Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЧАСТИЧНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЧАСТИЧНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ"

■Я-19Ш

Государственная комиссия СМ СССР по продовольствию

и закупкам Всесоюзный научно-исследовательский институт фитопатологии Главагробиопрома

На правах рукописи

МИРГОРОДСКИЙ Сергей Валентинович

УДК: 619: 616.34—085.37

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЧАСТИЧНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ

(06.01.11- — защита растений от вредителей и болезней)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Голицыне, 1990

Работа выполнена в Северо-Кавказском научно-исследовательском институте фитопатологии Глэвагробнопрома при Гостом и сси и СМ СССР по продовольствию и закупкам.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Л. М. УМ НОВ.

Научный консультант-, кандидат сельскохозяйственных наук

В. В. ЧИҐРИН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, (грофсссор

Н.Н.ГУСЕВА

кандидат биологических наук Г. К, СОРОКИНА

Ведущее учреждение-. Всесоюзный се деки ион и о-генетический институт.

Защита состоится __» * L A 1990 года в /У час.

f/& мин, на заседании специализированного совета К. 120.66.01 во Всесоюзной научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу: и^-ч.-чекая область, Одинцовский район, н/о Большие Вязе,'/^

С . і 'с : і /--'¡-.у- ^ библиотеке Всесоюзного кауч-

ИО-ііСС.Чс.; • • !. . Vi';. ОГНИ.

/

Ая'Т.^-феряг •• : •.. л.:н « /j^ » î-і- » > 1990 г.

V1:'.-"МЙ ceKp. ".;T>t> о-ч ■ М).ованпо; -. ..

И, H. ЯКОВЛЕВА

ОБШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

i

Актуальность теад, а настоящее время основным способом защиты щеницы от ржавчинных заболеваний является выведение усюйчи -вых к этим патогенам сортов. При этом вое больший интерес прояв -ляется к сортам, обладащмм так называемой частичной устойчивое -тыо, которая выражается з замедленном развитии заболевания при восприимчивом типе реакции на паразита. Поскольку во многих еду ~ чаях частичная устойчивость имеет расокеспецифический характер, она нокех сохраняться э течение значительно бодав длительного периода времени, чем расоспецифическая устойчивость.

Выявление сортеобразtos, обладающих частичной устойчивостью, представляет собой довольно слсхнуи задачу. Во-первых, г полевик экспериментах необходимо убедиться, что при восприимчиво« типе реакции на патоген заболевание развивается замедленно. Во-вторых, нужно выяснить причины замедленного развития болезни или факторы частичной устойчивости, я котором относятся интенсивность заболевания, продолжительность латентного периода и, в ряде случаев, спорообразоватвльная способность пустула с единицы шшади икфи -цировэнного листа.

Необходимость проведения всех этих измерений делает работу по отбору я оценке частично устойчивых сортов secuta слоеной.

Меаду тем, имеющиеся а литературе сведение (Найдёнова,IS8S) показывает возможность существенного упрощения и ускорения таких исследований путем использования некоторых биохимических критериев степени колонизация растения паразитом, например, путём ишу -нофермеитного анализа грибных антигевоав инфицированной растительной ткани, Изучение возможностей данного методического приема при исследовании реакции возбудителя бурой ржавчины в растениях пшеницы к стало основной задаче!! настоящей работы,

Цель и задачи исследований. Цель исследования: предложить метод выявления в условиях полевого эксперимента сортов и линий пшеницы, обладающих частичной устойчивостью к jMccinia recóndita, путем количественного определения антигенов гриба во флаговых листьях растений. Исходя из этой цели, был поста влез ряд следующих задач:

X, Изучить возможность с достаточной точность», снеЦКфИЧНОСТЫ) И ит>яииярт,ьем;о Определять СеЛКИ МИцеЛИЯ

Р T^rnndita В ИН$ИДИ[ ов ан н и*' ч^Аат' Ó ElbM-ílílc Ti Я X 0 • 'i; : ■■ "flHOTEHA

■ОСИ. СО/Г' - 1К(ДМИ ИМ. к, •• >иэв!-- ,

¡аеницы с помощью

- г -

иммуноферментного ан&лиза.

2. Изучить особенности накопления грибной биомассы б инфицированных возбудителем бурой ржавчины растениях пшеницы, различных по степени частичной устойчивости сортов.

3* Выяснить взаимосвязь между количеством грибных антигенов ж зараженных лисггях и гаяим общепринятым при выявления сортов с частичкой устойчивость» показателен как площадь под кривой развития болезни.

4. Установить степень взаимосвязи между накопление« грибных антигенов в тканях флагового листа и изменениями отдельных элементов структуры урожая.

Научная новизна,работы. Предложен метод, позволявший «а оо -нова количественного шму ноферменгного ©пределевня антигенов Р* згесоз41Ъв » проследить динамику роста патогена а тканях растения-хозяина и получить количественные различия, используемые для выявлений сортов с частичной устойчивостью к возбудителе бурой ржавчины. Показано наличие корреляционной взаимосвязи между количеством грибных антигенов во флаговых листьях инфицированных растений и степень» их частичной устойчивости.

