной системе табак — вирус табачной мозаики впервые выявлено действие экстрактов яиц, как неспецифических индукторов устойчивости растений Элиситорным действием обладали экстракты из яиц с молекулярным весом более 100 кДа,

6 При изучении экзогенных факторов на процесс вылупления личинок цистообразующих нематод установлены различия в реакции разных видов нематод на одни и те же индукторы Фосфонистые производные аспарагиновой кислоты стимулировали выход личинок G rostochiensis, и не выступали как индукторы вылупления личинок Н glycines

1 Компактин - ингибитор синтеза стеринов оказывал ингибирующее действие на вылупление личинок цистообразующих нематод

8 Выявленные в ходе проведенных исследований природные регуляторы процесса вылупления личинок из яиц могут служить основой для разработки новых средств защиты растений от паразитических нематод.

6. ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ

1 Романенко, Н. Д, Джавахия, В Г, Попов, И О , Приданников, М. В. (2002)

Изучение распространения золотистой картофельной цистообразующей нематоды - Globodera rostochiensis и оценка пораженности ею сортов картофеля Тезисы докладов первой всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям С -Петербург, 2002г с -222-223

2 Романенко, Н. Д., Джавахия, В Г., Попов, И О, Приданников, М. В. (2002)

Изучение распространения Globodera rostochiensis и оценка нематицидной активности компактина и ловастатина в борьбе с ней Материалы докладов научной конференции "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (зоонозы)", выпуск 3 M, 2002 , с - 251-253

3 Романенко, Н. Д, Джавахия, В Г , Попов, И О , Приданников, М. В. (2002)

Изучение эффективности экологически безопасных способов борьбы с золотистой цистообразующей нематодой Globodera rostochiensis Материалы докладов научной конференции "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (зоонозы)", выпуск 3 M, 2002 , с. - 253-254

4 Приданников, М. В., Петелина, Г Г, Пальчук, M В, Воинова, T. M,

Джавахия, В Г (2003) Изучение возможности использования компактина и ловастатина в защите растений от фитопатогенов и вредителей Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии Материалы Всероссийского совещания 16-18 июля 2003г, Голицыно 2003, с.-179-181

5 Хомутов, Р M, Приданников, М. В., Петелина, Г. Г, Пальчук, M В,

Джавахия, В Г (2003) Препараты на основе хитозана как индукторы устойчивости картофеля к золотистой цистообразующей нематоде картофеля. Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии Материалы Всероссийского совещания 16-18 июля 2003г, Голицыно 2003 , с. - 191-192

6 Romanenko, N. D , Dzhavakhia, V G, Popov, I О, Pridannikov, M. V. (2004)

Studying of biological and economical efficiency of using physiologically active substances and nematicidic bioagents m struggle against cyst-formmg

nematode - Globodera rostochiensis and Heterodera glycines Abstracts of

XXVII International Symposium European Society of Nematologists, Rome, 14-18 June 2004, p -105.

7 Приданников, M. В., Петелина, Г Г, Пальчук, М В (2005) Влияние

водного раствора экстракта из гомогенизированных яиц Globodera rostochiensis на отрождение инвазионных личинок в экспериментах "ш vitro" Материалы докладов научной конференции Теория и практика борьбы с паразитарными заболеваниями, 6, с - 290-291

8 Pridannikov, М. V., Petelma, G. G, Paltchuk, М V. (2006) Globodera

rostochiensis cyst components induce its egg hatching in vitro. Abstracts of

XXVIII International Symposium European Society of Nematologists, Blagoevgrad, Bulgaria, 5-9 June 2006, p - 114

9 Приданников, M. В., Петелина, Г Г, Пальчук, М В, Джавахия, В Г

(2006) Индукция отрождения личинок золотистой картофельной нематоды Защита и карантин растений. 9, с - 35-36

10 Украинцева, С А, Приданников, М. В., Джавахия, В Г (2007) Компактен -

потенциальный биопестицид. Защита и карантин растений (в печати)

11 Mikhail V. Pridannikov, GalinaG Petelma, Manna V Palchuk, Edward P.

Masler and VitalyG Dzhavakhiya (2007) Influence of Globodera rostochiensis cyst components on G rostochiensis egg hatching m vitro Nematology (в печати)

Автор благодарен своим научным руководителям Виталию Георгиевичу Джавахия и Николаю Демьяновичу Романенко за поддержку в ходе выполнения работы Особая благодарность Петелиной Г Г., Пальчук М В и Дебловой 3 Н за помощь в проведении экспериментов Кроминой К А за помощь в проведении экспериментов с индукцией устойчивости на табаке и суспензионной культуре клеток табака. Щербаковой JIА и Шумилиной Д В за ценные замечания и обсуждение результатов в ходе исследования Спасибо всем сотрудникам лаборатории молекулярной биологии ВНИИ фитопатологии за помощь и дружеское отношение

Особую благодарность автор выражает Эдварду Маслеру за неоценимую помощь в написании статьи в журнал Nematology

Подписано в печать 21 09 2007 г Исполнено 21 09 2007 г г Печать трафаретная

Заказ № 757 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Приданников, Михаил Викторович

Введение.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Возбудители глободерозов и гетеродерозов.

1.2 Жизненный цикл цистообразующих нематод.

1.3 Факторы вылупления личинок цистообразующих нематод.

1.3.1. Влияние физических факторов на вылупление личинок.

1.3.2. Природные индукторы вылупления личинок цистообразующих нематод.

1.3.1 Искусственные индукторы вылупления нематод.

1.3.4. Ингибиторы вылупления нематод.

1.3.5. Компоненты цист как индукторы или ингибиторы вылупления

1.3.6. Стадии процесса вылупления.

1.4 Новые направления в защите растений от фитопаразитических нематод.

Глава 2 Материалы и методы исследований.

2.1 Материалы.

2.1.1 Химические вещества, использованные в работе.

2.1.2 Нематоды, использованные в работе.

2.2 Методы.

2.2.1 Приготовление инокулюма.

2.2.2 Экстракция цист из субстрата.

2.2.3 Стерилизация цист и приготовление суспензии яиц.

2.2.4 Приготовление корневых диффузатов.

2.2.5 Приготовление гомогената цист и яиц.

2.2.6 Приготовление гомогената оболочек цист и смывов с яиц и цист.

2.2.7 Определение общего белка по методу Бредфорда.

2.2.8 Нагревание и замораживание гомогената.

