Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуносупрессия аминоксидазы плазмы крови и мнестические процессы у белых крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Иммуносупрессия аминоксидазы плазмы крови и мнестические процессы у белых крыс"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

на правах рукописи

БУЗИНОВА Елена Викторовна

ИММУНОСУПРЕССИЯ АМИНОКСИДАЗЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ И МНЕСТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ У БЕЛЫХ КРЫС.

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

(зав.кафедрой - профессор, академик РАМН И. П. Ашмарин)

Научный руководитель;

профессор, академик РАМН И. П. Ашмарин

Официальные оппоненты: Н. С. Попова - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Т. А. Воронина - доктор медицинских наук, профессор

Ведущее учреждение: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Защита состоится 9 февраля 1998 г, в 15 час. 30 мин. На заседании Специализированного Совета Д.053.05.35 при биологическом факультете МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 5 » января 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Б.А.Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Как известно, важным регулятором концентрации моноаминов в различных органах и тканях служат - моноаминоксидазы (МАО). Отклонения концентраций моноашшов от нормальных значений в значительной мере определяют ряд патологий, в том числе такие психические болезни как депрессивные и маниакальные психозы, болезнь Паркинсона, шизофрению. Одной из причин развития этих заболеваний являются нарушения в механизме функционирования МАО мозга. На основе раскрытия механизмов дезаминирования нейротрансмштеров разработан обширный класс психотропных препаратов, широко использующихся в медицине. Наиболее изучены митохондриальные формы МАО: А и В. Это мембранно-связанные формы фермента, которые осуществляют непосредственное расщепление биогенных аминов не только в пресинаптических окончаниях нейронов ЦНС, но и в различных органах и тканях на периферии: в почках, в сердце, в легких, в соединительной ткани, в тромбоцитах и др. В плазме крови, в свободном состоянии, имеется аминоксидаза (АО) и/или растворимая форма МАО. (Горкин, 1981, Mondovi В., Riccio Р., 1990 и др.). Физиологическая роль этого энзима не выяснена с достаточной определенностью. Вероятнее всего он регулирует соотношение концентраций биогенных моноаминов в крови. Есть лишь косвенные указания на функции АО плазмы. Заведомо ограничена также информативность возможных попыток оценить ее роль путем введения в кровоток очищенных препаратов фермента и наблюдения физиологических эффектов, т.к. продолжительность циркуляции вводимых извне энзимов обычно весьма ограничена. Было бы весьма полезным выявление ее специфических фармакологических ингибиторов, но и это может лишь не намного приблизить решение задачи в силу кратковременности действия такого рода агентов и наличия ряда побочных эффектов.

Здесь особое значение приобретает метод активной иммунизации, который позволяет вызывать длительные специфические изменения активности энзима (Ашмарин И.П., Гомазков O.A., 1989) и тем самым влиять на функционирование соответствующих систем организма. Такую возможность открывает иммунизация к препаратам гетерологичного энзима животных, входящих в те же крупные таксоны, что и реципиент. При этом родство структуры и наличие некоторых сходных энзимов ведет к образованию аугоантител к энзиму реципиента. В то же время выбор умеренного по интенсивности режима иммунизации позволяет избежать развития состояния, которое можно квалифицировать как аутоиммунное заболевание. (Ашмарин И.П., Гомазков O.A., 1989, Pshezhetsky A.V., Danilova R.A., et al.

1993). Этот подход обеспечивает длительную модуляцию активности энзима, что в свою очередь оказывает определенное влияние на физиологические параметры состояния организма. Во-первых, образуя с энзимом в плазме крови прочный комплекс, они могут его инактивировать и способствовать его элиминации (Ашмарин И.П., Данилова P.A., Машковский М.Д. и др., 1989). Во-вторых, не исключена возможность проникновения небольшой доли аутоантител к аминоксидазе плазмы через гематоэнцефалический барьер и далее внутрь клеток. Если имеется хотя бы частичное родство структур аминоксидазы плазмы с митохондриальными МАО А и В, то возможно воздействие таких антител и на процессы контролируемые этими энзимами. Современные данные допускают возможность таких миграций антител при условии их длительной циркуляции в крови, даже если на пути мишени стоит гематоэнцефалический барьер (Passaro Е. et all., 1982, Bates I., 1985).

Цель исследования: изучить возможные влияния уровня аминоксидазы плазмы на некоторые общие характеристики активности ЦНС и на мнестические процессы у белых крыс при прямом системном введении, а главное, при использовании метода активной иммунизации к ферменту из филогенетически родственного источника - плазмы быка. В работе решались следующие задачи:

1. Изучить влияние АО плазмы при прямом системном введении:

а) на двигательную активность крыс в открытом поле

б) на уровень тревожности животных в тесте крестообразный приподнятый лабиринт.

2. Оценить влияние активной иммунизации к аминоксидазе плазмы быка на аминоксидазвую активность плазмы крови крыс.

3. Выяснить возможные изменения активности МАО типов А и В в мозге крыс, иммунизированных к аминоксидазе плазмы.

4. Используя метод активной иммунизации, как способ длительно действующей специфической модуляции активности энзима, исследовать влияние АО плазмы на двигательную активность, эмоциональное состояние и на мнестические процессы у белых крыс с помощью формирования условно-рефлекторных реакций активного и пассивного избегания.

5. Изучить возможные влияния иммунизации к АО плазмы на состояние моноаминергических систем мозга.