Практическая ценность|работы, Данные диссертационной работы были использованы при подготовке методических рекомендаций: "Биохимические методы оценки степени частичной устойчивости пшенацы к стеблевой и бурой рлбвчине", рассмотренных и принятых В рубАВКЗЦОД отделом растениеяоде«а и селекции ВАСХНИЛ* Методы определений грибных антигенов в инфицированной растительной ткана и диагностики степени частичкой устойчивости по содержанию грибной биомассы в инфицированных растениях испольауются в работах НПО "Кубань-эерво* ло выведение новых сортов пшеницы.(Акт о внедрении).

Апробация работы. Натеркалы диссертации докладывались на Всесоюзном совещании "Физиояого-биохиыическиа основы идаунитета растений к грибшш болезням для целен прикладной селекции", Уфа, авраль, 1588 г.; на Всесоюзно« сове&ашаи "йддуцдрованная устойчивость сельскохозяйственных культур к фитопатогенам", Чегет, сев -твбрь, 1989 г.; аа Республиканской конференции "Методы интенсификации селекционного процесса", Одесса, апрель, 1990 г.

Публикации■ Ло материалам диссертации опубликовано 3 сообщения.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, материалов и методов, экспериментальной части, включающей изложение результатов исследования л их обсуждение, эаклочения, выводов и списка цитированной литера -туры. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста« со-дераитЛ рисунка и 23 таблицы. Список литературы включает 173 наименования, из них Iff работы зарубежных авторов.

■ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили проростки и флаговые листья 24-х сортов и линий гшеницы, относящихся к'аиду Triticuaa aesti -vum L, Растения выращивали в контролируемых и полевых условиях. В качестве инфекщюаного материала использовали уредоспоры рас 7?, 105 и северокзвказсной популяции Puccinia rocondita ЕоЪ.ех. Beam, f.ep.tritici Erlbss. величина инфекционной нагрузка составляла 2,5 и 15 мг/м^. Тип поражения растений определяли по ыодифициро -вавкой шкале Kaina, jackaon (1921). Оценку степени поражения растение проводили при помощи шкалы Оетерсона <1948). Величину латентногопериода оценивали согласно методическим рекомендациям ли составлению прогноза бурой ржавчины и защите посевов пшеницы (1982), Критерий оценки площади под кривой развития болезни рас -считывали на ЭШ (Андрейченко и -др,, 1982), Величину массы 1000 верен и массу зерна с колоса определяли по методу Горине и др, <1963), Для получения автисывороток использовал«-стандартную схему иммунизации животных. Иммуноглобулины выделяли путем сульфат -яо-рдваяольного осаждения ( ВеЗаек е* в1*И969 ■). Ковъюгирование

прохиворхавчинных антител с пероксидазой проводили по методу Wilson» neks»« (1978). Содержание грибник антигенов в инфицировав -икс растениях определяли при помощи прэдого яаердофазного конку -рентного варианта ОД с преданкубацией меченных перонсидазоя ан -тате я и анализируемого анхигеаа. Хло^лфилд в образцах определяли в соответствии с методом Stevenson (1963), белок - по методу Joy pi (1951). Математические обработки полученных данных осуществлял* согласно доспехоау (1979), Плизсинскому (1961).

РЕЗУЛЬТАТЫ I! ОБСУаЩШЕ

Разработка иммунохимического метода количественного определения антигенов возбудителя бу»ой }1далчины в растениях пшеницы.

.Решение гтой задачи требовало получения высокоактивных аити-

сывороток ярогив антигенов лоабудителк бурой ржавчины пшеницы и приготовлений на их основе иымуно^ерментных препаратов. Кроме того» было необходимо подобрать наиболее пригодный для наших целей вариант постанов«« иммунофернентного анализа. Для этого мы провели оптимизацию двух различных модификаций иы:<<уноферментного ана -лиза (ИФА), в частности, "сэндаич"-вариэнта и прямого конкурент -ного анализа,определив оптимальные концентрадай сенсибилизирующих полистирол антител и иммуноферментного коныогата. Подобранные условия проведения анализа били использованы для сравнительного изучения возможностей этих вариант о г ¡¿ФА. при количественном определении антигенов бурой ржавчины. Результаты проведенного иссле -дования (табдЛ) показали, что чувствительность прямого конкуреа-тного варианта почтя в 10 раз превосходила таковую "сэндвич^-ана -лиза.

Таблица I

Сравнениз эффективности различных вариантов ЙФА при определении антигенов возбудителя бурой ржавчины шденицы .