2.2.9 Разделение водного экстракта гомогената яиц по молекулярному весу растворенных веществ.

2.2.10 Белковый электрофорез по Лэмли.

2.2.11 Оценка регуляторов вылупления.

2.2.12 Оценка индукции защитных ответов на суспензионной культуре клеток табака.

2.2.13 Проверка индукторов в системе «Табак - ВТМ».

2.2.14 Анализ данных.

Глава 3 Результаты исследований и их обсуждение.

3.1 Изучение влияния эндогенных факторов на вылупление личинок.

3.1.1 Компоненты цист как индукторы вылупления.

3.1.2 Влияние концентрации водного экстракта гомогенатов яиц на вылупление личинок.

3.1.3 Влияние температурного воздействия на активность водных экстрактов из гомогенатов яиц.

3.1.4 Молекулярный вес индукторов вылупления.

3.1.5 Определение природы индуктора вылупления.

3.1.6 Влияние компонентов цист G. rostochiensis и Я. glycines на вылупление личинок G. rostochiensis.

3.1.7 Влияние компонентов цист G. rostochiensis и Я glycines на вылупление личинок Я glycines.

3.2 Действие водных экстрактов гомогената яиц G. rostochiensis как индукторов устойчивости растений к фитопатогенам.

3.2.1 Антивирусная активность экстрактов из гомогената яиц.

3.2.2 Индукция раннего защитного ответа.

3.3 Изучение экзогенных регуляторов вылупления личинок.

3.3.1 Компактен.

3.3.2 Фосфонистые производные аминокислот и хитозан.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Индукторы вылупления личинок цистообразующих нематод сем. Heteroderidae (Skarbilovich) и перспективы их использования для защиты растений"

Седентарные цистообразующие нематоды семейства Heteroderidae -облигатные паразиты корневой системы растений - относятся к отряду Tylenchida. Эти нематоды принадлежат к числу наиболее опасных и экономически значимых патогенов сельскохозяйственных культур во всем мире, в том числе и России; некоторые представители этих паразитов включены в карантинный список Европейской организации по защите растений (ЕОЗР). Среди растений-хозяев этих нематод многие важные продовольственные культуры: зерновые (пшеница, овес, ячмень), овощные (картофель, все виды свеклы, капуста, морковь и некоторые другие), из кормовых культур многие виды бобовых и злаковых трав, а также некоторые декоративные культуры и большое число видов дикой и сорной растительности. Последние являются резервантами этих нематод в природе. Гетеродериды хорошо адаптированы к условиям обитания и способны длительное время сохранять жизнеспособность (от одного года до 8-10 лет) без кормового растения. Особо опасными патогенами на территории Российской Федерации, вызывающими большие потери урожая зерновых, овощных культур и картофеля, являются пшеничная цистообразующая нематода (.Heterodera filipjevi), свекловичная цистообразующая нематода (Я. schachtii), соевая цистообразующая нематода (Я. glycines), и золотистая картофельная нематода (Globodera rostochiensis). Эта нематода является возбудителем глободероза картофеля - очень широко распространенного и наиболее вредоносного заболевания этой культуры на территории России. По данным карантинной службы G. rostochiensis зарегистрирована более чем в 60 областях и краях Российской Федерации на площади более 50000 гектар. По данным литературы, в России на отдельных сильно зараженных приусадебных участках урожай картофеля снижается на 80 %, а в среднем на зараженных очагах паразит снижает урожайность картофеля до 30-40 % (Шестеперов, Савотиков, 1995). На каждом сильно зараженном растении нередко образуется только 1 -2 маленьких клубня, а в некоторых случаях последние могут и совсем отсутствовать. Картофельная нематода - карантинный объект, поэтому она не только причиняет прямой вред картофелеводству, но и дезорганизует семеноводство картофеля и препятствует развитию внутренних и международных торговых связей. Из зараженных хозяйств нельзя вывозить не только картофель, но и саженцы деревьев, кустарников, декоративных растений.

Традиционный химический метод регулирования численности нематод дорог и малоэффективен. К тому же, наиболее эффективные нематициды обладают высокой токсичностью для человека и теплокровных животных. Так как химический метод борьбы с цистообразующими нематодами связан большими затратами и к тому же не дает полной эффективности, то в последнее время все больше внимания уделяется изысканию биологических мер борьбы с ними. Основными методами регулирования численности и вредоносности цистообразующих нематод в почве являются применение систем севооборота с использованием видов растений, не являющихся хозяевами этих паразитов, что не всегда является экономически выгодным для сельхозпроизводителей. На практике весьма эффективным методом борьбы оказалось широкое применение устойчивых сортов растений, сильное обеззараживающее действие которых основано на стимуляции ими вылупления анабиотических личинок паразита из цист, и последующей их гибелью, так как они не могут развиваться в корнях устойчивых растений. Находясь в цистах, и при отсутствии растений-хозяев анабиотические личинки в течение многих лет могут сохранять свою жизнеспособность. Под влиянием корневых выделений картофеля происходит их вылупление, выход из цист и проникновение в корни растений. В корнях развивающиеся личинки хорошо защищены от воздействия внешней среды: попытки их уничтожения обычно приводят к гибели растения.

Единственным слабым звеном в развитии паразита с точки зрения борьбы следует считать вторую личиночную стадию, т.е. инвазионных личинок, только что вылупившихся из яиц и вышедших из-под защиты оболочек цист, но еще не успевших внедриться в корни растений. Такие личинки легко подвергаются воздействию внешних факторов и в случае отсутствия растения-хозяина быстро погибают. В настоящее время проводятся многочисленные исследования отдельных стадий развития нематод с целью выявления звеньев, воздействие на которые приводило бы к возможности регулирования численности паразитов. Среди них гормональные процессы (линька и размножение), синтез ферментов, энергетический метаболизм (дыхательные процессы), транспортные системы (мембранные функции), нейропередача, синтез коллагена (формирование стенки тела) и синтез ДНК. Влияние на эти мишени может оказываться как непосредственно, так и путем индукции защитных механизмов растения-хозяина.

Вылупление личинок из яиц - это исходный пункт активной жизни паразита. Тщательное изучение специфики процесса вылупления личинок имеет первостепенное значение не только с теоретической, но и с практической точки зрения. Изучение активности природных стимуляторов и ингибиторов процессов вылупления является предпосылкой для разработки новых методов борьбы с цистообразующими нематодами, связанных с использованием естественных, эволюционно-выработанных механизмов взаимоотношений в системе растение - нематоды.

