Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунохимическая оценка степени частичной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическая оценка степени частичной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине"

Л

Государственная комиссия СМ СССР по продовольствию

и закупкам Всесоюзный научно-исследовательский институт фитопатологии Главагробиопрома

На правах рукописи

МИРГОРОДСКИЙ Сергей Валентинович

УДК: 619: 616.34—0-85.37

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЧАСТИЧНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ

(06.01.11- — защита растений от вредителей и болезней)

Авторефер ат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Голицыне, 1990

Работа выполнена в Северо-Кавказском научно-исследовательском институте фитопатологии Главагробиопрома при Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам.

Научный руководитель: кандидат биологических наук А. М. УМНОВ.

Научный консультант: кандидат сельскохозяйственных наук

В. В. ЧИГРИН

Официальные епшшенты: доктор биологических наук, профессор

Н. Н. ГУСЕВА

кандидат биологических наук Г. К. СОРОКИНА

Ведущее учреждение: Всесоюзный селекционно-генетический институт.

Защита состоится ___» И О/¡¿и 1990 года в / ^ час.

& _мни. на заседании специализированного совета К. 120.66.01 во

Всесоюзном научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу: 143050, Московская область, Одинцовский район, и/о Большие Вя-земы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного науч-но-исследовател! ского института фитопатологии.

Автореферат разослан « /¿> » 1990 г.

Ученым сек])егарь специализирован:.ого совета

И.

Н. ЯКОВЛЕВА

WrcnKCüf

^ "m í

. : '',„,/ - I -

T ■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

КсуТЛЦИЙ I 11

Актуальность темы. В настоящее время основным способом защи-ы гсленицы от ржавчинных заболевают является выведение устойчи -ых к этим патогенам сортов. При этом все больший интерес прояв -яется к сортам, обладающим так называемой частичной устойчивое -ь», которая выражается в замедленном развитии заболевания при осприимчивом типе реакции на паразита. Поскольку во многих слу -апх частичная устойчивость имеет расонеспецифический характер, на может сохраняться з течение значительно более длительного пе-иода времени, чем расоспецифическая устойчивость.

Выявление сортообразцов, обладающих частичной устойчивостью, редсгавляет собой довольно слогную задачу. Во-первых, в полевых кспериментах необходимо убедиться, что при восприимчивом типе еакции на патоген заболевание развивается замедленно. Во-вторых, ужно выяснить причины замедленного развитая болезни или факторы астичной устойчивости, н которым относятся интенсивность заболе-ания, продолжительность латентного периода и, в ряде случаев, . порообразовательная способность пустулы с единицы площади инфа -.ированного листа.

Необходимость проведения всех этих измерений делает работу [О отбору и оценке частотно устойчивых сортов весьма сложной.

Между тем, имеюашеся в литература сведения (Найдёнова,1988) ¡оказывают возможность существенного упрощения и ускорения таких ^следований путей использования некоторых биохимических критери->в степени колонизации растения паразитом, например, путём ишу -юферментного анализа грибных антигенов в инфицированной растите-1ьной ткани. Изучение возможностей данного методического приема 1ри исследовании реакции возбудителя бурой ржавчины з растениях шеницы и стало основной задачей настоящей работы.

Цель и задачи исследований. Цель исследования: предложить «отод выявления в условиях полевого эксперимента сортов и линий шеницы, обладавших частичной устойчивостью к Puccinia recóndita, 1утем количественного определения антигенов гркба во флаговых ли-льях растений. Исходя из этой цели, был поставлен ряд следующих >адач:

I. Изучить возможность с достаточной точностью, специфичностью и воспроизводимостью количественно определять белки мицелия ?.recóndita в инфицированных флаговых листьях пиеницы с помощью

иммуноферментного анализа.

2. Изучить особенности накопления грибной биомассы в инфици рованных возбудителем'бурой ржавчины растениях паеницы, различны по степени частичной устойчивости сортов.

3. Выяснить взаимосвязь между количеством грибных антигенов в зараг:енных листьях и таким общепринятым при выявлении сортов с частичной устойчивостью показателем как площадь под кривой разни тия болезни.

Установить степень взаимосвязи между накоплением грибных антигенов в тканях флагового листе и изменениями отдельных элеме тов структуры урокая.

Научная новизна работы. Предлозен метод, позволявший на ос ■ нова количественного кямуноферментного определения антигенов rocondita , проследить динамику роста патогена в тканях растени. хозяина я получить количественные различия, используемые для выя лен#я сортов с частичной устойчивостью к возбудителю бурой рнавч. ны. Показано наличие корреляционной взаимосвязи между количество] грибных антигенов во флаговых листьях инфицированных растений и степенью их частичкой устойчивости.