; при коя центра дни анализируемого антигена,

ВЕГНТ _■т/"»._,_

: ол ; I_: 5_; ш

"Сэндвич" 0,061*0,062** 0,394*0,03 0,462*0,03 0,617*0,12

Прямой конкурентный 0,257-0,04 0,465*0,01 0,781*0,08 0,963*0,01

* разность оптических плотностей при анализе опытного и контрольного образцов;

*хотличке от контроля недостоверно яри ?=0,05

На основании данные табл.1 во всех дальнейших експериментах использовала именно этот вариант 1Ш,

Последушяй этап работы был связан с дальнейшей оптимизацией условий проведения и выяснения возможностей этого метода. При выполнении первой части этой задачи было изучено влияние на результат анализа продолжительности сорбциа антигена на полистироле, а такхе температуры и рн среды, при которой проходила сенсибилиэа -дня антигена. Результаты проведенного исследоіания доказали, что їммобилжзаиия грибного антигена практически полностью эаканчива -

лась в течение 2-х часов при 37°С и рн 9,6. Существенное влияние уделено и определению оптимального времени проведения иммуноло -гической реакции между иммобилизованным антигеном и ыеченщ&с^ор-ментом антителами. В результате установлено, что эта реакция практически полностью завершается в течение I часа. Кроме того, была изучена возможность увеличения чувствительности данного варианта ЙФА путем раздельного проведения реакций меченных ферментом антител о анализируемыми и шмобилизированными антигенами. Результаты проведенного исследования доказали, что предварительная инкубация меченных ферментом антител, о анализируемым- антигеном в течение 30 мин почти вдвое увеличивает степень ингибировения их реакций с пм-мобилизованньш антигеном по сравнению с вариантом, в котором обе реакции происходят одновременно.

Для выяснения возможности количественного определения возбудителя бурой рнзвчины пшеница, а также чувствительности и точности этого анализа, мы изучили зависимость степени конкурентного иц-гибирования реакции меченных ферментом антител с шиобидизирован-ным антигеном (У) от концентраций анализируемых антигенов (X).Было установлено, что данная зависимость носи; нелинейный характер. Математическая обработка полученных данных показала, что эха за -знойность хорошо апроксимируется функцией; в.21оь , где а -эмпирический коэффициент, значения которого.зависят ох партии по-яистиролових планшетов и иимувофврментного препарата, причем в пределах одной партии коныогата и планшетов он практически не изменяется. Концентрации антигена в анализируешь образцах опреде -ляли по формуле: ^

х = 101ое2с=1Г> •

Относительная погрешность определения варьировала о* 5 до 23/5 при анализе грибного в концентрациях 100-5000 иг/мл. Таким об -

разом, нажили предел чувствительности разработанного метода сос -тавлял 100-200 нг грибного белна/мд при ошибке определения до

Так как целью работы был копичес^вэнный анализ ржавчинных внаигеаов непосредственно в тканях инфицированных растений, то необходимо было выяснить не меняется ли характер взаимодействия грибных антигенов с меченными антителами в присутствии растительных экстрактов. Сравнительное определение различных концентраций ржавчинных антигенов е буфере и растительном экстракте не выявило значимой разницы между результатами анализа обоих образцов. Соотэет -ственно есть все основания считзть, что присутствие растительного

экстракте не оказывает влияния на определение ржавчинных антигенов.

Таблица 2

Определение концентрации антигенов возбудителя бурой ржавчины с пшошьо прямого конкурентного варианта ИФА

Внесено антигена, нг/мл : Конкурентное кнги-: биоовакие реакции,^ ♦Определено антигена*,нг/мл -¡Относительна: ¡погрешность.;

100 16,3 116*22 16,0

200 19,1 178*18 10,9

400 23,9 3SQ*32 5,0

€00 29,2 740*103 23,4.

800 30,5 850*106 6»3

1000 ЗМ 936*76 6»3

5000 53,8 5615*512 12,3

"представлены средние значения 8-ми определений 1 среднее квадратическое отклонение.

другой данной характеристикой серологического метода служит его специфичность. Поскольку 5 литературе имеются данные о зависимости степени серологического родства белков паразита и его хозяина от характера их взаимоотношений ( charndsttan, D« Toy, 1972) мы испытали как-вослриимчквш сорта пшеницы, так и сорта» обладающие устойчивостью разных типов. Результаты приведенного исследования (табл.З) показали, что экстракты здоровых растений всех изученных сортов не взаимодействовали с антителами против антигенов возбудителя бурой ржавчины пшеницы. Существенное значение,особенно при работе с полевыми образцами инфицированных растений,имело место н выявление В03М0ЕНЫХ перекрестных реакций между полученной нами сывороткой и антигенами других видов грибов, которые могли бы присутствовать в анализируемом материала. Проведенные исследования (табл.3) показала, что использованные в работе антитела не взаимодействовали с антигенами возбудителей мучнистой росы и сея -торноза пшеницы, но обладали jbucokhu сродством в антигенам воабу -дителя стеблевой ржавчины.

