Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуногенетический анализ активации клеток-регуляторов как механизма фармакологической модуляции иммуногенеза

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Иммуногенетический анализ активации клеток-регуляторов как механизма фармакологической модуляции иммуногенеза"



£ 1 ^^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 75:577.25:612.017

ПИСАРЕВ ВЛАДИМИР ШТРОФАНОВИЧ

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АКТИВАЦИИ КЛЕТОК-РЕГУЛЯТОРОВ КАК МЕХАНИЗМА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ МОДУЛЯЦИИ ИММУНОГЕНЕЗА

03.00.15 - генетика

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-1995

Работа выполнена в Институте генетики человека (директор - доктор биологических наук, профессор С.С.Шишкин) Медико-генетического научного центра Российской академии медицинских наук (директор -член-корр. РАМН, профессор В.И.Иванов.)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Л.А.Певницкий доктор медицинских наук В.П.Лесков.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.П.Алексеев доктор медицинских наук, профессор Б.В.Пинегин доктор биологических наук, профессор С.С.Шишкин

Ведущее учреждение - Российский Государственный Медицинский Университет.

Защита состоится ^^^ 1895г.

в часов на заседании Специализированного совета Д.001.16.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан " ^¿з^СР? 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук, профессор

Л.Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пройдены. Широкое распространение в настоящее время таких заболеваний, как аллергические, острые и хронические инфекционные и неинфекционные болезни с выраженными проявлениями воспалительных реакций, первичные и вторичные иммунодефицитные состояния [Петров Р.В., Орадовская И.В., 1988], аутоиммунные и онкологические болезни, во многом обусловлено нарушениями регуляторных механизмов иммунной системы человека [Петров Р.В. и др.,19843.

Можно выделить по крайней мере три группы причин, которые лежат в основе иммунологических нарушений, определяющих изменение структуры заболеваемости населения и тенденцию к хронизации патологических процессов.

1. Ослабление естественного отбора, который у человека происходил в основном по признаку устойчивости к инфекции и на протяжении веков совершенствовал иммунную систему [Фогель Ф., Матульски Ф.,19901.

2. Снижение специфической и неспецифической (адыовантноподоб-ной) стимуляции клонов Т- и В-лимфоцитов, других клеток иммунной системы антигенами микрофлоры вследствие широкого применения антибиотиков.

3. Расширение ареала и интенсивности воздействия на организм человека антропогенных неблагоприятных экологических факторов, обладающих иммунотоксическим эффектом.

Возникающие иммунодефицитные состояния не только меняют характер и течение широко распространенных заболеваний, но и могут способствовать увеличению цитогенетических нарушений в лимфоцитах человека [Ilyinskikh N.N., Ilyinskikh I.N., 1983; Ильинских H.H., 1984]. Имеются основания полагать, что в условиях иммунодепрессии вирусоподобные элементы СХесин Р.В., 1984] и вирусы в большей степени являются причиной нестабильности генома [Ильинских H.H., 1984]. Кроме того, поскольку иммунная система контролирует генетический гомеостаз клеток организма СБернет Ф., 1971; Петров Р.В., 1976], то при иммунологической недостаточности нарушается способность элиминировать мутантно измененные клетки.

Многие наследственные и врожденные заболевания характеризуются нарушениями иммунной системы. Проявления иммунологической недостаточности характерны для синдромов Блюма, Дауна, Олбрайта, болезней Альцгеймера, Рейно, нейрофиброматоза Реклингаузена, пигментной хсе-

родермы, атаксии-телеангиэктазии и генетически гетерогенных первичных иммунодефицита состояний [обзоры: Ильинских Н.Н. ,1986; Писарев В.М., Лесков В.П., 1980].

Приведенные данные свидетельствуют о значении для медицинской генетики и иммунологии исследований,связанных с разработкой средств и способов фармакологической коррекции иммунологических нарушений.

Конечный эффект использования иммуномодулирующих препаратов в определенной мере обусловлен генетическими особенностями фармакоки-нетики, метаболизма препарата, чувствительности к нему клеток-мишеней, т.е. фармакогенетическими факторами [Телегин Л.Ю., Певницкий Л. А. ,19793. С другой стороны, результат действия препарата на иммунную систему может зависеть от его способности влиять на отдельные генетически детерминированные ключевые компоненты иммунорегуля-торных механизмов, в том числе на продукцию и акцепцию медиаторов иммуногенеза [Писарев В.М. и соавт., 1985; Пухальский А.Л.,1992].

Значение генетических факторов в иммуностимулирующем действии фармакологических иммуномодуляторов было продемонстрировано на мышах в отношении левамизола [1?епоих Б. е1 а1.,1979] и тимозина СКа-геквуагЬо С. а1.,19873. Показано также, что генетические различия в чувствительности к шмуномодуляторам могут выражаться в различной продукции медиаторов иммуногенеза после импульсного воздействия фармакологических препаратов [Писарев В.М. и др.,19853.

Вместе с тем неиэученность клеточных и молекулярных механизмов, обеспечивающих фармакологическую коррекцию нарушений иммуноре-гулшции при патологии человека, тормозит как более детальное исследование иммуногенетических закономерностей, определяющих взаимодействие в системе "лекарство-организм", так и разработку новых подходов к иммунофармакотерапии. Это определяет актуальность исследования не только механизмов фармакологической иммуномодуляции, но и изучения генетического контроля процессов, определяющих воздействие препарата на иммунную систему.

В связи с гетерогенностью популяций иммунокомпетентных клеток, отличающихся друг от друга как особенностями дифференцировки, так и состоянием активации, воздействие фармакологических препаратов на лимфоциты может иметь неоднозначный характер. Поскольку пул циркулирующих лимфоидных клеток в крови человека составляет Есего лишь IX от их общего содержания в организме, а концентрация иммунотроп-ного препарата в крови строго лимитирована генетически детерминиро-

ванными процессами его метаболизма, следует полагать, что только некоторая часть клеток будет активирована препаратом-иммуномодуля-тором.

В 1984 гг. нами совместно с В.П.Лесковым [Лесков В.П., Писарев В.М., Аршинова С.А.,1984: Писарев В.М., Лесков В.П.,1985] были получены экспериментальные данные, свидетельствущие о возможности усиления иммунного ответа мышей ка антиген введением небольшого (5*10®) количества сингенных иммуноцитов, инкубированных in vitro с иммуномодулятором диуцифоном. Результаты позволили предположить, что в случае активации различными препаратами, иммуноциты могут приобрести способность функционировать в качестве клеток-регуляторов иммуногенеза и опосредовать эффект препарата в зависимости от генетически контролируемых процессов их активации. Такой механизм фармакологической иммуномодуляции предполагал не только необходимость его доказательства, но и мог иметь значение для разработки новых подходов к иммунофармакотералии.

Цадэ и задачи кесдакаванил. Целью настоящей работы явилось исследование иммуногенетических закономерностей и механизмов фармакологической модуляции иммуногенеза, лежащих в основе генетических различий в чувствительности к природным и синтетическим препаратам с иммуномодулирующей активностью, для разработки новых средств и способов ишунокоррекции.

В процессе работы была сформулирована новая научная концепция о значении фармакологически активированных клеток-регуляторов иммуногенеза как генетически контролируемых посредников в системе "лекарство-организм" .

В соответствии с целью работы решались следующие задачи.

1. Выявить новые химические и природные соединения, модулирующие продукцию цитокинов иммунной системы, перспективные для создания на их основе новых лекарственных иммуномодуляторов, и определить значение генетических факторов в контроле чувствительности им-мунокомпетентных клеток к их воздействию.

2. Установить значение генов главного комплекса гистосовмести-мости человека и мышей в контроле фармакологической иммуномодуляции.

3. Определить участие фармакологически активированных Т-кле-ток-регуляторов в опосредовании действия иммуномодулируквдих препаратов и выяснить, какие генетические факторы контролируют процессы

активации клеток-регуляторов.

4. Изучить молекулярные механизмы действия Т-клеток-регуляторов, роль межклеточных взаимодействий и участие мембраноассоцииро-ванных продуктов генов главного комплекса гистосовместимости человека в осуществлении эффекта клеток-регуляторов.

5. Обосновать использование ряда иммуномодуляторов для фармакологической активации клеток-регуляторов in vitro с целью последующего их введения в аутологичный организм (экстракорпоральная имму-нофармакотерапия) для лечения тяжелых иммунодефицитных состояний и других иммунологических нарушений.

6. На основании полученных данных сформулировать новую научную концепцию фармакологической регуляции иммуногенеза, предполагающую участие генетически контролируемых Т-клеток-регуляторов в опосредовании воздействия различных иммуномодуляторов на процессы пролиферации, дифференцировки и коммитирования лимфоцитов к программированной клеточной гибели.

Научная иошвиа. В работе предложено новое решение актуальной проблемы, связанной с изучением молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе генетических различий в чувствительности к фармакологическим препаратам-ишуномодуляторам, а также с разработкой новых подходов к лечению иммунодефицитных состояний. Это решение заключается в том, что фармакологически активированные клетки-регуляторы иммуногенеза используются и как объект при изучении механизмов генетических различий в чувствительности к иммуноыодуля-торам, и как инструмент исследования закономерностей фармакологической иммуномодуляции в целях разработки способов иммунокоррекции.

Впервые экспериментально обоснована научная концепция, позволяющая объяснить механизмы генетических различий в чувствительности к различным иммуномодулирующим препаратам и установить новые закономерности фармакологической иммуномодуляции. Сущность предлагаемой концепции заключается в следующем. Лишь некоторая часть иммуноком-петентных клеток может быть активирована фармакологическими препа-ратами-иммуномодуляторами. Активированные клетки - Т-лимфоциты выступают в качестве Т-клеток-регуляторов, являющихся посредниками в системе "лекарство-организм". Фармакологически активированные Т-клетки-регуляторы в процессе межклеточных вааимодействий, происходящих с участием мембраноассоциированных продуктов локусов DR и

DQ комплекса HLA человека, высвобождают в ранние сроки после активации регуляторные факторы, опосредующие воздействие фармакологических иммуномодуляторов на иммунную систему.