Научная новизна работы. Впервые проведена серия работ по изучению возможного участия аминоксидазы плазмы в регуляции поведения. Показано угнетение двигательной активности при системном введении фермента, не связанное с появлением чувства тревожности и страха.

Впервые использован метод иммупосупрессии для подавления активности аминоксидазы плазмы крови у крыс и регуляции мнестических функций на примере формирования условно-рефлекторных реакций активного и пассивного избегания. В нейрохимических исследованиях показана гетерогенность влияния иммунизации к аминоксидазе плазмы крови на активность моноамииергических систем мозга, выражающаяся в значительном угнетении активности митохондриальной МАО А в структурах мозга, тогда как активность МАО В практически не изменялась.

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследований позволяют использовать метод активной иммунизации к гетерологичным энзимам для длительного изменения активности эндогенных регуляторов. В принципе возможно использование иммунизации к легко выделяемой аминоксидазе плазмы для подавления активности митохондриальной МАО А аналогично антидепрессантам-ингибиторам МАО А, что может представлять интерес для медицинской практики при лечении заболеваний, связанных с нарушениями психических функций. Преимущества этого метода заключаются в длительном действии препарата, достигаемом всего лишь двукратным введением антигена.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 2-ом Всероссийском съезде Биохимического общества (Москва, 1997), на XXXI11 Международном конгрессе по физиологическим наукам (С.Петербург, 1997), на Всероссийской конференции Изменчивость и поведите животных (Борок, 1997), на заседай™ Московского отделения Нейрохимического общества России (ноябрь, 1997). Материалы диссертации вошли в 3 научные публикации.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 167 наименований, в том числе 94 на иностранных языках, иллюстрирована 29 рисунками и 9 таблицами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах (питомник «Крюково», по характеристикам близкие к крысам линии Вистар) с начальным весом 120-150 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Использовался препарат аминоксидазы плазмы крови быка (monoamine oxidase from bovine plasma, substrate - benzylamine) фирмы SIGMA - EC 1.4.3.4; № M4636 (активность препарата: 0.002 UNITS/ мг).

Введение препарата. Внутривенное введение. Раствор аминоксидазы плазмы вводили в хвостовую вену в дозе 40 мкг из расчета 0,2 мл на животное. Животные контрольной

группы получали эквивалентное количество физраствора. Иммунизация крыс к аминоксидазе плазмы быка. Первичная иммунизация к аминоксидазе плазмы проводилась с помощью внутривенного введения раствора фермента в хвостовую вену крыс в дозе 40 мкг. Животные контрольных групп получали эквивалентное количество физраствора. Вторичная иммунизация: через 14 дней после первого введения антигена животным опытных групп вводилось по 0.4 мл смеси равных объемов раствора аминоксидазы плазмы и полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) из расчёта 800 мкг фермента на 1 кг веса. В качестве контроля использовалось 2 группы животных: 1-ой вводили эквивалентное количество смеси ПАФ и физиологического раствора; 2-ой - только физиологический раствор. Смесь вводилась подкожно в 4 точки спины. Через 2 недели проводилась реиммунизация. Поведенческие эксперименты начинались не ранее, чем через 2 недели после реиммунизации.

Измерение веса животных и ректальной температуры. В ходе работы контролировался вес экспериментальных животных; вес измерялся непосредственно перед началом экспериментов и далее раз в месяц до их окончания. Измерение ректальной температуры поводилось через 2 месяца после первичной иммунизации.

Двигательная активность крыс в открытом поле исследовалась с помощью автоматической камеры РОДЭО-2, где регистрировались: уровень вертикальной активности (число заглядываний в верхние норки), уровень горизонтальной активности (число пересечений квадратов на полу камеры), количество центральных стоек и уровень норковой активности (число заглядываний в норки, расположенные в полу камеры). Эксперимент проводился в течении 10 минут с поминутной и суммарной регистрацией. В открытом поле тестировались все животные как после внутривенного введения препарата МАО (через 7 часов после введения и через 1,3,5 - 21 суток), так и после иммунизации.

Уровень тревожности животных исследовался с помощью крестообразного приподнятого лабиринта (КПЛ). КПЛ представляет собой крестообразную платформу, приподнятую над полом на расстоянии 80 см с четырьмя радиальными лучами шириной 10 см и длиной - 45 см, расположенными под углом 90 0 относительно друг друга. Одна пара несоединенных лучей имеет боковые стенки высотой 10 см, в другой паре лучи полностью открыты. Через сутки после внутривенного введения препарата аминоксидазы плазмы и через два месяца после первичной иммунизации проводили эксперимент. Во время опыта каждое животное помещали индивидуально в центральную часть платформы головой в сторону открытого луча и в течении 5 минут регистрировали следующие показатели: количество посещений открытых и закрытых лучей, количество заходов в открытые лучи, количество заглядываний в открытые лучи, время нахождения на открытых лучах, время

замирания, суммарное время и количество актов груминга, количество стоек, количество дефекаций, количество переходов из луча в луч, число нереализованных попыток выхода в открытые лучи, суммарное время пассивного поведения. Во время тестирования два наблюдателя находились на расстоянии не менее полуметра от лабиринта.