Таким образом, данный метод дает возможность проводить коли -чественный анелнэ возбудителя бурой ржавчины в растениях, поражен-яых наряду с этой болезнью сеяториозои и мучнистой росой, однако не позволяет вести раздельное определение различных видов ржавчин-

ншс грибов при совместном заражении. Для проверки воспроизводимо-

Гаолица 3

Специфичность антител, подученных к белкам ржавчиишг грибов,при определении концентрация этих белков методом конкурент ого i№A

Источник антигена

Разведение экстрак-rКонкурентів или концентра-!ное инги -ция антиген Гбировакие нг/мл* ; реакции,

IЭквивалентная концентрация Гантигенов рка-Івчквннх грибов, 1_«г/мл

Сорта пшеницы

Безостая і 1:1 1,7s® 0

Колос HI 0 0

Лан xu 0 0

Замена l:l 3,1ій 0

Культура 3,7®®

Septoria помогши Ш 0

Рцесіпіа greminis IOOOO 60,1 8153

Puccini* ïecondita XOÛOO 63,U 94SQ

Листья пшеницы ¿зараженные) u?*

Ezy.qiphe greminia 1:1 0

Pucclnia grasdnia I: I 37,2 1649

^Разведение 1:1 - гомогенат I г листьев пшеницы или мицелия гриба дальнейшему разведению но подвергался; XX

стличиа от контроля, не содержалего конкурентных антигенов, недостоверно,

сти метода извлечения грибных антигенов из растительных тканей од сравнили результаты анализа 6-ій независимо полученных экстрактов зараженных растений одного срока и срока развития инфекции (тазл, 4).

Результаты этого эксперимента показали достаточно высокую степень воспроизводимости использованного метода определения грибных антигенол в растительных образцах: максимальное отклонение результатов одного анализа от среднего значения б-ти определений не превышало о средняя величина составила ір^і. Эти эеличшш иоз-но считать параметрами точности рпзрлботэнкого метода при работе с инфицировании«! растениями пи о и из.

Таблица 4

Определение воспроизводимости ИФА ржавчинных антигенов в растениях пшеница

Повторное»

Определено антигена, ^Отклонение от среднего мкг/г*_! значения, 'А

1 г з

н

5

6

Среднее

XI ,1і! ,9 10,4*2,4 15,6*5,1 12,7*2,3 15,2*2,5 17,4*3,2 13,4*2,5

17,2*2,4 22,4*4,0 16,4*2,4 5,3*0,8 1,5*0.2 29,6*2,8 15,4*2,0

^представлена средние значения1восьми определений * среднее квадратичное отклонение.

Диагностика частичной -устойчивости пшеницы к возбудителю буров ржавчины методом иммукоаермеитного анализа.

Целью данного раздела работы стало выявление возможности и путей использования разработанного метода ИФА ркавчшшых антигенов в тканях инфицированного растения для'выявления сортов пше -вицы, обладаших хозяйственно значимым уровнем частичной устой -чивости к возбудители бурой раавчины пшеницы. Учитывая возможность изменения характерз взаимоотношений паразита и растения-хозяина на разных этапах онтогенеза, било вааио установить фазу развития исследуемого растения, наиболее четко охрэиашего л модельных экспериментах его поведение в реальных полевых условиях, а также выяснить зависимость полученных при этом данных от условий внешней среды и количественных и качественных характеристик инфекционного материала* Для решения первой чести поставленной вадачи мы провели исследование характера взаимосвязи между ско -ростью накопления грибных антигенов в инфицированных растениях и степенью ах частичной устойчивости на стадквх проростков, цвeie-нил к молочной спелости. Результаты изучения взаимосвязи между степенью частичной устойчивости, показателем которой являлась пло-иадь под кривой развития болезни (1ШРБ), полученная на основе учетов кнгенеизаосги пораженном», проведенных з полевых условиях указанных сортов паеницы к ■ р.гесолаш», и количеством грибных ая-

тигеноа, накопленных в проростках тех же сортов, инфи пиров енншс двумя расами этого патогена, представлены в табл.5.

Таблице 5

Накопление грясных антигенов в проростках пшеницы, различных по степени частичной устойчивости к возбудители бурой ржавчиш

4 Раса 105 Раса 77

Сорт шеницы •Тип поражения в •баллах -¡ПКРБ* " 2 ; см' •Содержание грибных ан-.•тигенов, ' шг/г •Тип пора: аения в : .баллах 5 • ■гПКРБ* icM2 ♦ I ¡Содержание ¡грибных •антигенов, ; ыкг/г

Спартанка 3 85,0 60,5 4 299,0 133,1

Павловка 4 Ю4,о 7.9 3 37,5

Лабинка 2-3 38,0 10,5 3 44,0 39,5

Русалка 3 44,0 29,1 2-3 37,5 48,6

Исток 4 49,5 9,3 XX »et JÜC

Ьечванка 3 58,0 6,5 2-3 67,5

262Ih2482 103,2 73,5 3 144,0 27,6

262Ih2485 ме ** JÜ4 4 78,7 143,1

*влощадь под кривой развития болезни, определенная на основе учетов интенсивности поражения, проведенных стандартным методом в полевых условиях; юс