Цели и задачи исследований

Основной целью данных исследований был поиск и исследование природных регуляторов процессов, связанных с вылуплением личинок цистообразующих нематод и изучение возможности применения этих веществ для защиты растений. В связи с этим в задачи этой работы входило:

1. Исследование действия эндогенных факторов (компонентов цист) на вылупление личинок цистообразующих нематод (G. rostochiensis и Н. glycines).

2. Изучение природы веществ, выделенных из водных экстрактов гомогенатов яиц G. rostochiensis и Н. glycines и стимулирующих вылупление личинок этих нематод;

3. Исследование действия биологически активных соединений (компактина, аминофосфинатов, хитозана) на вылупление личинок G. rostochiensis и Н. glycines',

4. Проверка водных экстрактов гомогенатов яиц G. rostochiensis на способность индуцировать защитный ответ растений в системе «Табак -Вирус Табачной Мозаики (ВТМ)».

Научная новизна исследований.

1. Впервые показано, что водные экстракты гомогената яиц G. rostochiensis способны активизировать процессы вылупления личинок этой нематоды из яиц;

2. Впервые показана способность водных экстрактов гомогената яиц G. rostochiensis индуцировать устойчивость табака к ВТМ;

3. Впервые показана способность фосфиновых аналогов аспарагиновой кислоты индуцировать вылупление личинок G. rostochiensis из яиц.

Практическая значимость работы.

1. Модифицирована методика проведения лабораторного эксперимента по изучению действия различных веществ в качестве индукторов или ингибиторов вылупления личинок нематод, что позволило быстро и с достаточно высокой достоверностью определять активность влияния тех или иных веществ на процесс вылупления личинок цистообразующих нематод из яиц;

2. Полученные данные об индукторах вылупления, содержащихся в цистах G. rostochiensis и Н. glycines, могут послужить основанием для начала разработки принципиально новых подходов контроля цистообразующих нематод, таких как индукция вылупления анабиотических личинок в отсутствии растения - хозяина;

3. Показано, что вещества, содержащиеся в экстрактах яиц G. rostochiensis, обладают антивирусной активностью, что может быть важным для дальнейшего их изучения с целью разработки вирулицидов.

4. Показана активность фосфиновых аналогов аспарагиновой кислоты, как индукторов вылупления личинок G. rostochiensis из яиц. А так же продемонстрированы способности компактна и хитозана снижать активность индукторов вылупления.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены: на Первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям», С.-Петербург, 2002 г; на 3-й и 6-й научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (зоонозами)», Москва, 2002 и 2005 гг; на Всероссийском совещании «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии», Голицыно, 2003 г; на XXVII и XXVIII международных симпозиумах Европейского Общества Нематологов в Риме, 2004 г. и Благоевграде, 2006 г.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Материал изложен на 105 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 23 рисунка. Список литературы включает 140 работ, из которых 110 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Приданников, Михаил Викторович

Выводы

1. При изучении эндогенных факторов вылупления личинок из яиц цистообразующих нематод (оболочки цист, яйца и водные смывы с поверхности стенок цист и яиц) впервые показана индуцирующая активность всех исследованных компонентов. Наибольшей индуцирующей активностью обладали водные экстракты гомогенатов яиц;

2. Индукторы вылупления личинок, выделенные из экстрактов яиц цистообразующих нематод G. rostochiensis и Я. glycines видоспецифичны. Перекрестное испытание их на вылупление личинок показало отсутствие индуцирующей активности в отношении тестируемых видов;

3. Индукторы вылупления из экстрактов яиц G. rostochiensis термостабильны. После кипячения и многократного замораживания индуцирующая активность их сохраняется. Индуцирующая активность из экстрактов яиц Я. glycines при нагревании 100 °С снижается в два раза;

4. В состав индуктора (или индукторов) вылупления из гомогенатов яиц G. rostochiensis входит белковая составляющая;

5. Молекулярная масса индуцирующей фракции в водном экстракте гомогената яиц менее 5 кДа;

6. На модельной системе табак - вирус табачной мозаики впервые выявлено действие экстрактов яиц, как неспецифических индукторов устойчивости растений. Элиситорным действием обладали экстракты из яиц с молекулярным весом более 100 кДа;

7. При изучении экзогенных факторов на процесс вылупления личинок цистообразующих нематод установлены различия в реакции разных видов нематод на одни и те же индукторы. Фосфиновые производные аспарагиновой кислоты стимулировали выход личинок

G. rostochiensis, и не выступали как индукторы вылупления личинок

H. glycines.

8. Компактин - ингибитор синтеза стеринов оказывал ингибирующее действие на вылупление личинок цистообразующих нематод.

9. Выявленные в ходе проведённых исследований природные регуляторы процесса вылупления личинок из яиц могут служить основой для разработки новых средств защиты растений от паразитических нематод.

Автор благодарен своим научным руководителям Виталию Георгиевичу Джавахия и Николаю Демьяновичу Романенко за поддержку в ходе выполнения работы. Особая благодарность Петелиной Г. Г., Пальчук М. В. и Дебловой 3. Н. за помощь в проведении экспериментов. Кроминой К. А. за помощь в проведении экспериментов с индукцией устойчивости на табаке и суспензионной культуре клеток табака. Щербаковой JI.A. и Шумилиной Д.В. за ценные замечания и обсуждение результатов в ходе исследования. Спасибо всем сотрудникам лаборатории молекулярной биологии ВНИИ фитопатологии за помощь и дружеское отношение.

Особую благодарность автор выражает Эдварду Маслеру за неоценимую помощь в написании статьи в журнал Nematology.

Заключение

Представленные результаты позволяют заключить, что в водных экстрактах из гомогената яиц цистообразующих нематод G. rostochiensis и Я. glycines присутствуют вещества, способные индуцировать вылупление личинок этих нематод из яиц. Эти индукторы являются специфичными для каждого вида нематод. Индукторы вылупления из яиц G. rostochiensis способны сохранять активность после кипячения и многократного замораживания. В то же время нагревание до 100°С экстрактов из яиц Я. glycines снижает их индуцирующую вылупление активность в два раза.

Снижение активности экстрактов яиц G. rostochiensis после проведения ферментативного гидролиза с использованием протеиназы К, позволяет предположить, что в состав индуктора (или индукторов) вылупления входит белковая составляющая. Было показано, что индуцирующей активностью обладала фракция экстракта яиц с молекулярной массой водорастворимых веществ менее 5 кДа.