Выработка условного рефлекса активного избегания (УРАИ1 проводилась по стандартной методике в челночной камере через 2 месяца после первичной иммунизации. Выработка условного рефлекса происходила в течении 21 дня по 20 предъявлений в опыт. Между 6-ым и 17-ым днями эксперимента был сделан 10-ти дневный перерыв. В каждом предъявлении включался условный раздражитель - звук (800 Гц), через 10 сек на фоне звука включался безусловный раздражитель - ток (U=220v, 1=1-2 mA, 10 сек), переход животного на звук приводил к невключению тока в данном предъявлении. Ток выключался либо вместе со звуком (в момент перехода крысы в другую половину камеры), либо через 10 секунд после начала его подачи. После выключения обеих раздражителей следовал межсигнальный интервал длительностью 15 сек. В ходе опыта регистрировалось: число реакций избегания (на звук), число реакций избавления (на ток), количество непереходов, число межсигнальных реакций и латентный период. Критерием обученности служило достижение 80% положительных реакций в опыт.

Выработка условной реакции пассивного избегания (УРПИ") проводилась через 2 месяца после первичной иммунизации по стандартной методике. Экспериментальная камера была разделена на два отсека - тёмный и светлый. Животное помещалось в светлый отсек камеры. В силу своей биологической склонности животное переходило в тёмный отсек камеры, где получало удар током (U~220 v., 1=2 mA). Затем крыса вынималась из камеры. На следующий день проверяли сформированный навык. Животное помещали в светлый отсек камеры и засекали время до захода в темный отсек. Максимальное время нахождения в светлом отсеке равнялось 300 сек. В качестве проверки сохранности полученного навыка, через 45 дней крыс повторно тестировали в камере для выработки УРПК

Титр антител к аминоксияазе плазмы быка в сыворотке крови экспериментальных животных определялся с помощью иммуноферментного метода (ELISA). Для получения сыворотки использовался 1 мл крови, взятой из яремной вены, у 5 крыс из каждой группы. Кровь центрифугировалась в течении 10 минут при 3500 об/мин. Сыворотки хранились в замороженном виде при температуре -18 °С. Иммуноферментный анализ сывороток был произведен к.б.н. М.Ф.Обуховой.

Определение аминоксидазной активности плазмы крови крыс. Для определения аминоксидазной активности плазмы крови крыс, типовым субстратом для которой является

бензилами», основываясь на методе радиометрического определения активности моноаминоксидазы (Пеккель, Киркель, 1985), были подобраны оптимальные условия определения бензиламиноксидазной активности плазмы контрольных животных. Для анализа использовано по 5 мл гепаринизированной крови 10 крыс, иммунизированных к аминоксидазе плазмы быка, и по 5 контрольных, получавших смесь ПАФ и ФР и чистый ФР. Выделение плазмы из экспериментальных проб проводилось в центрифуге К-24 при 0 "С (7500 об/мин, 40 мин). Работа проводилась в лаборатории «Биохимии аминов и других азотистых оснований» института Биомедицинской химии РАМН под руководством и при участии д.б.н. Т.А. Москвитиной.

Определение активности МАО-А и МАО-B в мозге. После окончания формирования реакции активного избегания у экспериментальных животных проводилось исследование активности моноаминоксидазы А и В в митохондриалшых фракциях сенеомоторной области коры и хвостатого ядра мозга крыс, выделенных путем дифференциального центрифугирования гомогенатов ткани в 10% градиенте сахарозы, в лаборатории Цитохимии Института Мозга РАМН под руководством и при участии д.б.н. Е.Л.Доведовой по следующим методикам: активность МАО типа А определялась по методике V. Popov et at., 1971, активное«. МАО типа В определялась по методике В.З.Горкина и соавт., 1967. Определение содержания дофамина (ДА), норадреналина (НА), серотонина (5'-НТ) и продукта конечного обмена серотонина - 5'-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) проводилось флуометрически в гомогеиатах указанных отделов мозга по методике Когана Б.М., Нечаева Н.В., 1979.

Статистическая обработка результатов. Результаты всех серий экспериментов обрабатывались с помощью пакета статистических программ STADIA, разработанном на кафедре физиологии высшей нервной деятельности, с использованием непараметрических кртериев Манна-Уитни-Вилкоксона и Ван-дер-Вардена. Графическая обработка данных проводилась с использованием графического редактора Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние одноразового системного введения аминоксидазы плазмы быка на поведение крыс. При проведении экспериментов по исследованию влияния аминоксидазы плазмы при одноразовом внутривенном введении на поведение крыс в условиях открытого поля получено: снижение вертикальной и горизонтальной активности через 7 часов после введения препарата; значительное снижение активности по всем регистрируемым показателям через 1 сутки после введения аминоксидазы плазмы; угнетение двигательной активности в опытной группе в течении 21 дня после введения препарата ; на

ориетировочно-исследовательскую активность значимого влияния раствора аминоксидазы плазмы при одноразовом внутривенном введении выявлено не было.

Оценивая поведение животных в крестообразном приподнятом лабиринте следует отметить, что уменьшение числовых характеристик поведения и увеличение временных свидетельствует об угнетении общей двигательной активности у животных после внутривенного введения аминоксидазы плазмы, что соответствует данным по открытому полю. Уровень тревожности и страха у экспериментальных животных при этом не повысился, поскольку, несмотря на то, что число заходов в открытые лучи в опытной группе было меньше, чем в контроле, время нахождения в них было больше. В то же время число стоек в опытной группе было больше, чем в контроле, что свидетельствует о большей поисковой активности, которая с увеличением страха должна уменьшаться. Увеличение времени пассивного поведения тоже свидетельствует об угнетении двигательной активности, в следствие чего число заходов и нереализованных попыток выхода в лучи снижается.