сорт проявляет расоспецифическую устойчивость к данной расе патогена.____-

Из табл.5 видна, что, хотя растения сортов Лабишса и Исток, обладавшие частичной устойчивостью в стадии взрослых растений, о чем свидетельствует малая величина ЗКРБ, и в стадии проростков, характеризовались очень низкой по сравнению с восприимчивыми растениями сорта Спартанка, скоростью накопления антигенов,коэффициенты корреляций между плошадьв под кривой развития болезни я количеством накопленных грибных антигенов в инфицированных про -ростках были относительно невысокими как в случае расы 105, так к при использовании расы 77 патогена {0,58*0,13 и 0,54*0,11 со -ответственно,). Полученные данные даат все основания считать, что использование проростков в диагностике частичной устойчивости взрослых растений является достаточно рискованным мероприятием, поскольку образцы, приобретающие такуш устойчивость только во

взрослом состоянии, будут отнесены к восприимчив™, В связи с этим в дальнеЗиих эксперчентах ш провели исследовании по выявлению той фазы развития взрослых растений, в которой содержание грибных антигенов более адекватно отображает степень его частичной устойчивости. Для атого было проведено изучение взаимосвязи между ос -ноанщ фито па т о логич е с к им параметром оценки устойчивости растения (плокади под кривой развития болезни) и количеством грибнш: антигенов, накопленных в ик^ицированньк. растениях в фазу полного цветения и фазу молочной спелости (табл.6).

Таблица 6

Накопление грибных антигенов во флаговом листе взрослых растений пшеницы различных по степени устойчивости

сортов

^ Гран-

Сорт шеницы и тип поражения, балл

Фаза

полного' цвете!-

.йя:"молочная" спелости» ШСРЕ:

;содержание:ранзи- ¡содержание«ранжи- ¡см ;ка :грибных ан-гровка ------— -- ------ '

¡грибных антрешка гигенов, ; по ;тигенов, > по ' ЙФА • мкг/г 1 ' ЯРА

¡по

Лезостая I (4) 4,9*С,Э 6 925,6*127,5 I 1137 . 2

Дарица (3) 2,1*0,4 12 377,5*30,3 6 509 II

Замена (3) 2,1*0,5 13 272,9*34,2 10 279 13

Зкрка (3) 1.7*0,9 14 108,9*40,0 15 248 14

Краснодарская 57 (2-3) 0,2*0,1 16 Ш5,0*35,5 13 179 15

Краснодарская 70 4,7*0,3 8 557,2*27,0 3 876 5

Колос (4) 4,6*0,2 10 418,6*28,1 5 760 8

Одесская 51 (3) 4,7*0,3 9 315,5*68,9 4 7 807 7

Павловка (2-3) 1,4*0,1 15 94,0*6,4 16 123 16

Партизанка (3) Спартанка (3) -эталон 5,1*1.и 5 168,6*32,9 14 476 12

12,4*2,3 г 512,2*76,8 4 908

Коток (2-3) 8,1*1,2 3 195,3*62,7 12 540 Ю

Полукарликовая 49 0) 20,3*2,1 I 876,4*22,3 2 1300 I

Криница (3) 4,4*0,1 и 247,9*30,1 II 950 ъ

Тарасовская 29 4,8*0,4 304,6*20,0

(5) ? 9 870 6

Олишшя 2 (3) 5,4*0,3 4 315,4*70,3 8 606 9

Математическая обработка всей сз^иы полученных данных показа-

ла довольно высокий уровень корреляции между ШСРБ и содержанием

грибных антигенов в обе фазы развития растения как при анализе абсолютах значения этих параметров, так и ври сравнении рангов каждого сорта, определенных по результатам фктопатологической оценки и данными ИФА. Коэффициент корреляции абсолютных значений составил 0,70*0,06 и 0,82*0,09 для фаз' цветения и молочной спе -лости соответственно. При сравнении рангов он был равен 0,66*0*06 и 0,80*0,13 для фаз цветения и молочной елелости соответственно. Учитывая более высокий уровень корреляции с Е1КЕБ, наблюдаемый при иммуноферментном анализе растений на стадии молочной спелости, а также отсутствие каких-либо принципиальных преимуществ при проведении анализа в более краткий срок, мы выбрали фазу молочной спелости как наиболее удобну» ори проведении диагностики частичной устойчивости методом ИФА.

Полученные данные позволяют также определить критерий для выявления сортов, обладающих хозяйственно-значимым уровнем частичной устойчивости. По данным селекционных учреждений (Воронкова, 1980), к таковым можно отнесги сорта, величина ШГРБ которых не превышает 50# от восприимчивого эталона. Аналогичным образом в случае ИФА основным показателем устойчивости можно, по-видимому, считать относительное (по сравнению с, эталоном) содержание грибной биомассы (см.табл.6). Мы установили существование мекду этими па -раметраш довольно тесной взаимосвязи ( г 78*0,05), описываемой регрессионна уравнением У « 0,952 + 5,5, где 3 - относительное значение ПЯРБ; X - относительное содержание грибной биомассы. Не -пользование этого уравнения для прогноза относительной величины ПКРБ, по данным ИФА, показало достаточно хорошие совпадения истинных и предсказанных значений этого параметра.

На основании этих данных можно считать содержание грибных антигенов критерием устойчивости, вполне пригодным для прогнозирования такого важного.фигопатологического параметра как ШСРБ.

