Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis"

На правах рукописи

Портнягина Ольга Юрьевну ^ ^ ^ ^

* М ДЕК 2X1 ,

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОРООБРАЗУЮЩЕГО БЕЛКА ИЗ НАРУЖНОЙ, МЕМБРАНЫ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биолотических наук

Владивосток 2000

Работа выполнена в Государственном учреждении Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии

наук.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

к.х.н., ст.н.с. Новикова О.Д. д.х.н., проф. Соловьева Т.Ф.

д.б.н., проф. Костецкий Э.Я. к.х.н., ст.н.с. Белогорцева Н.И.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится декабря 2000г. в 10 час на заседании диссертационного совета в ГУ ТИБОХ ДВО РАН 690022, г. Владивосток, Проспект 100-летия, 159.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН (Владивосток-22, Проспект 100-летия, 159, ДВГИ)

Автореферат 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н.:

Прокопенко Г.И. /

В ом. о

О

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Поверхностные белки наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий играют заметную роль в патогенезе инфекции: способствуют адгезии (и, возможно, инвазии) бактерий, влияют на характер иммунного ответа, обеспечивая устойчивость к фагоцитозу. Кроме того, они взаимодействуют с системой связывания комплемента и ингибируют продукцию лимфоцитов.

Неослабевающий интерес к этим белкам объясняются целым рядом их иммунологических особенностей. Во-первых, такие белки, как правило, характерны для данного рода или вида микроорганизма, т.е. являются иммунологическими маркерами. Во-вторых, они относятся к высокоиммуногенным компонентам микробных клеток, и определение антител к ним используется при диагностике инфекционных заболеваний. Кроме того, многие из поверхностных белков оказывают ярко выраженное протективное действие и поэтому могут служить основой при конструировании вакцинных препаратов.

Порины принадлежат к доминирующим в количественном отношении компонентам НМ и осуществляют жизненно важную функцию для микробной клетки. В нативной мембране они существуют в олигомерной форме, чаще всего в виде тримеров, которые образуют трансмембранные каналы для диффузии ниэкомолекулярных соединений, как питательных веществ, так и продуктов жизнедеятельности клетки. По своим физико-химическим свойствам порины представляют собой p-структурированные слабокислые белки, которые, в отличие от обычных интегральных белков, содержат значительное количество гидрофильных аминокислот.

В растворах изолированные порины могут существовать только в присутствии детергентов. При этом, благодаря высокой структурной пластичности молекулы, они могут образовывать различные конформационные интермедиаты. В литературе имеются ограниченные сведения об условиях образования, пространственной структуре и стабильности этих молекулярных форм белка. Тем не менее, получен целый ряд экспериментальных доказательств, свидетельствующих о том, что изменение конформации поринов приводит к изменению биологической активности этих белков.

Основной порообразующий белок НИ/1 Yersinia pseudotuberculosis, микроба, вызывающего заболевание лсевдотуберкулезом, обладает всеми вышеуказанными биологическими свойствами поверхностных антигенов бактериальной клетки. Выяснение взаимосвязи между пространственной структурой данного белка и его иммунобиологической активностью расширит представление о различных свойствах молекулярных форм поринов и позволит правильно оценить возможности практического использования этих белков в качестве диагностических антигенов и компонентов химических вакцин.

Иерсиниозы и, в частности, псевдотуберкулез, имеют большой удельный вес в инфекционной патологии человека. Доля псевдотуберклеза (или по международной классификации болезней - 10, экстраинтестинального

иерсиниоза) в инфекционной патологии населения нашей страны, и Дальневосточного региона в частности, в последние годы заметно увеличилась. При этом многообразие клинических форм, часто маскирующих псевдотуберкулеэ под другие заболевания (даже неинфекционной этиологии), осложняет его диагностику. Кроме того, она затруднена и за счет современных эпидемиологических особенностей возбудителя: в последние годы заболевание чаще всего протекает в виде спорадических случаев, а не носит характер эпидемических вспышек, регистрировавшихся ранее. Следует особо подчеркнуть, что большая часть болеющих псевдотуберкулезом - дети в возрасте до 14 лет. Они составляют более 65% от общего числа заболевших.

В этих условиях увеличивается значимость лабораторных методов верификации псевдотуберкулеза, что, в свою очередь, определяет устойчивое внимание исследователей к разработке новых иммунохимических методов лабораторной диагностики данного заболевания.

Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в изучении иммунобиологических свойств основного порообразующего белка из НМ псевдотуберкулезного микроба (иерсинина) и, на основе полученных результатов, выбора максимально эффективной молекулярной формы данного антигена для целей иммунодиагностики и вакцинопрофилакгики.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- выделить и охарактеризовать физико-химические свойства различных молекулярных форм порина;

- сравнить антигенную структуру, иммуногенные и протективные свойства стабильных информационных интермедиатов иерсинина;

- сконструировать высокоэффективную диагностическую тест-систему на основе порина для дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза.

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное исследование иммунобиологических свойств различных молекулярных форм основного порообразующего белка НМ Yersinia pseudotuberculosis. Установлено, что порин является видо- и родоспецифическим антигеном рода Yersinia. Продемонстрирована высокая иммуногенная и протективная активность термоденатурированной мономерной формы порина по сравнению с олигомерами белка, представляющими собой частично развернутые молекулы с нестабильной третичной структурой. На основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) при использовании в качестве антигена термоденатурированного мономера разработана эффективная диагностическая тест-система, позволяющая достоверно идентифицировать псевдотуберкулеэ на ранних стадиях развития инфекции.

Теоретическая значимость работы

Полученные данные вносят вклад в изучение взаимосвязи между структурой и биологической активностью одного из интегральных мембранных белков грамотрицательных бактерий, а также в исследование роли поринов на ранних стадиях развития инфекции и в инициировании клеточных и

гуморальных защитных механизмов макроорганизма.

Практическая значимость работы

Разработана новая видоспецифическая иммуноферментная тест-система для определения антител в сыворотках крови больных с использованием в качестве антигена термоденатурированного мономера порина, наиболее стабильной по своим физико-химическим характеристикам и эффективной для защиты животных от экспериментальной инфекции молекулярной формы белка.

На способ диагностики псевдотуберкулеза Российским агенством по патентам и товарным знакам выдан патент на изобретение «Способ диагностики псевдотуберкулеза» №2153172. По материалам разработки оформлены Методические указания МУ 3.1.1.001-98 «Определение антител в сыворотках людей методом ИФА для диагностики псевдотуберкулеза», предназначенные для сотрудников диагностических, иммунологических и биохимических лабораторий, врачей инфекционистов общей поликлинической и лечебной сети. Данные методические указания утверждены решением комиссии по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Центре Госсанэпиднадзора в Приморском крае от 28.06.98. и разрешены к применению на территории Приморского края.

Разработан новый метод получения данного антигена, пригодный для наработки препарата порина в условиях опытного производства.

Основные положения работы доложены на:

• 2-ой Всесоюзной научно-практической конференции «Иерсиниозы», Владивосток, 1989 г;

• 5-th International Symposium on Yersinia, Japan, 1990;

• 9-th European Symposium on animal, plant and microbial toxins, Tallinn, 1990;

• 8-th Conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry, Riga, 1991;

• 3-th German-Russian Work-shop on Biotechnology, Berlin, 1994;

• 5-ом Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике, Москва, 1995;

• 6-ом Русско-Японском медицинском симпозиуме, Хабаровск, 1998;

• 19-th Pacific Science Congress, Sidney, 1999.

Материалы диссертации изложены в 6 научных статьях, патенте на изобретение и 9-ти тезисах докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 90 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), материалов и методов исследования (1 глава), результатов и их обсуждения (9 глав), выводов, списка цитируемой литературы и приложения.

Положения выносимые на защиту

1. В изолированном виде иерсинин может существовать в олигомерной и мономерной формах, отличающихся пространственной организацией белковой молекулы.

2. Олигомер и мономер иерсинина имеют различную антигенную структуру и отличаются по своим иммуногенным ипротективным свойствам.

3. Иммуноферментная тест-система для диагностики псевдотуберкулеза позволяет эффективно и достоверно выявлять в сыворотках крови больных антитела к возбудителю заболевания на ранних стадиях развития инфекционного процесса.

Результаты исследования и их обсуждение

Получение иерсинина из НМ У. pseudotuberculosis.

Для получения иерсинина использовали два метода. Первый метод заключался в том, что фракцию клеточных оболочек псевдотуберкулезного микроба, полученную после механической дезинтеграции клеток, экстрагировали тритоном Х-100, избирательно растворяющим белки цитоплазматической мембраны. После этого остаток клеток экстрагировали 2% раствором додецилсульфата натрия (ДСН) при температуре 45-50°С для получения комплекса пептидогликана (ПО и ассоциированных с ним белков НМ.

Порины грамотрицательных бактерий в НМ настолько прочно связаны с ПГ, что комплекс ПГ-белок разрушается только с помощью детергентов при нагревании выше 70°С (Rosenbusch,1974) либо в присутствии высоких концентраций NaCI (Reithmeier, Bragg, 1977). При диссоциации ПГ-белкового комплекса изолированный иерсинин получали в двух молекулярных формах: олигомерной (тример) и мономерной с кажущимися молекулярными массами 110-120 кДа и 33,5 кДа соответственно. Эти полипептиды являются термолабильными формами белка, т. е. они способны изменять свою электрофоретическую подвижность после нагревания выше критической температуры. Для иерсинина критической температурой является 50°С. При этой температуре начинается процесс денатурации белка, происходящий в интервале от 50° до 70°С. Он сопровождается уменьшением электрофоретической подвижности белка. Нагревание раствора иерсинина выше 70° С в течение 5 минут приводит к переходу обеих форм иерсинина в термоденатурированный мономер с молекулярной массой 40 кДа.