Активная иммунизация крыс к аминоксндазе плазмы быка. Иммунизация животных проводилась смесью равных объемов препарата аминоксидазы плазмы быка (фирмы SIGMA), растворенной в физрастворе (ФР), и полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) из расчета 800 мкг/кг а 4 точки спины в два этапа. Использовалось две группы контроля: первой вводили эквивалентное количество смеси ПАФ и ФР, второй - эквивалентное количество ФР.

Результаты иммуноферментного анализа. Титр антител в сыворотке крови экспериментальных животных измеряли с помощью ELISA через 4 месяца после первичной иммунизации. Среднее значение титра антител к аминоксидазе плазмы быка в сыворотке иммунизированных крыс составляло 1/3400, в плазме контрольных крыс, получавших смесь ПАФ с ФР, - 1/225, у контрольных крыс, получавших лишь ФР, - 1/125. Различия между опытной группой и двумя группами контролями были достоверны с вероятностью меньшей 0.001. Эти данные свидетельствуют об иммуяогенности избранного препарата аминоксидазы и эффективности избранного режима иммунизации. Вместе с тем, они позволяют считать интенсивность иммунизации умеренной.

Определение амшюксидащюй активности плазмы крови крыс. Через 2 и 6 месяцев после первичной иммунизации проводили измерение аминоксидазной активности плазмы крови экспериментальных животных. При анализе аминоксидазной активности плазмы крови показано, что определяемая активность не чувствительна к специфическому ингибитору МАО - депренилу (96% активности в присутствии 0,1 мкМ депренила), но тормозится ингибитором медь-содержащих оксидаз - семикарбозидом (63% активности в присутствии 1 мМ ингибитора), т.е. обусловлена наличием в плазме крови классической

бензиламиноксидазы плазмы крови. Через 2 месяца после первичной иммунизации активность эндогенной аминоксидазы плазмы крови крыс составляла 49,7% (р<0.01) от аминоксидазной активности плазмы крови контрольных крыс, инъецированных смесью ПАФ с ФР. Через 6 месяцев -активность аминоксидазы в плазме крови крыс составляла 62,3% (р<0.05) от активности аминоксидазы в плазме крови контрольных животных, получавших ФР.

Влияние активной иммунизации к аминоксидазе плазмы быка на активность МАО митохондшальных фракций мозга крыс. Поскольку эффект иммунизации к плазменной аминоксидазе выражается в ингибировании моноамин-бензиламии-оксидазы плазмы крови, то возникает вопрос: не способны ли сформированные антитела подавлять активность митохондриальной моноаминоксидазы, которая имеется в различных тканях, в том числе и в мозге. Для ответа на этот вопрос нами были проведены серии экспериментов по определению моноаминоксидазной активности в различных структурах мозга. Определение активности МАО А и МАО В в митохондриальных фракциях сенсомоторной области коры и хвостатом ядре мозга экспериментальных животных проводилось через 6 месяцев после первичной иммунизации к АО плазмы.

Активность митохондриальной МАО типа А в сенсомоторной коре и хвостатом ядре крыс. Активность МАО А определяли по количеству расщепленного субстрата (серотонина) в пробах указанных областей мозга в перерасчете на содержание белка. Активность МАО типа А в сенсомоторной коре мозга крыс, иммунизированных к аминоксидазе плазмы, значительно снижена как по сравнению с контролем, получавшим смесь ПАФ с ФР, так и по сравнению с контролем, получавшим только ФР. В хвостатом ядре наблюдалась аналогичная картина (рис.1).

а) б)

В ПАФ + ФР В ПАФ+АО пл

•*• •••

77] \

СЕНСОМОТОРНАЯ КОРА

2 1,5 1

0,5 О

Офр

О ПАФ + АО ПЛ

ХВОСТАТОЕ ЯДРО

СЕНСОМОТОРНАЯ КОРА

ХВОСТАТОЕ ЯДРО

Рис.1. Влияние иммунизации к аминоксидазе плазмы на активность МАО типа А в сенсомоторной коре и хвостатом ядре мозга: а) по сравнению с контролем ПАФ+ФР; б) по сравнению с контролем ФР; *** - р<0,01 ПАФ + АО плазмы по сравнению с ПАФ + ФР, хх -р<0,01; ххх - р<0,001 ПАФ+АО пл по сравнению с ФР

Активность митохондриальной МАО типа В в сенсомоторной коре и хвостатом ядре крыс. Активность МАО типа В определяли по количеству расщепленного субстрата (р-нитрофеншшиламина) в митохондриальных фракциях сенсомоторной коры и хвостатого ядра в перерасчете на содержание белка в пробах. Результаты измерений изображены на рис.2.

а) б)

Рис.2. Влияние иммунизации к аминоксидазе плазмы на активность МАО типа В в сенсомоторной коре и хвостатом ядре мозга крыс: а) по сравнению с контролем ПАФ+ФР; б) по сравнению с контролем ФР.

Таким образом, иммунизация к аминоксидазе плазмы быка приводит к угнетению активности митохондриальной моноаминоксидазы типа А в тканях мозга, тогда как активность моноаминоксидазы типа Б изменяется не значительно.