Изучение зависимости ^опенки степени частичной устойчивости методом ИФА от факторов внешней срезд.

Оценивая результаты предыдущего раздела работ, следовало иметь в виду, что они были получены при одной инфекционной нагрузке г одном генотипе вирулентности. возможность феЕОТИЛНческОЙ ¡13 не к ч кг О с -ги процессов взаимодействия хозяина и паразита, связанная с зтш фактором, требовала проверка выявленной закономерности в варьирую -сих условиях внешней среды и инфекционного фока, выяснение ььггг-л -

кости результатов оценки степени частичной устойчивости методом И4А ot климатических факторов проводили путем сравнения трехлетних испытаний одного и того же набора сортов пшеницы (табл.7).Исследования трех лет отличались между собой ло целом!' ряду изучению: климатических факторов, таких как: относительная влажность воздуха, количество осадков, среднесуточная температура воздуха.

Математическая обработка полученных данных показала относительно невысокий уровень корреляции меаду результатами фитопатологических исследований 1987, 1988 и 19Б9 годов как при использовании относительных значений ПКРБ, так я при сравнении рангов изучаемых сортов. Коэффициенты корреляции этих параметров были равны 0,51 i *0,11, 0,46*0,13 и 0,23*0,06 для IS87, 1988 и 1285 годов соответственно. Существенно, что аналогичным обрезом изменились и результаты оценки степени частичной устойчивости тех же сортов пшеницы методом ИФА, причем характер взаимосвязи между результатами ишуно-химического и фитопатологического методов оставался постоянным.Коэффициент корреляции между этими параметрами для 1987, 1968 и 1989 годов составил 0,72-0,16, 0,80-0,03 и 0,68-0,14 соответственно.Использование приведенной ранее формулы позволило прогнозировать относительное значение ЛКРБ по данным ИфАс достаточно высокой точ -костью. Корреляции рангов частичной устойчивости изученных ооргов, полученных по истинному я прогнозируемому знвчениюПКРЕ, состави -ли для 1987,1988 и 1989 годов 0,80*0,09, 0,76*0,08 и 0(39*0,03 соответственно. На оснований »их данных можно заключить, что разработанный нами иммун©химический метод оценки степени Частичной ус -тойчивости шеницы к возбудителю бурой ржавчины может быть использован в любых климатических условиях.

Другим этапом выяснения возможностей и ограничений шмунохи -мического метода диагностики степени частичной устойчивости шеницы к возбудителе бурой ржавчины стало изучение зависимости результатов анализа от плотности инфекционного фона (табл.8).

Несмотря на довольно существенные изменения в проявлении час-î тичной устойчивости различных сортов шеницы при изменении, инфек -цдонной нагрузки, юшунохимический метод практически во всех слу -чаях четко отражал реальный характер взаимоотношений между партнерами. Прогнозируемые значения относительной ПКРБ, как правило, хорошо совпадали с таковыми, полученными в результате фитопатологи -ского анализа (табл.8). Хорошо выдерживалась при этом и ранжировка большинства изучении* сортов. Хоэ^ициентн корреляции частичной устойчивости, определенные тмуиохимически и фитопатологически.

■ -13- Габлида 7

Зависимость резyльясов ощакя стелено устойчивости растение пшеницы к p.xecondita

методом Шк от с сг одних условия

Сорт паеницы г тип поранения s баллах

1?87 год

антиген* .'ЙКРЬ*

I98S год|

1989 год

¡прогноз;

* -ч :

антиген* >ПШ* ,-прогноз : антиген*; ДКРБ*

ИКРЕ*

* прогноз ! ПК®*

Безостая I (4) Замена (3) Колос (4)

Павловка (2-3)

Спартанка (3) - эталон

Исток £2-3)

Олимпия 2 (3)

Олимпия (2-3)

бв,г(3)м 125,0(1) 70,4(3) 166,5(1) 263,0(3) 163,5(1) 185,6(1) 75,0(3) 182,4(1)

54,8(5) 30,9(7) 57,6(5) 0,3(8) 6,6(8) 5,6(8) - -

81,8(2) 83,7(4) 83,4(2) 80,6(3) 170,0(2) 82,2(3) 130,1(2) 125,0(1) 129,4(2)

18,3(8) 13,5(8) 22,8(8) 59,3(5) 38,0(5) 61,9(5) 27,7(6) 50,0(6) 31,8(6)

100,0(1) 100,0(2) 100,5(1) 100,0(2) 100,0(4) XÛU,3(2) 100,0(3) 100,0(2) 100,3(3)

38,1(6) 59,5(5) 41,7(6) 76,4(4) Ш.0С1) 78,2(4) 37,9(5) 50,0(5) 41,5(5)

88,8(3) 69,0(4) 18,5(6) 12,3(7) 23,0(6) 1,8(7) ■37,5(7) 7,1(7)

23,5(7) 57,5(6) 27,8(7) 7,0(7) 23,3(6) 12,0(7) 69,5(4) 75,0(4) 71,6(4)

процент от sталана¡^абсолютные значения концентрации антигенов и величины ПКРБ по эзалону составили 3415 мкг/г и 918 428 «кг/г а 223 см% 1224 ыкг/г и 474 см2 за 1987, I98S и 1989 гг. соответственно;

цифра в скобках - ранг сорта по результатам изучения соответствующего параметра.