Пока остается неясным механизм действия веществ из экстрактов гомогената яиц и их роль в метаболизме личинок нематод, поэтому требуются дальнейшие исследования по идентификации веществ, отвечающих за индукцию вылупления личинок. Возможно, их определение откроет новые направления и подходы к изучению физиологии фитопаразитических нематод, контролированию их численности и снижению их вредного воздействия на растения.

Экстракты из гомогенатов яиц содержат так же вещества, способные защищать растения табака от ВТМ. Противовирусная активность компонентов цист не была показана ранее и интересна для дальнейшего исследования.

Было показано, что активные соединения на основе фосфиновых аналогов природных аминокислот, хитозана и компактина могут выступать в качестве потенциальных противонематодных агентов.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Приданников, Михаил Викторович, Большие Вязёмы

1. Бороздина, К. И. (1960) Биоэкологическое обоснование химическогометода борьбы с картофельной нематодой {Heterodera rostochiensis, Wollenweber). Материалы V Всесоюзного совещания по изучению нематод. Тезисы докладов. Самарканд, 19-21.

2. Васильева, И. С. Зиновьева, С. В., Пасешниченко, В. А.,

3. Удалова, Ж. В. (1998) Защитное действие фуростаноловых гликозидов на растения, зараженные галловой нематодой Meloidogyne incognita. Прикладная биохимия и микробиология, 34(5): 560-563.

4. Васюкова, Н. И., Зиновьева, С. В., Ильинская, Л. И., Переход, У. А.,

5. Чаленко, Г. И., Герасимова, Н. Г., Ильина, А. В., Варламов, В. П., Озерецковская, О. Л. (2001) Индуцирование устойчивости растений с помощью водорастворимого хитозана. Прикладная биохимия и микробиология, 37(1): 115-122.

6. Декер, Р. (1963) Новые исследования в области борьбы с нематодами.

7. Международный сельскохозяйственный журнал, 2: 60-62.

8. Деккер, X. (1972) Нематоды растений и борьба с ними. М.: Колос. С.444.

9. Егоров, Н. С., Баранова, Н. А., Крейер, В. Г. (1995) Микробныеингибиторы ферментов биосинтеза и этерификации холестерина. Антибиотики и химиотерапия, 5: 38-44.

10. Жуков, Ю. Н., Вавилова, Н. А., Осипова, Т.И., Воинова, Т.М., Хурс, Е.Н.,

11. Джавахия, В.Г., Хомутов, P.M. (2004) Аминоалкилфосфинаты новые эффективные ингибиторы меланиногенеза и фунгициды. ДАН, 398: 696-698.

12. Жуков, Ю. Н., Вавилова, Н. А., Осипова, Т.И., Воинова, Т.М., Хурс, Е.Н.,

13. Джавахия, В.Г., Хомутов, P.M. (2004) Фунгицидная активность фосфиновых аналогов аминокислот обмена метионина. ДАН 397: 1-3.

14. Зиновьева, С. В., Чижов, В. Н. (2006) Современные направлениязащиты растений от паразитических нематод. В Прикладная нематология. Буторина, Н. Н., Зиновьева, С. В., Кулинич, О. А. и др. Институт Паразитологии РАН. М. Наука. Глава 11: 269-290.

15. Инге-Вечтомов, С. Г. (1997) Метаболизм стеринов и защита растений.

16. Соровский образовательный журнал. 11: 16-21.

17. Кирьянова, Е. С., Кралль, Э. JI. (1971а) Паразитические нематодырастений и меры борьбы с ними. Л.: Наука, Т. 1.

18. Кирьянова, Е. С., Кралль, Э.Л. (1971b) Паразитические нематодырастений и меры борьбы с ними. Л.: Наука, Т. 2.

19. Кораб, И. И., Бутовский, А. П. (1939) Главнейшие итоги изучениясвекловичной нематоды {Heterodera schachtii Schmidt) и методов борьбы с ней. Сборник работ по нематодам сельскохозяйственных растений под редакцией Кирьяновой Е. С. Сельхозгиз. 75-120.

20. Котова, В. В., Козарь, Е. Г., Кононков, П. Ф., Шестеперов, А. А.1999) Борьба с фитопаразитическими нематодами на основе использования свойств растений-антагонистов.

21. Сельскохозяйственная биология. 3: 24-32

22. Кравцова, Н. Н. (1979) Соевая нематода в Приамурье. Защита икарантин растений. 5: 46.

23. Левченко, В. И., Квашнина, Н. А. (2006) Методы выявления иидентификации картофельной нематоды. Защита и карантин растений, 11: 30-32.

24. Лутова, Л. А., Бондаренко, Л. В., Козырева, О. Г., Инге

25. Вечтомов, С. Г. (1990) Получение мутантов растений с измененным составом фитостеринов, обладающих устойчивостью к насекомым. //Вести. ЛГУ. Сер. 3. 2(10): 82-87.

26. Лутова, Л. А., Левашина, Е. А., Бондаренко, Л. В., Байрамова, Н. Л.,

27. Андронова, Е. В., Инге-Вечтомов, С. Г. (1992) Мутанты высших растений по биосинтезу стеринов. Генетика. 28(2): 129-135.

28. Лутова, Л. А., Павлова, 3. Б., Иванова, М. М. (1998)

29. Агробактериальная трансформация как способ измениеня гормонального метаболизма у высших растений. Генетика. 34(2): 165-182

30. Лутова, Л. А., Ходжайова, Л. Т. (1998) Молекулярно-генетическиеаспекты устойчивости высших растений к вредителям сельского хозяйства. Генетика. 34(6): 719-729.

31. Матевосян, Г. Л., Кудашов, А. А, Сотник, В. Г., Гуськова, Л А. (2002)

32. Фиторегуляторные аспекты повышения устойчивости растений к нематодам. Всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям, посвященная 300-летию Санкт-Петербурга, Научные материалы. 146-147.

33. Мяге, Э. А. (1974) Влияние некоторых биотических и абиотическихфакторов на вылупление личинок картофельной нематоды (Heterodera rostochiensis Woll.). Академия наук Эстонской ССР, 160с.

34. Озерецковская, О. Л. (1994) Индуцирование устойчивости растенийбиогенными элиситорами фитопатогенов. Прикладная биохимия и микробиология. Т.37. 5: 533-541.

35. Озерецковская, О. Л., Васюкова, Н. И., Зиновьева, С. В., (2002)

36. Хитозан как элиситов индуцированной устойчивости растений. Хитин и Хитозан: получение, свойства и применение. Наука 2002. 339-335.