Влияние активной иммунизации к аминоксидазе плазмы быка на вес и температуру тела экспериментальных животных. В ходе экспериментов проводился контроль изменения веса и температуры тела экспериментальных у трех групп животных, используемых в эксперименте. Средние данные по изменению веса у животных экспериментальных групп представлены ниже (таблица 1).

Таблица 1. Изменение веся экспериментальных животных до п после иммунизации к АО плазмы.

ФР (й-22) ПАФ+ФР (п=22) АО пл + ПАФ (11=32)

до 177,5 +10,32 171+8,31 175,5 ±5,13

через 1 месяц 191,5 + 8,36 211 + 5,97 222 ±2,97

через 4 месяца 257,5 ± 10,05 356,5 ±7,47 418,5+13,97

через 6 месяцев 309,4+12,25 490,5 + 15,52м"1, 504,5 ± 8,08й1

р<0.001 в груше ПАФ+ФР уэ ФР

1,1 -р<0,001 в группе АО ш + ПАФ V? ФР

Несмотря на то, что значимых различий в весе животных, иммунизированных к аминоксидазе плазмы, и по сравнению с контролем, получавшим смесь ПАФ с ФР, не

наблюдалось, все животных обеих этих групп был достоверно больше по сравнению с контролем, получавшим ФР.

Ректальную температуру у животных экспериментальных групп измеряли во второй половине дня непосредственно до первичного введения антигена и через 6 месяцев после (таблица 2).

Таблица 2. Изменена« ректальной температуры у экспериментальных животных до и через 6 месяцев после иммунизации к аминоксидазе плазмы.

ФР (п=22) ПАФ+ФР (п=22) АО roi + ПАФ (п=32)

до иммунизации 37,93 +ОД 38,1 ±0,31 37,97 ±0,31 37,94 +0,36 38,19 +0,2

через 6 месяцев после 38,09 + 0,22 37,91 ±0,24 38,26 +0,09 38,76 +0,17 38,75 +0,18*"

ш Г Ш1 ■ I

"р<0.001 группе АО пи + ПАФ vs ПАФ+ФР

*** - р<0.001 группе АО пл + ПАФ vs ФР

Таким образом, иммунизация к аминоксидазе плазмы приводит к некоторому увеличению ректальной температуры по сравнению как с контролем, получавшим чистый физиологический раствор, так и с контролем, получавшим смесь ПАФ с ФР. Следует отметить, что вес и ректальная температура в группе контрольных животных, получавших смесь ПАФ и ФР были больше, чем в контрольной группе, получавшей чистый ФР. Такое влияние иммунизации может быть следствием воспалительного эффекта, вызванного влиянием ПАФ (Bennet et all., 1992). Следует однако учитывать, что увеличение веса и ректальной температуры, так же как и увеличение потребления пшци в течении дня, показано для крыс линии SHR (спонтанно гипертензивные крысы), где это не связано с воспалительным процессом, а является следствием изменения метаболизма (Shido, Nagasaka, 1989).

Влияние активной иммунизации к аминоксидазе плазмы быка на поведение белых крыс. В работе использовалось 3 группы животных: опытная - иммунизированные к аминоксидазе плазмы смесью энзима н полного адъюванта Фрейнда и 2 группы контроля: перыой вводили смесь ПАФ с ФР, второй - чистый физраствор. Учитывая тот факт, что ПАФ оказывает специфическое влияние на поведение животных (Кустова, Данилова, Адмарин, 1992), ФР контроль с поведенческой точки зрения не является полноценным, - наиболее показательно и важно сравнение с ПАФ - контролем.

Поведение в открытом поле. При регистрации двигательной активности в открытом поле достоверного влияния иммунизации к аминоксидазе плазмы не наблюдалось; была зарегистрирована лишь тенденция к угнетению активности по всем регистрируемым показателям.

Влияние иммунизации к аминоксидазе плазмы быка на поведение крыс в крестообразном приподнятом лабиринте. Тестирование животных в КПЛ проводилось в течении 300 сек. В ходе эксперимента визуально регистрировались показатели поведения в открытых и закрытых лучах, а также количество и время актов груминга, время замирания и количество дефекаций.

Крысы, иммунизированные к АО плазмы, также как и животные контрольной группы, получавшие смесь ПАФ с ФР, в тесте крестообразный приподнятый лабиринт вели себя более пассивно по сравнению с контролем, получавшим чистый ФР, что выражалось в меньшем числе переходов из луча в луч и увеличении времени замирания. Был выявлен особый тип поведения, характерный только для иммунизированных животных - свисание с закрытых лучей. На открытых лучах крысы, иммунизированные к АО плазмы, проявляли большую активность по сравнению с контролем, получавшим смесь ПАФ с ФР, но она была меньше по сравнению с контролем, получавшим чистый ФР. Несмотря на то, что иммунизированные животные не посещали открытые лучи, что может быть проявлением чувства страха, количество и время актов груминга и число болюсов у крыс, иммунизированных к АО плазмы, было меньше, чем в двух группах контроля. Поэтому меньшая активность в лучах лабиринта иммунизированных животных, может быть следствием некоторого угнетения общей двигательной активности, при этом исследовательско-ориентировочная активность у этих животных угнетена не была.

В целом, результаты этого теста оказались мало продуктивны.