составили 0,85*0,05 и 0,89*0,05 для высокого и низкого инфекционного фона соответственно. На основании этих данных можно заключить, ИФА пригоден для диагностики степени частичной устойчивости пран -тическа при любой плотности заражения.

Таблица 8

Зависимость результатов ацнкг отелена устойчивости растений пшеницы к Р.гесошШя методом КФА от величины инфекционной нагрузки

1 *'"'...... 1 ' 11 ■'— ■ ....... ■■'-ни | ■ ..... -.,^,»»,»»»1 а. !■■—

Сйрт {высокий инфекционный сЬоя*»Низкий инфекционный ФОН**

пшеницы ;антиген^!пш*^;пр°гн°1, а]1тиген*?*ШН;*^:П1>™ : ; : ПКРБ*^ -ПКРБ

Безостая X 79,4(2)ЩНЙ1Ш,3(Х) 00,7(2) 97,3(2) 97,7(2)

Замена 63,2(5) 29,7(7) 65,3(5) 2,2<а) 5,3(8) 6,4(8)

Колос 75,3(3) 79,4(4) 76,8(3) 71,2(4) 95*4(3) 72,9(4)

Павловка 14,4(8) 12,2(8) 18,9(8) 61,3(5) 48,2(5) 63,5(5)

-"эталон8 Х0и,0(2) 1Ш,3(1) 100,0(1) 110,0(2} 100,3(1)

ЙСТОК 41,3(6) ¿1,2(5) 44,5(6) 81,9(3) 126,3(1) 83,Х(3)

Олимпия 2 69,1(4) 91,2(3) 70,9(4) 15,3(6) 12,4(7} 19,8(6)

Олимпия 31,2(7) 47,8(6) 34,9(7) 7,9(7) 33,1(6) 12,8(7)

^Величина инфекционной нагрузки - Х5 мг свор/м^; х* у

величина инфекционной нагрузки - 2,5 мг спор/ьг;

5Е»К

процент от эталона; хххх

цифра в скобках - ранг сорта по результатам изучения соответствующего, параметра.. _____

Для выяснения возможностей Ш ори использовании различного по набору генов вирулентности инфекционного материала ш провели сравнительное изучение растений, инфицирования в одних и гех же условиях различными расами патогена (габл.9).

Результаты проведенного исследования полазали, что л в этом случае ЬИА грибных антигенов в листьях инфицированных растений позволяет довольно точно прогнозировать величину ПКРБ. Коэффициент корреляции рангов изученных сортов по данным фитопатологнческого анализа и иммуиохкмичоского метода составил 0,^4*0,03 и 0,8? 4 ¿0,05 для рас 77 и ИЛ соответственно. Можно считать, что рэзробо-

танный иммунохимическид метод оценки степеня частичноа устойчивости позволяет получать надежные результаты ша зависимости от генотипа вирулентноети патогена, а также при оценив уровня специфичности (или неспецифичности) устойчивости этого типа.

Таблица 9

- Зависимость результатов оценки степени частичной устойчивости пшеницы к Р.пэсотШа метолом ИФА от генотипа вирулентности

патогена

;_Раса 77*_; Раса 105х__

іантиген1®ІПКРВ'® }дРсг523;авхиген**1ПКРВИ ¡проноз паеняцы 5 , ІШСЕБ5« і І ¡пкЕБ**

Колос " 47,5(3)***61»5(3)Г 50,4(3) 109,1(2}' 80,2(3) 108»9(2)

эталон*"8 " 100»°СХ) 100,0(1) 100,3(1) 100,0(4) 100,0(2) 100,5(4)

Павловка 33,7(4) 14,7(5) 37,3(4) 71,8(5) 56,2(5) 73,5(5)

Лабннха 3,1(6) 1,3(6) 8,2(6) 16,9(7) 20,5(7) 21, 3(7)

їачванка **** ххх'к юн« 49,2(6) 31,4(6) 52,0(6)

262Иі2482 27,7(5) 48,2(4) 31,6(5) 228,8(1) 122,3(1) 222,6(1)

Кавказ 70,0(2) 99,0(2) 71,8(2) 106,3(3) 75,1(4) 106,2(3)

"генотипы вирулентности рас: 105/ 1,2с,3,10,14а,14ъДб,1&,23;

77/ І,2а,2ь,2с,З,IIД4а,1<и>,18,20,26; st*

процент я.эталону.; ххзс

цифра я скобках - ранг сорта, определенный по резулътагаи изучения соответствующего параметра;

K50UÍ

сорт проявляет расоспецафическу» устойчивость я данной расе патогена.