37. Ходжайова, Л. Т., Левашина, Е. А., Усольцева, М. Ю.,

38. Бондаренко, Л. В., Лутова, Л. А. (2000) Изменение содержания растительных стеринов как биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами. Генная инженерия и экология, 1: 124128.

39. Федеральный закон от 15 июля 2000 года N 99-ФЗ "О карантинерастений".

40. Шестеперов, А. А. Савотиков, В. Ф. (1995) Карантинныефитогельминтозы. Книга 1, Москва, «Колос».

41. Шестеперов, А. А. (2007) Грозит ли посевам свеклы в Россиипочвоутамление»? Защита и карантин растений, 7: 50-53.

42. Шишова-Касаточкина, О А., Леутская, 3. К. (1979) Биохимическиеаспекты взаимоотношений гельминта и хозяина. Изд. Наука, с. 280.

43. Atkinson, Н. J. and Ballantyne, A. J. (1979) Evidence for the involvementof calcium in the hatching of Globodera rostochiensis. Annals of Applied Biology 93:191-198.

44. Atkinson, H. J. Opportunities for molecular biology in crop protection.1993) Ed. D.J. Beadle et al. L: Brit. Crop protection Council, 257-266.

45. Atkinson, H. J., Fowler, M. and Isaac, R. E. (1987b) Partial purification ofhatching activity for Globodera rostochiensis from potato root diffusate. Annals of Applied Biology 110: 115-125.

46. Atkinson, H. J., Taylor, J. D. and Fowler, M. (1987a) Changes in thesecond stage juveniles of Globodera rostochiensis prior to hatching response to potato root diffusate. Annals of Applied Biology 110:105114.

47. Atkinson, H. J., Taylor, J. D. and Ballantyne, A. J. (1980) The uptake ofcalcium prior to the hatching the second stage juveniles of Globodera rostochiensis. Annals of Applied Biology 94:103-109.

48. Bates, J. A., Taylor, E. J. A., Gans, P. Т., and Thomas, J. E. (2002)

49. Determination of relative proportions of Globodera species in mixed populations of potato cyst nematodes using PCR product melting peak analysis. Molecular plant pathology 3(3): 153-161

50. Baker, С. J., Orlandi, E.W., and Norton, M. (1993) Harpin, an elicitor ofthe hypersensitive response in tobacco caused by Erwinia amylovora, elicits active oxygen production in suspension cells mock. Plant Physiol. 102: 1341-1344.

51. Birch, A. N. E., Robertson, W. M., Geogheghan, I. E., McGavin, W. J.,

52. Alphey, T. J. W., Phillips, M. S., Fellows, L. E., Watson, A. A., Simmonds, M. S. J. and Porter, E. A. (1993) DMDP a plant derived sugar analogue with systemic activity against plant parasitic nematodes. Nematologica 39: 521-535.

53. Bolla, R. (1979) Developmental nutrition of nematodes: the biochemicalrole of sterols, heme compounds, and lysosomal enzymes. Journal of Nematology. 11:250-259.

54. Bradford, M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of

55. Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.

56. Byrne, J., Twomey, U, Maher, N., Devine, K. J. and Jones, P. W. (1998)

57. Detection of hatching inhibitors and hatching factor stimulants for golden potato cyst nematode, Globodera rostochiensis, in potato root leachate. Annals of Applied Biology 132: 463-472.

58. Carroll, M. (1995) Characterization of rhizosphere bacterial isolates whichaffect the hatch of potato cyst nematodes. MSc thesis, The National University of Ireland, Cork, Ireland.

59. Charlson, D. V., Tylka, G. L. (2003) Heterodera glycines cyst componentsand surface disinfestants affect H. glycines hatching. Journal of Nematology 35(4): 458-464.

60. Chitwood, B.G., Bulirer, E.M. (1946) The life history of the goldennematode of potatoes, Heterodera rostochiensis Wollenweber, under long Island, new York, conditions. Phytopathology. 36: 180-189.

61. Chitwood, D. J. (1999) Biochemistry and Function of Nematode Steroids.

62. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 34(4): 273— 284

63. Chitwood, D. J. (2002) Phytochemical based strategies for nematodecontrol. Annual Review Phytopathology 40: 221-249.

64. Clarke, A. J. (1970) Hatching factors and sex attractants of cyst nematodes.

65. Report of Rothamsted Experimental Station for 1969, p. 179. Harpenden: Rothamsted.

66. Clarke, A. J. (1971) Hatching factors and sex attractants of potato cystnematode. In Report of Rothamsted Experimental Station for 1970, pp. 147-148. Harpenden: Rothamsted.

67. Clarke, A. J. and Hennessy, J. (1987) Hatching agents as stimulants ofmovement of Globodera rostochiensis juveniles. Revue de Netmatologie 10: 471-476

68. Clarke, A. J. and Shepherd, A. M. (1966a) Picrolonic acid as a hatchingagent for the potato cyst nematode, Heterodera rostochiensis Woll. Nature, London, 221: 546.

69. Clarke, A. J. and Shepherd, A. M. (1967) Flavianic acid as a hatchingagent for Heterodera cruciferae Franklin and other cyst nematodes. Nature, London, 213:419-20.

70. Clarke, A. J. and Shepherd, A. M. (1968) Hatching agents for the potatocyst-nematode, Heterodera rostochiensis Woll. Annuals of Applied Biology 61: 139-149.

71. Clarke, A. J. and Shepherd, A. M. (1966b) Inorganic ions and the hatchingof Heterodera spp. Annuals of Applied Biology. 58: 497-508.

72. Cohn, E, Spiegel, Y. (1991). Root nematode interactions, in Plant Roots;

73. The. Hidden Half, ed. Waisel, Y., Eshel, A., Kafkafi, U. pp. 789-805. New York: Marcel Decker

74. Cronin, D., Moenne-Loccoz, Y., Dunne, C. and O'GaraF. (1997b)1.hibition of egg hatch of the potato cyst nematode Globoderarostochiensis by chitinase-producing bacteria. European Journal of Plant Pathology, 103: 433-440.

75. Cronin, D., Moenne-Loccoz, Y., Fenton, A., Dunne, C, Dowling, D. N. and

76. O'Gara, F. (1997a) Role of 2,4-diacetylphloroglucinol in the interactions of the biocontrol pseudomonad strain F113 with the potato cyst nematode Globodera rostochiensis. Applied and Environmental Microbiology, 63: 1357-1361.