Формирование реакции активного избегания и сохранность условного рефлекса. Оценивая характер формирования условного рефлекса, нами был проведен анализ данных по появлению 1-ой, 2-ой, 3-ей и т.д. реакций избегания на звук Для этого подсчитывалось число сочетаний условного и безусловного раздражителей предъявленных до появления 1-ой, 2-ой, 3-ей и т.д. реакций избегания (рис.3). На рисунке хорошо видно, что экспериментальные кривые трех групп животных не пересекаются между собой, т.е. процесс формирования условного рефлекса проходил по-разному: чем ниже кривая, тем быстрее формируется условно-рефлекторный ответ.

На начальном этапе процесс формирования реакции избегания у животных, иммунизированных к аминоксидазе плазмы, проходил несколько медленнее по сравнению с животными контрольной группы, получавшей чистый ФР.

рис.3. Влияние иммуносупрессии аминоксидазы плазмы на начальный этап формирования условной реакции активного избегания.

Тогда как в группе контроля, получавшей смесь ПАФ и ФР процесс формирования навыка замедлен значительно и число сочетаний звук+ток, необходимое для последовательного появления реакций избегания, на несколько десятков больше, чем необходимо иммунизированным животным (рис.3). Следует учесть наибольшую показательность сравнения хода формирования условного рефлекса в группе иммунизированных животных по сравнению с контролем, получавшим смесь ПАФ и ФР. Именно эти различия свидетельствуют об специфическом влиянии иммунизации к АО плазмы на процесс формирования условного рефлекса.

Оценивая процесс формирования условного рефлекса активного избегания (рис.4) у животных, иммунизированных к

аминоксидазе плазмы, по сравнению с двумя группами контроля мы не наблюдали значимых различий по средним значениям реакций избегания в опытной группе по сравнению с контролем, получавшим смесь ПАФ с ФР до 10-ти дневного перерыва. В контрольной группе, получавшей чистый ФР, число реакций избегания было несколько больше, чем в двух группах иммунизированных животных в течении всего эксперимента за исключением 5 и 19 дня. Эти различия не были достоверны. Положительное влияние иммунизации к АО плазмы было выявлено после 10-ти дневного перерыва, который послужил тестом на сохранность сформированного навыка. Этот перерыв в процессе обучения не сказался на ходе формирования условного рефлекса у животных, иммунизированных к АО плазмы, и у животных контрольной группы, получавших

рис.4. Влияние иммуносупрессии аминоксидазы плазмы на формирование условной реакции активного избегания

»-р<0.01; *«-р<0.001 АО пл + ПАФ по сравнению с ПАОн-ФР

физраствор: число реакций избегания в течении последних пяти дней эксперимента последовательно увеличивалось. У животных контрольной группы, получавшей смесь ПАФ и ФР, после 10-ти дневного перерыва нарушился процесс консолидации временных связей и процент реакций избегания оставался на том же уровне, что и до перерыва (35%). В последующие дни эксперимента увеличения числа реакций избегания на звук в этой группе животных также не наблюдалось: на 21 день эксперимента было всего 41,7 % положительных реакций. Таким образом, активная иммунизации к АО плазмы не приводила к нарушению обучения в тесте УРАИ. В то время как в контрольной группе, получавшей смесь ПАФ и ФР, наблюдалось нарушение процесса обучения (Кустова, Данилова, Ашмарин, 1992), вызванное негативным действием самого адъюванта, побочные эффекты которого описаны во многих исследованиях (Godefroy et all, 1987, Bennet et all, 1992, Lei et all, 1996 и др.).

Анализ количества межсигнальных реакций в течении первых 6-ти дней обучения показал, что достоверных различий между опытной и контрольными группами по данному показателю не наблюдалось (рис. 5).

Оценивая число межсигнальных реакций как показатель, отражающий ход процессов генерализации условного

рефлекса в ЦНС, можно отметить, что генерализация условного рефлекса у

иммунизированных к АО плазмы

рис.5. Влияние иммуносупрессии аминоксидазы плазмы ,.

~ . животных проходила плавно и 10-

на число межсигнальных реакций при формировании г

УРАИ. ти дневный перерыв на ее ход

значительного влияния не оказал. Тогда как этот перерыв оказался ключевым для животных, получавших смесь ПАФ и ФР, и процесс генерализации условного рефлекса у них остался незавершенным.

Таким образом, иммуносупрессия акминоксидазы при использовании в качестве адекватного контроля смеси ПАФ с ФР выявило достоверное положительное влияние после 10-ти дневного перерыва. После перерыва процент реакций избегания у животных, иммунизированных к аминоксидазе плазмы, увеличился и к концу эксперимента: среднее значение процента положительных реакций в опытной группе было 80, тогда в контроле

(ПАФ + ФР) после перерыва процент реакций не изменился (35%) и сохранился на том же уровне до конца эксперимента (41%).

Формирование и воспроизведение условной реакции пассивного избегания. Формирование условной реакции пассивного избегания проводили в камере, поделенной на два отсека: темный и светлый. В ходе эксперимента регистрировалось: время захождения в темный отсек при первом помещении в камеру (ЛП), время захода в темный отсек при помещении в камеру второй раз (УРПИ через 1 сутки) и время захода в темный отсек при помещении в камеру третий раз, через 1,5 месяца. Результаты формирования и воспроизведения УРПИ представлены на рис. 6.