Второй альтернативный метод выделения иерсинина базируется на устойчивости данного белка к трипсину. Основной стадией получения порина является инкубация с данным ферментом обработанных ЭДТА и лизоцимом клеточных оболочек У. pseudotuberculosis в растворе тритона Х-100, которая приводит к расщеплению основного количества белков НМ. Далее иерсинин осаждают при подкислении раствора до рН 5.0 и добавлении NaCI до конечной концентрации 0,5 М. В этом случае иерсинин выделяли преимущественно в виде тримера.

Дальнейшую очистку иерсинина от сопутствующих белков и липополисахарида (ЛПС) проводили гель-хроматографией на сефакриле S-300 в присутствии детергента. Два цикла гель-хроматографии позволяют получить образцы иерсинина, содержащие 70-75% белка и не более 7% ЛПС.

Молекулярные формы иерсинина, полученные с помощью вышеописанных способов, были названы нами: И-1 - тример иерсинина, полученный диссоциацией комплекса ПГ-белск в присутствии ДСН, И-И -тример иерсинина, полученный при расщеплении лизоцимом слоя ПГ, И-Ш -мономер иерсинина, И-1\/-термоденатурированный мономер иерсинина.

Полученные молекулярные формы порина были использованы для изучения конформационных изменений, происходящих при выделении иерсинина под воздействием различных денатурирующих факторов (детергентов и температуры) с помощью физико-химических (спектроскопия КД, собственная белковая флуоресценция, седиментационный анализ) и иммунохимических (иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблоттинг (ИБ)) методов.

По данным электрофореза в полиакриламидном геле (ДСН, ПААГ-электорофореза) оба тримера иерсинина, И-1 и И-И, были индивидуальны. Однако они отличались по своему злектрофоретическому поведению. В случае И-! в области молекулярных масс, соответствующих тримеру белка (110-120 кДа), полипептадная зона была диффузной. Для И-ll, напротив, в этой области характерно наличие 1-3 полос. Наблюдаемая на фореграммах множественность полос свойственна и поринам из других бактерий и вызвана присутствием в белках связанного ЛПС (Schweizer, Hindennachetal., 1978).

Методом аналитического центрифугирования (с помощью скоростной седиментации), для И-l была выявлена гетерогенность по молекулярной массе. На седиментограмме наряду с основным пиком с коэффициентом седиментации 7,6 S обнаружены небольшие пики с коэффициентами седиментации 5,2 S и 2,6 S. Согласно этим данным, в процессе выделения И-1 подвергается частичной диссоциации.

Напротив, И-И в этих же условиях был гомогенен и имел коэффициент седиментации 7,2 S. Указанное значение коэффициента седиментации для И-II близко к величине, полученной для тримерной формы порина из E.coli (Chen, Kramer et al., 1979).

Спектры КД И-l и И-ll в диапазоне длин волн 190-250 нм (рис.1, а и б) заметно отличаются. Они имеют различные максимумы отрицательных и положительных полос и значение молярной эллиптичности, равное 0 (8=0) при разных длинах волн. Форма спектров свидетельствует о высоком содержании ß-структуры в обоих белках.

Данные расчета содержания элементов вторичной структуры по методу Провинчера (табл.1) подтвердили выводы, сделанные на основе качественного анализа формы спеюров. Как видно из таблицы, вторичная структура И-ll характеризуется высоким содержанием участков с параллельными ß-складчатыми слоями, небольшим количеством участков с неупорядоченной конформацией и отсутствием а-спирали. Тример И-1, помимо p-структурированных участков, доля которых меньше, и неупорядоченных сегментов, доля которых больше, содержит в полипептидной цепи а-спиральные звенья.

В ароматической области КД-спектров исследуемых белков видна тонкая третичная структура (рисунок не приведен) с некоторыми различиями в положении и амплитуде полос. Сравнительный анализ показал, что И-1 обладает менее фиксированной третичной структурой, нежели И-ll, что, по-видимому, обусловлено ослаблением некоторых внутримолекулярных связей в белке, произошедшим под действием ДСН в процессе выделения.

Рис.1. Спектры КД тримеров иерсинина И-1 (а) и И-И (б). Спектры сняты при 24° С (1,3) и после предварительного нагревания до 90° С (2,4).

Табл. 1. Содержание элементов вторичной структуры в образцах иерсинина.

Образец иерсини на, в 0,1% ДСН а- спираль,% Р- структура,% Р- изгиб,% Неупорядо ченная структура, % Флуоресцен ция А'Макс (НМ) ПРИ ^еоэб 280нм 296НМ

И-1 12 53 21 14 322 330

И-11 0 66 19 15 328 331

И-111 • 12 48 21 19 327 328

И-1У ' 23 43 14 20 315 337

Положения максимумов спектров суммарной флуоресценции И-1 и И-11 различаются: для И-И оно находится при 328 нм, для И-1 - при 322 нм. Известно, что коротковолновое положение максимумов спектра (320-330 нм) так же, как и высокие значения квантовых выходов флуоресценции, указывают на то, что значительное число остатков триптофана локализовано в участках белковой молекулы со сравнительно малой подвижностью и недоступных молекулам воды. Следовательно, для тримеров иерсинина в растворе характерно полное экранирование остатков триптофана от молекул растворителя. Поскольку И-11 имеет более компактную глобулу, смещение

максимума спектра излучения в случае И-1 в сторону эмиссии тирозина можно считать признаком частичной денатурации. Как правило, такое явление обусловлено тем, что увеличивается расстояние между остатками тирозина и триптофана и, в связи с этим, наблюдается уменьшение или прекращение передачи энергии возбуждения с тирозина на триптофан.

Параметры спектров флуоресценции триптофана обоих исследуемых белков приведены в таблице 1. Несмотря на отмеченные выше различия в третичной структуре И-1 и И-И, микроокружение остатков триптофана у них одинаково, судя по положению максимумов спектров флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 296 нм.

Таким образом, установлено, что олигомеры иерсинина в растворах ДСН представляют собой р-структурированные белки с достаточно стабильной по отношению к температуре и детергенту вторичной структурой. Однако олигомер иерсинина, экстрагированный первым способом (И-1), имеет менее стабильную третичную структуру по сравнению с порином, полученным вторым методом (И-П). И-1, скорее всего, представляет собой частично денатурированную форму белка.

После нагревания растворов олигомеров белка до 90°С и последующего охлаждения его до 24°С, т.е. при переходе И-1 и И-П в И-1\/, в спектре КД появляется новая отрицательная полоса при 208 нм и наблюдается небольшое увеличение эллиптичности при 220 нм (рис.1, а и б). Данные расчета содержания элементов вторичной структуры по методу Провинчера (табл.1) свидетельствуют о существенном увеличении в полипептидной цепи иерсинина доли а-спиральных участков (до 23%) за счет уменьшения содержания р-структур различного типа.

Как видно из таблицы, для спектра флуоресценции И-1\/ характерен коротковолновый сдвиг (максимум суммарной эмиссии белка после нагревания наблюдается при 315 нм т.е. смещен в сторону эмиссии тирозина), что, как было указано выше, свидетельствует о реорганизации нативной структуры белка.

При возбуждении только остатков триптофана (/^оэ5 296 нм) полоса флуоресценции в спектре иерсинина после нагревания (И-1\/) имеет максимум при 337 нм. Это означает, что в результате температурной денатурации в растворе детергента остатки триптофана становятся более доступны растворителю. Приведенное выше значение максимума в спектре триптофановой флуоресценции иерсинина можно рассматривать как признак денатурированного мономера. Очевидно, что по отношению к третичной структуре иерсинина температура является более существенным денатурирующим фактором по сравнению с детергентом.

Совокупность полученных данных позволяет сделать следующие выводы. В результате воздействия денатурирующих факторов при выделении и диссоциации иерсинина происходят различные по глубине изменения на всех уровнях структуры порина (вторичной, третичной и четвертичной). Для мономерных форм иерсинина (И-Ш, И-1\/) характерно существенное ослабление внутримолекулярных связей на уровне третичной структуры белка. При этом в содержании элементов вторичной структуры белка не наблюдается радикальных изменений. Сохраняется характерное для порина соотношение элементов вторичной структуры белка: 60-85% обоих типов р-структуры и 0-23% а-спирали. Увеличение содержание а-слирали наблюдается только при одновременном воздействии на иерсинин повышенной температуры и ионного детергента (ДСН).

Иммунохимические свойства иерсинина

Наличие в нашем распоряжении изолированных тримеров иерсинина И-1 и И-Н, отличающихся пространственной организацией молекулы, а также мономерных форм белка с различной степенью денатурации (И-111 и И-1У), позволили нам проследить за изменением антигенной структуры и иммунобиологических свойств различных конформеров иерсинина при изменении конформационного состояния и физико-химических характеристик данной макромолекулы.

Иммуногенные свойства иерсинина.

Обнаружено, что основной порообразующий белок в ряду поверхностных белков псевдотуберкулезного микроба принадлежит к числу иммунодоминантных антигенов НМ. Так, при иммунизации мелких и крупных лабораторных животных бактериями псевдотуберкулеза в сыворотках крови обнаружены антитела к иерсинину. Следует особо отметить, что у обезьян при экспериментальной инфекции и у людей при естественном развитии заболевания антитела к порину преобладают (рис.2).

При иммунизации кроликов изолированным иерсинином (как тримером, так и мономером) наблюдалось образование специфических антител с титрами в пределах от 1:25600 до 1:102400.