77. Devine, K. J. and Jones, P. W. (2000) Response of Globoderarostochiensis to exogenously applied hatching factors in soil. Annals of applied biology, 137:21-29.

78. Devine, K.J. Byrne, J. Maher, N. and Jones, P.W. (1996) Resolution ofnatural hatching factors for the golden potato cyst nematode, Globodera rostochiensis. Annals of Applied Biology, 129: 323-334.

79. Doncaster, С. C., Seymour, M. K. (1973) Exploration and selection ofpenetration site Tylenchida. Nematologica. 19: 137-145.

80. Edwards, D. L., Payne, J., Scares, G. G. (1990) Novel isolates of Bacillusthuringiensis having activity against nematodes. US Pat. 4948734.

81. Ellenby, C. (1945) The influence of crucifers and mustard oil on theemergence of larvae of the potato root eelworm, Heterodera rostochiensis Wollenweber. Annals of Applied Biology, 32: 67-70.

82. Ellenby, C. (1968) The survival of desiccated larvae of Heteroderarostochiensis and schachtii. Nematologica. 14: 544-548.

83. Ellis, P. R. (1966) The effect of different soil drying times on theaxstraction from soil and hatching potato root eelworm. Plant pathology. 15:175-179.

84. Felix, G. and Boiler, T. (2003) The highly conserved RNA-binding motif

85. RNP-1 of bacterial cold shock proteins is recognized as an elicitor signal in tobacco. Journal Biology Chemistry, 278: 6201-6208.

86. Ferris, J.M., Mai, W. F. (1956) Viability of encysted golden nematodelarvae following seasonal temperature changes and drought. Plant diseases reporter 40: 966-970.

87. Forrest, J. M. S., FarrerL.A. (1983) The response of eggs of the whitepotato cyst nematode Globodera pallida to diffusate from potato and mustard roots. Annals of Applied Biology, 103: 283-289.

88. Fukuzawa, A., Furusaki, A., Ikura, M. and Masamune, R. (1985a)

89. Glycinoeclepin A, a natural hatching stimulus for the soybean cyst nematode. Journal of the Chemical Society, 4: 222-224.

90. Fukuzawa, A., Matsue, H., Ikura, M. and Masamune, R. (1985b)

91. Glycinoeclepins В and C, nortriterpenes related to glycinoeclepin A Tetrahedron Letters 26:5539-5542.

92. Greco, N., Brandonisio, A. (1986) The biology of Heterodera carotae.

93. Nematologica, 32: 447-460.

94. Hesling, J. J. (1957) The hatching response of Heterodera major (O.

95. Schmidt) to certain root diffusate. Nematologica, 2: 123-125.

96. Jones, F. G. W. (1970) The control of potato cyst-nematode. J. R. Soc. Arts118:179-199.

97. Jones, P. W., G. L. Tylka, and R. N. Perry. (1998) Hatching, in R. N. Perryand D. J. Wright, eds. The physiology and biochemistry of free-living and plant-parasitic nematodes. New York: CAB International, 181-212.

98. Jong, C., Wyss, U. (1999) New approaches to control plant parasiticnematodes. Applied Microbial Biotechnology, 551: 439-446.

99. Kraus, G. A., Johnson, В., Kongsjahju, A. and Tylka, G. L. (1994)

100. Synthesis and evaluation of compounds that affect soybean cyst nematode egg hatch. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 42: 1839-1840.

101. Kraus, G. A, Vander Louw, S. J., Tylka, G. L., Soh, D. H. (1996)

102. Synthesis and tasting of compounds that inhibit soybean cyst nematode hatch. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44:1548-1550.

103. Kort, J., Ross, H., Rumpenhorst, H.J., Stone, A.R. (1977) An internationalscheme for identifying and classifying pathotypes of potato cyst nematodes Globodera pallida. Nematologica 23: 333-339.

104. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural protein during the assemblyof the head of the bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.

105. Levene, В. C., Owen,M.D.K. and Tylka, G. L. (1998a) Response ofsoybean cyst nematode to herbicides on soybeans. Weed Science, 46: 264-270.

106. Levene, B.C., Owen, M. D. K. and Tylka, G. L. (1998b) Influence ofherbicide application to soybeans on soybean cyst nematode egg hatching. Journal of Nematology, 30: 347-352.

107. Lewis, M. F., Mai, W. F. (1960) Survival of encysted and free larvae of thegolden nematode if relation to temperature and relative humidity. Proceeding of Helmintologycal Society of Washington, 27: 80-85.

108. Lownsberry, B. F. (1951) Larval emigration from cysts of the goldennematode of potatoes, Heterodera rostochiensis Woll. Phytopathology, 41:889-896.

109. Mai, W. F., Mechow, J. (1952) Relative humidity in relation of viability oflarvae enclosed in cysts and free larvae of the golden nematode, Heterodera rostochiensis, Wollenweber. Phytopathology, 42: 469-470.

110. Malinowska, E. (1996) The range of stimulatory action of the nematoderesistant cultivar Tarpan on hatching of juveniles from the cysts ofgolden potato cyst nematode (Rol pathotype) under field conditions. Biuletyn Instytutu Ziemniaka, 46:104.

111. Man-Hong Sun, Li Gao, Yan-Xia Shi, Bao-Jii Li and Xing-Zhong Liu.2006) Fungi and actinomycetes associated with Meloidogyne spp. eggs and females in China and their biocontrol potential. Journal of Invertebrate Pathology, 93(1): 22-28.

112. Masamune, Т., Anetai, M., Fukuzawa, A., Takasugi, M., Matsue, H.,

113. Kabayashi, K., Ueno, S., Katsui, N. (1987a) Glycinoeclepins, natural hatching stimuli for the soybean cyst nematode, Heterodera glycines. I. Isolation. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 60: 981-999.

114. Masamune, Т., Anetai, M., Takasugi, M. and Katsui, N. (1982) Isolation ofa natural hatching stimulus, glycinoeclepin A, for the soybean cyst nematode. Nature, 297: 495-496.

115. Masamune, Т., Fukuzawa, A., Furusaki, A., Ikura, M., Matsue, H.,

116. Kaneko, Т., Abiko, A., Sakamoto, N., Tanimoto, N., Murai, A. (1987b) Glycinoeclepins, natural hatching stimuli for the soybean cyst nematode, Heterodera glycines. II. Structural elucidation. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 60: 1001-1014. '

117. Miller, P. M. (1968) The susceptibility of parasitic nematodes to subfreezing temperatures. Plant Disease Reporter, 52: 768-772.