Впервые показано, что межлинейные различия в чувствительности к действию иммуномодулирующих соединений связаны с особенностями активации клеток-регуляторов иммуногенеза.

Впервые установлено, что целый ряд химических соединений и препаратов с иммуномодулирующей активностью реализуют свое действие на клетки иммунной системы посредством активации Т-клеток-регулято-ров, контролирующих процессы пролиферации, дифференцировки, антите-лообразования, продукции различных цитокинов иммунокомпетентными клетками.

Впервые установлена роль генов главного комплекса гистосовмес-тимости в контроле активации клеток-регуляторов иммуногенеза имму-номодулкрующими препаратами.

Впервые показана возможность фармакологического контроля препаратом- иммуномодулятором кортикостероид-индуцированных процессов коммитирования лимфоцитов к программированной клеточной гибели. Выявлены механизмы этого контроля, связанные с высвобождением под воздействием фармакологически активированных клеток-регуляторов растворимых факторов с молекулярной массой 75-90 кД.

Практическая зкачкыоста.

1. Обнаружение большей чувствительности к иммунокорригирукмцему воздействию разных иммуномодулирующих препаратов у лиц с фенотипами HLA-B5 и HLA-DR5 позволяет рекомендовать использование HLA-типиро-вания в целях индивидуализации иммунофармакотерапии.

2. Полученные экспериментальные данные легли в основу разработки нового подхода к коррекции иммунологических нерушений, в том числе - иммунодефицитных состояний, аутологичными клетками-регуляторами, активированными in vitro фармакологическими препаратами (метод экстракорпоральной иммунофармакотерапии - ЭИФТ). разработан упрощенный вариант ЭИФТ и обосновано использование различных лекарственных препаратов с иммуномодулирующей активностью с целью индукции клеток-регуляторов in vitro. Проведена клиническая апробация нового варианта ЭИФТ при лечении больных с тяжелыми поражениями фагоцитарной системы.

3. Изучение иммуномодулирующей активности и механизмов дейс-

твия синтетического гексалептида тимогексина способствовали разработке на его основе нового лекарственного препарата имунофан и проведению предварительных клинических испытаний. Результаты экспериментальной работы использованы в качестве материалов по препарату имунофан, представленных для его утверждения в качестве лекарственного средства в Фармакологическом комитете России. Экспериментально обосновано использование препарата имунофан в клинической практике при иммунодефицитных состояниях, включая первичный селективный IgA-иммунодефицит, а также с целью снижения уровня продукции фактора некроза опухоли (ФНО) и дезинтоксикации при заболеваниях, сопровождающихся гиперпродукцией данного цитокина.

4. Обнаружение среди группы оригинальных производных рибонук-леотидов, подавляющих репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), соединений, ингибируюгцих продукцию ФНО, открывает перспективы соэдания эффективных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции.

Осиошшз гкшманкя.вшосиаиз на защиту.

1. Гены главного комплекса гистосовместимости участвуют в контроле иммуномодулирующего эффекта препаратов с разной химической структурой.

2. Межлинейные различия в чувствительности к действию иммуно-модулирующих препаратов проявляются на уровне активации Т-кле-ток-регуляторов иммуногенеза.

3. Гены главного комплекса гистосовместимости мышей контролируют процессы активации клеток-регуляторов различными фармакологическими препаратами.

4. Действие фармакологически индуцированных клеток-регуляторов на клетки иммунной системы опосредовано как их мембраноассоцииро-ванныыи структурами, так и высвобождением растворимых факторов в ранние сроки после воздействия препарата. Продукты генов главного комплекса гистосовместимости участвуют в проявлении активности клеток-регуляторов .

5. Клетки-регуляторы, активированные фармакологическими имму-номодулягорами, способны контролировать процессы пролиферации и дифференцировки иммуноцитов, антителообразование, продукцию цитоки-нов, ингибировать процессы активации Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы в мононуклеарах человека и могут быть использованы для коррекции иммунодефицитных состояний и других нарушений иммунной системы.

6. Предложена концепция, согласно которой фармакологически ак-

тивированные клетки-регуляторы иммуногенеза выступают в качестве ранних посредников воздействия иммуномодулирующих препаратов на иммунную систему.

Внедрение.

Совместно с коллективом авторов получено авторское свидетельство N 1797894 (1992), проводятся клинические испытания разработанного нового ишуномодулиругощего фитопрепарата. Предложенный вариант метода ЭИФТ с использованием препарата милдронат для активации клеток-регуляторов внедрен в практику работы областной клинической больницы N 1, г. Курск, для лечения больных с иммунологической недостаточностью. Метод позволил достигнуть быстрого и устойчивого клинического эффекта, в том числе в случаях, когда другие способы лечения были неэффективны. Автор, как участник работы по экспериментальному обоснованию метода ЭИФТ, внедренного в практику в Институте иммунологии МВМП РФ, отмечен Серебряной медалью ВДНХ СССР (1987).

Апробация работы. Материалы исследования докладывались: 1) в виде устных сообщений - на Всесоюзной конференции по проблемам профилактики, диагностики и лечения аутоиммунных заболеваний и кммуно-дефицитов (Новосибирск, 1985); республиканской конференции "Механизмы шмуностимуляции"(1985); конференции "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной аллергологии и иммунологии" (Каунас, 1986); конференции "Актуальные проблемы иммунологии. Иммунодефицита и иммунокоррекция" (Владивосток, 1987); IX межинститутской конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1988); рабочем совещании "Иммуномодуляторы природного происхождения" (Владивосток, 1990); Международном симпозиуме "Проблемы иммунофармаколо-гии" (Тбилиси, 1990); международной конференции "Синтетические оли-гонуклеотиды: проблемы и перспективы практического применения" (Москва,1991); LXII сессии общего собрания АМН СССР (Москва, 1991); научной конференции по проектам, выполняемым в рамках ГНТПР "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" (Москва, 1992); I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); I Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1992); III межреспубликанской конференции по медицинской ботанике (Киев, 1992); VIII Международном конгрессе по иммунологии (Будапешт, 1992); I Международном конгрессе по гаахунореабилитации ( Дагомыс, 1994); 2) в виде

стендовых сообщений - на республиканской конференции "Механизмы им-муностимуляции" (Киев, 1985); Всесоюзной конференции по экологической безопасности (Иркутск, 1991); на международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992); конференции по проблемам экологической медицины (Алма-Ата, 1993); на международном симпозиуме Фалька "Цитокины и печень", Фрайбург,1994).

Публикации. Соискатель имеет 85 печатных работ, 46 из них (39 в отечественных изданиях и 7 в зарубежных) по теме диссертации.

Объем и структура исследования. Диссертация написана по типу монографии, ее материал изложен на 284 страницах машинописного текста, содержит 60 графических иллюстраций и 82 таблицы. Диссертация состоит из введения, изложения собственных результатов исследований с обсуждением (4 главы), заключения и выводов, а также библиографического указателя.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В опытах использовали мышей-самцов линий CBA/CaLacSto, DBA/2JSto, BALB/cJSto, C57BL/6, CC57BR/MV и гибридов (CBAxC57BL/6)Fl, а также мышей конгенно-резистентных линий C57BL/10 и B10.D2 массой 18-25 г, в возрасте 2-3 месяца. Мышей получали из питомников РАМН "Столбовая" и "Ралполово", а также разводили в виварии МГНЦ РАМН. В качестве антигенов применяли эритроциты Сарана (ЭБ), овальбумин и Vi-антиген брошнотифозных бактерий. Для определения антителообразующих клеток (АОК) использовали метод локального гемолиза в агарозном геле по Jeme и Nordln.

В работе использовали мононукдеарные клетки (МНЮ гепаринизи-рованной (25 Ед/мл) периферической крови здоровых и больных доноров, выделенные с помощью одноступенчатого градиента плотности (1,077 г/см3) фиколл-верографина или фиколл-пак ("Pharmacia", Швеция).

Прилипающую фракцию МНК выделяли на пластиковых чашках Петри, предварительно обработанных сывороткой плода коровы (СПК) в течение часа в термостате.

Для определения продукции иммуноглобулинов МНК помещали в 24-луночные планшеты ("Nunc", Дания) и полную среду для культивиро-

вания (2 пм L-глутамина, 40 мкг/мл гентамицина, 10 тМ HEPES-буфера рН 7,2 ("Sigma". США). Содержание иммуноглобулинов определяли иммуноферментным методом в надосадочной жидкости (НЖ) МНК, культивированных в течение 8 дней в среде "Iscove" ("Flow", Великобритания) с аналогичными добавками, используя наборы моноклональных антител и соответствующие стандарты производства НПК "Перспектива", Россия.

Для определения продукции ФНО МНК помещали в 24-луночные планшеты ("Nunc", Дания) в среде инкубации с добавлением 5Z СПК. Содержание ФНО оценивали твердофазным иммуноферментным или биологическим методами (с использованием чувствительной к ФНО клеточной линии L-929) в HJX МНК после 12 часов культивирования клеток при 37бС в атмосфере 5% СО2. В работе использованы наборы для иммуноферментно-го определения МО производства МП "Красная капля" (Минск, республика Беларусь) .

Пролиферативный ответ лимфоцитов на митогены - фитогемагглоти-нина (ФГА) ("Difco", США), конканавалина А (Кон A) ("Calblochem", Швейцария) или интерлейкин-2 (ИЛ-2) ("Cetus", США), оценивали с помощью реакции бласттрансформации СФримель Г., 1987]. Пролиферативный ответ лимфоидных клеток на ФГА, Кон А и рекомбинантный ИЛ-2 определяли через 72 часа по включению 3Н-тимидина (1 мкСи на лунку 96-луночного планшета), который добавляли за 4-6 часов до окончания культивирования. По окончании инкубации содержимое лунок переносили на фильтры ("Tltertek", "ICN", Великобритания) с помошью клеточного харвестера ("Tltertek". "ICN", Великобритания). Высушенные фильтры помешали во флаконы со сцинтилляциокной жидкостью и определяли уровень включения радиоактивной метки с помощью сцинтиляционного бета-счетчика ("Mark III", США).