Достоверное положительное влияние иммунизации к АО плазмы на процесс формирования УРПИ выражалось в увеличении времени захода в тёмный отсек у иммунизированных животных при повторном помещении в камеру в 1,3 раза по сравнению с ПАФ контролем и в 2,7 раза по сравнению с ФР контролем. При этом 50% опытных животных вообще не перешли в тёмную половину камеры в течении всего времени регистрации (300 секунд). Из крыс, входящих в контрольную группу ПАФ + ФР, только 33% не зашли в темную половину камеры; в группе контрольных животных, получавших ФР, крыс не зашедших в темную половину камеры не было.

Для оценки влияния иммунизации к АО плазмы на сохранность сформированного

рефлекса через 1,5 месяца

эксперимент повторяли. Нами были

получены следующие данные (рис.

6). Время захода в темный отсек

камеры у животных,

иммунизированных к АО плазмы,

увеличилось от 176 сек до 187. В

контрольной группе, получавшей рис.6. Влияние иммуносупрессии аминоксидазы шесь ^ и фр> ее м плазмы на формирование и воспроизведение условной реакции пассивного избегания.

200

3100

£ 50

□ФР

^150 -{- 0ПАФ + ФР

9 АО пл + ПАФ

УРПИ через 1,5 месяца

*"-р<0.001 АО пл + ПАФ по сравнению с ПАФ+ФР; ххх- р<0.001 АО пл + ПАФ по сравнению с ФР

захода в темный отсек уменьшилось в 1,3 раза (от 131 сек до 96); в контрольной группе, получавшей ФР, время УРПИ уменьшилось в 2,3

раза (от 65 сек до 28).

Таким образом, иммунизация к АО плазмы приводит к более прочному закреплению сформированного рефлекса пассивного избегания, особенно, по сравнению с контролем, получавшим смесь ПАФ+ ФР.

Влияние иммунизации к аминоксидазе плазмы быка на содержание биогенных аминов в отделах мозгах. Известно, что увеличение триптофана в плазме крови (Громова, 1980, Семенова, 1992) и увеличение серотонина в мозге (Тушмалова, Воронина, 1963, Кругляков, 1975) приводят к нарушению условного рефлекса. Введение ПАФ приводит к увеличению триптофана в плазме, который является предшественником серотонина и способен свободно проникать сквозь ГЭБ (Kadlec et all, 1986, Godefroy et all, 1987, Bennet et all, 1992, Lei et all, 1996). Основываясь на выше изложенных данных, ход формирования и воспроизведения условных рефлексов активного и пассивного избегания в группе животных, получавших смесь ПАФ и ФР, мы обьясшши влиянием повышенного содержания серотонина в мозге животных. Как было показано выше иммунизация к АО плазмы ведет к подавлению активности МАО А в сенсомоторной коре и хвостатом ядре мозга крыс. Следовательно, содержание серотонина в этих отделах мозга также должно увеличиться. Для выяснения этого мы провели серию экспериментов по определению содержания серотонина, продукта его конечного обмена 5"-ОИУК, а также дофамина и норадреналина в исследуемых отделах мозга. Для более жесткого контроля мы проводили анализ содержания данных веществ по сравнению с биохимически чистым контролем, получавшим ФР. Иммунизация к АО плазмы приводит к резкому увеличению в 5,7 раза содержания серотонина в хвостатом ядре. При этом содержание 5-ОИУК уменьшилось в 3,2 раза в хвостатом ядре и в 2,6 раза в сенсомоторной коре. В хвостатом ядре содержание дофамина и норадреналина было увеличено в 1,2 раза (р<0.01) и в 1,6 раза (р<0.001) соответственно. В сенсомоторной коре достоверно увеличено было только содержание норадреналина

Таким образом, иммуносупрессия аминоксидазы плазмы вызывает специфическое изменение состояния нейромедиаторных систем, выраженное в повышении активности катехоламинэргической системы и подавлении активности серотонинэргической системы, что наиболее выражено в стриатуме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Из представленных выше данных следует, что плазменная аминоксидаза вовлечена в регуляцию поведенческих функций. При ее прямом введении наблюдается седативный эффект. Иммуносупрессия эндогенного фермента с помощью метода активной иммунизации к гетерологичному энзиму приводит к появлению нескольких эффектов, основной из

которых подобен эффектам антидепрессантов, причем развивается в сочетании с анксиогенным эффектом при незначительном подавлении обхцей активности.

Использование метода активной иммунизации позволило нам выявить участие аминоксидазы плазмы крови в формировании мнестнческих процессов. При формировании условно-рефлекторных навыков у животных, иммунизированных к АО плазмы, не нарушался процесс консолидации временных связей по сравнению с неспецифическим контролем иммунизации смесью ПАФ и ФР. Также у животных, иммунизированных к аминоксидазе плазмы, была зарегистрирована более высокая способность воспроизведения сформированного рефлекса по сравнению с контролем. Бее это наблюдалось на фоне подавления активности МАО типа А в сенсомоторной коре и хвостатом ядре мозга животных, что в свою очередь приводило к изменению уровня нейромедиаторов в мозге.

Представленные данные, позволяя впервые предположить соучастие АО плазмы в процессах когнитивной деятельности, заслуживают также внимания в аспекте разработки новых моделей нарушений деятельности мозга, связанных с гиперфункцией биоаминных систем нейротрансмиссии.