аа бб ввгг

Рис. 2. Иммуноблоттинг сывороток: а - белых мышей, б - морских свинок, инфицированных культурой штамма 680 У. pseudotuberculosis; в - павиана-гамадрила, г - человека, переболевших псевдотуберкулезом. На дорожки нанесены препараты: 1 - термоденатурированный мономер ирсинина (И-IV), 2 -лизат культуры клеток штамма 680 Y. pseudotuberculosis.

Антигенная структура молекулярных форм (тримера и мономера) иерсинина

Одним из методов изучения антигенной структуры белков является постепенное разрушение присущей данному белку нативной структуры

уменьшается количество антител, специфичных к олигомерной форме белка (т.е. к «информационным» детерминантам) и возрастает количество антител, специфичных к мономеру (т.е. к «составным» детерминантам) (рис. 7).

О -1-1-^--1--1-1-1--1

О 3 б 9 12 15 18 21 24

дшзабзракряи

Рис.7. Динамика изменения специфичности антител у мышей линии ВА1.В/С. 1- Взаимодействие сыворотки, полученной при иммунизации 100 мкг И-1 с антигеном И-1.2- Взаимодействие той же сыворотки с антигеном И-1\/.

Эти данные в определенной степени согласуются с результатами исследования сывороток больных псевдотуберкулезом людей на разных стадиях развития инфекции. Так, использование И-1 и Й-1У в качестве антигенов для анализа сывороток методом ИБ позволило выявить изменения в качественном составе специфических антител к иерсинину в течение болезни. В первую неделю заболевания в сыворотках крови выявлены антитела к обеим молекулярным формам белка (рис.8). В более поздние сроки заболевания в сыворотках крови обнаружены антитела только к мономерной форме иерсинина.

Рис.8 Иммуноблоттинг белковых фракций псевдотуберкулезного микроба с сыворотками крови больных людей, взятыми на 7-й (а и б) и 21 (в и г) дни заболевания. На дорожки нанесены препараты: а,в - тример иерсинина И-1, б,г - мономер иерсинина И- IV.

Иерсинин - видо- и родоспецифический антиген рода Yersinia.

С помощью ИФА при исследовании типовых кроличьих антисывороток к различным сероварам возбудителя псевдотуберкулеза (I-VI) (рис.9) была доказана видоспецифичность иерсинина. В качестве антигена использовали термоденатурированный мономер иерсинина И-IV. Сравнение кривых титрования сывороток показало, что во всех исследованных антисыворотках присутствуют антитела к порину : ход кривых титрования совпадает, титры отличаются не более, чем на одно разведение, за исключением гомологичной антисыворотки (к \ В серовару). Последняя имеет более высокий конечный титр по сравнению с гетерологичными антисыворотками (ко II-VI сероварам). Этот результат нельзя объяснить только присутствием ЛПС в образцах порина, поскольку было показано, что ЛПС в соответствующей концентрации взаимодействует с исследуемыми сыворотками на уровне фона.

Также было установлено антигенное родство иерсинина и порообразующих белков некоторых видов иерсиний. Показано, что иерсинин реагирует с сыворотками к бактериям Y.enterocolitica (проверено 6 сероваров), а также с сыворотками к Y.kristenseníi ( 4 серовара), У. intermedia (1 серовар), Y.frederiksenii (1 серовар) (рис.10). Для подтверждения вывода о родоспецифичности иерсинина был проведен иммуноблоттинг кроличьих антисывороток пяти видов микроорганизмов рода Yersinia с иерсинином и фракцией белков наружной мембраны псевдотуберкулезного микроба. Анализ иммуноблотов показал, что во всех указанных антисыворотках содежатся антитела к порину (рис. 11).

При исследовании взаимодействия иерсинина с антителами к другим микроорганизмам сем. Bnterobacteriaceae обнаружен значительно более низкий уровень перекрестных реакций. В эксперименте мы использовали набор стандартных кроличьих антисывороток к сальмонеллам (S. typhimurium, S. paratyphi S, S. anatum, S. enteritidis, S. cholerae-suis, S. heidelberg) и шигеллам ( Sh. flexneri, Sh. sonnei, Sh. dyzenteridae), возбудителям, вызывающим кишечные заболевания. Перекрестные реакции наблюдались лишь с антисыворотками к Sft. ñexneri, Sh. sonne/, S. cholerae-suis (рис.12).

1.1СШ)

I 12Э0СО

I 1.64D

i песо s

1.400 1.100

Рис.9. Результаты исследования кроличьих антисывороток к различным (I-VI) сероварам У.рвеисМиЬегси/ОБ/з (2-7) с помощью ИФА на основе иерсинина; 1 - антисыворотка к иерсинину И-1\/. Антиген И-1\/ из I серовара Y.pseudotubercuiosis.

1.102« 125000 16400 1.1600 1400 1:100

1 2 3 <

Рис.10. Результаты исследования кроличьих антисывороток к различным представителям рода Yersinia; антиген - иерсинин И-IV. 1-6. Y.enterocolitica (3;5;6;8;6.30;6.31 серовары), 7-10. Y.kristensenii ( 16f;28d;11.246c;12.25e серовары), 11. У. intermedia (17 серовар), 12. Y.frederiksenii (5 серовар), 13. Иерсинин И-IV. Антиген-И-IV из I серовара Y.pseudotuberculosis

t H«ipi!ii

I» ?т ;<r ?>■ 5r 4* 4т 4»/7 5>r

" t ± ii v i :s a, *

5, ~ f\ % >

Jk

Рис.11. Иммуноблоттинг сывороток кроликов, иммунизированных: а -мономерной формой порина И-IV; б - фракцией белков наружной мембраны Y.pseudotuberculosis. Электрофореграмма лизатов клеток из Y.intermedia (1), Y.enterocolitica (2), Y.kristensenii (3), Y.frederiksenii (4), Y.pseudotuberculosis (5). Микроорганизмы выращены при 4 °С ("холодный" вариант-Х) и 37 0 С ("теплый" вариант-Т).

1:102400

1:25600

1:6400

1:1600

1:400

1:100 1-7» r~i

ПН

2 3

4 5 6 7 8 8 10 11 12

Рис.12. Результаты исследования кроличьих антисывороток к различным представителям семейства Enterobacteriaceae. Антиген - И-IV из I серовара Y.pseudotuberculosis. 2- Shigella fiexneri , 3- S. sonnei, 4- Salmonella ABCD, 5- S. typhimurium, 6- S. paratyphi B, 7- S. paratyphi A, 8- S. anatum, 9- S. enteritidis, 10-S. heideiberg 11- S. cholerae-suis, 12- E. coll.

Протективные свойства иерсинина^

Одним из важнейших направлений исследований микроорганизмов рода Yersinia является разработка средств специфической профилактики кишечных заболеваний, вызываемых этими бактериями. Нами было проведено сравнение протективной активности двух молекулярных форм иерсинина (И-l и И-IV) в отношении белых мышей и морских свинок при инфицировании их возбудителями псевдотуберкулеза 1-го и Ill-го сероваров.

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что двукратная иммунизация животных препаратами иерсинина индуцировала формирование у них специфического иммунитета, причем мономерная форма И-IV оказалась эффективнее тримерной И-1.

При двукратном введении 12,5 мкг иерсинина морским свинкам индекс резистентности (ИР) для И-l был значительно выше, чем для И-IV: в 3 раза при заражении культурой У. pseudotuberculosis 1-го серовара и в 2 раза при заражении возбудителем псевдотуберкулеза Ill-го серовара (табл.3).

В связи с тем, что иерсинин является родоспецифическим антигеном, представляло интерес проверить защитные свойства иерсинина при заражении животных культурой другого представителя рода Yersinia - У. pesf/s. Однако двукратная иммунизация белых мышей и морских свинок препаратами иерсинина оказалась неэффективной при заражении мышей возбудителем чумы (табл.4).

Изучение воздействия иерсинина на клетки макроорганизма (In vitro) показало, что иммунизация животных (белых беспородных мышей) иерсинином увеличивала количество макрофагов, участвующих в фагоцитозе (ФП) при взаимодействии бактерий псевдотуберкулеза 1-го и 111—го сероваров с перитонеальными макрофагами. На плазмалемме макрофагов иммунных животных адсорбировалось больше бактерий, чем на клетках неиммунизированных мышей, усиливалась поглотительная и переваривающая активность макрофагов (Р < 0,01).

Табл. 2. Протективнооть препаратов иерсинина в отношении возбудителя псевдотуберкулеза (штамм 147,1 серовар), при подкожном заражении.

Расчетная величина показателя

Группа животных для ДЛЯ

белых мышей ИР морских свинок ИР

Иммунизированные двукратно И-1 33394х: 1,8 63,9 1824*. 1,4 2,6

Иммунизированные двукратно И-IV 93407х 1,5 178,6 291х 1,7 0,42

Контроль 523М ,4 1,0 700х:! ,5 1,0

Табл. 3. Протективнооть препаратов иерсинина в отношении возбудителя псевдотуберкулеза (штамм 326, III серовар), при подкожном заражении.

Расчетная величина показателя

Группа животных ДЛЯ ДЛЯ

белых мышей ИР морских свинок ИР

Иммунизированные двукратно И-1 157233": 1,6 15,6 149,72х:!,6 3,6

Иммунизированные двукратно И-IV 322100х: 1,3 32,0 Збб1:1 ,4 0,08

Контроль 10062х1,4 1,0 4188*1,5 1,0

Таблица 4. Протективнооть препаратов иерсинина в отношении возбудителя чумы(штамм 1300), при подкожном заражении.