■ Изучение взаимосвязи между содержанием грибных антигенор в инфицированных листьях пдециц« и продолжительностью латентного периода заболевания»

Другим важным фитоаатологическим параметром устоЯчавости.еп-редвлнюпяи возможность и скорость развития эшфитотмя, является продолжительность латентного периода заболевания, Результат сравнительного изучения содержания антигенов во флаговых листьях растений,ивфицироввншге возбудителем популяция Р.твсдаШ* в фазумяочю»

спелости, и продолжительности латентного периода показал, что» хотя в большинства случаев растения, характеризующиеся коротким ла -тентным периодом развития заболевания, накапливают к анализируемому периоду значительно большее количество грибных антигенов, чем те, которым свойственен продолжительный латентный период, можно нейти и немало исключений из этого правила* В целом уровень корреляции между этими параметрами оказался довольно низким (г = -о,61 ±0,18) и не позволял надеяться на прогнозирование продолжительности латентного периода по данным ЙФА. Проведение сравнительного изучения этой взаимосвязи па значительно более ранней стадии заболе -вания, в фазу цветения растения, не показал» существенных различий в случае исследований растений в фазу молочной спелости (г =-0,39* •*0,09). Видимо, возрастает роль других факторов, воздействующих на развитие гриба в растениях, что и приводит к появлению сортов,схожие по латентному периоду« но накапливающих различающееся 2 несколько раз количество грибного мицелия*

И в заключение работы мы провели изучение возможности использования предлагаемого методического приема для прогнозирования воздействия ржавчинной инфекции на некоторые элементы структуры урожая больного растения, В частности, была изучена взаимосвязь между количеством грибных антигенов в инфицированном флаг-листе и изме -пением массы 1000 зёрен и массы зерна с колоса. Проведенное исследование показало определенную тенденцию к такой взаимосвязи, однако коэффициент корреляции между изучаемыми параметрами был относительно невысоким ( ^ * 0»>0,5; и не позволяет надеяться на прог -позирование изменения этих элементов структуры урожая по даннш

Существенно, что столь же невысокие коэффициенты корреляции были получены и при сравнении тех же элементов структуры урожая с ПКРБ.

Окончательное заключение ло этому вопросу требует, по-видимому, оценки большого числа элементов структуры урожая и в первую очередь урожая с единицы шшади.

выводы

1,Разработан специфический метод количественного иымунофер-меитного анализа антигенов Euccinia reeotviita в зараженных растениях пшеницы, выращенных в полевых условиях» позволявший опре -дедять не менее 0,5 мкг tía I г сырой массы флаговых листьев с точность» ^¿0%, причем специфичность» чувствительность и точность определения грибного белка не зависят от условий виративания, инфекционной нагрузки и генотипа патогена; метод позволяет опреде -лить антигены гриба на 2-3 день после заражения.

2. Показано суиеетвсзанке корреляционное взаимосвязи между количеством грибных антигенов во флаговом листе резких сортов инфицированных растений шеняцы и степень» их частичной устойчивости к бурой ржавчине.

З» Выведено уравнение линейной регрессии, позволяющее оценивать площадь под кривой развития болезни по данный однократного определения грибных антигенов в инфицированном флаг-листе.

4. Не обнаружено существенной корреляции между накоплением грибного белка в зараженных листьях сортов пшеницы, обладающих частичной устойчивостью, и снижением массы 1000 зёрен.

5. Разработанный имцунохимический метод определения степени частичной устойчивости павлины к Р*recóndita апробировав селекционерами НПО "Нубаньзерно" и практически используется в работе по выведению устойчивых сортов. ,

ПЇЗДОЖЕШ ЙКШШДСТВУ

Оценивать степень частичной устойчивости щеницы к бурой ржавчине соответственно методическим рекомендациям: "Биохимиче -скве методы оценки степени частичной устойчивости ІШЄШЩК к стеблевой и бурой ржавчине".

Список работ по материалам диссертации

1. Чкгрин В.В., Миргородский C.B., Алексеева Т.П. ¡^пользование

ишанофериевтного анализа при изучении инфекционного процесса у растений яиеницы // Тезисы докладов совещания "фиэиоло-го-биохикаческие основы ишувитета к грибнш болезням pacte-Вий". - Уфа, 1988. - C.IÎ2.

2. Миргородский C.B., Чигрин В.В. йммунохимическая оценка степени частичной устойчивости поеиицы к бурой ржавчине // Тезисы докладов "Индуцированная устойчивость сельскохозяйственных культур к фитопатогенам". - 19-25 сентябри 1989. - Чвгет; Ростов-на-Дону, 1989. - С.64-65. ' •

3. Миргородский C.B., Чигриа Б.В. Количественная оценка развития рхавчинпых грибов в тканях лиотьел шоеницы при поыоиа имцуно-ферыентного ан&лиаа // Неходы интенсификации селекционного процесса: Сборник научных трудов. Всесоюзный с еле кционн о-гане-тический институт (ВСГК), - Одесса, 1990. - С.80.

Î.ÎA 07573 подписано к печати 07.90, формат 6Cx84Vl6.-Заказ V»8, тира* - I0O.

Т.т1шп:-а:."Ï:>; "Ai'^ouinv.mo.'iiTpa-ji'.cT к1.'л 11