Практическая ценность работы. Данные диссертационной работы были использованы при подготовке методических рекомендаций: "Биохимические методы оценки степени частичной устойчивости пшеницы ] стеблевой к бурой ржавчине", рассмотренных и принятых к цубликац) отделом растениеводства и селекции БАСХНЯЛ. Методы определения грибных антигенов в инфицированной растительной ткани и диагностики степени частичной устойчивости по содержанию грибной биоисс-си в инфицированных растениях используются в работах НПО "Кубань-зерно" по выведению новых сортов пшеницы.(Акт о внедрении).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Bei союзном совещании "фиэиояого-биохимические основы иммунитета растений к грибным болезням для целей прикладной селекции", Уфа, апрель, 1588 г.; на Всесоюзном совещании "Индуцированная устойчивость сельскохозяйственных культур к фитопатогенамп5 Чегег, сан • тябрь, 1989 г.; на Республиканской конференции "Методы интенсификации селекционного процесса", Одесса, апрель, 1990 г.

Публикации. По ыатериалаы диссертации оцубликовано 3 сообщения.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состо-¡т из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспери-юнтальной части, включающей изложение результатов исследования и IX обсуждение, заключения, выводов и списка цитированной литера -7ры. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, со-;еркит 4 рисунка и 23 таблицы. Список литературы включает 173 наименования, из них 144 работы зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили проростки и флаговые листья ¡4-х сортов и линий пшеницы, относящихся к'виду Triticua aeeti -rua Ь. Растения выращивали в контролируемых и полевых условиях. 3 качестве инфекционного материала использовали уредоспора рас 77, [05 и северокавказской популяции Puccinia rocondita ВоЪ.ех. Веза. r.sp.tritici Ег1кзз. Величина инфекционной нагрузки составляла Ï,5 и 15 мг/м^. Тип поранения растений определяли по модифициро -заяной шкале Mains, jockaon (1921). Оценку степени поранения растений проводили при помощи шкалы Петерсона {1948), Величину 1атенхного. периода оценивали согласно методическим рекомендациям ю составлению пригноза бурой ржавчины и защита посевов пшеницы [1982). Критерий оценки площади под кривой развития болезни рас -зтатывали на ЭКЛ (Андрейченко и-др.., 1982). Величину массы 1000 зёрен и массу зерна с колоса определяли по методу Горина и др. (1963). Для получения антисывороток использовали стандартную схему иммунизации яивотных. Иммуноглобулины выделяйи путем сульфат -во-риванольного осаядения ( Bejnelc et; ai., 1959 ■ ). Конъюгированиа

прогиворжавчинных антител с пероксидазой проводили по методу таL-зоп, накапе (1978). Содержание грибных антигенов в инфицирован -ных растениях определили при помощи прямого взордофазного конку -рентного варианта ИФА с прединхубацией меченных пероксидазой ан -тител и анализируемого аагнгена. Хлорофилл в образцах определяла в соответствии с методом Stevenson (1963), белок - по методу Лоури (1951). Математические обработки полученных данных осуществляли согласно Доспехову (1979), Плохинскону (1961).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка кммунохимического метода количественного определения антигенов возбудителя бурой ржавчины s растениях пшеницы.

Решение этой задачи требовало получения высокоактивных антк-

сызороток против антигенов возбудителя бурой раавчины пшеницы и приготовления на их основе иммуноферментных препаратов. Кроме того, было необходимо подобрать наиболее пригодный для наших целей вариант .постановки иммуноферментного анализа. Для этого ыц проведи оптимизацию двух различных модификаций иммуноферментного ана -лиза (ИФА), в частности, "сзндвич"-варианта и прямого конкурент -кого анализа,определив оптимальные концентрации сенсибилизирующих полистирол антител к иммуноферментного коньюгата. Подобранные условия проведения анализа били использованы для сравнительного изучения возможностей этих вариантов ИФА при количественном определении антигенов бурой ржавчины. Результаты проведенного иссле -дования (табл.1) показали, что чувствительность прямого конкурентного варианта почти в 10 раз превосходила таковую "сэндвич^ана -лига.

Таблица I

Сравнение эффективности различных вариантов ИФА при определении антигенов возбудителя бурой ркавчины пшеницы .

дЧз2Х при K0HUeKIPaU»K анализируемого антигена,

мкг/мл__

ОЛ ! I_I 5_! IQ

"Сэндвич" 0,061*0,062** 0,394*0,03 0,482*0,03 0,617*0,12 Прямой кон- ' ,

курентный 0,257*0,04 0,465*0,01 0,781*0,08 0,963*0,01

* разность оптических плотностей при анализе опытного и контрольного ооразцов;

^отличие от контроля недостоверно при Р=0,05

На основании данных табл.1 во всех дальнейших экспериментах использовали именно этот вариант ИФА.