Расчетная величина показателя

Группа животных для для

белых мышей ИР морских свинок ИР

Иммунизированные двукратно И-1\/ 9*1,5 1,1 7Х:1 ,3 0,8

Иммунизированные двукратно И-I 8*1,3 1,1 6*1,4 0,7

Контроль 7*1,2 1,0 8х 1,5 1,0

По данным световой микроскопии макрофаги иммунных животных поглощали в течение первого часа взаимодействия значительно большее количество бактерий, чем клетки неиммунных мышей. Микроорганизмы, поглощенные макрофагами от иммунных животных, переваривались быстрее, чем в клетках контрольной группы. Через 8 часов в макрофагах иммунных мышей количество внутриклеточных бактерий уменьшалось в 8-10 раз и лишь в 3-4 раза в клетках неиммунных животных. Жизнеспособные

внутриклеточные бактерии обнаруживались через 48 часов

после начала эксперимента, однако в макрофагах иммунных животных их было примерно в 100 раз меньше по сравнению с контролем. Следовательно, иммунизация животных иерсинином вызывает достоверное усиление активности макрофагов, их способности адсорбировать, поглощать и переваривать бактерии псевдотуберкулеза.

Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует о том, что иерсинин при введении лабораторным животным индуцирует формирование у них специфического протекгивного иммунитета, что позволяет рекомендовать его в качестве компонента химической вакцины.

Участие иерсинина в патогенезе псевдотуберкулеза

Для исследования роли поринов на ранних стадиях развития инфекции были использованы различные экспериментальные модели in vivo и in vitro. Продемонстрирована выраженная биологическая активность иерсинина по отношению к эпителиальным клеткам Rh329. В эксперименте были использованы две молекулярные формы иерсинина (И-l и И-IV). Установлено, что обработка монослоя клеток иерсинином способствовала усилению адсорбции и инвазии бактерий в клетки, при этом тример иерсинина был более активен по сравнению с мономером (табл.5).

Таблица 5. Показатели адсорбции и инвазии псевдотуберкулезного микроба в эпителиальные клетки после обработки их иерсинином.

Препарат иерсинина Доза, мкг белка % инфицированных клеток Логарифм числа проникших в клетки бактерий (М± гп)

И-IV 25 65 ¿3,2 3,38 ±0.178

И-1 25 98 ±1,5 5,07 ±0,3

Y. pseudotuberculosis 1179-83 (контроль) 32,5 + 1,5 2,8 ±0.25

В опытах in vitro было установлено, что иерсинин оказывает токсическое действие на клеточные культуры тканей человека. Клетки кишечника эмбрионов человека (КЭЧ) оказались особенно чувствительны к действию порина: эффект развивался под действием больших доз иерсинина (100-200 мкг) в течение 24 часов. Обработка клеток КЭЧ иерсинином в дозе 100 мкг, вызывала вакуолизацию цитоплазмы и округление части клеток при сохранении монослоя, такие изменения становились видны уже через 6 часов после обработки. Через 24 часа наблюдалось сползание монослоя и резкая деградация оставшихся клеток.

Парентеральное введение иерсинина в дозе 100 мкг на мышь, одновременно с заражением культурой У. pseudotuberculosis 3 серовара штамм 251 7 в дозе 105 клеток, вызывало гибель от 20 до 60% животных в течение 7 суток независимо от схемы иммунизации. Причем гибель животных в опытных группах начиналась раньше (2-е сутки), чем в контрольной группе (5-е сутки). Стремительное развитие инфекции в этом случае свидетельствует о стимулирующем действии иерсинина на развитие инфекции, возможно за

о стимулирующем действии иерсинина на развитие инфекции, возможно за счет дегенеративных изменений клеток.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что порин НМ псевдотуберкулезного микроба усиливает адгезию и инвазию бактерий в клетки. Можно предположить, что под влиянием этого антигена происходят изменения в рецепторах эукариотической клетки, которые делают ее более чувствительной к воздействию бактерий псевдотуберкулеза. Сходное действие порообразующего белка на эпителиальные клетки и макрофаги свидетельствует об общности механизмов узнавания псевдотуберкулезного микроба этими двумя типами клеток (так называемых профессиональных и непрофессиональных фагоцитов).

Тест-система для диагностики псевдотуберкулеза

При конструирование диагностической тест-системы требуется соблюдение следующих условий. Необходимо выбрать антиген с помощью которого наиболее полно и воспроизводимо может быть определено наличие специфических антител в биологических жидкостях. Необходимо подобрать концентрацию антигена, концентрацию антивидовых антител, время сорбции компонентов тест-системы на планшет, выбрать реагент для блокирования неспецифического связывания, определить диагностический титр исследуемой сыворотки.

Термоденатурированный мономер иерсинина, отличающийся конформационной стабильностью, оказался наиболее подходящим антигеном для тест-системы. Условия проведения анализа были подобраны на кроличьих сыворотках: а) концентрация порина-2,5-5 мкг; б) сенсибилизация планшетов в течение 2 часов при 37° С; в) блокирование неспецифического связывания 0,1% раствором медицинского желатина в течение 16 часов при 4° С. За минимальный диагностический титр в ИФА было принято разведение сыворотки 1:800.

При апробации разработанной тест-системы для диагностики псевдотуберкулеза были исследованы 114 сывороток взрослых больных с характерными клиническими проявлениями (в том числе: 46 сывороток от больных с бактериологическим подтверждением диагноза) и 79 индивидуальных донорских сывороток. Кроме того, учитывая выраженный полиморфизм псевдотуберкулезной инфекции, при апробации тест-системы были исследованы 64 образца сывороток крови больных другими инфекционными заболеваниями непсевдотуберкулезной этиологии (иерсиниоз-26, сальмонеллез-18, вирусный гепатит-20).

Сравнительное исследование сывороток крови 3-х групп людей, с бактериологически подтвержденным диагнозом «псевдотуберкулез» (1-ая группа), с заболеваниями непсевдотуберкулезной этиологии (2-ая группа), здоровых доноров (3-я группа), показало достаточно высокую специфичность ИФА тест-системы с использованием в качестве антигена лорина из внешней мембраны псевдотуберкулезного микроба. Несмотря на то, что сыворотки больных иерсиниозом и сальмонеллезом взаимодействовали с порином, в диагностических разведениях значения ОП псевдотуберкулезных сывороток в среднем почти в 3 раза выше.

При сравнении статистически достоверных результатов серологического обследования больных псевдотуберкулезом с помощью предлагаемой тест-системы и реакции непрямой гемаггпютинации (РИГА) на основе

коммерческого типоспецифического ди агн ости кум а использовали

сыворотки крови больных с бактериологически подтвержденным диагнозом. Оказалось, что эффективность ИФА почти в 2 раза выше. Так, с помощью РИГА положительная реакция обнаружена только в 52% случаев, а с помощью ИФА - в 98% (рис.13). Причем при использовании коммерческого диагностикума заболевание не выявлялось именно в тех случаях, когда возбудители псевдотуберкулеза принадлежали к III и IV сероварам.

100 90 80 . 70 60

50 «

30

та ю о

дшгегьнссъ забапеетн«, неде™

Рис.13 Сравнительная эффективность ИФА на основе иерсинина и РИГА на основе коммерческого диагностикума в различные сроки заболевания.

При обследовании сывороток крови здоровых доноров с помощью разработанной тест-системы у 13% людей обнаружена положительная реакция на псевдотуберкулез. Этот результат коррелирует с наблюдениями некоторых авторов (Багрянцев, 1985) о том, что в регионах с постоянно циркулирующим возбудителем заболевания общий фон уровня антител в крови местных жителей выше, чем в целом по стране.

При изучении возможности использования данной тест-системы для диагностики псевдотуберкулеза у детей было проанализировано 380 сывороток, полученных из детского инфекционного отделения Городской клинической больницы № 2 г. Владивостока. Все сыворотки также были разделены на четыре группы: сыворотки от больных с предварительным (не подтвержденным бактериологически) диагнозом «псевдотуберкулез» - 218 (1-ая группа); сыворотки от больных с заболеваниями, сходными по клиническим признакам с псевдотуберкулезом - 102 (2-ая группа); сыворотки от больных с заболеваниями некишечной этиологии (энурез, инфекции мочевыводящих путей) - 38 (3-я группа); сыворотки от практически здоровых детей - 22 (4-ая группа). Диагноз для некоторых больных из 2-ой группы был подтвержден данными бактериологического (сальмонеллез, дизентерия) и биохимического (гепатит) анализов.

С помощью разработанной нами тест-системы у 88 больных (67%) из 1-ой группы был подтвержден предварительный диагноз. Для сравнения эффективности методов ИФА и РИГА при диагностике псевдотуберкулеза 33 сыворотки этой же группы были проверены в РИГА с типовым коммерческим диагностикумом. Положительные значения (в разведении 1:50 - 1:200) в этой реакции имели 24 сыворотки (72%), тогда как с помощью ИФА положительный результат (при диагностическом разведении сыворотки 1:800) был

зафиксирован в 29 случаях (91%). У больных из 2-ой группы положительная реакция была отмечена в 58 случаях (57,4%), при этом не было зафиксировано ни одного положительного результата для больных, имеющих бактериологическое подтверждение диагноза (сальмоннелез и дизентерия). У 14 человек из 3-ей группы (36,8%) обнаружены антитела к порину из псевдотуберкулезного микроба.

Положительные реакции у детей из 2-ой (гепатит) и 3-ей (энурез) групп представляли особый интерес. В этом случае для подтверждения специфичности предлагаемой тест-системы был использован метод ИБ. Сыворотки детей больных гепатитом (рис.14,А) и энурезом (рис.14,Б) сравнивали с сывороткой больного, у которого диагноз «псевдотуберкулез» был подтвержден бактериологически. Как показали результаты ИБ, в сыворотках указанных больных обнаружены антитела к порину из У. рзеибоФегсШоБ/Б. В связи с этим можно предположить, что дети были инфицированы возбудитлем псевдотуберкулеза на фоне основного заболевания.