118. Miwa, A., Nii, Y., Okawara, H. and Sakakibara, M. (1987) Synthetic studyon hatching stimuli for the soybean cyst nematode. Agricultural and Biological Chemistry, 51: 3459-3461.

119. Mori, K. and Watanabe, H. (1989) Recent results in the synthesis ofsemiochemicals: synthesis of glycinoeclepin A. Pure and Applied Chemistry, 61: 543-546.

120. Mulder, J.G., Diepenhorst, P., Plieger, P. and Briiggemann-Rotgans, I.E.M.1992) Hatching agent for the potato cyst nematode. Patent application No. PCTINL92/00126.

121. Murai, A., Tanimoto, H., Sakamoto, H. and Masamune, T. (1988) Totalsynthesis of glycinoeclepin A. Journal of the American Chemical Society, 110:1985-1986.

122. Myers, R., Sipes, В., Nagai, С et al. (2002) Engineering coffee for rootknot nematode resistance using cysteine and serine proteinase inhibitors. Ibid. 4(2): 234.

123. Nitao, J. K., Meyer, S. L. F. and Chitwood, D. J. (1999) In-vitro assays of

124. Meloidogyne incognita and Heterodera glycines for detection of nematode-antagonistic fungal compounds. Journal of Nematology, 31: 172-183.

125. Ohl, S. A., Van der Lee, F., Cammart, R. et al. (1998) Molecular breedingfor nematode resistance in potato. Abstract of 24th International Nematology Symposium, Dandee (UK), p.84.

126. Oji, 0., Sapra, V. T. and Pacumbaba, R. P. (1988) Effects of nematicideand herbicide interactions on field populations of cyst nematode and agronomic characters of soybean. Journal of Agronomy and Crop Science, 160: 309-313.

127. Oostendorp, M. and Sikora, R.A. (1990) In vitro interrelationships betweenrhizosphere bacteria and Heterodera schachtii. Revue de Nematologie, 13: 269-274

128. Oka, Y., Nacar, S., Putievsky, E., Ravid, U., Yaniv, Z., and Spiegel, Y.2000) Nematicidal activity of essential oils components against the root-knot nematode. Phytopathology, 90 (7): 710-715.

129. Okada, T. (1972a) Hatching inhibitory factor in the cyst contents of thesoybean cyst nematode, Heterodera glycines Inchinohe (Tylenchida: Heteroderidae). Applied Entomology and Zoology, 7: 99-102.

130. Okada, T. (1972b) Hatching stimulant in the egg of the soybean cystnematode, Heterodera glycines Ichinohe (Tylenchida: Heteroderidae). Applied Entomology and Zoology, 7: 234-237.

131. Okada, Т. (1974) Effects of hatching stimulants obtained from the cystcontents of Heterodera species (Tylenchida: Heteroderidae) on the hatching of other species. Applied Entomology and Zoology, 9:49-51.

132. Onions, T. G. (1955) The distribution of hatching within the cyst of potatoroot eelworm, Heterodera rostochiensis. Quarterly Journal Microbial Science, 96: 495-513.

133. Payan,L. A., Johnson, A. W. and Littrell, R. H. (1987) Effects ofnematicides and herbicides alone or combined on Meloidogyne incognita egg hatch and development. Annals of Applied Nematology (Supplement to the Journal of Nematology, 19(1): 67-70

134. Perry, R.N. (1989) Dormancy and hatching of nematode eggs. Parasitology1. Today, 5: 377-383.

135. Perry,R.N. (2002) Hatching, in: Lee,D.L., editor. The biology ofnematodes, vol. 6. London: Taylor and Francis, 147-169.

136. Perry, R.N. and Beane, J. (1989) Effects of certain herbicides on the invitro hatch of Globodera rostochiensis and Heterodera schachtii. Revue de N6matologie, 12:191-196

137. Perry, R. N., A. J. Clarke and J. Hennessy. (1980) The influence of osmoticpressure on the hatching of Heterodera schachtii. Revue Nematology, 3(1): 3-9.

138. Perry, R.N. and Clarke, A.J. (1981) Hatching mechanisms of nematodes.

139. Parasitology, 83: 435-449.

140. Rawsthorne, D. and Brodie, В. B. (1986) Relationship between root growthof potato, root diffusate production, and hatching of Globodera rostochiensis. Journal of Nematology, 18(3): 379-384.

141. Rawsthorne, D. and Brodie, B.B. (1987) Movement of potato root diffusatethrough the soil. Journal of Nematology, 19: 119-122.

142. Salazar, A., Ritter, E. (1993) Effect of day light during cyst formation,storage time and temperature of cysts on the in vitro hatching Globodera rostochiensis and G. pallida. Fundamental and Applied Nematology, 16: 567-572.

143. Samuel, M.A., Hall H., Krzymowska, M., Drzewiecka, K., Hennig, J.,

144. Ellis, B.E. (2005) SIPK signaling controls multiple components of harpin-induced cell death in tobacco // Plant Journal, 42(3): 406-416.

145. Schepherd, A. M. (1959) Increasing the rate of larval emergence fromcysts in hatching tests with beet eelworm, Heterodera schachtii Schm. Nematologica. 4: 161-164.

146. Schepherd, A. M. (1961) Larval emergence in pea root eelworm,

147. Heterodera gottingiana Liebscher. Abstract of papers given at Vl-th International Nematology Symposium, Gent, p. 72.

148. Shepherd, A. M. & Clarke, A. J. (1971) Moulting and hatching stimuli, in

149. Zuckerman, B.M., Mai, W.F. & Rohde, R.A. Eds. Plant Parasitic Nematodes, New York, NY, USA, Academic Press. 2: 267-287.

150. Slack, D. A., Hamblen, M.L. (1961) The effect of factors on larvalemergence from cysts of Heterodera glycines. Phytopathology, 51: 350-355.

151. Stirling, G. R. (1984). Biological control of Meloidogyne javanica with

152. Bacillus penetrans. Phytopathology, 74: 55-60.

153. Takasugi, M., Yachida, Y., Anetai, M., Masamune, T. and Kegasawa, 11975) Identification of asparagusic acid as a nematicide occurring naturally in the roots of asparagus. Chemistry Letters, 45-46.

154. Tefft, P. M., and Bone, L. W. (1985) Plant-induced hatching of eggs of thesoybean cyst nematode Heterodera glycines. Journal of Nematology, 17: 275-279.