Последующий этап работы был связан с дальнейшей оптимизацией условий проведения и выяснения возмояностей этого метода. При выполнении первой части этой задачи било изучено влияние на результат анализа продолжительности сорбции антигена на полистироле, а гакхе температуры и рН среды, при которой проходила сенсибилиза -ция антигена. Результаты проведенного исследования показали, что иммобилизация грибного антигена практически полностью заканчива -

Вариант ИФА

лась в течение 2-х часов при 37°С и рН 9,6. Существенное влияние уделено и определению оптимального времени проведения кммуноло -гической реакции между иммобилизованным антигеном и меченнымифэр-ментом антителами. В результата установлено, что эта реакция практически полностью завершается в течение I часа. Кроме того, была изучена возможность увеличения чувствительности данного варианта ЙФА путем раздельного проведения реакций меченных ферментом антител о анализируемыми и иммобилизированными антигенами. Результаты проведенного исследования показали, что предварительная инкубация меченных, ферментом антител, с анализируемым- антигеном в течение 30 мин почти вдвое увеличивает степень ингибирования их реакций с иммобилизованным антигеном по сравнению с вариантом, в котором обе реакции происходят одновременно.

Для выяснения возможности количественного определения возбудителя бурой рнзвчины паеницы, а тзкяе чувствительности и точности этого анализа, ми изучили зависимость степени конкурентного ингибирования реакции меченных ферментом антител с иммоСилизирован-ным антигеном (У) от концентраций анализируемых антигенов (X).Было установлено, что данная зависимость носит нелинейный характер. Математическая обработка полученных данных показала,^что эта за -вискмость хорошо апроксиыируется функцией: в.21о£", где а -эмпирический коэффициент, значения которого зависят от партии по-листиролозых планиетов и иммуноферментного препарата, причем з пределах одной партии коныогата и планшетов он практически но изменяется. Концентрации антигена в анализируемых образцах опреда -ляли по формуле:

X = Ю1ое2(=гг0 •

Относительная погрешность определения варьировала от 5 до 23$ при анализе грибного белка в концентрациях 100-5000 нг/мл» Таким об -разом, нлхний предел чувст-вияельности разработанного метода сос -тавлял 100-200 нг грибного белка/мл при ошибке определения до 20$,

Тан как целко работы был количественный анализ ржавчинных антигенов непосредственно в тканях инфицированных растекЧй, то необходимо было выяснить не меняется ли характер взаимодействия грибных антигенов с меченными антителами в присутствии растительных экстрактов. Сравнительное определение различных концентраций ряав-чинных антигенов в буфере и растительном экстракте не выявило значимой разницы мезду результатами анализа обоих образцов. Соответ -ственно есть все основания считать, что присутствие растительного

- б -

экстракта не оказывает влияния на определение ржавчинных антигенов

Таблица 2

Определение концентрации антигенов возбудителя бурой ржавчины с помощью прямого конкурентного варианта ИФА

Внесено анти- ! Конкурентное кнги- -Определено ан-:0тносительная гена, нг/мл : бировакие реакции,% гтигена",нг/мл :погрешность,%

100 16,3 116*22 16,0

200 19,1 178*18 10,9

400 23,9 380*32 5,0

600 29,2 740*103 23,4

8ÛU 30,5 850*106 6,3

1000 31,4 936*76 6,3

5000 53,8 5615*512 12,3

^представлены средние значения 8-ми определений * среднее квадратическое отклонение.

другой вааной характеристикой серологического метода слуяит его специфичность. Поскольку в литературе имеются данные о зависимости степени серологического родства белков паразита и его хозяина от характера их взаимоотношений ( charndattan, De Voy, 1972) цы испытали как-восприимчивые сорта пшеницы, так и сорта, обладающие устойчивостью разных типов. Результаты приведенного исследования (табл.3) показали, что экстракты здоровых растений всех изученных сортов не взаимодействовали с антителами против антигенов возбудителя бурой рнавчины пиеницы, Существенное значение,особенно при работе с полевыми образцами инфицированных растений,имело место и выявление возможных перекрестных реакций ыевду полученной нами сывороткой и антигенами других видов грибов, которые могли бы присутствовать в анализируемом материале. Проведенные исследования (габл.З) показали, что использованные в работе антитела не взаимодействовали с антигенами возбудителей мучнистой росы и сеп -ториоза пшеницы, но обладали высоким сродством к антигенам возбу -дитедя стеблевой рзивчины.

Таким образом, данный метод дает возможность проводить коли -явственный анализ возбудителя Сурой ркавчины в растениях, пораген-аых наряду с этой болезнью септориозом и мучнистой росой, однако не позволяет вести раздельное определение различных видов ряавчил-

1ых грибов при совместном заражении. Для проверки воспроизводимо-

Гаолида 3

Специфичность антител, полученных к белкам раавчднных грибов,при определении концентрации этих белков методом конкурентного ИФА

Источник антигена

Разведение экстрак та или концентрация антигена,

нг/млх

тКонкурент-¡ное инги -:бирование

Jреакции, : %

.'Эквивалентная ¡концентрация !антигенов рка-.'вчинннх грибов, ' нг/мл

Безостая I 1:1 I,?** 0

Колос 1:1 0 0

Лан 1:1 0 0

Замена 1:1 ' 3,1** 0

Культура 3,7^

Saptoria nodorura 1:1 0

Paccinia greisinis IOÜOÜ 60,1 8155

Pucciniü recóndita 10000 63,и 9490

Листья пшеницы (зараженные)

Szysipha sraninio 1:1 0

Puccinia graainig 1:1 37,2 1649

"Разведение 1:1 - гомогенат I г листьев пшеницы или мицелия гриба дальнейшему разведению не подвергался;

отличие от контроля, не содержащего конкурентных антигенов, недостоверно.