В 4-ой группе положительных реакций не обнаружено, в отличие от сывороток крови взрослых здоровых доноров. Отсутствие положительных результатов среди здоровых детей можно объяснить только возрастными особенностями развития детской иммунной системы.

сЬ

ей

и-1У

Рис.14. А. Иммуноблоттинг сывороток крови больных: а,-псевдотуберкулеэом; б.-гепатитом А; в.-гепатитом В. Б. Иммуноблотинг сывороток крови больных: а.-энурезом; б.-псевдотуберкулезом.

В особую группу были выделены больные с известным сроком заболевания. Наибольшее количество положительных результатов в этой группе (57% - у взрослых и 77% - у детей) было отмечено в первые 10 дней от начала заболевания. Следовательно, использование предлагаемой тест-системы в первую декаду от начала проявления клинических признаков заболевания наиболее эффективно.

Новый способ получения иерсинина

Для обеспечения потребностей клинических лабораторий в тест-системах для диагностики 'псевдотуберкулеза необходимо увеличить производство антигена и сделать возможным его наработку на технологических установках в условиях опытного производства. Главной задачей усовершенствования способа получения антигена стало исключение длительных по времени и требующих дорогостоящего оборудования стадий выделения белка.

Основой разработанного нами метода стала последовательная экстракция целых микробных клеток вместо клеточных оболочек, получение которых требует механической дезинтеграции. Показано, что саркозилат натрия избирательно извлекает низкомолекулярные белки, загрязняющие иерсинин при обычном способе выделения. Экстракция клеток саркозилатом натрия перед выделением комплекса ПГ-белок позволяет получить индивидуальный белок, не требующий очистки с помощью гель-хроматографии (рис. 15).

12 3 4

Рис.15 Электрофорез белковых фракций на различных стадиях выделения иерсинина. 1.-Низкомолекулярные белки, извлекаемые раствором саркозилата натрия, 2.-Иерсинин и примесные белки в супернатанте после осаждения комплекса ПГ-белок, 3.-Иерсинин, полученный обычным способом, перед очисткой геЛь-хроматографией, 4.-Иерсинин, полученный новым способом.

Выводы

1. Выделены и охарактеризованы различные молекулярные формы иерсинина. Показано, что олигомеры белка представляют собой частично развернутые молекулы с нестабильной третичной структурой. Для вторичной структуры иерсинина, которая сохраняется в различных денатурирующих условиях, характерно преобладание.

2. У иерсинина выявлено наличие двух типов антигенных детерминант:

«конформационные», формирующиеся на уровне четвертичной структуры белка, и «составные», которые определяются аминокислотной последовательностью белка и его вторичной структурой.

3. Индукция антител к иерсинину имеет волнообразный характер, типичный для белковых антигенов и зависит от дозы вводимого препарата и молекулярной формы белка. В процессе формирования иммунного ответа к иерсинину уменьшается количество антител, специфичных к «конформационным» детерминантам, и возрастает количество антител к «составным» детерминантам.

4. Иерсинин является протективным антигеном, участвующим в обеспечении гуморальных и клеточных факторов защиты макроорганизма.

5. Показано, что иерсинин участвует в патогенезе псевдотуберкулезной инфекции, способствуя увеличению адгезии и инвазии бактерий псевдотуберкулеза в клетки.

6. Иерсинин является родо- и видоспецифическим антигеном, дающим в иммуноферментном анализе низкий уровень перекреста с другими представителями семейства Enterobacteriaceae.

7. Обнаружено, что по своим свойствам термоденатурированный мономер иерсинина является наиболее подходящим антигеном для целей иммунодиагностики и вакцинопрофилапши.

8. На основе иммуноферментного анализа с использованием термоденатурированного мономера иерсинина в качестве антигена разработана новая видоспецифическая тест-система для определения антител в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом.

9. Разработан новый, упрощенный метод выделения термоденатурированного мономера иерсинина - диагностического антигена из псевдотуберкулезного микроба, пригодный для получения белка на технологических установках в условиях опытного производства.

Материалы диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Новикова О.Д., Федорееэа Л И., Хоменко В.А., Ермак И.М., Лихацкая Г.Н., Мороз С.В., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию. // Биоорганическая химия, 1993.-Т.19,№5.-С. 547-563.

2. Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Фролова Г.М., Соловьева Т.Ф., Прокопенкова А.П. Использование порина из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis для серодиагностики псевдотуберкулеза. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1995.-№8,- С.199-202.

3. Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф.,Оводов Ю.С. Антигенные свойства поринов наружной мембраны рода

иерсиний. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1996.-№6.-С,657-660.

4. Дармов И.В., Маракулин И.В., Погорельский И.П., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф. Профилактика экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции с помощью иммунизации порином из Yersinia pseudotuberculosis. И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1999. -Т.127, №2.-0.221-223.

5. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Динамика иммунного ответа к порину из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,

1999.-Т. 128, №10.-С. 437-440.

6. Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Бениова С.Н., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В. Апробация иммуноферментной тест-системы на основе белка-порина из Yersinia pseudotuberculosis для диагностики псевдотуберкулеза. // Иммунология,

2000.-Ns2.-C.59-61.

7. Гордеец А.В., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Малашенкова В.Г., Бениова С.Н., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Способ диагностики псевдотуберкулеза. II Патент РФ на изобретение № 2153172 (2000).-Бюлл. изобр., 2000, №10.

х? I ¿<? >'/

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Портнягина, Ольга Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Порообразующие белки наружной мембраны (НМ) и их биологические свойства

1.1. Структура и функции НМ грамотрицательных бактерий 5

12. Основные белки НМ грамотрицательных бактерий 7

1.3. Структура и функциональные особенности порообразующих белков 10

1.4. Биологические свойства порообразующих белков НМ грамотрицательных бактерий 13

1.4.1. Антигенная характеристика белков НМ грамотрицательных бактерий

1.4.1.1. Антигенные детерминанты белков 14

1.4.1.2. Структура антигенных детерминант поринов 16

1.4.2. Иммуногенные свойства поринов 17

1.4.3. Порины как протективные антигены 19

1.4.4. Протективные свойства антител к поринам 21

1.4.5. Другие виды биологической активности поринов 22

1.4.6. Взаимодействие поринов с антибиотиками 25

1.5. Иммунодиагностика псевдотуберкулеза 27-29 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. Материалы и методы исследования

2.1. Выделение порообразующего белка из НМ Y. pseudotuberculosis

2.1.1. Культивирование клеток Y. pseudotuberculosis

2.1.2. Первичная обработка биомассы клеток

2.1.3. Получение порообразующего белка 30

2.2. Физико-химические методы 32

2.3. Аналитические методы

2.4. Иммунологические методы

2.4.1. Получение антисывороток * 33

2.4.2. Получение сывороток крови

2.4.3. Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.4.4. Реакция связывания антигена со специфической антисывороткой в ИФА 34

2.4.5. Иммуноблоттинг

2.5. Биологические методы 35

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3. Иммунобиологические свойства лорообразующего белка НМ Yersinia pseudotuberculosis Ъ

3.1. Выделение и характеристика белка-порина из НМ Y. pseudotuberculosis Ъ

3.1.1. Иерсинин - основной белок НМ Y. pseudotuberculosis 37

3.1.2. Получение иерсинина и его физико-химическая характеристика 38

3.2. Иммунохимические свойства иерсинина 43

3.2.1. Иммуногенные свойства иерсинина 44

3.2.2. Антигенная структура молекулярных форм (тримера и мономера) иерсинина 46

3.2.3. Динамика иммунного ответа на различные молекулярные формы иерсинина 51

3.2.4. Иерсинин - видо- и родоспецифический антиген рода Yersinia 55

3.2.5. Протективные свойства иерсинина 60

3.2.6. Участие иерсинина в патогенезе псевдотуберкулеза 64

4. Тест-система для диагностики псевдотуберкулеза 66

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунобиологические свойства порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis"

Взаимоотношения поверхностных структур бактериальной клетки с макроорганизмом являются определяющими в развитии инфекционного процесса. Организация, стабильность и барьерная функция наружной мембраны (НМ) очень важны для целостности, роста и жизнеспособности самой бактериальной клетки. НМ защищает клетку от неблагоприятных факторов и обеспечивает обмен с окружающей средой питательными веществами и продуктами метаболизма. Транспорт малых гидрофильных молекул (до 600 Да) через НМ осуществляется с помощью большого числа водонаполненных трансмембранных пор, образованных белками НМ, доминирующими в количественном отношении и названными поринами в соответствии с их специфической функцией. Выяснение механизма функционирования НМ тесно связано с изучением структуры и свойств мембранных белков. Установление биологической функции мембранных белков, как отдельных компонентов НМ бактерий, представляет не только теоретический интерес, но и связано с решением целого ряда прикладных вопросов, таких как создание эффективных вакцинных препаратов и усовершенствование диагностики заболеванийЛоверхностные белки НМ грамотрицательных бактерий играют заметную роль в патогенезе инфекции: способствуют адгезии (и, возможно, инвазии) бактерий, влияют на характер иммунного ответа. Неослабевающее внимание к ним объясняется целым рядом иммунологических особенностей данных белков. Во-первых, среди них, как правило, находятся белки, специфические для данного рода или вида микроорганизма, т.е. являющиеся иммунологическими маркерами. Во-вторых, они относятся к высоко иммуногенным компонентам микробных клеток, и определение антител к ним используется при диагностике инфекционных заболеваний. Кроме того, многие поверхностные белки оказывают ярко выраженное протективное действие. Объектом нашего исследования является псевдотуберкулезный микроб Yersinia pseudotuberculosis, вызывающий дальневосточную скарлатиноподобную лихорадку, или экстраинтестинальный иерсиниоз. В результате многолетних исследований нами были получены и обобщены многочисленные экспериментальные данные, касающиеся структуры и функции отдельных компонентов бактериальной мембраны, а также их роли в инициировании и развитии бактериальной инфекции. Детальное изучение их иммунобиологических свойств необходимо для решения проблем, связанных с профилактикой и лабораторной диагностикой этого заболевания.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.Порообразующие белки наружной мембраны (НМ) и их биологические свойства

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Портнягина, Ольга Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Выделены и охарактеризованы различные молекулярные формы иерсинина. Показано, что олигомеры белка представляют собой частично развернутые молекулы с нестабильной третичной структурой. Для вторичной структуры иерсинина, которая сохраняется в различных денатурирующих условиях, характерно преобладание (3-структуры.