Уровень экспрессии мембраноассоциированных структур определяли клеточным твердофазным иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител к структурам CDS, CD4, CD8, HLA-DR и HLA-DQ ("Serotec", Великобритания) и антимышиных Р(аЬ')-фрагментов шму-ноглобулинов, конъюгированных с пероксидазой хрена ("Seromed", Великобритания) .

При определении ИЛ-2 клетки селезенки мыши или МНК человека культивировали в концентрации 5х106/мл в присутствии 5 мкг/мл Кон А ("Calblochem", Швейцария) в среде RFMI-1640, содержащей 2% сыворотки АВ или 5% СПК в течение 20-24 часов. Содержание ИЛ-2 в НЖ определяли по способности образцов поддерживать пролиферацию ИЛ-2-зави-

симых клеточных линий CTLL-2 или НТ-2, оцениваемую по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток. В качестве контроля использовали рекомби-нантный ИЛ-2 с известной активностью.

Определение антигенспецифической реактивности Т-клеток проводили с помощью реакции торможения прилипания лейкоцитов или LAI-теста (Leucocyte adherence inhibition), который проводили согласно описанию [Харкевич Д.Д. и соавт., 1985; Осна Н.А. и соавт., 19843, В качестве антигенов использовали синтетические пептиды npeSl (последовательность 13-26), S1 (21-47) и npeS2 (132-145) оболочки вируса гепатита В, а также пептид НВсог (140-163), любезно предоставленные С.М.Андреевым (Институт иммунологии МЗМП РФ).

Активность Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы (СМЭ) определяли в ядрах мононукдеаров, вьщеленных по методу Агуттера [Соколова И.А. и соавт. ,19933. Активировали СЮ в ядрах путем инкубации в течение 1-1,5 часов уравновешенных по ДНК образцов ядер в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, рН=8,0, 0,25% сахарозу, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ СаС1г [Волгина В.В. 1991]. Пробы депротеинизировали в растворе хло-роформ-изоамиловый спирт (24:1). Электрофорез ДНК проводили в гелях 1,2% агарозы в трис-ацетатном буфере по методу Blu [Соколова И.А. и соавт.,1993]. Негативы денситометрировали на приборе Хромоскан-200 (Joyce - Lolble, Англия). Активность эндонуклеазы выражали в относительных единицах согласно формуле [Ткачева Т.М. и соавт., 19933, оценивая степень гидролиза ядерной ДНК по характеристике профиля пика субстратной ДНК на денситограмме.

Типирование антигенов HLA- А, В, С, DR было проведено Г.К.Бай-мукановой в стандартном лимфоцитотоксическом тесте [Terasaki Р. ,19783 с использованием сывороточных панелей НИИ гематологии и переливания крови МЗ ЗФ, Санкт-Петербург, и "Behrlng Mannheim", Германия, направленных к 7 специфичностям локуса HLA-A: 1,2,3,9,10,11.28; 15 специфичностям локуса HLA-B:5,7,8,12,13,15,16. 17,18,21,27,35,40,41; 4 специфичностям локуса HLA-C: wl,w2,w3,w4 и 7 специфичностям локуса HLA-DR:1,2,3,4,5,6,7.

В работе использовали следующие препараты: диуцифон, любезно предоставленный д.м.н. В.П.Лесковым (Институт иммунологии МЗМП РФ); кемантан в виде субстанции, любезно предоставленной к.х.н. Б.М.Пя-тиным (Институт фармакологии РАМН); милдронат (в виде лекарственной формы); препараты лекарственных растений, предоставленные д.х.н. А.Д.Бакуридзе (Тбилисский государственный медицинский институт,

Республика Грузия) и к.х.-ф.н. Г.А.Дроздом (Курский государственный медицинский университет,г.Курск); тимогексин, предоставленный к.м.н. В.В.Лебедевым (Центральный НИИ эпидемиологии ГКСЭН); а также оригинальные соединения - производные нуклеозидов и нуклеотидов, синтезированные член-корр. РАН, проф. А.А.Краевским и сотр. (Институт молекулярной биологии РАН). Структура соединений представлена на рис. 1.

Рис. 1. Производные нуклеозидов и нуклеотидов,использованные в работе.

Cyt (1а-б; IIa-б)

В Thy (1в; IIB)

Ade (1г-д; Иг-д)

R' СН3 (Ia; IIa)

Н (1а-г; IIa-г)

R" 0С2Нб (1б-г; Пб-г)

ОСНз (1д; ПД)

А ОН (1а-д)

Н2РО3 (Па-д)

При статистической обработке данных использовали критерий t Стьюдента. представляя среднюю, ошибку средней (М ± т) и доверительные интервалы, рассчитанные по формуле M±tm при р<0,05. В некоторых случаях применяли непараметрические критерии знаков, U, ТШ и метод X2 СГублер Е.В.,1973; Гублер Е.В., Генкин A.A., 1978].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пмыуногенетичбсккэ закономерности действия синтетических и

прзфодниз $грнгко2огичшшх шиунсыодулятороз нымунноЯ скстши.

В работе использовали клетки мышей конгенно-резистентных линий C57BL/10 (BIO) и B10.D2, отличающихся только по гаплотипу Н-2 (Н~2Ь и H-2d, соответственно). Чувствительность клеток селезенки (КС) к препаратам исследовали по изменению пролиферативной реакции клеток на ФГА и рекомбинантный М-2 после импульсной обработки КС препарата)®. в качестве лекарственных препаратов с иммуностимулирующей активностью использовали препараты диуцифон [Голощапов Н.М. и со-авт..1S82J и кемантан САрцимович Н.Г.,1988].

Результаты экспериментов с использованием препаратов представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, трехчасовая обработка КС мышей BIO, но не B10.D2 кемантаном или диуцифоном приводила к усилению их проли-фиративной реакции на ФГА. В некоторых случаях наблюдалось снижение пролиферативного ответа клеток на митоген у мышей B10.D2 под влиянием обоих препаратов.

Таблица 1. Пролиферативная реакция на ФГА спленоцитов, обработанных диуцифоном или кемантаном.

1 |Доза |ФГА, |ыкг/мл Доза Включение 3Н-тимидина, имп/мин |

препарата, мкг/мл BIO B10.D2 |

1 1 Контроль D20 D50 D150 1 5 743И13 j 8 1861522 | 10 334±679* | 10 3481238* | 13 95612 617 | 11 925±1 015 | 13 879+1 452 | 5 497±2 001* |

Контроль КЗО К100 16 48713 965 | 27 052±8 448* 1 28 535±2 787 | 20 991±5 348 | 6 95513 382 1 4 182И 995 |

1 5 1 Контроль D25 D75 D225 55 296± 2 188 | 54 378±15 530 | 64 2651 1 256 | 83 357± 1 315* | 89 076И6 600 | 27 2681 892 | 26 0331 5 033 | 8 7831 1 337* |

Контроль К25 К75 К225 50 79б±11 181 | 113 6301 7 865* | 97 51И 7 513 | 100 309И8 446 | 1 82 259И0 006 | 37 368И0 026* | 61 3191 9 421 | 23 4621 3 882* | |

Примечание: Б - диуцифон; К - кемантан; *р<0.05 по сравнению с контролем (клетки, инкубированные без препарата) Аналогичные межлинейные различия в характере иммуномодулирую-щего действия препаратов диуцифона и кемантана были получены и при исследовании пролиферативной реакции КС на ИЛ-2 (рис.2).

Рис. 2. Пролиферативная реакция КС мышей линий C57BL/10 и B10.D2

на ИЛ-2 после импульсной обработки диуцифоном и кемантаном.

100 ко

«1 . -ю 20 -

О - ■ (1

По оси абсцисс: концентрация препарата, мкг/мл. По оси ординат: включение 3Н-тимидина, имп/мин, х 103. МЫШИ: 1,2 - линия BIO; 3,4 - ЛИНИЯ B10.D2. Препараты: 1,4 - диуцифон; 2,3 - кемантан. Концентрация ИЛ-2: А - 25 ME/мл; В - 50 МЕ/мл.

Использование природного иммуномодулятора - препарата лекарственного растения (ПЛР) Scrophularia nodosa, предварительно исследованного нами, позволило подтвердить значение генов комплекса Н-2 в определении чувствительности КС к иммуномодулирующему действию препаратов с различной химической структурой и разного происхождения. Как видно на рис. 3, обработка КС мышей линии BIO ПЛР in vitro приводила к большей стимуляции пролиферативного ответа на ИЛ-2 по сравнению с КС мышей линии B10.D2. Таким образом, наличие галлотипа Н-2Ь, но не H-2d определяло наибольшую чувствительность к иммуномодулирующему действию ПЛР. Представляло интерес исследование эффекта ПЛР in vivo у мышей других линий, отличающихся по гаплотипу Н-2. В экспериментах использовали мышей линий CC57BR (Н-2Ь) и DBA/2 (H-2d). При изучении влияния ПЛР на первичный иммунный ответ к ЭБ были получены данные, указывающие на различия в чувствительности к иммуностимулирующему действию ПЛР. Так. после введения ПЛР в дозе 2 мкл у мышей линии DBA усиление иммунной реакции составило 220% (п=12) а у мышей CC57BR - 357% (п=11) по отношению к своему контролю (мыши не получившие ПЛР).

Рис. 3. Влияние ПЛР на чувствительность мышей конгенных линий ВЮ и BIO.DE к рекомбинантному ИЛ-2.

80 _

/ " х

60 N.

/ S

/

40 ;...

20 :

i

1:900 1:300 1:100

По оси абсцисс: разведение ПЛР при обработке клеток. По оси ординат: включение 3Н-тимидина, имп/мин.

Межлинейные различия были достоверны по непараметрическому критерию Ри<0.05, При этом мыши линии CC57BR обладали большей имму-нореактивностыо по отношению к ЭБ, чем мыши линии DBA/2 (число АОК на селезенку составляло 8827 (6663*12446) против 2494 (2022+3075), соответственно). Это указывает на то, что генетически детерминированный низкий уровень иммунной реакции на антиген не определяет большую чувствительность к иммуностимулирующему действию препарата.

Аналогичный характер мекинейных различий в чувствительности к ПЛР был выявлен и при исследовании пролиферативной реакции КС мышей на ФГА через сутки после введения препарата in vivo (табл. 2).