сти метода извлечения грибных антигенов из растительных тканей т сравнили результаты анализа б-ти независимо полученных экстрактов зараженных растений одного срока и срока развития инфекции (табл. 4).

Результаты этого эксперимента показали достаточно высокую степень воспроизводимости использованного метода определения грибных антигенов в растительных образцах: максимальное отклонение результатов одного анализа от среднего значения 6-ти определений не превшало Щ\>, а средняя величина составила %. Зти величины moz-но считать параметрами точности разработанного метода при работе с инфицирован ш.ш! растениями пшеницы.

Таолица 4

Определение воспроизводимости ИФА ржавчинных антигенов в растениях пшеницы

Повтор-ность ¡Определено антигена, : мкг/гк 1 Отклонение от среднего ; значения, >£

I 11,1*1,9 17,2*2,4

2 10,4*2 Л 22,4*4,и

3 15,6*3,1 16,4*2,4

4 12,7*2,3 5,3*0,8

5 15,2*2,5 1,5*0,2

б 17,4*3,2 29,6*2,8

Среднее 13,4*2,5 15,4*2,0

'представлены средние значения восьми определений х среднее квадратичное отклонение.

Диагностика частичной устойчивости пшеницы к возбудителю бурой ржавчины, .методом иммуноферментного анализа.

Целью данного раздела работы стало выявление возможности и путей использования разработанного метода КФА ржавчинных антигенов в тканях инфицированного растения дм'выявления сортов пае -ницц, обладающих хозяйственно значимым урознем частичной устой -чивости к возбудителю бурой ржавчины пшеницы. Учитывая возможность изменения характера взаимоотношений паразита и растения-хозяина на разных этапах онтогенеза, было важно установить фазу развития исследуемого растения, наиболее четко отражающего а модельных экспериментах его поведение в реальных полевых условиях, и также выяснить зависимость полученных при этом данных от условий внешней среды и количественных и качественных характеристик инфекционного материала. Для реиения первой части поставленной задачи мы провали исследование характера взаимосвязи между ско -росгь» накопления грибных антигенов в инфицированных растениях и степенью их частичной устойчивости на стадиях проростков, цветения и молочной спелости. Результаты изучения взаимосвязи между степень» частичной устойчивости, показателем которой являлась пло-падь под кривой развития болозни (1ШРБ)„ полученная на основе учетов интенсивности порааеннооти, проведенных з полевых условиях указанных сортов пшеницы к-р.гвсоайНаь и количеством грибных ан-

тигенов, накопленных в проростках тех не сортов, инфицированных двумя расами этого патогена, представлены в табл.5.

Таблица 5

Накопление грибных антигенов в проростках пшеницы, различных по степени частичной устойчивости к возбудителю бурой ряавчини

: Раса 105 Раса 77

Сорт пшеницы ; Тип пора-; ПКРБ*-Содерка-•аения в : г 2 :ние гри-!баллах ;бньпс ан: : ;тигенов, : : ! мкг/г Тип поранения в . баллах »ПКРБ? ¡а/ Юодоргание ¿грибных .'антигенов, • мкг/г

Спартанка 3 85,0 60,5 4 299,0 133,1

Павловка 4 104,0 7,9 3 43,1 37,5

Лабинка 2-3 38,0 10,5 3 44,0 39,5

Русалка 3 44,0 19,1 2-3 37,5 48,6

Исток 4 49,5 9,3 нх 5« .

Бачванка 3 58,0 6,5 2-3 67,5 41,9

2621*12482 4 103,2 73,5 3 144,0 27,6

2621Ь2485 xx хк же 4 78,7 143,1

"плоаадь под кривой развития болезни, определенная на основе учетов интенсивности поранения, проведенных стандартным методом в полевых условиях;

як

сорт проявляет расоспецифическуи устойчивость к данной расе патогена.___•

Из табл.5 видна, что, хотя растения сортов Лабинка и Исток, обладающие частичной устойчивостью в стадии взрослых растений, о чем свидетельствует малая величина ПКРБ, и в стадии проростков, характеризовались очень низкой по сравнению с восприимчивыми растениями сорта Спартанка, скоростью накопления антигенов„козф-фициенты корреляций между плошадьн под кривой развития болезни и количеством накопленных грибных антигенов в инфицированных про -ростках были относительно невысокими как в случае расы 105, так и при использовании расы 77 патогена (0,58*0,13 и 0,54*0,11 со -ответственно). Полученные данные дают все основания считать, что использование проростков в диагностике частичной устойчивости взрослых растений является достаточно рискованным мероприятием, поскольку образцы, приобретавшие такую устойчивость только во