2. У иерсинина выявлено наличие двух типов антигенных детерминант: «конформационные», формирующиеся на уровне четвертичной структуры белка, и «составные», которые определяются аминокислотной последовательностью белка и его вторичной структурой.

3. Индукция антител к иерсинину имеет волнообразный характер, типичный для белковых антигенов, и зависит от дозы вводимого препарата и молекулярной формы белка. В процессе формирования иммунного ответа к иерсинину уменьшается количество антител, специфичных к «конформационным» детерминантам, и возрастает количество антител к «составным» детерминантам.

4. Иерсинин является протективным антигеном, участвующим в обеспечении гуморальных и клеточных факторов защиты макроорганизма.

5. Показано, что иерсинин участвует в патогенезе псевдотуберкулезной инфекции, способствуя увеличению адгезии и инвазии бактерий псевдотуберкулеза в клетки.

6. Иерсинин является родо- и видоспецифическим антигеном, дающим в иммуноферментном анализе низкий уровень перекреста с другими представителями семейства ЕМегоЬаМепасеае.

7. Обнаружено, что по своим свойствам термоденатурированный мономер иерсинина является наиболее подходящим антигеном для целей иммунодиагностики и вакцинопрофилактики.

8. На основе иммуноферментного анализа с использованием термоденатурированного мономера иерсинина в качестве антигена разработана новая видоспецифическая тест-система для определения антител в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом.

9. Разработан новый, упрощенный метод выделения термоденатурированного мономера иерсинина - диагностического антигена из псевдотуберкулезного микроба, пригодный для получения белка на технологических установках в условиях опытного производства.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Портнягина, Ольга Юрьевна, Владивосток

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологический исследованиях. J1. 1962.

2. Берзофски Д.А., Берковер А.Д. Взаимодействие антиген-антитело. В кн.: Иммунология; Под. ред. У. Пола. М.: Мир. 1989. С.58-59.

3. Бобровник С.А. Динамика взаимодействия моноклональных антител с иммобилизованным на платах антигеном. // Укр. Биохим. журн.1998. Т.70. N3. С.118-128.

4. Дельвиг A.A., Семенов Б.Ф. Механизмы формирования иммунного ответа к пориновым белкам наружной мембраны менингококков серогруппы В. // Журн. микробиол. иэпидемиол. 1997. N6. С.92-96.

5. Дробков В.И., Дармов И.В. Иммунохимические методы диагностики псевдотуберкулеза. //Клин, лабор. диагност. 1993. N.5. С.3-7.

6. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк. 1991.

7. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная иммунология: Пер. с нем. М.: Мир. 1982. Т.2. С. 267.

8. Иванов Б.П., Петров А.Б. Повышение иммуногенности пептидных вакцин: Актуальные проблемы создания и применения иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней. Пермь, 1993. Т.1. С. 35-53.

9. Кавун Э.М., Скок М.В., Комиссаренко C.B. Иммунологическое распознавание цитохрома С: динамика антителообразования, механизмы регуляции. //Докл. АН СССР. 1988. Т.302. N.l. С.246-248.

10. Королюк А.М., Головачева С.Н. Опыт приготовления сухого эритроцитарного антигенного препарата и применение его для серологической диагностики псевдотуберкулеза. // В кн.: Тез. докл. 16-го Всесоюз. Съезда микробиол. иэпидемиол. М. 1972. Ч. 1. С. 298.

11. Маурер г. Диск-электрофорез. М.: Мир. 1971. С. 94.

12. Навашин С.М., Сазыкин Ю.О. Фундаментальные основы создания новых эффективных антибиотиков. // Антибиотики и химиотерапия. 1992. Т 37. N. 4. С. 5-11.

13. Новикова ОД, Зыкова Т.А., Ядыкина Г.М., Глазунов В.П., Соловьева ТФ., Оводов Ю.С. Изучение иерсинина основного полипептида наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis. //Биол. мембраны. 1985. Т. 2. N.7. С. 714723.

14. Новикова О.Д., Набиуллин А.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Выделение и характеристика белков внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. И Химия природ, соедин. 1983. N. 3. С. 359-364.

15. Петровская В.Г. Генетические основы вирулентности патогенных и условно патогенных бактерий. // Журн. микробиол. и эпидемиол. 1984. N. 7 С. 77-85.

16. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Биологические свойства эндотоксинов грамотрицательных бактерий. // Успехи современной биологии. 1980. Т. 90. Вып. 1(4). С. 62-79.

17. Супотницкий М.В. Эффективное патентование средств специфической профилактики инфекционных заболеваний. // Биотехнология. 1997. N. 9-10. С.56-79.

18. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей химии. М. Просвещение. 1975. С. 85-89.

19. Achouak w., Pages J.M., De Mot R., Molle G., Heulin. A major outer membrane protein of Rachnella aquatis functions as a porin and root adhesin. // J. Bacterid. 1998. V. 180. N. 4. P. 909-913.

20. Alberti S., Marques G., Hernandezalles S., Rubires X., Tomas J.M., Vivanco F., Benedi V. Interaction between complement subcomponent Clq and the Klebsiella pneumoniae porin OmpK36. // Infection and Immunity. 1996. V. 64. N. 11. P. 57195725.

21. Aldea M., Herrero E., Estevo M.I., Guerrero R. Surface-density of major outer membrane proteins in Salmonella typhimurium in different growth conditions. // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 120. N. 8. P. 355-367.

22. Atassi M.Z. Precise determination of the entire antigenic structure of lysozime. // Immunochem. 1978. V. 15. P. 909-936.

23. Atassi M.Z. Antigenic structure of mioglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. // Immunochem. V. 12. P.423-438.

24. Barlow D.J., Edwards M.S., Thornton J.M. Continuous and discontinuous protein antigenic determinants. //Nature. 1986. V. 322. P. 757-748.

25. Benjamin D.C., Berzofsky J.A., East I.J. The antigenic structure of proteins: a reappraisal. // Annu. Rev. Immunol. 1984. V. 2. P. 67-101.

26. Benson S.A., Occi J.L.L., Sampson B.A. Mutations that alter the pore function of the OmpF porin of Escherichia coli K-12. // J. Mol. Biol. 1988. V. 203. N. 4. P. 961970.

27. Benz R.; Bauer K Permeation of hydrophilic molecules through the outer membrane of gram-negative bacteria. Review on bacterial porins. // Eur.J.Biochem. 1988. V. 176. N. 1. P. 1-19.

28. Bornet C., Davi-Regli A., Bosi C., Bollet C., Pages J.M. Imipenem resistance of Enterobacter aerogens mediated by outer membrane permeability. // J. Clin, microbiol. 2000. V. 38. N. 3. P. 1048-1052.

29. Braun V., Rehn K. Chemical characterization special distribution and function of a lipoprotein of the Escherichia coli cell wall. // EurJ.Biochem. 1969. V. 10. N. 2. P. 426-438.

30. Chakrabarti S R., Chaudhuri K.,Sen K., Pas J. Porins of Vibrio cholerae: Purification and characterization of OmpU. //J. Bacteriol. 1996. V. 178. N. 2. P. 524-530.

31. Charrel R.N., Pages J.M., Demicco P., Mallea M. Prevalense of outer membrane porin alteration in beta-lactam-antibiotic-resistant Enterobacter aerogens. II Antimicrob. Agents and Chemotherapy. 1996. V. 40. N. 12. P. 2854-2858.

32. Chen R., Kramer C., Schmidmayr W., Henning U. Primary structure of major outer membrane protein I of Escherichia coli B/r. // Proc.Nat. Acad. Sei. USA. 1979. V. 76. N. 10. P. 5014-5017.

33. Chevalier J., Pages J.M., Mallea M. In vivo modification of porin activity conferring antibiotic resistance to Enterobacter aerogens. I I Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1999. V. 266. N. 1. P. 248-251.

34. Chin J.C., Dai J., Watts J.E. Antibody response against Pseudomonas aeruginosa membrane proteins in experimentally infected sheep. // Veterinary Microbiol. 1995. V. 43. N. l.P. 21-32.

35. Currie J.A., Marshall J.D., Crozier D. // J. Infect. Dis. 1966. V. 116. P. 117-122.

36. Delcour A. Function and modulation of bacterial porins: insights from electrophysiology. //FEMS Microbiol. Lett. 1997. V.151. P.115-125.

37. Donaldson D.M., Roberts R.R., Lausen H.S., Tew J.C. Interrelationship between serum beta-lysin, lysozime, and the antibody-complement system in lilling Escherichia coli. II Infect. Immun. 1974. V. 10. P. 657-666.