Мышей иммунизировали ЭБ в дозе 5*107, вводили ПЛР и через сутки выделяли КС. Контроль - введение физиологического раствора вместо ПЛР. Изменение пролиферативной реакции иммунных КС (ИКС) оценивали по индексу иммуномодуляции, рассчитываемому по формуле: (D ИКС опыта/D ИКС контроля)* 100% , где значение D (дельта) разница между включением эН-тимидина в клетки, культивированные с ФГА (5 мкг/мл) и без него. Полученные данные (см. табл. 2)позволяют заключить, что генетические различия в чувствительности к иммуностимулирующему действию ПЛР проявляются на ранних этапах иммуногенеза, связанных с процессами пролиферации иммуноцитов.

—B10.D2 - - ВЮ

Таблица 2. Межлинейные различия в реакции на ФГА иммунных клеток селезенки после введения ПЛР.

1 ' 1 |Доза | НИР. 1 , ... ^ | Индекс шмуномодуляции, 7Л. (М ± т) в разные дни после | иммунизации мышей I

1 1 1 1_ CC57BR DBA/2

1 1 1 1 1 г ■ день +1 | день +2 t день +1 | 1 день +2 |

1 1 I Контроль| 1 2 | 1 ю 1 1 1 1 100 ± 4 | 100 ± 12 191 ± 9* | 169 ± 2 251 ± 16 | 44 ± 13 i . .. 1 100 ± 8 | 35 ± 18 | 35 ± 20 | 1 100 ± 14 | 37 ± 14 | 65 ± 15 | 1

2. Зашюимость нымунокоррнгаругсщого действия лыыуноиодулятсров in vitro от генов глазного комплекса гестосшшвстимости чшжвеиа.

В ходе исследований по изысканию новых иммуномодулирухдах препаратов и соединений были получены данные о способности синтетического гексапептида тимогексина (ТГ) и фитоэкстракционного препарата (ФЭП) усиливать продукцию ИЛ-2, модулировать продукцию ФНО [Plsarev V.M. et al.,19923 и корригировать функциональную активность иммуно-цигов в различных моделях экологического и лекарственого иммунодефицита [Писарев B.M. и соавт.,1992; Ваймуканова Г.К. и соавт.,1993; Тутельян A.B.,19933. Учитывая полученные нами совместно с Л.А.Пев-ницким и Г.К.Баймукановой данные о сниженной способности МНК профессиональных водителей автотранспорта отвечать пролиферативной реакцией на митоген и продуцировать ИЛ-1 и ИЛ-2 СПевницкий Л.А. и соавт., 1994], было проведено изучение зависимости иммунокорригирующей активности ФЗП и ТГ от HLA-фенотипа водителей.

МНК типированных доноров культивировали в присутствии ФГА или Кон А (5 мкг/мл) с добавлением (опыт) или без (контроль) ФЭП (50 мкг/мл) или ТГ (0,05 мкг/мл). Оценку пролиферативной реакции клеток проводили через 72 часа, продукцию цитокинов определяли по Кондратенко И.В. и соавт (1991) и Клаус Д. (1990) через 24 часа культивирования. Предварительно проведенное HLA-типирование позволило уста-

новить отсутствие выраженных различий,,по частоте антигенов HLA в двух исследованных выборках (водители й контроль) СПевницкий JI.A. и соавт.,1994].

Выборка была подразделена на группы водителей, несущих определенный антиген HLA (HLA-X4) и без данного антигена (HLA-X"). Степень коррекции оценивали по отношению индекса стимуляции в культуре с добавлением препарата к индексу стимуляции в культуре клеток без препарата (индекс коррекции). Анализ результатов позволил выявить различия в чувствительности к иммуномодулирующему действию препаратов, связанные с наличием антигенов HLA-B5 и HLA-DR5.

Как видно из табл. 3, ТГ и ФШ в 2 и в 1,5 раза, соответственно, усиливали продукцию ИЛ-1 МНК водителей с фенотипом В5+ и DR5+. Определение уровня ФГА-стимулированной продукции ИЛ-2 в зависимости от фенотипа HLA позволило установить,,аналогичную закономерность, а именно: использованные иммуномодул^рдоре препараты эффективно повышали (в 1,6-2,2 раза) способность,тк продукции ИЛ-2 клетками водителей с фенотипами HLA-B5+ и HLA-DR5+^ ,JIpH этом иммунокорригирующая активность ТГ была более высокой погсравнению с ФЭП.

Таким образом, следует заключить^,'*ига МНК доноров с фенотипами HLA-B5+ и HLA-DR5+ наиболее чувствительны к иммунокорригирующему воздействию использованных шмуномодуляторов m vitro. Это позволяет расценивать наличие данных антигенов как генетических маркеров при возможном профилактическом назначении иммуномодулирующих препаратов ТГ и ФЭП в случае риска возникновения экологического иммунодефицита у лиц, чувствительных к воздействию иммунотоксических антропогенных факторов окружающей среды.

3. Клеточные основы генетических различий в чувствхталъностк к

нымуноыодударукяциы препаратам.

Ранее нами было показано, что в ходе иммунного ответа мышей на ЭБ генерируются клетки-регуляторы (КР), способные антигенонеспеци-фически усиливать пролиферативную реакцию клеток на митогены и иммунный ответ на другой антиген и пролиферативную реакцию КС на митогены [Писарев В.М. и соавт.,1989J0 Предположили, что межлинейные различия в чувствительности к прецар^ам-иммуномодуляторам могут быть опосредованы активацией иммунных^КР в ранние сроки после введения препарата. Опыты проводили с использованием мышей линий DBA/2

Таблица 3. Значение генов НЬА в контроле чувствительности МНК к иммунокорригирующему действию препаратов ТГ и ФЭП.

Группы

1 2

3

4

1 2

Фенотип НЬА-доноров

1-1

Значения индекса коррекции* иммунологических показателей

НЬА-В5+ НЬА-В5-Р1-2 НЬА-В1?5+ НЬА-Б1?5-РЗ-4

НЬА-В5+ Н1А-В5-

Р1-2 НЬА-И?5+ НЬА-0И5-РЗ-4

+ТГ

+ФЭП

реакция на Кон А

1,7±0,1 (15) 1,4±0,1 (21)

0.025 1,8±0,2 (10) 1,4+0,1 (23) 0,025

1.4±0,2 (14) 1,2±0,1 (22)

>0,05 1,6±0,2 (10) 1,3±0,1 (17) >0,05

продукия ИЛ-

2,0±0,1 (11) |

1,5±0,1 (19) |

0,0001 |

2,0±0,2 ( 6) |

1,6±0,1 (16) |

0.041 I

1

1,5±0,1 (И) 1,240.02(19) 0.0001 1,5±0,1 ( 6) 1,3±0,03(16) 0,016

+ТГ

+ФЭП

реакция на ФГА

1,8±0,2 (15) 1,3±0,1 (21)

0,0077 1,8±0,3 (10) 1,5±0,2 (23) >0,05

1,7±0,2 (15) 1,2±0,1 (21)

0,004 1,7±0,2 (10) 1,3+0,1 (17) >0,05

продукция ИЛ-2

2,2+0,1 ( 9) 1.5±0,1 (19) 0,0001 2,2+0,2 (16) 1.6±0,1 (16) 0,0054

1,6±0,1 ( 9) 1,3+0,12(19) 0,0006 1.7Ю.1 ( 6) 1,3±0.01(16) 0,0001

<о

I

Примечание. * Индекс коррекции - индекс стимуляции пролиферации клеток с препаратом/индекс стимуляции без препарата.

и CC57BR, оппозитных по чувствительности к ПЛР (см. раздел 1).

В качестве KP использовали КС мышей CC57BR и DBA/2, взятые через сутки после иммунизации 5*107 ЭБ (ИКС). Часть доноров одновременно с ЭБ получала ПЛР из расчета 1, 2 или 4 мкл/мышь. Иммунные КС таких мышей обозначали как ИКС-1ШР1, ИКС-ПЛР2 и ИКС-ПЛР4, соответственно. Суспензию КС, содержащую KP, обрабатывали глютаровым альдегидом для предотвращения их пролиферации и продукции растворимых факторов и добавляли в концентрации 20% к сингенным свежевыделенным ИКС (106/мл); Результаты оценки пролиферативной реакции на ФГА (3 мкг/мл) представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4, добавление к сингенным КС 20% иммунных КС мышей CC57BR , но не DBA/2, получивших ПЛР, приводило к достоверному усилению пролиферативной реакции КС. Межлинейные различия Таблица 4. Влияние ПЛР на генерацию клеток-регуляторов In vivo у иммунных мышей с различной чувствительностью к иммуностимулирующему действию препарата.

i-г

I Клетки в |Пролиферативная реакция на ФГА(М±ш, ZZ к контролю) .I культуре

h

I Контроль I I+207J1KC I I+202ЖС-ПЛР11 I+20%ИКС-ПЛР2I I +20ХИКС-ШР41

100 ± 6 101 ± 24 142 ± 12 164 ± 10* 193 ± 16*

Примечание . Контроль - пролиферативная реакция КС иммунных мышей соответствующей линии на ФГА.*р<0.05 по сравнению с контролем, в активации КР, индуцированных ПЛР in vivo, соответствовали таковым при оценке влияния ПЛР на первичный иммунный ответ. Полученные результаты дают основание полагать, что межлинейные различия в чувствительности к иммуномодулирующему действию ПЛР связаны с различиями в чувствительности к ПЛР-индуцированной активации КР in vivo. Следовательно, воздействие ПЛР (и,вероятно, других иммуномодулято-ров) in vivo может опосредоваться активацией КР. Выраженный иммуностимулирующий эффект КР, сохраняющийся после фиксации клеток глю-

таровым альдегвдом, указывает на то, что действие КР опосредовано их мембраноассоциированными структурами.