взрослом состоянии, будут отнесены к восприимчивым. В связи с эхиъ в дальнейших экспериментах мы провели исследования по выявлению той фазы развития взрослых растений, и которой содержание грибных антигенов более адекватно отображает степень его частичной устойчивости. Для атого было проведено изучение взаимосвязи между ос -новным фитопагологическкм параметром оценки устойчивости растения (площади под кривой развития болезни) и количеством грибных антигенов, накопленных в инфицированных растениях в фазу полного цветения и фазу молочной спелости (табл.6).

Таблица 6

Накопление грибных антигенов во флаговом листе взрослих растений пшеницы различных по степени устойчивости

сортов

Саза

гран-

Сорт пшеницы и тип поражения, балл : полного цветем :я: молочной спелости [;ПКРБ: ров- :ка по ПКРБ

}с оде ржание:ранаи-:грибных ан?ровка уигенов, ; по : мкг/г !ИФА |содержание»ранки-:грибных ан4ровка ;тигенов, • по : мкг/г : КФА 2 : • • : I

Безостая I (4) 4,9*0,9 б 925,6*127,5 I 1137 2

Дарица (3) 2,1*0,4 12 377,5*3и,3 6 509 II

Замена (3) 2,1*0,9 13 272,9*34,2 10 279 13

Зиряа (3) 1,7*0,9 14 108,9*40,0 15 248 14

Краснодарская 57 (2-3) 0,2*0,1 16 185,0*35,5 13 179 15

Краснодарская 70 (3) 4,7*0,3 8 557,2*27,0 3 876 5

Колос (4) 4,6*0,2 Хи 418,8*28,1 5 760 8

Одесская 51 (3) 4,7*0,3 9 315,5*68,9 7 807 7

Павловка (2-3) 1,4*0,1 15 94,0*6,4 16 123 16

Партизанка (3) Спартанка (3) -эталон 5,1*1,0 12,4*2,3 5 2 168,6*32,9 512,2*76,8 14 4 476 908 12 4

Исток (2-3) 8,1*1,2 3 195,3*62,7 12 540 10

Полукарликовая 45 (3) 20,8*2,1 I 876,4*22,3 2 1300 I

Криница (3) 4,4*0,1 11 247,9*30,1 II 950 3

Тарасовская 29 с з5 4,8*0,4 7 304,6*20,0 9 870 6

Олимпия 2 (3) 5,4*0,3 4 315,4-70,3 8 606 9

Математкчвская оОрзботаа всей суммы полученных данных показа-

ла довольно высокий уровень корреляции между ПКРБ и содержанием

грибных антигенов в обе фазы развития растения как при анализе абсолютных значений этих параметров, так и при сравнении рангов кандого сорта, определенных по результатам фитопатологической. оценки и данными ИФА. Коэффициент корреляции абсолютных значений составил 0,70*0,06 и 0,82*0,09 для фаз' цветения я молочной спе -лостл соответственно. При сравнении рангов он был равен 0,66*0,06 и 0,8U*0VÍ3 для фаз цветения и молочной спелости соответственно. Учитывая более высокий уровень корреляции с ПКРБ, наблюдаемый при иммуноформентном анализе растений па стадии молочной спелости, а также отсутствие каких-либо принципиальных преимуществ при проведении анализа в более краткий срок, мы выбрали фазу молочной спелости как наиболее удобную пра проведении диагностики частичной устойчивости методом ИФА.

Полученные данные позволяют также определить критерий для выявления сортов, обладающих хозяйственно-значимым уровнем частичной устойчивости. По данным селекционных учреждений (Боронкова, 1980), к таковым могио отнести сорта, величина ПКРБ которых не превышает 50$ от восприимчивого эталона. Аналогичны;,! образом в случае ИФА основным показателем устойчивости мокно, по-видимому, считать относительное (по сравнению с. эталоном) содорнание грибной биомассы (см.табл.6). Мы установили существование мегду этими па -раметрамн довольно тесной взаимосвязи ( г =0,78*0,05), описываемой регрессионным уравнением У = 0,95Х + 5,3, где У - относительное значение ПКРБ; X - относительное содержание грибной биомассы. Ис -пользование этого уравнения для прогноза относительной величины ПКРБ, по данным ИФА, показало достаточно хорошие совпадения истинных и предсказанных значений этого параметра.

На основании этих данных можно считать содерзанпе грибных антигенов критерием устойчивости, вполне пригодным для прогнозирования такого вааного фитопатологического пзраметра как ПКРБ.

Изучение зависимости оценки степени частичной устойчивости методом ИФА от факторов внешней среды.

Оценивая результаты предыдуаего раздела работ, следовало иметь в виду, что они были получены при одной инфекционной нагрузке и одном генотипе вирулентности. Возможность фенотиаической изменчивое -ти процессов взаимодействия хозяина и паразита, связанная с этим фактором, требовала проверка выявленной закономерности в варьирую -еих условиях знеиней среди и инфекционного фока, выяснение завися -

мости результатов оценки степени частичной'устойчивости методом ИФА от климатических факторов проводили путем сравнения трехлетних испытаний одного и того же набора сортов пшеницы (табл.7).Исследования трех лет отличались между собой по целому' ряду изученных климатических факторов, таких как: относительная влажность воздуха, количество осадков, среднесуточная температура воздуха.

Математическая обработка полученных данных показала относительно невысокий уровень корреляции иеаду результатами фитоиатологи-ческих исследований 1987, 1988 и 1989 годов как при использовании относительных значений ПКРБ, так и при сравнении рангов изучаемых сортов. Коэффициенты корреляции этих параметров были равны 0,51 * *0,11, 0,48*0,13 и 0,23*0,06 для 1987, 1988 и 1985 годов соответственно. Существенно, что аналогичным образом изменились и результаты оценки степени частичной устойчивости тех же сортов пшеницы методом ИФА, причем характер взашлосвяаи между результатами иммуно-химического и фитопатологического методов оставался постоянным.Коэффициент коррелации между этими параметрами для 1987, 1988 и 1989 годов составил 0,72-0,16, 0,80-0,1)3 и 0,68-0,14 соответственно.Использование приведенной ранее формулы позволило прогнозировать относительное значение ПКРБ по данным ИФА с достаточно высокой точ -костью. Корреляции рангов частичной устойчивости изученных сортов6 полученных по истинному и прогнозируемому значению ПКРБ, оостави -ли для 1987,1988 и 1989 годов 0,80*0,09, 0,76*0,08 и 0,89*0,03 соответственно. На основании этих данных можно заключить, что разработанный нами иммунохимический ыетоД оценки степени частичной ус -тойчивости пшеницы к возбудителю бурой ржавчины может быть использован в любых климатических условиях.

Другим этапом выяснения возможностей и ограничений шмунохи -мического метода диагностики степени частичной устойчивости пяени-цы к возбудителю бурой ржавчины стало изучение зависимости результатов анализа от плотности инфекционного фона (табл.8).

Несмотря на довольно существенные изменения в проявлении час-^ тичной устойчивости различных сортов пшеницы при изменении инфек -ционной нагрузки, иммунохимический метод практически во всех слу -чаях четко отражал реальный характер взаимоотношений между партнерами. Прогнозируемые значения относительной ПКРБ, как правило, хорошо совпадали с таковыми, полученными в результате фитопатологи -ского анализа (табл.8). Хорошо выдерживалась при этом и ранжировка большинства изученных сортов. Коэффициенты корреляции частичной устойчивости, определенные ишунохимически и фитопатологически,

• -1?- Таблица 7

Зависимость результатов оцмши стелена устойчивости растений пшеницы к p.recondita

методом ИМ от негодных условий

Сорт пшеницы и тип поражения в баллах 1 1987 год i ' 1988 год * 1989 год

:антиген* iПКРБ" • прогноз: ПКРБЯ « антиген*|ПКРБк .-прогноз :антигеня| • • ИКРБХ : : ПКЕБ* прогноз ПКРБ54

Безостая I (4) 68,2(3)** 125,0(1) 70,4(3) 166,5(I) 163,0(3) 163,5(1) 185,6(1) 75,0(3) 182,4(1)

Замена (3) 54,8(5) 30,9(7) 57,6(5) 0,3(8) 6,6(8) 5,6(8) - - -

Колос (4) 81,8(2) 83,7(4) 83,4(2) 80,6(3) 170,0(2) 82,2(3) 130,1(2) 125,0(1) 129,4(2)

Павловка (2-3) 18,3(8) 13,5(8) 22,8(8) 59,3(5) 38,0(5) 61,9(5) 27,7(6) 50,0(6) 31,8(6)

Спартанка (3) - эталон 100,0(1) 100,0(2) 100,3(1) 100,0(2) 100,0(4) 100,3(2) 100,0(3) 100,0(2) 100,3(3)

Исток (2-3) 38,1(6) 59,5(5) 41,7(6) 76,4(4) 171,0(1) 78,2(4) 37,9(5) 50,0(5) «,5(5)

Олимпия 2 (3) 61,5(4) 88,8(3) 64,0(4) 18,5(6) 12,3(7) 23,0(6) 1.8(7) '37,5(7) 7,1(7)

Олимпия (2-3) 23,5(7) 57,5(6) 27,8(7) 7,0(7) 23,3(6) 12,0(7) 69,5(4) 75,0(4) 71,6(4)

t

С

процент'от эталона";?абсолвтные значения концентрации антигенов и величины ПКРБ по эталону составили 3415 шг/г и 908 аг, 428 инг/г и 228 сг-Г, 1224 шег/г и 474 см^ за 1987, 1983 и 1989 гг. соответственно;

xx

цифра в скобках - ранг ссрта по результатам изучения соответствующего параметра.

составили 0,83*0,03 и 0,89*0,05 для высокого и низкого инфекционного фона соответственно. На основании этих данных можно заключить, ИЗА пригодеп для диагностики степени частичной устойчивости прак -тически при любой плотности заражения.

Таблица 8

Зависимость результатов аенкг степени устойчивости растений пшеницы к Р.гесоп&Ш! методом ИФА от величины инфекционной нагрузки

Сорт пшеницы

Высокий инфекционный фон*»Низкий инфекционный Фон'

кх

антиген***: ПКРБ***; прогн£1 антигбн*РпХРБ*^:пР™ ; : ПКРБ50^ : : ПКРБ

Безостая I 79,4(2)ХХХХШ,3(1)

Замена 63,2(5) 29,7(7)

Колос 75,3(3) 79,4(4)

Павловка 14,4(8) 12,2(8)

Спартанка - эталон 100,0(1) 1Ш,0(2)

Исток «,3(6) 51,2(5)

Олимпия 2 69,1(4) 91,2(3)

Олимпия 31,2(7) 47,8(6)

80,7(2) 65,3(5} 76,8(3) 18,9(8)

100,3(1)

44,5(6) 70,9(4) 34,9(7)

97,3(г) 1,2(8) 71,2(4) 61,3(5)

100,0(1)

61,9(3) 15,3(6) 7,9(7)

92,1(4) 5,3(8) 95я4(3) 48,2(5)

100,0(2)

128,3(1) 12,4(7) 33,1(6)

97,7(2) 6.4(8) 72,9(4) 63,5(5)

100,3(1)

83,1(3) 19,8(6) 12,8(7)

хВеличина инфекционной нагрузки - 15 мг спор/;/;

xx р

величина инфекционной нагрузки - 2,5 ыг спор/м ;

xxx

процент от эталона; хххх -

цифра в скобках - ранг сорта по результатам изучения соответ-

ствующего параметра. __

Для выяснения возможностей ИФА при использовании различного по набору генов вирулентности инфекционного материала мы провели , сравнительное изучение растений, инфицированных в одних и тех ае условиях различными расами патогена (табл.9).

Результаты проведенного исследования показали, что и в этом случае ИФА грибных антигенов в листьях инфицированных растений позволяет довольно точно прогнозировать величину ПКРБ. Коэффициент корреляции рангов изученных сортов по данным фитопатологического анализа и иммунохкмического метода составил 0,94*0,03 и 0,89 * *0,05 для рас 77 и 1и5 соответственно. Можно считать, что разрабо-

тайный иммунохимический метод оцежи степени частичной устойчивости позволяет получать надежные результаты вне зависимости от генотипа вирулентности патогена, а та.тае при оценке уровня специфичности (или неспецифичности) устойчивости этого типа.

Таблица 9

Зависимость результатов оценки степени частичной устойчивости пшеницы к ?„госоп<Ш;а методом ИФА от генотипа вирулентности

патогена

Раса 77*_; Раса 105х

с°Рг • антиген**:ПКРБ** »пР°гноэ:антигв„«г пшеницы .аи^ьгвн илгл !пнрБ«? ;антигеи

ПКРБ** ÍnP°r^3 'ПКРБ

Колос 47,5(3)***61,5(3) 50,4(3) 109,1(2) 80,2(3) 108,9(2)

эталон™ " 100»°(1) 100,0(1) 100,3(1) 100,0(4) 100,0(2) 100,3(4)

Павловка 33,7(4) 14,7(5) 37,3(4) 71,8(5) 56,2(5) 73,5(5)

Лабиняа 3,1(6) 1,3(6) 8,2(6) 16,9(7) 20,5(7) 21,3(7)

Бачванка жйкя síxx sxsx 49,2(6) 31,4(6) 52,0(6)

262Ih2482 27,7(5) 48,2(4) 31,6(5) 228,8(1) 122,3(1) 222,6(1)

Кавказ 70,0(2) 99,0(2) 71,8(2)'106,3(3) 75,1(4) 106,2(3)

^генотипы вирулентности рас: 105/ I,2с,3,10,14а,14ъ,16,18,23;

77/ I,2а,2ь,2с,3,11,14а,14 ь,18,20,26; хк

процент я эталону.;

" цифра в скобках - ранг сорта, определенный по результатам изучения соответствующего параметра;

K5ÍSX

сорт проявляет расоспещкшческуа устойчивость н данной расе патогена.

Изучение взаимосвязи мезду содержанием грибных антигенов в инфицированных листьях пшеницы и продолжительностью латентного периода заболевания.