38. Dubois M., Gillis K.A., Hamilton J.K., Rebera P.A., Smith F. Calorimetric method for determinated of sugars and related substances. // Analyt. Chem. 1956. V. 28. N.2. P. 350-356.

39. Elkins C., Barkley K.B., Carbonetti N.H., Coimbre H. J., Sparling P.F. Immunobiology of purified recombinant outer membrane porin protein of Neisseria gonorrhoeae. // Molecular Microbiol. 1994. V. 14. N. 5. P. 1059-1075.

40. Fernandes P.V., Kim K., Cundy K.R., Huang N.N. Antibody to cell envelope proteins of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis patients. //Infect. Immun. 1981. V. 33. N. 2. P. 527-532.

41. Galdiero M., Delero G.C., Donnarumma G., Marcatili F., Galdiero F. Interleukin 1 and Interleukin-4 gene expression in human monocytes stimulated with Salmonella tuphimurium porins. // Immunology. 1995. V. 86. N. 4. P. 612-619.

42. Hedatrom R.C., Pavlovskis O.R., Galloway R. Antibody response of infected mice to outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa II Infect. Immun. 1984. V. 41. N. l.P. 49-53.

43. Henning U., Schmidmayer W., Hindennach I. Major proteins of the outer cell envelope membrane of Escherichia coli Kl 2, multiple species of protein I. // Mol. Gen. Genet. 1977. V. 154. N. 3. P. 293-298.

44. Henriksen A.Z., Maeland J.A. A conserved domain on enterobacterial porin protein analyzed by monoclonal-antibody. // APMIS. 1991. V. 99. P. 49-57.

45. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Enhancement by a serum factor of the immunoaccessibility of an Enterobacterial porin protein domain. // APMIS. 1991. V. 99. P. 703-710.

46. Hindennach J., Henning U. The major proteins of the Escherichia coli outer cell envelope membrane. Preparative isolation of all major membrane proteins. // Eur.J.Biochem. 1975. V. 59. N. 1. P.207-213.

47. Howell S., Crine Ph. Type VI membrane proteins? // TIBS. 1996. V.21. P. 171-172.

48. Huang,HJ.; Hancock,R.E.W. The role of specific surface loop regions in determining the function of the imipenem-specific pore protein OprD of Pseudomonas aeruginosa. // J. Bacteriol. 1996 V. 178. N. 1. P. 3085-3090.

49. Joshihara E., Gotoh N., Nishino T., Nakae T. Protein D-2 porin of the Pseudomonas aeruginosa outer membrane bears the protease ativity. // FEBS Lett. 1996. V. 30. N. 394(2). P. 179-182.

50. Karch H., NixdorfF K. Antibody producting cell responses to an isolated outer membrane protein and to complexes of phospholipids from Proteus mirabilis. H Infect.Immun. 1981. V. 31. N. 3. P. 862-867.

51. Knapp W., Steuer W., Untersuchugen über den nachweis komplementbilder und agglutinierendez antikorper genen Pasteurella pseudotuberculosis in sera infizieter und Immunisierter menschen und tiere. // Lschr. Immun. Exp. Ther. 1956. Bd. 113. S. 370375.

52. Kouhen R., Bernadac A., Pages J.M. Colicin N interaction with sensitive Escherichia coli cells: in situ and kinetic approaches. // Res. Microbiol. 1998. V. 149. N. 9. P. 645651.

53. Kouhen R., Pages J.M. Dynamic aspects of colicin N translocation throught the Escherichia coli outer membrane. //J.Bacteriol. 1996. V. 178. N. 17. P. 5316-5319.

54. Kuusi M., Nurminen M., Saxon H.,Valtonen M., Makela P.H. Immunization with major outer membrane proteins in experimental salmonelesis of mice. // Infect. Immun. 1979. V. 25. N. 3. P. 857-862.

55. Luckey M., Nickaido H. Specificity of diffusion channels produced by Vphage receptor protein of Esherichia coli. //Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 77. N. LP. 167-171.

56. Lugtenberg B., Van Alpen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and outer gram-negative bacteria. // Biochem. Biophys. Acta. 1983. V. 737. N. LP. 51-115.

57. Lupi N., Bourgois A., Bernadac A., Laboucari S., Pajes J.-M. Immunilogical analysis of porin polymorphism in Escherichia coli B and K-12. // Mol. Immunol. 1989. V. 26. N. 11. P. 1027-1036.

58. Lutwiche P., Exner M.M., Hancock R.E.W., Trust T. J. A conserved Aeromortas-porin provides protective immunity to rainbow-trout. // Infection and Immunity, 1995. V.63, N58. P.3137-3142.

59. Maier C., Bremer E., Schmid A., Benz R. Pore-forming activity of the Tsx protein from the outer membrane of Escherichia coli. II J.Biol. Chem. 1988. V. 263. N. 5. P. 2493-2499.

60. Makiikola O., Heesemann J., Toivanen A., Granfors K. High frequency of Yersinia antibodies in healthy populations in Finland and Germany. // Rheumatology Internat. 1997. V. 16. N. 6. P. 227-229.

61. Mallea M., Chevalier J., Boraet C., Eyraud A., Davi-Regli A., Bollet C., Pages J.M. Porin alteration and active efflux: two in vivo drug resistance strategies used by Enterobacteraerogens. //Microbiology. 1998. V. 144. N. 11. P. 3003-3009.

62. Manavalan P., Johnson W.C. Sensitivity of circular dichroism to protein tertiary structure class. //Nature. 1983. V. 305. N. 27. P. 3738-3744.

63. Marandi M.V., Mittal K.R. Role of outer membrane protein H (OmpH)- and OmpA specific monoclonal antibodies fromhybridoma tumors in protection of mice against Pasteurella multocida. //Infection and Immunity. 1997. V. 65. N. 11. P. 4502-4508.

64. Markwell M.A.K., Haas S.M., Biebes L.L., Tolbert N.E. A modification of the procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. // Anal. Biochem. 1978. V. 87. N. 1. P. 206-210.

65. Meghji S., Henderson B., Naiz S.P., Tufano M.A. Bacterial porins stimulate bone resorption. //Infect, and Immun. 1997. V. 65. N. 4. P. 1313-1316.

66. Mizuno T., Cheu U.Y., Inoyue A. A comparative study on the genes for three porins of the Escherichia coli outer membrane. DNA sequence of the osmoregulated OmpC gene. //J.Biol. Chem. 1983. V. 258. N. 21. P. 6932-6940.

67. Muthukkumar S., Muthukkarupan V.R. Detection of porin antigen in serum for early diagnosis of mouse infections with Salmonella typhimurium. II FEMS Microbiol. Immunol. 1992. V. 89. N. 3. P. 147-153.

68. Muller D.J., Engel A. Voltaje and pH induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy. // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 1347-1351.

69. Nakae T. Identification of the major outer membrane protein of Escherichia coli that produces transmembrane channels in reconstituted vesicle membranes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 71. N. 3. P. 877-884.

70. Nakamura K., Mizushima S. Effect of heating in dodecyl sulfate solution on the conformation and electrophoretic mobility of isolated major outer membrane proteins from Escherichia coli K-12. // J.Biochem. 1975. V. 80. N. 6. P. 1411-1422.

71. Palva E.T., Randall L.L. Arrangement of protein I in Escherichia coli outer membrane: cross-linking study. //J.Bacteriol. 1978. V. 133. N. 1. P. 279-286.

72. Palva E.T., Randall L.L. Cross-linking analysis of the two forms of protein I, a major outer membrane protein of Escherichis coli. // J.Bacteriol. 1979. V. 138. N. 1. P. 254256.

73. Provencher C.W., Glocker J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. // Biochemistry. 1981. V. 20. N. 1. P. 33-37.

74. Ranling E.G., Martin N.L., Hancock R.E.W. Epitope mapping of the Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein OprF. // Infect, and Immun. 1995. V. 63. N. 1. P. 38-42.

75. Reeves P. The genetics of outer membrane proteins. In: Bacterial outer membranes. Biogenesis and functions. // Ed. Inouye M. New York: Wiley Interscience. 1979. P.255-291.

76. Reithmeier R.A.F., Bragg P.D. // Cross-linking of the proteins in the outer membrane of Escherichia coli. //Biochem.Biophys.Acta. 1977. V. 466. N. 2. P. 245-254.

77. Rosenbusch J.P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecylsulfate binding. // J.Biol.Chem. 1974. V. 249. N. 10. P. 8019-8029.

78. Rosgue W.J., Coughlin R.T., McGroarty E.J. Lipopolysaccharide tightly boynd to porins monomers and trimers from Escherichia coli. II J.Bacteriol. 1987. V. 169. N. 9. P. 4003-4010.

79. Roy. S., Biswas T. Splenocyte proliferation by porin of Shigella dysenteriae type 1 and inhibition of bacterial invasion of Hela cell by anty-porin antibody. // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 141. N. 1. P. 25-29.

80. Rudel T., Schmid A.3 Benz R., Kolb H.A., Lang F., Meyer T.F. Modulation of Neisseria porin (PorB) by cytolitic ATP/GTR of target cells: Parallels between pathogenaccomodation and mitochondrial endosymbiosis. // Cell. 1996. V. 85. N. 3. P. 391-402.

81. Schindler M., Rosenbusch J.P. Structural transitions of porin, a transmembrane protein. //FEBS Lett. 1984. V. 173. N. 1. P. 85-89.

82. Schweizer M., Hindennach I., Garten W., Henning U. Major proteins of Escherichia coli outer cell envelop membrane. Interaction of protein II* with lipopolisaccharide. // Eur. J. Biochem. 1978. V. 82. N. 1. P. 211-217.