Полученные данные позволили предположить, что межлинейные различия при воздействии ммуномодуляторов in vitro также обусловлены генотипически обусловленными различиями в активации КР. Поэтому в последующих экспериментах мы исследовали активность лекарственно индуцированных КР у мышей линий В10 и B10.D2, в отношении которых были показаны межлинейные различия в действии диуцифона и кемантана In vitro. Результаты опытов, в ходе которых исследовали влияние КР на пролиферативную реакцию иммуноцитов на ФГА, представлены на рис. 4.

Рис. 4. Активность фармакологически активированных клеток-регуляторов у мышей BIO и B10.D2.

В 20 ,

0,5 I 1.5 2 2.5 3 3,5 4 4,5

10 Ь

О tu.

К25

К75

К225

По оси абсцисс - концентрация препаратов, мкг/мл: О - диуцифон, К - кемантан.

По оси ординат - включение 3Н-тимидина, имп/мин, х 103. Концентрация ФГА - 5 мкг/мл.

Как видно на рис. 4, обработка препаратами КС мышей линии В10, но не В10.02 приводит к индукции КР.добавление которых в количестве 10£ к сингенным КС усиливает их пролифератвный ответ на ФГА. Проли-феративная реакция на митоген КС мышей линии В10.02 под влиянием сингенных КР был снижен. При сопоставлении полученных данных с результатами, представленными в табл. 1 (исследование прямого воздействия препаратов на КС), видно, что характер межлинейных разли-

чий при прямом и опосредованном через KP действии обоих препаратов на КС одинаков.

При исследовании влияния KP мышей линии BIO и B10.D2 на диффе-ренцировку сингенных иммунных В-лимфоцитов были выявлены аналогичные межлинейные различия (рис. 5).

Рис. 5. Роль генов главного комплекса гистосовместимости в контроле активации клеток-регуляторов дифференцировки В-лимфоцитов.

» B10.D2

—*— В10

(D) и

%% к контролю КС).

интервалы при существенно (до

2 раз) увеличивали число антигелопродуцентов в культуре иммунных КС, взятых за сутки до пика антителообразования (на 3-й день после иммунизации ЭБ) и культивированных в течение 8-10 часов в 96-луночных планшетах в среде RFMI 1640 с необходимыми добавками. Полученные данные подтверждают предположение о том, что межлинейные различия в чувствительности иммуноцитов к действию иммуномодуляторов могут быть связаны с различиями в генерации КР под влиянием фармакологических препаратов. Поскольку мыши контрастирующих линий являлись конгенными, то следует заключить, что гены комплекса Н-2 вносят вклад в контроль фармакологической индукции In vitro КР.

По оси абсцисс: концентрация препаратов - диуцифона кемантана (К), мкг/мл.

По оси ординат: относительное увеличение числа АОК, (АОК в культуре иммунных КС с добавлением интактных Представлены средние геометрические и доверительные р< 0,05.

Как видно на рис 5, КР мышей BIO, но не B10.D2

4. Уеханизыы действия фармакологически актнвнразгшшх клэ-ток-регуляторов иммуногенеза.

В последующих экспериментах было установлено, что КР, активированные диуцифоном и кемантаном, были чувствительны к обработке анти-Т-сывороткой кролика и анти-ТЬу-моноклональными антителами мыши и комплементом. Это указывало на то, что фармакологически активированные КР являются Т-лимфоцитами. Обработка таких КР гдютаровым альдегидом в концентрации, препятствующей продукции растворимых факторов (0,1%-0,ЗХ), не меняла их активности in vivo и In vitro. Это свидетельствовало о значении мембраноассоциированных структур КР в проявлении их активности.

Учитывая значение 1а-антигенов - продуктов генов главного комплекса гистосовместймости в осуществлении иммунорегуляторных межклеточных взаимодействий [Медуницин Н.В., Алексеев Л.П.,19873, представляло интерес исследовать влияние иммуномодулирующих соединений, активирующих КР, на изменение проявленности продуктов локу-сов HLA-DR и HLA-DQ на клеточной мембране МНК человека.

С этой целью МНК : инкубировали в течение 1 часа в среде RPMI 1640 без (контроль) или в присутствии производных нуклеозид-5'-фос-фонатов Ilr и Пд (5 мкМ) или тимогексина (0,05 мкг/мл), отмывали и определяли уровень экспрессии молекул HLA на клеточной поверхности с помощью клеточного иммуноферментного анализа и моноклональных антител. Часть клеток (106/мл) дополнительно культивировали в среде с добавлением 5% СПК и митогена лаконоса (10 мкг/мл) и определяли уровень экспрессии 1а-антигенов на протяжении нескольких часов. Результаты опытов, представленные на рис. 6 и 7, свидетельствуют о том, что и ТГ, и производные нуклеотидов достоверно усиливают экспрессию молекул HLA-DR на клеточной поверхности. При дальнейшем культивировании клеток в присутствии митогена лаконоса повышенный уровень экспрессии антигенов HLA сохранялся.

Полученные данные позволяют предположить, что клетки с повышенной экспрессией мембраноассоциированных структур - продуктов генов главного комплекса гистосовместимости в первые часы после воздействия препарата могут ' способствовать дополнительной активации взаимодействующих клеток, проявляя тем самым свою функциональную активность как клеток-регуляторов.

Рис.6. Кинетика экспрессии антигенов НЬА-Б!? и НЬА-БЦ в условиях воздействия соединений Ид и Пг.

А IILA.DK В НЬА.од ,

По оси ординат - единицы оптической,плотности (Е°). По оси абсцисс - часы после окончания инкубации клеток с препаратами. Группы: 1 - контроль (клетки без препаратов); 2 - соединение Пд; 3 - соединение Пг.* р<0.05 по сравнению с контролем. После отмывки клеток от препарата в культуру добавлен митоген лаконоса (10 мкг/мл).

Рис. 7. Кинетика изменения экспрессии НЬД-БИ на клеточной поверхности после импульсного воздействия тимогексина.

О 0,5 13

По оси абсцисс - срок после окончания воздействия ТГ, часы. По оси ординат - индекс стимуляции экспрессии в процентах к контролю (100Х, клетки без ТГ).

Группы: 1 - контроль; 2 - ТГ, 0.05мкг/мл; 3 - ТГ, 0.01 мкг/мл.

Для проверки этого предположения КР сразу после инкубации с соединением Пд или Пг обрабатывали в течение 45 мин антителами, отмывали и добавляли в культуру МНК, стимулированных митогеном ла-коноса. В качестве контроля использовали МНК, к которым добавляли преинкубированные без препарата клетки, обработанные аналогичными антителами в сходных условиях. Добавление контрольных МНК не приводило к значительному изменению пролиферативной реакции на митоген лаконоса или продукции 1еА и 1дМ в культуре МНК. КР, активированные ТГ или соединением Пд, достоверно усиливали пролиферативную реакцию и синтез иммуноглобулинов. Данные, представленные на рис. 8, свидетельствуют о том, что блокада структур НЬА-БР или НЬА-ВД антителами препятствует эффекту КР. Аналогичные данные были получены с использованием препарата ТГ, а также при изучении регуляции полик-лонального синтеза иммуноглобулинов МНК.

Рис. 8. Влияние моноклональных антител на активность клеток-регуляторов пролиферативной реакции МНК на митоген лаконоса.

К)' 10° 10"

10"1 ю5 К)5 !<►*

-по -1Ж С02

2 3 4 5

Ь -об-

По оси ординат - включение 3Н-тимидина, имп/мин, х Ю3.

По оси абсцисс - клеточные суспензии: а - МНК, 106; МНКДО5, инкубированные с соединением Пд, 5 мкМ; с - клетки Ь, работанные моноклональными антителами.

Группы: 1 - клетки а; 2 - клетки а + Ь; 3 - клетки а + (с + анти-ОД); 4 - клетки а + (с + анти-Б!?); 5 - клетки а + (с + ан-

ТИ-С02).

Как видно на,рис. 8, обработка антителами против мембраноассо-вдированной структуры CD2 Г-лимфоцитов также ингибировала активность КР. Последнее указывает на то, что КР, активированные Пд,являются Т-лимфоцитами, как и КР, активированные другими препаратами.

В последующих экспериментах исследовали значение межклеточных взаимодействий в опосредовании эффекта КР, индуцированных ТГ(рис.9). Рис. 9. Влияние межклеточных взаимодействий клеток-регуляторов на продукцию иммуноглобулинов.

Па оси ординат - концентрация IgA шш IgM, нг/мл, в НЖ МНК. По оси абсцисс - группы: везде добавлены МНК, 106; 1 - контроль (только МНК)-, добавление клеток: 2 - 5% НК; 3 - 5% НК-ТГ; 4-5% НК(Р); 5 -' 5% НК-ТГ (Р); 6 - ПК(Р); 7 - 5% ПК + 5% НК(Р); 8-5% Ж + 5% НК-ТГ(Р). Обозначения: НК- нормальные неприлипаквдие клетки; НК-ТГ - неприлипающие клетка, инкубированные с ТГ; ПК - прилипающие клетки; Р - разделение добавленных клеток от МНК непроницаемой для '.клеток мембраной (группы 4-8).

С этой целью использовали двухкамерные 24-луночные планшеты "Costar", ОНА. В нижние камеры добавляли МНК и антиген лаконоса, в верхние - неприлипающие к пластику КР или КР и прилипающие клетки (ПК). На рис. 8 видно, что КР, добавленные непосредственно к МНК (группа 3) или в верхнюю камеру (группа 5) усиливают продукцию IgA, но не IgM. Только добавление смеси клеток ПК+КР в верхнюю камеру (группа 8) способствовало усилению не только синтеза IgA, ко и продукции IgM (группа 8). Следовательно, действие КР опосредуется выс-

вобождением растворимых факторов, при этом межклеточные взаимодействия КР могут усиливать их продукцию. Последний вывод был впоследствии подтвержден в дополнительных экспериментах, в которых к МНК добавляли надосадочную жидкость (НЖ) КР, инкубированных с ПК (1:1). При этом эффект НЖ смеси клеток в отношении стимуляции продукции 1дМ был наиболее выражен.

Эффект КР, активированных ТГ, проявлялся в соответствии с особенностями прямого воздействия иммуномодулятора на клетки. Так,- при-прямом действии ТГ усиливалась продукция 1гА и уменьшался синтез 1дЕ МНК здоровых доноров, а также больных с селективным 1дА-иммунодефицитом и атопическим дерматитом, соответственно.

Добавление к МНК КР приводило к аналогичному эффекту (рис.10), проявлявшемуся в разнонаправленном характере регуляции 1гА и 1дЕ под воздействием КР.

Рис. 10. Регуляция продукции 1%А и 1&Е в культуре МНК человека с помощью аутологичных клеток-регуляторов, активированных тимогексином.

По оси ординат - концентрация 1дА и 1дЕ, нг/мл, М ± ш. По оси абсцисс - концентрация ТГ при активации КР, мкг/мл. Уровень синтеза 1(? МНК: штриховая линия внизу - 1дА, штриховая линия вверху - 1дЕ. 1,2- содержание после добавления к МНК 2.5% (1) и 10% (2) клеток, инкубированных с ТГ. 3, 4- содержание 1рЕ после добавления к МНК 2,5% (3) и 10% (4) клеток, инкубированных сТГ. * р < 0.05 по сравнению с контрольной группой (контроль - добавление клеток, необработанных ТГ).

Было показано, что НЖ КР уже через Z часа после их активации ТГ содержит растворимые факторы, опосредующие действие КР на МНК и обладащие аналогичными свойствами в отношении подукции IgA и IgE.

Значение высвобождения ранних факторов в опосредовании действия КР было подтверждено и в другой экспериментальной системе при изучении влияния КР на продукцию фактора некроза опухоли (ФНО). Обнаружили, что через 2-4 часа после воздействия ТГ НЖ КР ингибирует продукцию ФНО МНК [Писарев В.М. и соавт. ,1995]. Фракционирование НЖ клеток,; инкубированных без (НЖ-Н) или в присутствии ТГ (НЖ-ТГ) с помощью гель-фильтрации на колонку нагруженной сефакрилом S300 или сефадексом 6150 (Pharmacia, Швеция), позволило выявить в НЖ-ТГ наличие фракций, соответствующих белкам с молекулярной массой 70-85 кД, ингибирующих продукцию ФНО (рис.11).

Рис. 11. Влияние фракций НЖ МНК на индуцированную ЛПС продукцию ФНО клетками человека.

150 ----------

50 F

WV

'ЗгГ-А iMo

Кта VW

• V Т 1

та

iV'T1

К МНК добавляли фракции Мг 70-85 кД, полученные из НЖ МНК, инкубированных без (НЖ-Н) или в присутствии ТГ (НЖ-ТГ). Концентрация ЛПС 1 мкг/мл.

По оси ординат - уровень продукции ФНО , %% к контролю (содержание ФНО без добавления НЖ к МНК принято за 100%). По оси абсцисс - добавление фракций НЖ: 1 - НЖ-Н; 2 - НЖ-ТГ. Срок получения НЖ после инкубации клеток с ТГ: А-2 часа, В-4 часа.

Инкубация рекомбинантного ФНО с фракциями 70-85 кД НЖ-ТГ, но не НЖ-Н, приводила к двукратной ингибиции активности ФНО в цитоток-сическом тесте с использованием клеток линии Ь-929. Следует полагать что НЖ клеток, инкубированных с ТГ, содержит растворимые факторы, связывающие или изменяющие конформацию активных участков молекулы ФНО. По своим свойствам - способности ингибировать активность ФНО и по молекулярной массе данный фактор сходен с растворимым рецептором ФНО р75. Механизм ингибиции продукции ФНО данным фактором может быть обусловлен связыванием продуцирующихся в первые часы культивирования молекул ФНО, что препятствует положительной аутокринной регуляции со стороны ФНО, т.е. индукции экспрессии генов ФНО под влиянием самих молекул цитокина. Не исключено, что растворимый комплекс ФНО-рецептор непосредственно ингибирует продукцию ФНО клетками, являясь отрицательным элементом регуляции синтеза ФНО.

Таблица 5. Влияние факторов 75-90 кД фракций НЖ инкубированных МНК на активность СМЭ.

1 н I фракции Активность СМЭ 1 (ед. акт.) в клетках после добавления |

фракций НЖ (М±ш)

4-часовые 1 1 | 2-часовые |

преднизолон, Ю-5 1 |дексаметазон. Ю-5 |дексаметазон, 10"5|

I контроль 101 ± 13.5 | 77+19 | 159 ± 39 |

п=10 | П= 3 | ¡1= 5 |

|НЖ-Н 94 ± 22 | 105 ± 24 | 214 ± 55* |

п= 4 I П= 3 | п= б |

| НЖ-ТГ 45 ± 9* | 35 ± 5А | 97 ± 37** |

1 П= 4 I п= 3 1 | п= 6 | 1 1

Примечание, п - число отдельных опытов. * Ртщ<0.05 при сравнении с контрольной группой 10) или с последней и группой НЖ-Н(**). В опытах, проведенных совместно с А.В.Данилиной, Е.Л.Зюзиной и Г.В.Шмариной (МГНЦ РАМН), было показано, что эффект КР в отношении модуляции процессов коммитирования иммуноцитов к программированной

клеточной гибели, связанной с активацией Ca/Mg-зависимой эндонукле-азы (СМЭ), также опосредован ранней продукцией регуляторных факторов. В таблице 5 представлены данные, свидетельствующие об ингиби-ции фракциями НЖ-ТГ с молекулярной массой 75-90 кД активности ядерной СМЭ, индуцированной воздействием кортикостероидных гормонов на МНК.

Представленные в данном разделе результаты указывают на то, что активированные различными препаратами-иммуномодуляторами КР способствуют высвобождению регуляторных факторов, влияющих на разнообразные форш проявления активности иммунокомпетентных клеток -синтез иммуноглобулинов, продукцию цитокинов, ингибицию продукции СМЭ - фермента, определяющего коммитированиё лимфоцитов к программированной гибели [Wyllie А.Н. et al.,19921. Такие факторы можно рассматривать как молекулы-посредники действия КР. Последние в свою очередь могут являться посредниками воздействия иммуномодулирующих препаратов на иммунноую систему. Эту точку зрения дополнительно подтверждают полученные в ходе работы данные, суммарно приведенные в табл. ,,6; ■

Как видно из табл. б, прямое воздействие разных иммуномодулирующих препаратов и соединений на клетки иммунной системы и действие КР носят однонаправленный характер.

Результаты, представленные в разделах 1, 3 и 4, указывают на возможность нового подхода к оценке механизмов ранних этапов воздействия иммуномодулирующих препаратов. В соответствии с полученными данными, свидетельствующими'о роли генетически контролируемых процессов активации КР иммуномодуляторами в опосредовании эффектов последних на иммунную систему, предлагается новая концепция фармакологической иммуномодуляции, в соответствии с которой клетки-регуляторы выступают в качестве генетически контролируемых посредников в системе "лекарство-организм".

Сущность концепции заключется в следующем. Только часть наиболее чувствительных к иммуномодудяторам Т-клеток активируется под их влиянием. Состояние активации может проявляться в повышенной экспрессии иммунорегуляторных мембраноассоциированных структур, в частности продуктов локусов DR и DQ системы HLA. Взаимодействие активированных Т-клеток-регуляторов с другими клетками приводит к раннему высвобождению короткодистантных медиаторов - мессенджеров. Миграция КР и последующая акцепция окружающими лимфоцитами таких

Таблица 6. Сопоставление иммуномодулирущей активности препаратов при их прямом воадействи на иммуноциты и КР, активированных препаратом in vitro.

1 | Препарат 1 1 | Биологический эффект | Прямое 1 - - ■ 1 | Действие |

|(соединение) 1 1 действие 1 КР |

1 1 | | препарата

|Оригинальные 1 1 (увеличение числа АОК in vivo + | + |

|производные |ингибиция продукции ФНО |

|нуклеозидов |in vitro | + | + |

|и их 5'-фосфо- ! усиление пролиферативной |

|натов ¡реакции на митогены in vitro + 1 + 1

|увеличение продукции им- |

|муноглобулинов | 1 | + 1 + 1

|тимогексин 1 1 |увеличение продукции ИЛ-2 | + 1 + 1

|увеличение синтеза 1ёА | + ! + 1

(уменьшение синтеза 1еЕ ( + 1 + 1

(модуляция продукции ФНО в |

(зависимости от его уровня | + 1 + 1

|модуляция антигенспецифи- |

|ческого торможения адгезии|

|лейкоцитов | + 1 + 1

|ингибиция активности Са/М^-

| зависимой эндонуклеазы, |

|индуцированной кортикосте- (

Iроидами ( 1 I + 1 + 1

| диуцифон и ! I (усиление иммунной реакции |

| кемантан |на ЗБ | + 1 + 1

(увеличение пролиферативной|

(реакции на митоген | 1 1 + 1 + 1

| милдронат 1 I (усиление иммунной реакции |

)на ЭБ | 1 I + 1 + 1 1 1

Примечание. Статистически обработанные цифровые данные соответствующих экспериментов представлены в диссертации.

медиаторов, или связывание последних с цитокинами определяет основной результат воздействия иммуномодулирущих препаратов на иммунную систему.

При изучении механизмов фенотипического проявления генетического контроля иммунофармакомодуляции концепция позволяет акцентировать внимание на ранних этапах воздействия иммуномодуляторов, так как именно на этих этапах в первую очередь реализуются генетические различия в чувствительности к препаратам.

5. Использование клеток-рэгуляторов иммунной системы в целях

экстракорпоральной имыунофармакотерапии.

В 1984-85гг. был предложен новый подход к иммунокорригирующей терапии, основанный на введении в организм аутологичных иммунокомп-тентных клеток (клеток-регуляторов), активированных in vitro лекарственными препаратами- иммуномодуляторами. [Лесков В.П., Писарев В.М.,1984; Писарев В.М. и соавт.,1985; Гущин И.С. и соавт.,1985]. В этих работах было экспериментально обосновано использование препарата диуцифон с целью индукции клеток-регуляторов. Разработанный метод лечения получил название экстракорпоральной иммунофармакоте-рапии (ЭИФТ) [Гущин И.С. и соавт.,1987] и был внедрен в практику в Институте иммунологии ШШ РФ.

Предложенная концепция объясняет высокую терапевтическую эффективность ЭИФТ при лечение тяжелых иммунодефицитных состояний и аллергических заболеваний и предполагает использование различных препаратов иммуномодуляторов для активации клеток-регуляторов иммуногенеза.

Как терапевтическая процедура метод ЭИФТ осуществляется с помощью приемов цитафереза, когда часть лейкоцитов выводится из кровотока, обрабатывается in vitro препаратом, инкубируется, отмывается и реинфузируется больному (Лесков В.П. и соавт., 1984; Гущин И.С. и соавт., 1986). Однако использование для цитафереза сепаратора клеток IBM-2997 (Гущин И.С. и соавт., 1986) затрудняет широкое применение метода в РФ.

Совместно с сотрудниками кафедры иммунологии Курского государственного медицинского университета доц.С.М.Юдиной и к.м.н. A.M.Галановым на базе клинической областной больницы, г.Курск, и экспериментальной базе лаборатории иммуногенетики Инсти-

тута генетики человека МГНЦ РАМН была проведена работа, в задачи которой входила разработка нового варианта ЭИФТ, не требующего аппаратуры IBM для цитафереза, с использованием других препаратов, способных индуцировать клетки-регуляторы иммуногенеза in vitro.

Проведенное исследование с применением препарата милдронат , обладающего иммуномодулирующей активностью, позволило обосновать его использование для целей ЭИФТ. Так, введение мышам КС, активированных препаратом, приводило к 3-кратному усилению иммунных реакций сингенных реципиентов.

Совместно с доц. С.М.Юдиной и А.М.Гапоновым был разработан технически иной вариант ЭИФТ, исключающий использование аппарата IBM 2997 для цитафереза. Была проведена клиническая апробация варианта ЭИФТ с использованием милдроната на базе Курской областной клинической больницы при лечении больных с тяжелой гнойной инфекцией, устойчивой к антибиотикотерапии на фоне выраженного вторичного иммунодефицитного состояния, не корригируемого имеющимися в наличии иммуномодулируюшими препаратами.

Основной особенностью метода явилось использование отечественной системы "Гемакон 500/300" для забора крови и выделения лейкоцитов с использоанием раствора реополиглюкина. Метод позволил выделять 2*1О9 лейкоцитов от одного больного и реинфузировать ж после активации препаратом. 60% клеток составляли МНК.

Разработанный вариант ЭИФТ с применением милдроната и других препаратов был успешно апробирован при лечении тяжелой ожоговой болезни, осложненной гнойной инфекцией, резистентной к антибиотика- и иммунофармакотерапии, сепсисе,при иммунодефицитных состояниях с поражением макрофагального звена иммунитета (Yudina S.M.et al.,1994).

В табл. 7 представлены результаты исследования иммунологических показателей больных последней группы при лечении методом ЭИФТ в разработанном варианте (3-4 процедуры).

Как видно из табл. 7, уже в ходе ЭИФТ востанавливался до нормы показатель активности фагоцитов. Это сопровождалось положительным клиническим эффектом.

Полученные клинические результаты позволяют предложить использование метода ЭИФТ для попытки коррекции иммунодефицитных состояний характерных для многих наследственных болезней , а также при наследственных дефектах фагоцитоза, в особенности при устойчивости к традиционной иммуномодулирующей терапии. Основные преимущества

метода ЗИФТ связаны с выведением КР из-под контроля супрессорных воздействий продуктов метаболизма бактерий, антибиотиков, эндогенных факторов, препятствующих активации клеток-регуляторов фармакологическими препаратами в организме.

Таблица 7. Изменение иммунологических показателей при лечении методом ЗИФТ больных с дефектами фагоцитарной системы.

I-1-1-!-1

| Иммунологические| | | |

| показатели | до лечения | в ходе лечения | после лечения |

I-,-, , | |

|название|норма| | | |

IT-РОК | 40 - 52| 32,0 ± 2,6 | 33,0 ± 2,4 | 43,0 ± 1,2* |

IB-РОК | 10 - 20| 6,7 + 2,0 ! 13,3 ± 2,0 | 14,7 ± 2,3 |

|фагоци- ill I I

|тарный | 46 - 80| 23,7 ± 1,76 | 63,7 + 2,6* | 68,0 ± 1,64* |

|индекс || | | | i_i_i_i_i_j

Примечание. *р<0.05 по сравнению со значением до лечения.

Дальнейшие исследования генетических и молекулярных механизмов, лежащих в основе активации Т-клеток-регуляторов in vivo и in vitro будут способствовать совершенствованию новых подходов к имму-нофарыакотерапии, включая метод ЗИФТ.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены новые вещества и препараты синтетического и природного происхождения, которые обладают выраженной иммуностимулирующей активностью, способны усиливать продукцию интерлейкина-2 к модулировать продукцию фактора некроза опухоли-альфа (ФНО). Установлены межлинейные различия в чувствительности лимфоцитов мышей к им-муномодулирующему воздействию ряда препаратов in vivo и in vitro.

2. Гены главного комплекса гистосовместимости участвуют в контроле чувствительности лимфоцитов мышей к иммуностимулирующему воздействию химических и природных иымуномодулирующих соединений. Установлена роль генов комплекса HLA человека (локусы HLA-B и HLA-DR) в определении чувствительности к иммунокорригирукицему воздействию новых препаратов-иммуномодуляторов.

3. Действие целого ряда препаратов и соединений с иммуномодулирущей активностью опосредовано активацией Т-клеток-регуляторов, стимулирующих процессы пролиферации, дифференцировки имунокомпе-тентных клеток и влияющих на продукцию цитокинов. Процессы активации клеток-регуляторов иммуногенеза зависят от галлотипа Н-2 мышей.

4. Механизмы действия фармакологически активированных клеток-регуляторов связаны с их мембраноассоциированными структурами и ранним высвобождением растворимых факторов в процессе межклеточного взаимодействия. Установлено участие продуктов локусов DQ и DR комплекса HLA человека в проявлении активности клеток-регуляторов.

5. Растворимые факторы с молекулярной массой 75-90 кД, высвобождаемые фармакологически активированными клетками-регуляторами, модулируют процессы коммитирования лимфоцитов человека к программированной клеточной гибели. Растворимые факторы ингибиции продукции ФНО по своим свойствам сходны с рецептором ФНО.

6. На основании полученных данных предложена новая концепция фармакологической регуляции иммуногенеза, согласно которой фармакологически активированные Т-клетки-регуляторы являются посредниками в системе "лекарство-организм" при осуществлении иммуномодулирувде-го воздействия препаратов на процессы иммуногенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лесков В.П., Писарев В.М., Аршинова С.А.. Исследование действия сингенных клеток селезенки мышей, обработанных диуцифоном, на величину иммунного ответа.// Бюлл. эксперим. биол. - 1977.-п10.- с.474-476.

2. Писарев В.М., Лесков В.П.. Исследование иммуноцитов, активированных In vitro, для переноса медиаторов in vivo с целью имму-нокоррекции.// Материалы II Национального конгресса по медицинской биологии и генетике с межд. участием.- София,1985. - т.2. - с.19.

3. Лесков В.П., Прозоровский Н.С., Гущин И.С., Писарев В.М.. Обоснование возможности применения активированных лимфоцитов для коррекции иммунодефицитных состояний.// Всесоюзная конференция "Проблемы профилактики, диагностики и лечения аутоиммунных заболеваний и иммунодефицитов".- Новосибирск,1985-т.2.- с.85-86.

4. Гущин И.С., Лесков В.П., Прозоровский Н.С., Писарев В.М.. Экстракорпоральная иммунофармакотерапия. // "Актуальные вопросы кли-

нической и экспериментальной аллергологии и иммунологии".- Каунас, 1986.- с. 59-60.

5. Гущин И.С., Лесков В.П., Прозоровский Н.С., Писарев В.М.. Использование клеток-продуцентов медиаторов иммунного ответа для иммунокорреквди.// Сб. трудов ЦНИИВС им. Мечникова "Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии."- Москва,1985.- с. 136-140.

6.Гущин И.С., Лесков В.П., Прозоровский Н.С., Писарев В.М.. Экспериментальное обоснование экстракорпоральной иммунофармакотера-

*пии.// "Актуальные вопросы иммунофармакологии".- Москва,1987.-С.71-82.

7. Писарев В.М., Георгиев В.П., Калашникова Е.А., Л.А.Певниц-кий.// Диклогексимид как стимулятор клеток-усилителей иммуногенеза.// "Актуальные проблемы иммунологии. Иммунодефициты и иммунокор-рекция",- Владивосток,1987.- с.137.

8..Гущин И.С, Писарев В.М., Прозоровский Н.С., Лесков В.П.. Возможности иммуномодуляции клетками, опосредующими дифференцировку В-лимфоцитов.// "Актуальные проблемы иммунологии. Иммунодефициты и иммунокоррекция".- Владивосток.-1987.- с.150.

9. Писарев В.М., Георгиев Б.П., Певницкий Л.А.. Роль генов главного комплекса гистосовместимости в контроле изменения пролифе-ративного ответа иммуноцитов на ингерлейкин-2 под влиянием иммуно-модуляторов.// IX Межинститутская конференция "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях".- Челябинск,1988,- с.174-175.

10. Георгиев Б.П., Писарев В.М., Дрозд Г.А., Певницкий Л.А.. Исследование иммуномодулирующих свойств норичника (Скрофулярия) у мышей разных генотипов In vivo и in vitro.// I Национальный конгресс по фармации.- София,1988.- с.148.

И. Георгиев Б.П., Писарев В.М.. Роль мембраноассоциированных структур клеток-усилителей в модуляции иммуногенеза.// X научная конференция болгарских аспирантов в СССР с международным участием: Актуальные проблемы современной науки.- Москва, 1988.- с.42.

12. Писарев В.М., Лесков В.П., Прозаровский Н.С., Гущин И.С.. Действие клеток-регуляторов иммуногенеза может быть опосредовано мембраноассоциированными структурами.// I Всесоюзный съезд иммунологов." Москва,1989.-т. 1,- с.352.

13. Писарев В.М., Лесков В.П., Георгиев Б.П., Гущин И.С., Певницкий Л.А.. Клетки-усилители как модуляторы иммуногенеза.// Вест-

ник АМН СССР.- 1989.- п2,- с.58-68.

14. Лесков В.П., Писарев В.М.. Вспомогательные молекулы межклеточного взаимодействия как физиологически активные пептиды клеточной мембраны.// Вестник АМН СССР.- 1989.- п4.- с.83-90.

15. Георгиев Б.П., Писарев В.М., Лесков В.П.. Клетки-регуляторы гуморального иммунитета, индуцированные антигеном или фармакологическими препаратами.// XI научная конференция болгарских аспирантов В СССР.- Москва, 1989.- с.39.

16. Георгиев Б.П., Писарев В.М., Певницкий Л.А.. Активность фармакологически индуцированных клеток-регуляторов иммуногенеза может контролироваться генами главного комплекса гистосовместимос-ти.// XI научная конференция болгарских аспирантов в СССР.- Москва, 1989.- с.39.

17. Дрозд Г.А., Горбачева Л.А., Писарев В.М., Конопля А.И., Ермакова А.Е., Георгиев Б.П.. Лекарственные растения - природные иммуномодуляторы.// "Иммуномодуляторы природного происхождения".-Владивосток, 1990.- с.24-25.

18. Лешин A.A., Писарев В.М., Тутельян A.B.. Изучение продукции фактора некроза опухоли в суспензиях иммунокомпетентных клеток больных реанимационного профиля.// Материалы конференции молодых ученых Казахстана.-Москва, 1990.- с.29-30.

19. Plsarev V.M., Tarussova N.B., LescovV.P., Kuchanova M., Tutelyan А.V.. Blfunctlonal properties of analogues of modified nucleotides: immune system cells stimulation and human immunodeficiency virus (HIV) replication inhibition.// Nucl. Acids Res.-' Symp.Ser.24.- p.21.

20. Курцикидзе М.Ш., Бакуридзе А.Д., Датукашвили Г.Ц., Писарев В.М.. Разработка и стандартизация растительной композиции иммуномо-дулирующего действия.// Ресурсоведческое и фитохимическое изучение лекарственной флоры СССР. - Научные труды.- т.XXIX- Москва, 1991.-с.205-210.

21. Курцикидзе М.Ш., Бакуридзе А.Д., Писарев В.М., Патудин A.B., Датукишвили Г.Д.. Разработка гранулированной лекарственной формы с иммуностимулирующей активностью.// Реализация научных достижений в практической фармации.-Тезисы докладов.- 1991, Харьков.-с.190-191.

22. Plsarev V.M., Tarussova N.B., Leskov V.P., Kyhanova M.K., Otrázheva E.D., Tutelyan A.V., Kremlev S.a., Pevnitzky L.A.. Bi-

functional properties of analogues of modified nucleotides.//International Symp."Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application."- Moscow,1991.- p.92.

23. Певницкий JI.А., Писарев B.M., Телегин Л.Ю., Тутельян A.B.. Генетические аспекты действия различных иммунодепресантов.// Вестник Российской АМН.- 1992.- п4.- с.52-55.

24. Писарев В.М., Тарусова Н.Б., Георгиев Б.П., Кухнова М.К., Тутельян A.B., Кремлев С.Г., Лесков В.П., Певницкий Л.А.. Иммуностимулирующая активность 5'-фосфонатов нуклеозидов.// Химико-фармакологический журнал.- 1992.-П7-8.- С.4-9.

25. Тутельян A.B., Писарев В.М., Лесков В.П., Тарусова Н.Б.,Кремлев С.Г., Куханова М.К.. Иммуномодулирующая активность производных нуклеозидов и нуклеотидов.// I съезд иммунологов России,- Новосибирск, 1992.- с.487.

26. Писарев В.М., Кремлев С.Г., Тутельян A.B., Талонов A.M., Лесков В.П., Певницкий Л.А.. Модуляция продукции цитокинов и иммуноглобулинов клетками-регуляторами иммуногенеза.// I съезд иммунологов России.- Новосибирск, 1992.- с.365.

27. Певницкий Л.А., Писарев В.М.. Телегин Л.Ю., Тутельян A.B.. Генетические аспекты модуляции иммунного ответа.// I съезд иммунологов России.- Новосибирск, 1992.- с.353.

28. Лебедев В.В., Писарев В.М., Смирнова М.П., Кремлев С.Г..Максимов С.Л., Тутельян A.B., Степанов С.Г.. Новые синтетические иммунорегуляторные пептиды: механизмы действия и клинико-диагностические аспекты применения при инфекционной патологии.// I съезд иммунологов России.-Новосибирск, 1992.- с.270.

29. Лебедев В.В., Покровский В.И., Писарев В.М., Смирнова М.П., Сулейманова А.К., Шелепова Т.М.. Тимогексин - новый лекарственный препарат .содержащий синтетический регуляторный пептид, и клинико-иммунологические аспекты его применения при инфекционной патологии.// I Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". -Москва, 1992.- с.101.

30. Писарев В.М., Бакуридзе А.Д., Курцикидзе М.Ш.. Иммунокор-ригирующие свойства многокомпонентного фитоэкстракционного препарата при экспериментальном моделировании фармакологического и экологического иммунодефицита.// Ill межреспубликанская конференция по медицинской ботанике.-Киев, 1992.- с.109-110.

31. Кремлев С.Г., Писарев В.М., Лебедев В.В.. Модуляция экс-

прессии вспомогательных молекул межклеточного взаимодействия и синтез иммуноглобулинов.// I съезда иммунологов России.- Новосибирск,

1992.- с.251-252.

32. Plsarev V.M., Kremlev S.G., Lebedev V.V., Tutelyan A.V.. Modulation of immunoglobulin and tumor necrosis factor production by regulatory cells induced by synthetic hexapeptlde thymohexln -modified analog of thymopoietin.// VIII International Congress of Immunology.- Budapest, 1992.- p.271.

33. Курцикидзе М.Ш., Бакуридзе А.Д., Махарадзе P.В., Писарев В.М., Берашвили Д.Т., Ларин А.С., Иванова А.С., Тутельян А.В., Пев-ницкий А.В., Манько В.М.. Способ получения средства, обладающего иммуностимулирующей активностью.// А.с. N 179894.- 1992.

34. Plsarev V.M., Kremlev S.S., Lebedev V.V., Tutelyan A.V.. Isotype-specific regulatory cells of immunoglobulin production induced by immune system hormone thymopoietin.// Международный симпозиум по аллергологии и клинической иммунологии.- Алма-Ата, 1992.-с.246.

35. Писарев В.М., Лесков В.П., Талонов A.M., Кремлев С.Г., Тутельян А.В., Лешин А.А., Певницкий Л.А.. Механизмы фармакологической индукции клеток-регуляторов иммуногенеза и перспективы экстракорпоральной иммунофармакотерапии патологических состояний.// XI Республиканская научная конференция "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологическим и патологических состояниях".- Челябинск, 1992.-с.81.

36. Leskov V.P., Prosorovsky N.S., Plsarev V.M., Popov A.N.. Erythrocytes with membrane fixed recombinant interleukin-2 as the model of immunoregulatory cells.// VIII International congress of Immunonol.- Budapest, 1992.- p.235.

37. Баймукакова Г.К., Писарев В.М., Певницкий Л.А., Белозеров Е. С.. Система HLA как фактор риска в возникновении экологической иммунодепрессии.// Проблемы экологической медицины.- Алма-Ата,

1993,- с.46-47.

38. Лешин А.А., Писарев В.М., Кремлев С.Г., Лебедев В.В., Тутельян А. В.. Фактор некроза опухоли и возможности коррекции его продукции у больных с гнойно-септическими осложнениями терминальных состояний.// Анестезиология и реаниматология.- 1993.- п2.- с.38-40.

39.Певницкий Л.А., Ваймуканова Г.К., Писарев В.М., Лебедев В.В., Бакуридзе А.Д., Курцикидзе М.Ш.. Экологический имунодефицит:

иммунологические аспекты его развития и коррекции.// Вестник РАМН.-1994.-П4,- С. 20-28.

40. Pisarev V., LeoshlnA., Tutelyan А., DanilinaA., Kremlev S., Lebedev V. .Semienov V.. Septic Inflammation and control of TNF spontaneous production.// 12th. Eur. Immunol. Meeting.- Barselo-na,1994.- p.126.

41. Pisarev V..Volgina V., DanilinaA., Shmarina G., Tkacheva Т., Tutelyan A.. Modulation of corticosteroid-induced apoptosis in human lymphoid cells.//12th. Eur. Immunol. Meeting.- Barselo-na,1994.- p.220.

42.Pisarev v., Osna N.. Gaponov A., Danllina A., Tutelyan A., Pevnitzky L.. Pharmacological regulation of in vitro inflammatory cytokines production induced by hepatitis В virus cor and envelop antigen in acute and chronic viral hepatitis.// "Cytokins and gast-roenterol."- Falc. symp.- Freiburg, 1994.- p.31.

43. Gaponov A.M., Yudina S.M., Pisarev V.M., Nesterenko S.N.. Inflammation activity of monocytes under HBsAg influence.// International J. Immunoreabilitation.- 1994.- nl - p.119.

44. Yudina S.M., Pisarev V.M., Leskov V.P., Gaponov A.M.. Extracorporeal imunopharmacotherapy in the treatment of the hard secondary Immunodeficiency.// International J. Immunoreabi1itation.-1994.-nl, p.384.

45. Лебедев В. В., КремлевС.Г., Писарев В. М., Тутельян А.В.. Влияние синтетического регуляторного пептида тимогексина на продукцию различных классов иммуноглобулинов.// Еюлл. экспер. биол.-1994.- ШО.- с. 417-420.

46. Писарев В. М., Тутельян А. В. .Данилина А. В., КремлевС.Г., Ткачева Т.И., Лебедев В.В., Певницкий Л.А.. Механизмы ингибиции фактора некроза опухоли-альфа синтетическим гексапептидом - Имуно-фаном.// Вопросы мед. химии,- 1995,- п2.- с.

«Ш m.ldll ШЛг.