Другим важным фитояатологичесюш параметром устойчивости,определят®! возмогноссь и скорость развития эпифитотии, является продолзмельность латентного периода заболевания. Результат сравнительного изучения содерзанкя антигенов во флаговых листьях расгв-няй,инфицированных зозбудЕгелои популяция Р.гесспШа в фазу кяэ^ой

спелости) и продолжительности латентного периода показал, что, хо-.тя в большинстве случаев растения, характеризующиеся коротким ла -тентным периодом развития заболевания, накапливают к анализируемому периоду значительно большее количество грибных антигенов, чем те, которым свойственен продолжительный латентный период, можно найти и немало исключений из этого правила. В целом уровень корреляции между этими параметрами оказался довольно низким (г= -0,61 *0,18) и не позволял надеяться на прогнозирование продолжительности латентного периода по данным ИФА. Проведение сравнительного изучения этой взаимосвязи на значительно болое ранней стадии заболе -вания, в фазу цветения растения, не показали существенных различий в случае исследований растений в фазу молочной спелости (г =-0,39* *0,09). Видимо, возрастает роль других факторов» воздействующих на развитие гриба в растениях, что и приводит к появлению сортов,схожих по латентному периоду, но накапливающих различающееся в несколько раз количество грибного мицелия.

И в заключение работы ш пропели изучение возможности использования предлагаемого методического приема для прогнозирования воздействия ржавчинной инфекции на некоторые элементы структуры урожая больного растения. В частности, была изучена взаимосвязь между количеством грибных антигенов в инфицированном флаг-листе и изме -нением массы 1000 зёрен и массы зерна с колоса. Проведенное исследование показало определенную тенденцию к такой взаимосвязи, однако коэффициент корреляции между изучаемыми параметрами был относительно невысоким ( ^ с 0,3-0,5; и не позволяет надеяться на прог -позирование изменения этих элементов структуры урожая по данным ИФА.

Существенно, что столь же невысокие коэффициенты корреляции были получены и при сравнении тех же элементов структуры урожая с ПКРБ.

Окончательное заключение по этому вопросу требует, по-видимо^-му, оценки большого числа элементов структуры урожая и в первую очередь урожая с единицы площади.

ВЫВОДЫ

1.Разработан специфический метод количественного иммунофер-ментного анализа антигенов Расс1п1а госогиШга в заракенных растениях пшеницы, вырашенных в полевых условиях, позволяющий опре -делять нз менее 0,5 мкг на I г сырой массы флаговых листьев с точностью причем специфичность, чувствительность и точность определения грибного белка не зависяг от условий выраяивания, инфекционной нагрузки и генотипа патогена; метод позволяет опреде -лигь антигены гриба на 2-3 день после заразения.

2. Показано существование корреляционной взаимосвязи мезду количеством грибных антигенов во флаговом листе разных сортов инфицированных растений пшеницы и степенью их частичной устойчивое* ти к бурой ржавчина.

3. Выведено уравнение линейной регрессии, позволяющее оценивать площадь под кривой развития болезни по данным сцнократного определения грибных антигенов в инфицированном флаг-листе.

Не обнаружено существенной корреляции медду накоплением грибного белка в зараженных листьях сортов пшеницы, обладающих частичной устойчивостью, и снияением массы 1000 зёрен.

5. Разработанный иммунохнмичесний метод определения степени частичной устойчивости шгеницы к Р.госопйЗЛа апробирован селекционерами НПО "Кубаньзерно" и практически используется в работе по выведэцию устойчивых сортов. .

ПРЙДЛОЯЕНЛЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Оценивать степень частичной устойчивости пшеницы к бурой раавчине соответственно методическим рекомендациям: "Бнохимиче -ские методы оценки степени частичной устойчивости пшеницы к стеблевой и бурой рзавчине".

Список работ по материалам диссертации

1. Чигрии В.В., Миргородский C.B., Алексеева Т.П. Использование

иммуноферментного анализа при изучении инфекционного процесса у растений пшеницы // Тезисы докладов совещания "Физиоло-го-биохимические основы иммунитета к грибнш болезням растений". - Уфа, 1988. - С.112.

2. Миргородский C.B., Чигрин В.В. Иммунохимическая оценка степени частичной устойчивости пиеницы к бурой ржавчине // Тезисы докладов "Индуцированная устойчивость сельскохозяйственных культур к фитопатогонам"» - Х9-23 сшшбря 1989. - Чзгет; Ростов-на-Дону, 1989. - С.64-65. •

3. Миргородский C.B., Чигриа В.В. Количественная оценка развития ржавчинных грибов в тканях листьев пиеницы при помощи иммуно-ферментного анализа // Методы интенсификации селекционного процесса: Сборник научных трудов. Всесоюзный селекционно-генетический институт (ВСГИ). - Одесса, 1990. - С.80.

-MA 07573 подписано к печати 4.07.90, формат 6Dx84]/I6. Заказ 448, тираж - 100.

Типография "Лг|:С1.ро\толпгри.:!СТ АПл "