Подобие эффектов, наблюдаемых при иммунизации к АО плазмы, действию антидепрессантов побуждает также к развитию более широких поисковых исследований в направлении использования иммуносупрессии при терапии депрессивных состояний. При этом следует обратить внимание на изменения активности МАО мозга, наступающие, несмотря на известную консервативность гематоэнцефалического барьера. Важно еще раз подчеркнуть, что лишь иммуносупрессии открывает путь к длительной коррекции ряда систем. Во-первых, всего двух инъекций достаточно для подавления активности эндогенного энзима более, чем на 6 месяцев, тогда как фармакологический эффект применяемых в медицине ингибиторов МАО наступает только после 5-7 ежедневных инъекций и для его пролонгированного действия необходимо введение препарата в течении нескольких месяцев. Во-вторых, при активной иммунизации не образуется вредных метаболитов антидепрессантов.

Кроме изложенных выше основных задач диссертационной работы, результаты выполнения которых выносятся на защиту, нами выполнено также поисковое исследование, имеющее целью определить дальнейшие перспективы развития метода активной иммуносупрессии для выяснения регуляторных функций энзимов плазмы крови. В качестве такого энзима был избран катепсин А, «подозреваемый» в регуляции уровня некоторых пептидных регуляторов. Поскольку это исследование имеет пока поисковый характер и связано с основным содержанием диссертации лишь методологически и в плане выяснения

регуляторной роли энзимов плазмы, мы вынесли его описание в отдельный раздел

литературного обзора с целью дополнительной демонстрации перспективности метода

активной иммуносупрессии.

ВЫВОДЫ

1. Аминоксидаза плазмы быка при системном введении вызывает угнетение двигательной активности крыс в открытом поле и крестообразном приподнятом лабиринте; при этом не наблюдалось увеличения тревожности.

2. Аминоксидазная активность плазмы крови крыс значительно подавляется у животных, иммунизированных к аминоксидазе плазмы быка.

3. При анализе активности моноаминергических систем мозга в мигохондриальных фракциях сенсомоторной коры и хвостатого ядра было установлено угнетение активности МАО А у крыс, иммунизированных к аминоксидазе плазмы, тогда как активность МАО В практически не изменялась.

4. У иммунизировашшх к амипоксидазе плазмы крыс в течении б месяцев после первичного введения антигена наблюдалось некоторое увеличение веса и ректальной температуры, по сравнению с контрольными животными.

5. Иммуносупрессия аминоксидазы плазмы приводила к более прочному сохранению и воспроизведению рефлекса активного избегания

6. При формировании и воспроизведении условной реакции пассивного избегания наблюдался значительно более высокий уровень рефлекса у крыс, иммунизированных к аминоксидазе плазмы.

7. Увеличение поисковой активности и тревожности в тесте КПЛ на фоне иммуносупрессии аминоксидазы плазмы не сопровождалось значимым изменением двигательной активности в открытом поле.

8. Иммуносупрессия аминоксидазы плазмы приводит к значимому увеличению содержания серотонина, дофамина и норадреналина, а также к достоверному уменьшению содержания конечного продукта обмена серотонина - 5'чжсииндолуксусной кислоты - в сенсомоторной области коры и хвостатом ядре мозга.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ашмарин, Е.В. Бузинова, E.JI. Доведова, Ж.Е. Слесарева. Влияние активной иммунизации к МАО на активность нейромедиаторных систем мозга у белых крыс// Тез. Док. На 2-ом Съезде Биохимического общества РАН, ч.1, стр. 168, Москва, 19-23 мая 1997 г.

2. Е.В. Бузинова, Ж.Е. Слесарева, М.Ф. Обухова, И.П. Ашмарин. Иммунизация к моноаминоксидазе плазмы замедляет угасание условного рефлекса активного рефлекса избегания у крыс// Росс. Физиол. Ж. им. И.М.Сеченова, т. 83, №7, стр. 19-21,1997 г.

3. Бузинова Е.В., Слесарева Ж.Е. Активная иммунизация к МАО, как способ влияния на поведение белых крыс.// Мат. Всероссийской конференции Изменчивость и поведение животных, ИБВВ РАН, Борок, 21-25 октября 1997 г.

4. Бузинова, Е.Л.Доведова, М.Ю. Монахов, Т.А. Москвитина, М.Ф. Обухова, Ж.Е. Слесарева, И.П. Ашмарин. Влияние активной иммунизации к аминоксидазе плазмы крови на мнестические процессы и состояние медиаторных систем мозга крыс.// принято в печать в БЭБиМ, 1997г.

5. Бузинова Е.В., Доведова Е.Л., Москвипша Т.А., Ашмарин И.П. Нейрофизиологические аспекты влияния активной иммунизации к аминоксидазе плазмы на мнестические процессы у крыс.//Тезисы доклада на заседании Московского отделения Нейрохимического общества России, приняты в печать в ж. Нейрохимия, декабрь 1997.

6. E.V.Bouzinova, J.E.Slessareva, E.L.Dovedova, M.F.Obouchova, I.P.Ashmarin. Effect of MAO immunization on mnemonic processes and the state of neuromediator systems in white rats.// ХХХШ International Congress of Physiological Science, S. Petersburg, June 1997.

7.1.P. Ashmarin, E. Buzinova, M. Vinogradova, M. Potier and A. Pshezhetsky. Learning disability in rats induced by the immunosupression of cathepsin A in blood plasma. // Neurosci. Res. Comm., 1997, vol. 21,N2,p.l53-162.