83. Steven A.C., Ten Heggeler B., Muller R., Risten J., Rosenbusch J.P. Ultrastructure of a periodic protein layer in the outer membrane of Escherichia coli. // J.Cell.Biol. 1977. V. 72. N. 2. P. 292-301.

84. Towbin H., Staehelin T., Gordon tlectrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 76. P. 4350-4354.

85. Van Der Ley P., Strugve M., Tomassen J. Topology of outer membrane pore protein Pho E of Escherichia coli. Identification of cell surface-expoced amino-acids with the aid of monoclonal antibodies. // J.Biol. Chem. 1986. V. 261. N. 26. P. 1222212225.

86. Vangelder P., Decock H., Tommassen J. Detergent-induced folding of the outermembrane protein PhoE, a pore protein induced by phosphate limitation. // Europ. Biochem. 1994. V. 15. N. 226(3). P. 783-787.

87. Vonspecht B.U., Lucking H.C., Blum B., Schmitt A., Hungerer K.D., Domdey H. Safety and immunogenity of a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein I vaccine in human volunteers. // Vaccine. 1996. V. 14. N. 12. P. 1111-1117.

88. Wetzler L.W., Ho Y., Reiser H. // Neisserial porins induce B lymphocytes to express costimulatory B-2 molecules and proliferate. // J. Exp. Med. 1996. V. 1. N. 183(3). P. 1151-1159.

89. Схема 1. Выделение иерсинина новым способом.

90. Навеска высушенной ацетоном микробной массы 1. Тритон Х-100 (2% раствор, 1,5 ч, 4°С) 2. Центрифугирование, 5 ООО об./мин, 15 мин. 3. Отмывка от детергента, 15 ООО об./мин 15 мин (двукратно).

91. Супернатант белки цитоплазматической мембраны1. Осадок1. Ферментолиз.

92. Обработка осадка ДНК азой (5 мг ДНК -азы, 15 ч, 37°С) 2. Центрифугирование, 15 ООО об./мин, 60 мин.

93. Супернатант нуклеиновые кислоты1. Осадок

94. Супернатант -белки, растворимые в саркозилате натрия1. Осадок

95. Получение комплекса ПГ-белок 1. Обработка осадка ДСН (2% раствор, 45 мин, 50® С) 2. Центрифугирование, 15 000 об./мин, 60 мин. 3. Отмывка от детергента, 15 000 об./мин, 60 мин (двукратно).

96. Супернатант белки, растворимые в ДСН и НК1. Осадок ПГ -белок

97. Получение термоденатурированного мономера иерсинина. Диссоциация комплекса ПГ-белок (2% раствор ДСН ,7 мин, 100° С) 2. Центрифугирование, 15 000 об./мин, 60 мин. 3. Отмывка от детергента, 15 000 об./мин, 60 мин (двукратно).

98. Супернатант фракция белка - порина И-1У1. Диализ, лиофилизация.

99. Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования1. Российской Федерации

100. Определение антител в сыворотках людей методом иммуноферментного анализа для диагностики псевдотуберкулеза

101. Методические указания МУ 3.1.1.001 -98

102. Утверждены и введены в действие: решением комиссии по санитарно-эпидемическому нормированию при Центре Госсанэпиднадзора в Приморском крае от 28.06.98 г. Постановлением Главного государственного санитарного врача по Приморскому краю от 24.10.98 г.

103. Вводится впервые на территории Приморского края.

104. Предназначены для сотрудников диагностических, иммунологических и биохимических лабораторий, врачей- инфекционистов общей поликлинической и лечебной сети.1. Перепечатка разрешается

105. Для лабораторной диагностики псевдотуберкулеза используют бактериологические и серологические методы. Бактериологические методы, к сожалению, малоэффективны, так как обеспечивают лишь позднее выявление заболевания.

106. Обнаружено, что иерсинин является видоспецифическим антигеном рода Yersinia, дающим в ИФА низкий уровень перекреста с другими представителями энтеробактерий.

107. В зависимости от условий выделения иерсинин может быть получен в двух молекулярных формах: термолабильной тримерной и термостабильной мономерной с кажущимися молекулярными массами 110 и 40 кДа соответственно.

108. Инструкция по применению метода ИФА для серодиагностики псевдотуберкулеза1. Принцип метода

109. В основе предлагаемой тест системы для диагностики псевдотуберкулеза лежит метод иммуноферментного анализа (непрямой, неконкурентный анализ антител).

110. Список приборов и реактивов для проведения ИФА1. рН-метр (рН-150)

111. Комплект пипеток автоматических: 20-200 мкл, 200-1000 мкл, 5 мкл, 303000 мкл (многоканальная)

112. Комплект пипеток лабораторных

113. Сканирующий спектрофотометр5. Магнитная мешалка6. Шкаф термостатируемый

114. Микротитровальные планшеты из полистирола1. Список реактивов

115. Реактивы отечественные, используемые без предварительной очистки:1. Кислота серная , хч2. Натрия гидроокись , хч3. Натрий хлористый, чда

116. Натрий фосфорнокислый однозамещенный, 2 водный, чда

117. Натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12 водный, чда6. Натрий углекислый, хч

118. Натрий углекислый кислый, хч8. Кислота лимонная

119. Перекись водорода, 30% , хч10. О-фенилендиамин, ч1. Реактивы импортные:

120. Твин-20, (Merck, Германия)

121. Приготовление растворов для проведения анализа

122. Раствор №1. Буфер карбонат-бикарбонатный (0,01 М, рН 9,25) для нанесения антигена на планшет (твердый носитель): 1,59 г Na2CC>3 и 2,93 г NaHC03 в 1 л Н20. Раствор хранят не более месяца при 4° С.

123. Раствор №2. Буфер фосфатно-солевой (0,02 М, рН 7,2): 5,68 г Na2HP04 , 6,24 г NaH2P04 , 11,2 г NaCl в 2 л Н20.

124. Раствор №2"а" для разведения исследуемой сыворотки и отмывки планшетов: раствор №2 (1000 мл) + 0,5 мл Твин-20 (или Твин-80). Раствор не хранят.

125. Раствор №2"б" для разведения конъюгата: раствор №2 (100 мл) + 0,25 мл Твин-20 (или Твин-80). Раствор не хранят.

126. Раствор №3. Буфер цитратно-фосфатный (рН 5,0): 49,3 мл 0,2 М двузамещенного фосфорнокислого натрия (1,42 г на 50 мл Н20) и 50,7 мл 0,1 М лимонной кислоты (2,1 г на 100 мл Н20). Раствор хранят при 4°С не более месяца.

127. Раствор №4. Субстрат-индикаторный раствор: 10 мл раствора №3 + 4 мг О-фенилендиамина, готовят не ранее, чем за 10 мин до использования. В полученный раствор добавляют 0,005 мл 30% Н2Ог непосредственно перед внесением в лунки планшета. Раствор не хранят.

128. Раствор №5. Раствор серной кислоты (0,5 М): 1 мл концентрированной Н2804 растворяют в 15 мл НгО. Раствор используют для остановки ферментативной реакции. Раствор хранят при комнатной температуре1. Получение сывороток крови

129. Методика выявления специфических антител в сыворотках крови больных людей

130. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антигена в концентрации 2,5 мкг в мл. Адсорбцию антигена проводят в течение 18-20 ч при 4° С (или 2 ч при 37° С).

131. Раствор из лунок удаляют сильным встряхиванием и промывают трехкратно дистиллированной водой и раствором №2"а", попеременно. На каждом этапе планшет выдерживают по 3 мин. После отмывки планшеты высушивают на воздухе.

132. Во все лунки планшета вносят по 250 мкл раствора №2"б" (дляпредотвращения неспецифического взаимодействия меченных антител сантигеном). Инкубируют планшеты 18-20 ч при4°С.

133. Раствор из лунок удаляют и промывают, как указано в п. 2.

134. Раствор из лунок удаляют и промывают, как указано в п. 2.

135. В каждую лунку планшета вносят по 70 мкл субстрат-индикаторного раствора №4, выдерживают 30 мин в темноте при комнатной температуре.

136. Реакцию останавливают внесением во все лунки планшета 30 мкл раствора №5.

137. В лунках планшета, где прошла реакция, появляется окрашивание раствора от желтого до оранжево-коричневого. В лунках, где исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, субстрат-индикаторный95раствор бесцветен или слабоокрашен.

138. Результаты реакции учитывают, сравнивая окраску в опытных и контрольных лунках или определяя интенсивность окрашивания с помощью спектрофотометра при длине волны 492-495 нм.

139. Результаты реакции выражают как отношение ОП исследуемой пробы к ОП контроля (P/N). Положительной считают пробу с Р / N > 2,1.

140. При постановке ИФА необходимы следующие контроли на планшете:

141. Контроль неспецифического связываниялунки Е-1, F-1,G-1, Н-1). В данных лунках значение ОП окрашенного раствора не должно превышать значения 0,2.жтй£жш Фщшмр.ш1. ИЛ ИЗОБРЕТЕНИЕ2153172

142. Российским агентством по патентам и: товарным знакам на основании Патентного: закона Российской Федерации, введенного в действие 14 октября 1992 года, выдан настоящий патент на изобретение

143. СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА1. Патентообладагель(ли):см. на оборотепо заявке № 98122085, дата поступления: 02.12.1998 /л Приоритет от 02.12.1998 Автор(ы) изобретения:см. на оиороше

144. Патент действует на всей территории Российской Федерации в течение 20 лет с 2 декабря 1998 г. при условии своевременной уплаты пошлины за поддержание патента в силе

145. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерацииг. Москва, 20 июля 2000 г.ШШ