155. Thompson, J. M., Tylka, G. L. (1997) Differences in hatching of

156. Heterodera glycines egg-mass and encysted eggs in vitro. Journal of Nematology, 29:315-321.

157. Tiilikkala, K. A. (1991) Impact of climate and agricultural practices onthe pest status of Heteroderoidea nematodes in Finland. Annals Agriculture Fenniae, 30: 125-161.

158. Tsutsumi, M. (1976) Conditions for collecting the potato root diffusate andthe influence on the natural hatching of potato cyst nematode. Japanese Journal of Nematology, 6: 10-13.

159. Twomey, U. (1995) Hatching chemicals involved in the interactionbetween potato cyst nematodes, host and non-host plants. PhD thesis, The National University of Ireland, Cork, Ireland.

160. Urwin, P. E., Lilley, C. J., McPherson, M. J. and Atkinson, H. J. (1997)

161. Resistance to both cyst and root-knot nematodes conferred by transgenic Arabidopsis expressing a modified plant cystatin. The Plant Journal, 12(2): 455-461.

162. Urwin, P. E., McPherson, M. J., Atkinson, H. J. (1998) Enhancedtransgenic plant resistance to nematodes by dual proteinase inhibitor constructs. Planta. 204(4): 472-479.

163. Urwin, P. E., Troth, К. M., Zubko, E. L., Atkinson, H. J. (2000) Effectivetransgenic resistance to Globodera pallida in potato field trials. Molecular Breeding, 8: 95-101

164. Viglierchio, D. R. (1961) Effect of storage environment on "in vitro"hatching of larvae from cysts of Heterodera schachtii, Schmidt. Phytopathology, 51: 623-625.

165. Wallace, H. R. (1955) Factors influencing the emergence of larvae fromcysts of the beet eelworm, Heterodera schachtii Schmidt. Journal of Helmintology, 29: 3-16.

166. Wallace, H. R. (1958) Observation the emergence from cysts and theorientation of larvae of three species of the genus Heterodera in response of host plan roots. Nematologica, 3: 236-243.

167. Wallance, H. R. (1959) Further observations on some factors influencingthe emergence of larvae from cists of the beet eelworm Heterodera schachtii, Schmidt. Nematologica, 4: 245-252.

168. Whitehead, A.G. (1997) Control of potato cyst-nematode, Globoderarostochiensis Rol, by picrolonic acid and trap crops. Annals of Applied Biology, 87: 225-227.

169. Whitehead, A.G. (1992) Emergence of juvenile potato cyst nematodes,

170. Globodera rostochiensis and G. pallida and the control of G. pallida. Annals of Applied Biology, 120: 471-186.

171. Whitehead, A.G. (1998) Plant Nematode Control, pp. 170-171.

172. Wallingford: CAB International.

173. Widdowson, E. (1958) Potato root diffusate production. Nematologica, III:6.14.

174. Winslow, R. D. (1955) The hatching responses of some root eelworms ofthe genius Heterodera. The Annals of Applied Biology, 43: 19-36.

175. Wong, A. T. S, Tylka, G. L., Hartzler, R. J. (1993) Effects of eightherbicides on in vitro hatching of Heterodera glycines. Journal of Nematology, 25(4): 578-584.

176. Wuyts, N., Elsen, A., Sagi, L. (2002) Effect of plant secondary metaboliteson plant parasitic nematodes. The Nematology, 4(2): 208.

177. Публикации по материалам работы

178. Приданников, М. В., Петелина, Г. Г., Пальчук, М. В., Воинова, Т. М.,

179. Хомутов, Р. М., Приданников, М. В., Петелина, Г. Г., Пальчук, М. В.,

180. Приданников, M. В., Петелина, Г. Г., Пальчук, М. В., Джавахия, В. Г.2006) Индукция отрождения личинок золотистой картофельной нематоды. Защита и карантин растений. 9: 35-36

181. Украинцева, С. А, Приданников, М. В., Джавахия, В.Г. (2007)

182. Компактен потенциальный биопестицид. Защита и карантин растений (в печати).

183. Mikhail V. Pridannikov, Galina G. Petelina, Marina V. Palchuk, Edward P.

184. Masler and Vitaly G. Dzhavakhiya. (2007) Influence of Globodera rostochiensis cyst components on G. rostochiensis egg hatching in vitro. Nematology (в печати).

185. Фосфонистые производные аминокислот использованные в работе.

186. Шифр ФПА Химическая формула

187. Ala-Рн СНз-СН (NH2)-P(0)(0H)H

188. Asp-Рн НООС-СН2-СН (NH2)-P(0)(0H)H1.u-Рн (СН3)2-СН-СН2-СН (NH2)-P(0)(0H)H

189. Ser-Рн НО-СН2-СН (NH2)-P(0)(0H)H

190. Фосфонистые производные аспарагиновой кислоты, использованные в работе.

191. Шифр ФП аспарагиновой кислоты Формула Примечание

192. Аспарагиновая кислота (А, В, С, D места модификации) о н--в о П/ ^с^-он А-^НО V мнД D С

193. Асп-Рн °Ч\ ff ho^W\oh HO/\DNHA с

194. Х-156 °ч\ ° н4ггЧн НС> \ NH2 \ nD с Фосфиновый аналог

195. Х-261 ОН О II/ УУ^ОН А-^ СН,о' NH2 Метиловый эфир

196. Х-279 О SH -— В О II/ А-- СН3о' NH2 Тиофосфоновый аналог

197. Реактивы для приготовления геля для электрофореза.1. Реактив

198. Разделяющий (Separating) гель

199. Формирующий (Forming) гель:1. вода2. 1МТрис-НС1,0,74 мл1,50 мл (рН 8.8)3. "Stock" АА (30%, 29:1) 2,0 мл4. SDS (10 %)5. APS (10 %)6. TEMED40 мкл 20 мкл 4 мкл0,8 мл0,25 мл (рН 6,8) 0,40 мл 20 мкл 14 мкл 3 мкл1. Итого:4,3 мл1,49 мл

200. Химическая формула компактина

201. Стадии развития Globodera rostochiensis

Информация о работе

Приданников, Михаил Викторович
кандидата биологических наук
Большие Вязёмы, 2007
ВАК 06.01.11

Диссертация

Индукторы вылупления личинок цистообразующих нематод сем. Heteroderidae (Skarbilovich) и перспективы их использования для защиты растений - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы