Иммобилизация наноматериалов на поверхности живых клеток эукариот и прокариот

Замалеева, Алсу Ильгизовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммобилизация наноматериалов на поверхности живых клеток эукариот и прокариот
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммобилизация наноматериалов на поверхности живых клеток эукариот и прокариот"

004607855

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи

ЗАМАЛЕЕВА АЛСУ ИЛЬГИЗОВНА

ИММОБИЛИЗАЦИЯ НАНОМАТЕРИАЛОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ЖИВЫХ КЛЕТОК ЭУКАРИОТ И ПРОКАРИОТ

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2 СЕН 2010

Казань - 2010

004607855

Работа выполнена на кафедре биохимии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжси федеральный университет"

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Ишмухаметова Диляра Галимовна

Научный консультант: кандидат биологических наук Фахруллин Равиль Фаридович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

кандидат биологических наук, врач высшей категории Саттарова Лилия Ирековна

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики

Казанского научного центра Российской академии наук (г. Казань)

Защита диссертации состоится 30 сентября 2010 г. в 13.00 часов на заседа диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федералы университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевс: 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, аудитория № 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан августа 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ктуальность работы. В течение последних лет функциональные наноструктуры ривлекают все больший интерес ученых благодаря уникальным свойствам и возможности ч широкого применения в различных областях: электронике (Murray et al.. 2000: L.ee et al.. 309). оптике (Schmid et al.. 1998) и биосенсорах. (Bottomley et al.. 2004: Mani et al.. 2009). рименение наноматериалов в сочетании с биологическими макромолекулами позволяет >здавать новые методы диагностики заболеваний (Gao et al., 2004.: Park et al.. 2009) и азрабатывать новые биологически совместимые материалы с необычными свойствами -vov et al., 2008: Veerabadran et al., 2009). Кроме того, многочисленные исследования лли посвящены созданию и изучению гибридных систем, построенных с применением шоматериалов на основе биологических клеток. Эти работы, в основном, сфокусированы 1 создании микро- и наноконтейнеров для направленной доставки лекарств (Mohwald )00), микроэлектронных устройств (Berry et al.. 2004) и контролируемой иммобилизации 1еток (Krol et al., 2005).

Наноматериалы рассматриваются как перспективные модификаторы поверхностных руктур клеток. Например, широко используются полимеры, микрочастицы, наночастицы их всевозможные комбинации (Dahne et al., 2004). В ряде работ описывается ¿мобилизация наночастиц на поверхности различных клеток. В частности, было показано шесение золотых наночастиц на поверхность клеток Е. coli с целью создания ;ектрических микроконтактов (Berry et al., 2004). Получены и охарактеризованы (мплексы никелевых наночастиц и клеток бактерий для создания на их основе магнитных лкроустройств (Jing et al., 2007). Поверхность клеток дрожжей Kluveromyces fragitis была эдифицирована магнитными наночастицами, в результате чего были получены )фективные сорбенты на основе магнетизированных клеток (Safarik et al., 2007). Однако в :азанных работах клетка не рассматривается как живая функционирующая система, хотя ювидно, что находящиеся в непосредственной близости от поверхности живой клетки 1НОматериалы могут оказать существенное влияние на функционирование юхимического аппарата клетки и межклеточные взаимодействия. Таким образом, учение взаимодействия живых клеток с наноматериалами представляет особый интерес, обусловлено это тем, что гибридные системы, полученные на основе наноматериалов и -|вых клеток, могут быть использованы для выявления токсичных свойств 1номатериалов, для направленного изменения свойств клеток, регуляции их «иологической активности, визуализации клеточных органелл и высокоточной ектральной идентификации живых клеток, основанной на различиях в биохимическом ставе их поверхностиых структур. В связи с этим представляется весьма актуальным зработать такие методы иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток, торые позволяют сохранить их физиологическую активность.

Целью настоящей работы явилась иммобилизация наноматериалов на поверхности 1вых клеток и характеристика модифицированных клеток. Были поставлены следующие задачи:

Разработать метод иммобилизации сферических наночастиц благородных металлов, магнитных наночастиц. а также углеродных нанотрубок на поверхности клеток прокариот и эукариот с использованием послойного нанесения биосовместимых синтетических и биогенных полюлектродитов.

Охарактеризовать распределение наноматериалов на клеточных стенках и цитомлазматических мембранах клеток.

Исследовать влияние иммобилизованных наноматериалов на жизнеспособность модифицированных клеток.

Оцепить возможность использования метода иммобилизации наноматериалов на клеточных стенках и цитоплазматических мембранах живых клеток для модификации клеток с целью их идентификации спектроскопическими методами, а также

использования модифицированных клеток в электрохимических биосенсорах микроаналитических устройствах.

Научная новтна. В работе впервые описан универсальный метод иммобилизаци наноматериалов на поверхности живых клеток путем включения наноструктур в соста многослойных полимерных и биополимерных пол голе ктролитных пленок, что позволил привести их в контакт с клетками в непосредственной близости от поверхностны клеточных структур без проникновения наноструктур в цитоплазму. Показано, чт формирование наноструктурированных пленок на поверхности клеток разработанньи нами методом не влияет на жшнеспособность модифицированных клеток. Впервые был получены и охарактеризованы гибридные системы, состоящие из живых клеток наноматериалов различной природы.

Практическая значимости Разработанный метод иммобилизации наночасти благородных металлов на поверхности живых клеток может быть использован дл изучения биохимического состава клеток с применением поверхностно-усиленно рамановской спектроскопии. Модифицированные углеродными нанотрубками клетк могут быть использованы в качестве чувствительного элемента электрохимически биосенсоров для определения цитотоксичных веществ. Клетки, модифицирован™ полиаллиламин гидрохлорид-стабилизированными магнитными наночастицами, могу найти применение в микроканальных устройствах, так как после модификации возникае возможность пространственного манипулирования ими с помощью внешнего магнитног поля.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный универсальный метод модификации живых клеток позволяе эффективно иммобилизовать широкий спектр наноматериалов на поверхности клетс эукариот и прокариот.

2. Клетки, модифицированные наноматериалами. сохраняют физиологическу] активность, что позволяет использовать их в качестве структурных элементе биоэлектронных устройств.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на ежегодны итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2008-201 гг.), IV Международной конференции «Современные достижения бионаноскопии (Москва, 2008), II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эр в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), XII Международной научно молодежной школе «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия» (Казань, 2008), Saint-Peteisburg international conference of NanoBioTechnologies «NanoBio'08» (C. Петербург. 2008), всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молоды ученых «Нанотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2008), XIII всероссийскс конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Казань, 2009), XI международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синге исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений -Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009), XIII европейском симпозиуме студентов аспирантов-биологов «Симбиоз 2009» (Казань, 2009), 14th UKPCF Annual Meeting «U Polymer Colloids Forum» (United Kingdom, 2009). Работа была поддержана молодежны грантом Академии Наук Республики Татарстан (№ 14-15/2009(Г)) и Фондом содейств1 развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «Участш Молодежного Научно-Инновационного Конкурса» («УМНИК»)(№ 19-У-08-6).

Публикации по теме диссертации. Основное содержание работы отражено в двадцат научных публикациях [1-20], в том числе в пяти статьях, опубликованных в ведуш! международных журналах [1, 2, 4, 6, 7J, в двух статьях в российских журналах [3. 5] и патенте РФ [8]. Работы [1-7] удовлетворяют требованиям ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзо] литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждени выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 176 страниц! машинописного текста, включает 76 рисунков и 3 таблицы. Библиография включает 21 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования были конидии микромицетов Trichoderma aspereUum, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, бактерии Escherichia coli и Staphylococcus cohnii, водоросли Chlorella pyrenoidosa и лимфоциты крови крупного рогатого скота (КPC).

Методы исследования:

Методы синтеза наноматериалов'. в работе были использованы методы синтеза наноструктур: золотых наночастиц (АиНЧ) по методу Lee (Lee et al, 1982) и серебряных наночастиц (AgH4) по методу Handley (Handley, 1989); оксидных магнитных наночастиц (МНЧ) по методике, описанной ранее Фахруллиным (Fakhrullin, et al., 2010) с некоторыми модификациями. Многостенные углеродные нанотрубки (УНТ) были предварительно солюбилиз ированы.

Метод'иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток включал несколько этапов. На начальном этапе проводили подготовку клеток, для этого к клеткам добавляли водный раствор NaCl соответствующей для каждого объекта концентрации, встряхивали и центрифугировали. Далее клетки ресуспендировали в растворе NaCI. Нанесение полиэлектролитных пленок осуществляли по методу послойного нанесения (Krol et al., 2003): в раствор поликатиона полиаллиламин гидрохлорида (РАН) вносили суспензию клеток, затем инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут с последующим центрифугированием для удаления избытка полиэлектролота и промывали в воде. Затем аналогично наносили полианион полистирол сульфонат (PSS). Таким образом, на поверхность клеток можно нанести необходимое количество полимерных нанопленок. Для иммобилизации наноструктур на поверхности клеток, в суспензию, содержащую наноматериалы (АиНЧ, AgH4, МНЧ и УНТ), вносили определенный объем суспензии клеток, модифицированных РАН и PSS, и встряхивали. Далее клетки инкубировали и отмывали от несвязавшихся наночастиц. На последних этапах клетки, модифицированные пленками РАН, PSS и наноструктурами, обрабатывали РАН и PSS таким образом, чтобы последним слоем был PSS (для уменьшения агрегации клеток).

Для оценки формирования многослойных полиэлектролитных пленок и наноструктур были применены методы кварцевого наногравиметрического анализа (QCM 200 Stanford Research Systems (США)) и методы динамического светорассеивания (измерение Ç-потенциала) (Malvem Zetasizer3000 HS (Великобритания)).

Характеристику модифицированных клеток и синтезированных наноматериалов проводили с использованием методов оптической микроскопии (Cart Zeiss Jenamed, Leica DM 1000 (Германия)), флуоресцентной микроскопии (Carl Zeiss AxioScope Al (Германия), Olympus BX 51 (Япония), Leica DM IL (Германия)), сканирующей электронной микроскопии (Cari Zeiss EVO 40, Carl Zeiss EVO 50XVP (Германия)), энергодисперсионной спектрометрии (INCA 350 EDX (Германия)), просвечивающей электронной микроскопии (Jeol 1200 EX (Япония)), атомно-силовой микроскопии (NTEGRA Prima (Россия), Parie Systems ХЕ-100 (Южная Корея), поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (спектроскопии комбинационного рассеивания) (рамановский микроспектрометр Renishaw InVia Reflex Raman (Великобритания) и методом циклической вольтамперометрии (анализатор Ecotest-VA (Россия)).

Жизнеспособность модифицированных клеток определяли методами витального окрашивания клеток красителем трипановым синим и регистрации биохимической активности с использованием диацетатафлуоресиеина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Синтез и характеристика наноматериалов

На первом этапе работы мы осуществляли синтез (АиНЧ, AgHЧ, МНЧ) или подготовк (многостенные УНТ) наноматериалов и их характеристику с использование» спектроскопических и микроскопических методов. В таблице 1 приведены некоторы параметры синтезированных наноструктур.

Таблица 1. Параметры (размер и ¡¡-потенциал) сшггезированных наноматериалов

наноструктуры средний диаметр наноструктур, нм значение ¡¡-потенциала, мВ

АиНЧ 20±4 -34+2

AgH4 40±7 -38±2

МНЧ 15+3 +48±5

УНТ d~ 10-30,1-0,1-0,5 м км -35±3*

* - по данным Wang (Wang et al.. 2008)

Алгоритм иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток

В качестве исследуемых объектов были выбраны представители разных царств живо природы. Учитывая, что поверхностные структуры у клеток, принадлежащих к разньо типам организмов, различаются как по биохимическому составу и композици биополимеров, так и по физическим свойствам (толщина, поверхностный заряд и т.д. нами были выбраны клетки некоторых, на наш взгляд, типичных представителей царст животных, растений, грибов и бактерий, а именно: лимфоциты крови млекопигающи (КРС), клетки растений (одноклеточные водоросли С. pyrenoidosa), клетки грибов (дрожж 5. cerevisiae и конидии Т. asperellum) и прокариот - клетки грамотрицательных (Е coli) грач положительных бактерий (S. cohnii). Размеры клеток варьируют в пределах - 4 - 8 мю и обладают шаровидной или палочкообразной формой, что позволяет огггимизироват гидродинамические условия обработки клеток.

За основу метода иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток была взят техника послойного нанесения противоположно заряженных полиэлектролигов (Krol et al 2003). Основной и ранее не описанной особенностью показанного в данной работе метол стало нанесение наноматериалов совместно с нанопленками из синтетических биологических макромолекул. Таким образом, нанопленки служили в качестЕ макромолекулярного носителя, обеспечивающего как фиксацию наноматериалов ( поверхности клеток, так и защиту клеток от потенциально токсичного воздействк наноматериалов. Непосредственная модификация клеток заключалась в том, чг поверхность исследуемых клеток покрывали полиэлектролитами (например, РАН и PSS) различными наноструктурами (АиНЧ, AgH4. МНЧ и УНТ).

Предварительно нами было изучено формирование многослойных пленок на планарно поверхности с применением метода кварцевого наногравиметрического анализа. Был установлено оптимальное время адсорбции полиэлектролитов на противоположт заряженные поверхности, которое составило 15 минут.

Техника послойного нанесения полиэлектролигов основана на электростатическо взаимодействии наносимых слоев, поэтому в работе были определены значения i потенциала исследуемых объектов и используемых материалов в воде.

Принципиальная схема метода иммобилизации наноматериалов на поверхности клетс показана на схеме (Рис.1).Так как поверхность клеток заряжена отрицательно, щ иммобилизации наноматериалов суспензию клеток первоначально помещали в избытс положительно заряженного электролита.

После промывки клетки помешали в насыщенный раствор отрицательно заряженного полиэлектролита Р85. затем снова инкубировали в растворе РАН. Далее на подготовленную поверхность клеток наносили наноструктуры и закрепляли их бислойной пленкой РАН/Р88. Таким образом, при

иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток структура покрытий была следующей: РАН/РЯЯ/РАН/АиНЧ/ РАН/РББ, РАН/Р88/РАН/А§НЧ/РАН/Р88. РАН/Р88/РАН/МНЧ/РАН/Р88 и РАН/РЯЯ/ РАН/У НТ/РАН/Р88. Далее в работе будут приводиться сокращенные обозначения данных покрытий: РАН/Р88-АиНЧ, PAH/PSS-AgHЧ, РАН/Р88-МНЧ, РАН/Р88 -УНТ соответстве нно.

Рис. 1. Схематическое изображение процесса иммобилизации наноматериалов на поверхности живых клеток. Этапы:!. 2. 5. 6-Нанесение полиэлектролитов 4. Иммобилизация наноструктур на поверхности клеток

Характеристика клеток, модифицированных наноматериалами Клетки дрожжей Я. сегеуЁше и конидии Т. анрегейит, модифицированные полиэлектролитными пленками и наночастицами благородных металлов

На начальном этапе работы была оценена возможность применения биологических полимеров ДНК и БСА и синтетических полимеров РАН и РЯЯ для иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток 5. сегеушда и Т. аярегеИит. На огтгических микрофотографиях (Рис.2) видны агрегаты металлических НЧ в виде темных пятен на модифицированных клетках дрожжей, которые образуются при присоединении отрицательно заряженных НЧ к слою положительно заряженного полимера в результате частичной компенсации заряда. Особенно четко проявляется различие на оптических микрофотографиях конидий: клетки, модифицированные пленками и наночастицами. приобретают темную окраску из-за большого количества агрегатов наночаетиц. иммобилизованных на поверхности клеток.

А в с О » D L ' Í ЭЪ-е V¡y

F 3 о ш Ф- i

Иис.2. Типичные оптические микрофотографии дрожжей S. cerevisiae (А-Е) и конидий Т. usperellum (F-J): интактные метки (A. F); модифицированные PAH/PSS-AuH4 (B.G). PAH/PSS-АцНЧ (С.Н), ДИК/ВС А-АиНЧ (D.D. ДНК/ЕС. А-АцНЧ. Шкапа размера - 10мкм Таким образом, даже оптическая микроскопия позволяет оценить эффективность модификации поверхности клеток.

Следующим этапом характеристики модифицированных клеток стала сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), которая позволяет изучить модифицированную поверхность клеток с высоким разрешением и визуализировать наноструктуры, иммобилизованные на поверхности клеток.

тт.

1 Util

Рис.3. Типичные СЭМ изображения дрожжей S. cerevisiae (А-Е) и конидий Т. asperellum (F-J): интактные клетки (A.F); модифицированные PAH/PSS-AuH4 (B.G), PAH/PSS-AgH4 (С.Н). ДНК/ВСА-АиНЧ (D.1), ДНК/ВСА-АцИЧ

На электронных м икрофотографиях дрожжей и конидий, модифицированных полиэлектролитными пленками и НЧ, четко видны агрегаты металлических НЧ, I включенные в полимерные пленки и изменяющие однородную, ровную поверхность клеток (Рис. 3). Электронные изображения показывают неоднородный характер многослойных пленок в случае использования природных полимеров ДНК и БСА. что может быть связано с большей молекулярной массой и пространственным строением комплексов биополимеров по сравнению с синтетическими. Таким образом, можно предположить, что химическая структура полиэлектролитов оказывает влияние на процесс включения наночастиц в структуру пленок.

Для исследования распределения наночастиц на поверхности модифицированных клеток была применена просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Данная техника позволяет изучить тонкие срезы клеток и охарактеризовать распределение наночастиц не только на поверхности клеточных стенок и мембран, но и в цитоплазме. ПЭМ показала присоединение как единичных наночастиц, так и их агрегатов к клеточной стенке (Рис. 4), Как видно на рисунке, НЧ иммобилизованы на поверхности клеточной стенки, при этом не наблюдается проникновения НЧ в цитоплазму. Мы предполагаем, что полиэлектролигные пленки предотвращают проникновение НЧ и способствуют сохранению жизнеспособности клеток дрожжей в присутствии потенциально цитотоксичных НЧ благородных металлов.

Таким образом, с использованием элек- | тронной микроскопии были определены размеры многослойных пленок, плотность и характер распределения наноструктур на поверхности модифицированных клеток дрожжей и конидий. Установлено, что толщина образованных пленок была соизмерима с размерами наноструктур и составила ~ 25 нм для АиНЧ и ~ 50 нм для AgH4 содержащих нанопленок.

На следующем этапе работы была де-

п , Т , , _ _ тально изучена топография поверхности

Рис.4. шпичные ¡¡ЭМ изображения дрожжей S. , \

cerevisiae (Л-С) и конидии Т. asperellum (D-F): модифицированных клеток с использова-интактные клетки (А.О): модифицированные иием метода атомно-силовой микроскопии PAH/PSS-AuH4 (В. Е). PAH/PSS-Ai>H4 (С. F) (ДСМ).

й □

□

Рис.5. Типичные АС М изображения дрожжей S. cerevisiae (А-Е) и кониоий Т. asperellum (F-J): интактные метки (A.F): модифицированные PAH/PSS-АиНЧ (B.G). PAH/PSS-AxH4 (С.Н). ДНК/ВС А-АиНЧ ГШ). ДНК/ВС А-AgH4. Слева - профиль клетки с изображением продольного сечения клетки. справа-топография

поверхности

На Рис. 5 показаны изображения поверхности модифицированных наноматериалами клеточных

стенок, полученных при помощи АСМ. Для всестороннего анализа модифицированных клеток были использованы профиль среза клетки и топография поверхности интактных и модифицированных дрожжей.

Видно, что профиль интактных клеток относительно гладкий, поверхность ровная и однородная. После модификации клеток на поверхности четко видны АиНЧ и AgH4. Независимо от типа применяемых наночастиц, профиль клеток меняется, приобретает зигзагообразный вид. Поверхность же становится неоднородной, более шероховатой. Аналогичные результаты были показаны и для модифицированных конидий T.asperellum. После иммобилизации наноматериалов значительно увеличивается поверхностная плошадь модифицированных клеток. Можно провести параллели между клетками дрожжей и конидий, обработанных одинаковыми полимерами и НЧ. Очевидно, структура топографии поверхности клеток, модифицированных разными методами, соответствуют друг другу.

В качестве показателя, характеризующего изменение топографии модифицированной поверхности, обусловленного нанесением нанопленок и наночастиц, был использован параметр среднеквадратичной шероховатости (Sq) поверхности клеток. Данные приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Значения параметра среднеквадратичной шероховатости поверхности клеток

клетка значения параметра шероховатости (Sq) поверхности клеток, nm

интактная PAH/PSS-АиНЧ PAH/PSS-AgH4 ДНК/БСА-АиНЧ ДНК/БСА-AgH4

5. cerevisiae 1.6 ±0.1 11.5 ±0,3 2,3+0.1 2.3+0.2 22.6+0.6

Т. asperellum 3.3+0.2 7,6+0.2 20.7±0,4 17,5±0,3 17,9+0.3

Таким образом, видно, что после иммобилизации полиэлектролитных пленок и металлических НЧ шероховатость поверхности клеток увеличивается во всех случаях. Причем, для конидий Т. аярегеИит шероховатость увеличивается в большей степени по сравнению с клетками дрожжей. Это может быть связано с изначально более неровной поверхностью этих клеток.

w . В

Лимфоциты крови, модифицированные тлиэлектролитными пленками и наночистицам и благородных металлов

На начальном этапе метод иммобилизации наноматериалов был разработан для одноклеточных грибов, имеющих прочную клеточную стенку. Поэтому далее, для оценки функциональных возможностей метода иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток, не имеющих клеточной стенки, мы использовали лимфоциты в качестве объекта для иммобилизации наноматериалов.

Лимфоциты выделяли из крови крупного рогатого скота (быка) методом разделения клеток в градиенте фиколла (Кондратьева, 2004) (Рис. 6А). Выделенные лимфоциты модифицировали многослойными пленками и АиНЧ, как описано выше (все растворы полиэлектролигов и наночастиц были приготовлены в 0.9% NaCl для предотвращения разрушения клеток).

После покрытия лимфоцитов на оптических микрофотографиях отчетливо видны агрегаты наночастиц на поверхности клеток (Рис. 6В).

Сканирующая электронная микроскопия

Рис. о. ¡ипичные оптические микро, , , ... также показала адсороцию как единичных фотографии интактных лимфоцитов (А) и Г

модифицированных PAH/PSS-AuH4 (В) наночастиц, так и их агрегатов на

_ поверхности клеток (Рис. 7).

Следует отметить неравномерное распределение НЧ на поверхности лимфоцитов, что можно объяснить двумя причинами : (а) это может быть связано с дискретным значением поверхностного заряда клеток, вследствие чего отрицательно заряженные золотые частицы эффективнее присоединялись к участкам цитоплазмати-ческой мембраны, имеющим больший положительный заряд: (б) влияние на электростатическое взаимодействие могли оказать ионы Na+ и С Г. содержащиеся в физиологическом растворе.

Если микроорганизмы имеют толстую клеточную стенку в качестве дополнительного защитного барьера от проникновения НЧ в цитоплазму, то лимфоциты обладают лишь тонкой цитоплазматической мембраной.

â ЯЧШ А ш

Щ: с 2 мт

•. \ ; 1|jm

J--—

'ш^ШВ

Рис. 7. Типичные СЭМ изображения (А. В) и ПЭМ изображения (С.О) интактных лимфоцитов крови (АС) и модифицированных РАН/РЪЪ-АиНЧ (В,П)

В связи с этим, особый интерес представляло изучение распределения и проникновения наночастиц в цитоплазму клеток с применением метода ПЭМ. На ПЭМ-микрофегтографиях (Рис. 70) видно дискретное распределение одиночных наночастиц и их агрегатов, что подтверждает данные СЭМ, но при этом АиНЧ находятся на поверхности и не проникают внутрь клеток, что свидетельствует о способности полиэлектролт ных пленок препятствовать проникновению НЧ в цитоплазму.

Бактерии Е. coli и S. cohnii, модифицированные полиэлекгролигными пленками и наночастицами благородных металлов

Нами были выбраны бактерии, отличающиеся по форме и биохимическому составу клеточной стенки: г рам положительный вид - S. cohnii и грамотриизтельный вид - £ coli. Метод иммобилизации наноматериалов на поверхности бактерий осуществлялся аналогично вышеописанной схеме.

Плотность и распределение золотых и серебряных наночастиц на поверхности модифицированных клеток далее были изучены с использованием методов СЭМ и АСМ. Изображения бактерий, полученные с помощью СЭМ, показывают наличие единичных наночастиц и их агрегатов на поверхности модифицированных клеток, при этом их равномерность и плотность меняется от клетки к клетке, что может быть связано с наличием специфических участков связывания на бактериальной клеточной стенке (Рис. 8, 9). Необходимо отметить тот факт, что характер покрытия наночастицами поверхности бактерий разных видов Exoli и S. cohnii различен, что может быть обусловлено различным биохимическим составом клеточной стенки этих бактерий (Рис. 8,9).

Также было отмечено, что внутри одного вида бактерий, золотые и серебряные наночастицы по-разному модифицируют поверхность клеток. При сравнении Рис. 8В и 8С видно, что AgH4 формируют менее плотный слой на поверхности клеток £. coli (по сравнению с АиНЧ). В связи с этим топография поверхности модифицированных бактерий £ coli была охарактеризована АСМ.

На Рис. 10 представлена топография поверхности интакгной и

модифицированной клетки £ coli. Установлено, что поверхность интакгной бактерии £ coli относительно гладкая, ровная, тогда как при модификации наночастицами она меняется, становится шероховатой и неровной, четко виден характер распределения и агрегирования наночастиц. что затруднительно при визуализации с использованием СЭМ. Кроме того, при модификации AgH4 топографические характеристики

клеточной стенки £ coli меняются в большей степени по сравнению с АиНЧ, что может быть связано с большими размерами AgH4 и их агрегатов.

Рис. 8. Типичные СЭМ изображения бактерий Е coli: интактная (А):

модифицированная PAH/PSS -АцНЧ (В): модифицированная PAH/PSS -АиНЧ (С)

Рис. 9. Типичные СЭМ изображения бактерий S. cohnii: интактная (А);

модифицированная PAH/PSS-АцИЧ (В)

Рис. 10. АСМ-изображения бактерий E.coli: интактная клетка (А), модифицированная PAH/PSS-АцНЧ (В) и PAH/PSS-АиНЧ (С). Размер скана - 1x1 мкм

Водоросли С. pyrenoidosa, модифицированные полиаллиламин гидрохлорид-стабилиз ированными МНЧ

Ранее в литературе было описано применение магнитных наночастиц для модификации поверхности водорослей рода Chlorella с целью создания нового класса биосорбенгов (Safarikova et al., 2008), при этом происходила гибель магнетизированных клеток в процессе иммобилизации. В связи с этим, интересным представилось оценить возможности разработанного нами метода для магнетизации одноклеточных зеленых водорослей С. pyrenoidosa и сохранения их жизнеспособности. На данном этапе исследования был применен иной подход для иммобилизации наноматериалов, который заключался в том, что МНЧ в процессе синтеза стабилизировали полиэлектролигом РАН, что приводило к образованию на поверхности НЧ поликатионной пленки (значение С-потенциала составило ~ +48 мВ). Стабилизированные таким образом МНЧ затем одноэтапно наносили на поверхность клеток С. pyrenoidosa.

Одноклеточная водоросль С. pyrenoidosa окружена плотной клеточной стенкой и прилегающей к цитоплазме липидной мембраной; цитоплазма содержит хлоропласты, которые придают зеленую окраску клеткам (Рис. IIA). После иммобилизации МНЧ, водоросли приобретают бурую окраску вследствие адсорбции НЧ на поверхность клеток

Рис. 11. Типичные оптические микрофотографии водорослей С .pyrenoidosa: интактные клетки (А), модифицированные PAH-MNP (В); флуоресцентное изображение клеток, модифицированных FITC-PAH-MNР (С)

Для характеристики структуры полученного покрытия были использованы МНЧ, стабилизированные РАН, меченым поли(флуоресцеин изотиоцианатом) (FITC), которые одноэтапно наносились на поверхность клеток. На Рис. 11С видно, что зеленая флуоресценция FITC-PAH локализована вокруг клеточной стенки, это также подтверждает равномердаед^рытие поверхности водорослей МНЧ.

Равномерное распределение МНЧ на поверхности водорослей также было установлено с помощью ПЭМ, при этом толщина нанопленки составила 90 ±20 нм (Рис. 12). Для характеристики топографии поверхности магнитно-модифицированных водорослей мы применили метод СЭМ, совмещенный с техникой энергодисперсионного рентгеновского анализа (EDX), определяющего элементный состав исследуемого вещества (Рис. 13). На изображениях модифицированных клеток четко видны МНЧ. Элементный анализ также показал наличие на спектрах, полученных от магнитно-модифицированных водорослей, характерные пики атомов железа, которые отсутствуют на спектрах интактных клеток, что дополнительно демонстрирует эффективное присоединение МНЧ.

Рис. 12. Типичные ПЭМ-изображения водорослей С. pyrenoidosa,: интактная клетка (А); м одифицированная PAH-MNP (В)

Рис. 13. Типичные СЭМ изображения водорослей С. pyrenoidosa: интактная клетка (слева) клетка, модифицированная PAH-MNP (справа) и соответствующие им спектры энергодцсп:.рсионного элементного анализа. Шката размера - 200 нм

Клетки дрожжей S. cerevisiae, модифицированные полиэлектролитными пленками и УНТ

Далее была показана возможность применения анизотропных наноструктур для иммобилизации на поверхности клеток. Анизотропные наноматериалы представляют особый и¡ггерес в сравнении с изотропными НЧ (такими, как наносферы благородных металлов и оксида железа). Нами были использованы многостенные УНТ. обладающие уникальными физико-химическими свойствами (Liu et а!., 2009). которые используются в биоэлектронике (Gheith et al„ 2006), биосенсорах (Zhang et al., 2007) и тканевой инженерии (Jan, Kotov, 2007). УНТ обладают линейными размерами, лежащими в I микродиапазоне (>100 нм), тогда как их диаметр не превышает 3040 нм. Таким образом, нанесение анизотропных наноструктур на поверхность живых клеток может существенно отличаться от нанесения НЧ.

Модификацию поверхности клеток S. cerevisiae проводили, как описано выше, при этом в многослойную полиэлектролигную пленку был включен слой предварительно окисленных многостенных УНТ.

50 дт

Рис.14. Типичные оптические микрофотографии дрожжей 5. сегеукше: интактные (А), модифицированные РАН/Р$8-УНТ (В); флуоресцентное изображение клеток, модифицированных РШ/т/РШП/ИТ/ Р['ГС-РАН/Р$5 (С)

После иммобилизации полюлектролигов и УНТ, клетки приобретают темно-зеленую окраску, что свидетельствует о включении УНТ в структуру многослойной пленки и формировании плотного слоя покрытия из УНТ на поверхности клеток (Рис. 14В).

Наногрубки относятся к классу 1-мерных наноструктур, имеющих большие латеральные размеры, в частности, длина используемых нами УНТ достигала несколько сотен нанометров, тогда как толщина пленки РАН/РЯЯ по данным литературы составляет около 1 нм (Уее1Ъас11ап е1 а!., 2007). В связи с этим, для оценки целостности и равномерности полученного нанопокрытия, на предпоследнем этапе нанесения вместо РАН мы использовали флуоресцентно-меченый Р1ТС-РАН. Дистальная флуоресценция модифицированных клеток подтверждает формирование многослойной пленки на клеточной стенке (Рис. 14С). при этом видно, что пленка не повреждена УНТ. включенным и в состав многослойного покрытия.

Для более детальной характеристики многослойных покрытий были применены методы просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии.

На изображениях тонких срезов клеток, полученных с использованием ПЭМ, видно, что изначально гладкая и ровная клеточная стенка дрожжей после модификации полиэлектролитными пленками и УНТ меняется, становится «ворсистой» из-за длинных нитей нанотрубок, иммобилизованных на поверхности клеток (Рис.15). Толщина многослойной пленки, содержащей УНТ, составила в среднем, 80 нм, но также встречались тонкие участки с толщиной 20-30 нм или очень широкие участки в 200 нм, что может быть связано с характером адсорбции УНТ. На поверхности клеток встречаются как единичные УНТ, так и их агрегаты, которые могут образовываться вследствие адсорбции изначально агрегированных нанотрубок, либо в процессе самосборки агрегатов при иммобилизации УНТ на поверхности клеток.

Необходимо отметить, что УНТ ориентированы на поверхности модифицированных клеток хаотично: некоторые из них плотно прилегают к клеточной стенке, другие прикреплены к поверхности только одной стороной и ориентированы наружу, придавая «ворсистый» внешний вид модифицированным клеткам. Эти наблюдения позволяют предположить, что полиэлектролитные многослойные пленки обеспечивают эффективное присоединение УИТ к поверхности клеток, что, однако не мешает проникновению низкомолекулярных молекул внутрь клетки.

Далее структура многослойной пленки, содержащей углеродные нанотрубки, была охарактеризована методом СЭМ. Показано, что иммобилизация УНТ ведет к образованию однородного, равномерного покрытия из нанотрубок и пленок на поверхности дрожжей, что четко видно при сравнении изображений ингактных и модифицированных клеток. На Рис. 15 видны длинные нити УНТ, неплотно прилегающих к клеточной стенке, что подтверждается ПЭМ микрофотографиями. Вероятно, что такие неприкрепленные нити УНТ могуг служить в качестве микроконтактов между клетками и источником электрического тока в микроэлекгронных устройствах.

Изучение жизнеспособности клеток, модифицированных на ном ате риалам и

В связи с необходимостью иммобилизации наноматериалов на поверхности живых клеток, далее была изучена жизнеспособность и физиологическая активность модифицированных клеток. Ранее в литературе было показано, что полиэлектролитные пленки не влияют на жиз неспособность клеток (К1аЬипс1е е1 а1., 2001; О^айрго е1 а1., 2002), а металлические НЧ (Ье^олвй е! а1., 2008; БаЛав е! а1„ 2010) и УНТ (ЬоЬе е1 а1, 2006) циготоксичны. Мы полагали, что включение НЧ в структуру многослойной пленки позволит избежать непосредственного контакта НЧ с поверхностными структурами клеток и проникновения в цитоплазму, тем самым жизнеспособность и физиологическая активность модифицированных клеток будет сохранена. Нами была оценена жизнеспособность модифицированных клеток.

В качестве универсального метода оценки жизнеспособности был выбран биохимический метод определения физиологической активности клеток с помощью

Рис. 15. Типичные ПЭМ изображения (А, В) и СЭМ изображения (С,й) дрожжей 5. сегеук1ае: интактная клетка (А, С); клетка, модифицированная РАН/РЗБ-УНТ (ДО)

диацетата флуоресцеина (ФДА), используемый в мировой практике для определения жизнеспособности как прокариотических (Green et al, 2006), так и эукариотических (Afrimzon et al, 2008) организмов. ФДА, гидрофобное нефлуоресцирующее соединение, легко проникает через интактную мембрану в цитоплазму, где подвергается расщеплению внутриклеточными несгвцифическими эстеразами с образованием флуоресцеина, обладающего зеленой флуоресценцией (при возбуждении Х=488 нм) (Bieeuweret al., 1995). Флуоресцеин полярен и не способен проходить через неповрежденные мембраны, вследствие этого вещество аккумулируется только в цитоплазме жизнеспособных клеток с интакгной цигоплазматической мембраной. Следовательно, метод позволяет оценить жизнеспособность модифицированных клеток по двум параметрам: по биохимической активности и ингактности поверхностных структур модифицированных наноматериалами клеток. Эксперименты проводились при оптимальном значении рН~6,5, необходимом для ферментативного гидролиза диацетата флуоресцеина (Bieeuweret al, 1995).

IIa Рис. 16 представлены флуоресцентные микрофотографии дрожжей S. ceievisiae, модифицированные многослойной полиэлектролитной пленкой, содержащей в своем составе различные наноструктуры (НЧ благородных металлов и УНТ), где отчетливо видно, что вне зависимости от типа используемых наноструктур, модифицированные клетки флуоресцируют зеленым цветом, т.е. являются физиологически активными, в то время как флуоресценция в термически инактивиро-ванных клетках (отрицательный контроль) не наблюдается. На оптических микрофотографиях дрожжей, модифицированных УНТ, просматриваются темные пятна агрегатов нанотрубок на поверхности некоторых клеток, которые вызывают ослабление интенсивности флуоресценции, не влияя при этом на жизнеспособность модифицированных клеток.

' *4f й А В

ч» Щ ^ЧК ....

г.

¿э

. в 20 цт ■■■ шш 20 цт

С D

20цт 25 um

Рис. 16. Типичные микрофотографии дрожжей X. сегеук1ае: оптическая микрофотография клеток, модифицированных РАН/РЗ$-УНТ (А) и соответствующее ей флуоресцентное изображение после инкубации клеток с ФДА (В); флуоресцентное изображение живых (С) и мертвых клеток (£>), модифицированных РАН/РЯБ-АиНЧ, после инкубации с ФДА

Рис. 17. Типичное СЭМ изображение

Кроме того, о жизнеспособности модифицированных НЧ дрожжей сегеУ!51ае, в частности, их способности к размножению, свидетельствует многократно встречаемые в образцах дрожжей почкующиеся клетки. Типичное изображение почкующейся клетки, полученное методом сканирующей электронной микроскопии, показано на Рис. 17, при этом видно, что дочерняя клетка не несет НЧ на своей поверхности.

почкующейся клетки S. cerevkiae

Аналогичные результаты были получены и для модифицированных бактерий £ coli и S. cohnii. Так, после обработки ФДА, в модифицированных АиНЧ клетках £ coli, наблюдалась флуоресценция, характерная для физиологически активных клеток с ненарушенной цитоплазм этической

мембраной (Рис. 18).

Рис.18. Типичное флуоресцентное изображение клеток £ coli. м одифицированных PAH/PSS-ЛиИЧ. после инкубации с ФДА

А В

с •

А.* • • « •

.. t- Л, с * •

' t - *

- .с - Ffc , в •

vÄV' " '

Рис. !9. 'Типичные оптические микрофотографии интактных лимфоцитов, окрашенных ТС (А): флуоресцентное изображение лимфоцитов, окрашенных ФДА: интактные (В) и модифицированные РАН/РИЯ-АиНЧ (С)

Жизнеспособность лимфоцитов после выделения определяли окрашиванием трипановым синим (ТС): на Рис. 19 видно, что краситель не аккумулируется в живых клетках. После иммобилизации АиНЧ на поверхности лимфоцитов, модифицированные клетки были повторно окрашены 1С, и мы наблюдали, что все модифицированные клетки окрашивались в синий цвет, характерный для ТС. Мы предположили, что это связано с тем. что 1С является анионным красителем, который при диссоциации в воде приобретает отрицательный заряд, и может связаться с заряженной пленкой, сформированной на поверхности лимфоцитов, что приводит к ложноотрицательному результату. Поэтому жизнеспособность интактных и модифицированных лимфоцитов была изучена с применением ФДА. На рисунках представлена типичная оптическая микрофотография интактных лимфоцитов, окрашенных 1С (Рис. 19А), и соответствующее ей флуоресцентное изображение лимфоцитов, обработанных ФДА (Рис. 19В), при этом в живых лимфоцитах наблюдается характерная зеленая флуоресценция (Рис. 19В). Далее модифицированные нанопленками и АиНЧ лимфоциты были окрашены ФДА, и было показано, что после модификации лимфоциты остаются жизнеспособными (Рис. 19 С).

Для оценки жизнеспособности конидий Т. а5реге11ит были исследованы процессы прорастания. Было показано, что модифицированные А§НЧ конидии Т. алрегеИит формируют мицелий после !2 часов инкубации при + 37° С (Рис. 20), тогда как в контрольном образце, содержащем интактные конидии, после 12 часов инкубации в суспензии серебряных наночастиц и с после дующей инкубацией при + Рис. 20. Оптическая микрофотография 37^ в 0,01М растворе сахарозы в течение 12 конидий модифицированных РАН/КБ- прорастания „е наблЮдалось.

АцНЧ, формируюгцихмицелии

Жизнеспособность модифицированных МНЧ водорослей С. pyrenoidosa изучали методом, основанным на автофлуоресценции водорослей при возбуждении светом с длиной волны 540 нм, что соответствует максимуму поглощения хлорофилла В. Ранее этот тест был разработан и успешно применен для демонстрации жизнеспособности водорослей рода Chlorella (Chong et al, 2008).

Клетки С. pyrerwidosa модифицировали РАН-сгабилизированными МНЧ, инкубировали их в течение 48 часов и определяли влияние МНЧ на клетки водорослей, результаты показаны на Рис. i 21. Видно, что в магнитно-модифицированных водорослях, так же как и в интактных, наблюдается красная флуоресценция, что означает отсутствие циготоксичности у РАН-стабилизированных МНЧ.

Таким образом, было показано, что вне зависимости от типа используемых наноструктур, разработанный нами метод иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток не Рис. 21. Флуоресцентное изображение ингибирует жизнеспособность и биохимическую клеток С. pyrerwidosa: интактных (а), активность модифицированных клеток. модифицированных РАН-МНР (Ь)

Практическое применение метода иммобилизации наноматериалов на поверхности

живых клеток

Характеристика клеток, модифицированных полиэлектролитами и НЧ благородных металлов, методом поверхностгю-усиленной романовской спектроскопии

Одним кз практических применений разработанного нами метода служит характеристика и детекция микроорганизмов с помощью поверхностно-усиленной рамановской спектроскопией (ПУРС), в основе которой лежит явление рамановского рассеяния света в веществе, сопровождающееся заметным изменением его частоты, что обусловленно химическим составом исследуемого вещества. При этом в спектре рассеянного излучения появляются спектральные линии, которых нет в спектре возбуждающего света (Otto, 1999). Обычно для изучения сигнала применяют обработку объектов наночастицами (в основном, Au и Ag). Наноразмерные частицы, за счет воздействия поверхностных плазмонов усиливают интенсивность спектра, при этом частицы должны находиться в непосредственном контакте (2-3 нм) с веществом. Стандартно, при работе с микроорганизмами, применяют технику смешивания, что дает ! неравномерное распределение частиц и большое количество агрегированных клеток (Kahiaman et al., 2008).

Разработанный же нами метод позволяет изучить единичные клетки, так как послойное нанесение полиэлекгролитных пленок и наночастиц приводит к уменьшению агрегации клеток. Для исследования были выбраны модифицированные клетки бактерий Е coli и S. cohnii, имеющие важное практическое значение в биотехнологии и медицине. На первом этапе были изучены операционные характеристики метода пробоподготовки для ПУРС. Было показано, что агрегаты клеток дают более интенсивный сигнал рамановского спектра, однако вое прош водим ость при этом значительно ниже, чем при использовании единичных клеток, также было установлено, что сигнал ПУРС, полученный от модифицированных клеток, характеризуется высокой воспроизводимостью. Необходимо отметить, что интактные клетки, АиНЧ и AgH4 и полиэлектролигы имеют слабый сигнал и не оказывают значительного влияния на итоговый сигнал, соответственно спектр ПУРС,

полученный от модифицированных бактерий, обусловлен биохимическим составог клеточных стенок.

Для оптимизации процесса иммобилизации нами были опробованы два подхода модификации поверхности клеток: (1) на поверхность клеток наносили многослойную пленку РАН/РБЗ/РАНА^НЧ (АиНЧ УРАН/РЗБ. (2) наносили бислойную пленк PAH/AgHЧ(AuHЧ)/PAH. Для оценки эффективности методов сравнивали спектры ПУП клеток, модифицированных композитными пленками (1 и 2). Из Рис. 22 видно, что спект клеток ЕсоИ , модифицированных как 1. так и 2 способом, содержит характерные дл данного микроорганизма пики, тогда как в спектре шггактных клеток различимые пик отсутствовали. Однако применение бислойной пленки РАН с включенными в ее состав Н1 благородных металлов позволяет получить более интенсивный сигнал ПУРС, поэтом далее мы использовали второй вариант метода иммобилизации.

Рис. 22. Спектр ПУРС кчеток ЕсоИ в зависимости от типа модификации а)РАН/АцНЧ/РАЬ. 6)PAH/PSS/РАН/Ах//'I/PAH/PSS; I) интактные. 2,3)модифицированные клетки

Известно, что химический состав НЧ влияет на характер спектра ПУРС, в связи с этт далее нами было изучено влияние АиНЧ и AgH4 je качество и воспроизводимое!

Рамановские спектры модифицированных

бактерий S. cohnii представлены на Рис. 23.

При анализе спектров установлено, что

спектральные пики идентичны и

воспроизводят друг друга, однако при

использовании серебряных ианочастиц

интенсивность сигнала выше и спектральные

пики более четкие, что может быть связано с

более интенсивным поверхностно-

„ ,, „ с- I •• плазмонным резонансом серебряных

Рис. 23. Спектры ПУРС клеток S. cohnu, ' .

модифицированных РАН/АцНЧ/РАН (А) и ианочастиц при волне возбуждения лазера РАН/АиНЧ/РАН (В) 830 нм.

Аналогичные результаты были получены и для бактерий £ coli. Таким образе» использование AgH4 для модификации клеточной стенки бактерий позволяет увеличил эффективность характеристики бактерий методом ПУРС, вследствие чего в дальнейше бактерии были модифицированы полиэлектролигными пленками и AgH4.

Па Рис. 24 представлены спектры модифицированных бактерий £ coli и S. cohnii, которые демонстрируют различия биохимической структуры клеточной стен» исследуемых бактерий, принадлежащих к разным видам. Известно, что S. cohnii грамположительный вид. обладающий толстой клеточной стенкой из многослойно! пегггидогликана, состоящего из N-ацетилглюкозоамина (NAG) и N-ацетилы у рам овс кислоты (NAM), тогда как £ coli - грамотрииательный вид. особенность клеточной стет

спектров модифицированных бактерий.

которого заключается в наличии наружной мембраны, состоящей из фосфолипидов, липополисахаридов, липопротеина и белков, под которой расположено периплазматическое пространство, содержащее один слой пепгидогликана (Lengeler et al., 2005).

При анализе спектров ПУ PC модифицированных бактерий £ coli и S. cohnii (Рис. 24) установлено, что основные различия выявляются при волновом числе около 730 см"1 Происхождение этого пика было ранее исследовано двумя группами ученых и 400 бею Ш 1000 1200 м'ю 1600 был0 выяснено, он определяется

Raman shin (cm *) молскулами производных

Рис. 24. Спектры ПУРС бактерий S. cohnii (А) и флавинадениндинуклеотвда (ФАД) NAG £ coli (В). модифицированных PAH/AgH4/PAH и NAM et al, 2004: Jarvis et al, 2004).

По интенсивности данного пика можно предположить, что пик 730 см"1 обусловлен всеми указанными биохимическими структурами клеточной стенки. ФАД является важным коферменгом, участвующим в окислительно-восстановительных реакциях, и локализуется главным образом во внутренней стороне клеточной стенки бактерий (Efrima, Zeiri, 2009). Ранее было показано, что при использовании техники непосредственного смешивания наночастиц с бактериями, AgH4 проникают в периплазматическое пространство благодаря гибкой структуре клеточной стенки грамсггрицательных бактерий и контактируют с производными ФАД, NAG и NAM, вследствие чего наблюдается интенсивный пик при 730 см"' m спектрах ПУРС £ coli (Kahraman et al, 2007; Kahraman et al, 2008). Однако в случае применения послойной модификации клеточной стенки пленками и AgH4 бактерий £ coli наблюдается очень слабая интенсивность пика 730 см"'. Возможно, что обработка клеток положительно заряженным пол иэле кт рол игом РАН увеличивает стабильность внешней мембраны £ coli и предотвращает доступ наночастиц к определенным участкам бактериальной стенки, где находятся производные ФАД и пепгидогликаны. Для сравнения были приготовлены образцы бактерий £ coli с использованием двух методов: техникой смешивания и послойной модификацией. Было выявлено наличие слабого пика при 730 см"1 в обоих случаях для £ coli, тогда как на спектре ПУРС модифицированных бактерий S. cohnii присутствовал четкий и интенсивный пик в области 730 см'1.

Исходя из этого, можно сделать два вывода: во-первых, в случае S. cohnii пик 730 см"' обусловлен NAG и NAM грам положительной клеточной стенки данного вида, а в случае £ coli - обеими биохимическими группами производных ФАД или NAG и NAM грам отрицательной стенки бактерий. Во-вторых, бислойная пленка РАН селективно связывается с определенными, возможно, наиболее отрицательно заряженными участками грам положительной бактериальной клеточной стенки, что объясняет результаты микроскопических исследований неравномерного покрытия клеток S. cohnii наночастицами.

По данным литературы, интенсивность и четкость спектров ПУРС, полученных при непосредственном смешивании наночастиц с клеток, обусловлены суммарным биохимическим составом клеток в составе образуемых агрегатов (Jarvis et al, 2008). Разработанный же нами метод модификации поверхности клеток наноматериалами позволяет идентифицировать и характеризовать единичные клетки. При использовании объектива х50 светового микроскопа, луч лазера фокусируется на клетке благодаря свойству AgH4 эффективно отражать свет.

Интенсивность получаемого сигнала ПУК ограничена размером пятна образцу облучаемого лазером, но если даже в образц находятся несколько клеток, луч лазера i диаметром 1 мкм может сфокусироватьс; только на единичной клетке. На Рис. 2: представлены рамановские спектры агрегато клеток и единичных клеток модифицированных бислойной пленкой РАН i Рис. 25. Спектры ПУPC S. cohnii. модифици- наночастицам и. Видно, что оба спектр рованных РАН/АцНЧ/РАН: агрегаты (А) и идентичны по характерным пикам i единичные клетки (В) отличаются только интенсивностью пиков.

Также установлено, что спектры ПУРС, полученные от модифицированных бактерий, обладают высокой воспроизводимостью. Кроме того, статистический анализ рамановских спектров, полученных от 8 различных бактерий S. cohnii, модифицированных АцНЧ, показал, что коэффициент вариации спектров, полученных от модифицированных бактерий, не превышает 10%, что подтверждает воспроизводимость метода.

Таким образом, было показано, что метод модификации клеток многослойными пленками, содержащими наночастицы благородных металлов, в разных вариациях может быть использован для характеристики биохимического состава клеточной стенки микром ицетов, бактерий различных видов, а также для определения видовой принадлежности единичных клеток в бактериальной смеси.

Применение дрожжей, модифицированных полиэлектролитными пленками и УНТ, в качестве чувствительных элементов электрохимических биосенсоров На данном этапе работы нами была продемонстрирована возможность применения электрохимических методов для характеристики дрожжей, модифицированных многослойными пленками, содержащими УНТ. Для этой цели регистрировали перенос электрона, используя феррицианид-ион в качестве искусственного акцептора электронов. Подобный подход был ранее успешно применен для быстрого и достоверного определения суммы окисляющихся органических соединений (показатель биохимического потребления кислорода) (Chen. 2008), этанола (Baronian, 2004) формальдегида (Khlupova et al., 2007) и скрининга токсичных соединений (Liu et al., 2009). Для детекции сигнала биосенсора регистрировали кривую окисления-восстановления иона [FeiCNje]1' в режиме циклической вольт-амперометрии. Участие феррицианида как акцептора электрона в дыхательной цепи микроорганизмов приводит к понижению его концентрации, а значит, и к снижению тока восстановления. При этом образующийся ферроцианид [Fe(CN)6f" восстанавливается на электроде с регенерацией исходной (активной) формы индикатора. Об эффективности феррицианида как акцетора электронов, а значит, об активности микроорганизмов, можно судить по величине тока восстановления и соотношению пиков на вольтамперограммах.

В данной работе был использован видоизмененный метод иммобилизации клеток на стеклоуглеродные электроды, предложенный Хлюповой (Khlupova et al.. 2007). Для этого на поверхность электрода наносили полимеры Рис. 26. Схема нанесения клеток на поверх- PAH/PSS и клетки, учитывая заряд наносимых ность стеклоуглеродных электродов слоев (схема - на Рис. 26)

Далее в раствор вводили феррицианид-ионы и регистрировали катодную вольтам перо-грамму. Полученные циклические вольтамперограммы феррицианид-иона на поверхности электрода, покрытого пленкой (PAH/PSS)), характерны для квазиобратимого переноса

«тем гам ют 14W <ш R»m«m «hrt (tm')

электрона. Об этом говорит симметрия пиков при несколько увеличенной разности потенциалов пика окисления и восстановления (150-180 мВ по сравнению с теоретическим 60 мВ). Величина стандартного редокс-потенциала, определяемая как полусумма потенциалов пика окисления и восстановления, сместилась в сторону несколько меньших анодных значений 15, =+200 мВ отн. Ag/AgC!) по сравнению со значением, полученным на непокрытом электроде (+295 mV). Это может быть связано со ограниченной скоростью переноса электрона через непроводящие слои пленки (PAH/PSSV Линейная зависимость тока в координатах I - Vu (I - ток пика восстановления феррицианида, мкА, и - скорость сканирования потенциала, мВ/с) характерна для диффузионного контроля переноса электрона (замедленной стадии переноса индикатора к поверхности электрода). При регистрации не-I скольких вольтам перограмм из одного раствора индикатора было установлено, что ток пика восстановления значительно увеличивался после первого сканирования и далее оставался постоянным в течение, по крайней мере, 30 мин.

После включения слоя живых ингактных клеток в многослойную полимерную пленку ток восстановления [FeiCN^j'" значительно уменьшался по сравнению с аналогичным измерением в отсутствие клеток. Это может быть связано с участием [Fe(CN), f' в переносе электрона по электрои-транепортной цепи живых клеток. В подтверждение этого, при использовании термически инактивированных клеток восстановления /FefCN),,]'' в зависимости регистрируемое значение тока незначительно от модификации клеток дрожжей возрастало (Рис.27).

Изменение тока пика восстановления феррицианида при переходе от живых к мертвым клеткам составило 2,2 ± 0,1 мкА, или 20% от начального величины тока пика, наблюдаемого для пленки PAH/PSS в отсутствие клеток. Далее были изучены клетки, модифицированные полиэлектролигными пленками PAH/PSS и многостенными углеродными нанотрубками. Морфология вольтам перограмм [Fe(CNH на электродах, модифицированных покрытиями, содержащими клетки, и покрытых только пленкой PAH/PSS, была в целом одинакова. Наблюдалась хорошо разрешенная пара редокс-пиков обратимого переноса электрона. При этом значение тока пика восстановления [Fe(CN)i] при внесении в поверхностный слой живых клеток дрожжей, модифицированных УНТ, уменьшался до 9.0±0,2 мкА. Для сравнения, в случае иммобилизации УНТ на поверхности мертвых клеток дрожжей он составил 12,0±0,1 мкА. Таким образом, изменение тока в экспериментах с живыми и мертвыми клетками, модифицированными многослойными полиэлектролигными пленками, содержащими в своем составе УНТ, была выше, чем для интактных живых и мертвых клеток в тех же условиях измерения сигнала. В то же время, эффективность переноса электрона, на ион индикатора, определяемая как уменьшение тока пика восстановления по сравнению с электродом, модифицированным слоем (PAH/PSS)). была выше для модифицированных клеток. Возможно, это связано с частичным электростатическим отталкиванием отрицательно заряженных редокс-анионов от УНТ, несущих карбоксильные группы.

Различное поведение модифицированных живых и мертвых клеток также проявлялось на стадии отмывки электродов после измерения. Для контроля стадии отмывки электроды сначала инкубировали в растворе [Fe(CN>, f" и далее переносили в 0,5 М NaCl, не содержащий феррицианид-ионов. В обычных условиях токи, отнесенные к восстановлению феррицианид-иона, снижались до нуля в течение S0 мин, что

1 nJ

0 6 12 18 24 30 t. мин

Рис. 27. Изменения тока

свидетельствовало о быстром высвобождении феррицианида из поверхностного слоя | Однако для электродов, покрытых модифицированными клетками, было обнаружен первоначальное увеличение тока восстановления на 15% от начального значения. Далее ' различия в сигналах электродов, покрытых живыми и мертвыми модифицированным клетками, в течение 3 минуг отмывки достигали 50% от начальногозначения. Это являете вполне достаточным признаком для распознавания живых и мертвых клеток, включенны: в полимерные слои. Мы предполагаем, что полученные результаты могут быт использованы в создании респираторных микробных сенсоров или в антимикробны тестах для увеличения чувствительности определения антимикробной активност препаратов или оценки показателей жизнеспособности клеток.

Перспективы практического применения одноклеточных водорослей модифицированных магнитными наночастицами

Разработанный метод иммобилизации МНЧ на поверхности живых клеток водоросле может быть применен для пространственной манипуляции магнитно-модифицированным клетками с помощью постоянного внешнего магнитного поля. Это открывает новьи возможности для применения таких магнетизированных водорослей при создани] микрофлюидных устройств, микроканальных биосенсоров, а также искусственны: фотосинтетических ячеек.

В качестве одного из возможных практически: применений мы предлагаем министруктурировани клеток, ассоциированных вокруг магнитов. Так, магнетизированные водоросли С. ругепо1с1оха мож но расположить в определенном порядке на по верхности стекла при помощи небольших магнито_ с диаметром - 2мм. находящихся под стеклом, ка. показано на Рис. 28. Мы полагаем, что подобную технику можно применить для непосредственной: нанесения магнетизированных клеток на микрока налы или микроэлекгроды, оснащенные микромаг нигам и, для создания оптических или элекгрохи-м ических биосенсоров.

Магнитное поведение РАН-МНЧ модифицированных водорослей С. ругепоМояа было изучено с применением коэрцитивного спектрометра, где в качестве контроля использовали интактные водоросли С. ругепо1с1о5а. На Рис. 29 показано, что магнетизированные клетки С. ругепо1(1оза обладают супергарамагнигными свойствами, тогда как интактные водоросли не проявляют магнитных свойств.

Рис. Фотография, ичлюстрирующая процесс микроструктурирования МНЧ-модифицированных водорослей

-3000 -1000 1000 3000 Applied magnetic field. Ое

Рис. 29. Изотермические кривые магне-тизации водорослей С. pyrenoidosu: ин-тактных (А) и МНЧ-модифицированных (В) клеток

Характер кривой магнетизации позволяет предположить, что клетки С. pyrenoidosa, модифицированные РАН-сгабилиз ированным и МНЧ, будут проявлять магнитные свойства только при их помещении во внешнее магнитное поле. Это позволяет использовать МНЧ-модифицированные клетки С. pyrenoidosa как чувствительный элемент биосенсоров, которые будут обладать преимуществами многократного использования. Кроме того. МНЧ-модифицированные водоросли могут использоваться в других биотехнологических приложениях благодаря широкому спектру ферментативной активности клеток.

ВЫВОДЫ

1. Разработанный метод иммобилизации наноматериалов путем их включения в состав биосовместимых полиэлектролигных многослойных пленок позволяет эффективно присоединить сферические наночастицы и углеродные нанотрубки к поверхности прокариотических и эукариотических клеток.

2. Об эффективности иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток свидетельствуют результаты исследования поверхности модифицированных клеток методами сканирующей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, спектрометрии энергетической дисперсии. Методом просвечивающей электронной микроскопии на тонких срезах модифицированных клеток показано наличие слоя наночастиц на поверхности клеток и отсутствие их в цитоплазме.

3. После .покрытия клеток полимерными пленками и наночастииами дрожжи 5. cerevisiae сохраняют способность к почкованию, конидии Т. asperellum сохраняют способность к прорастанию и формированию мицелия, одноклеточные водоросли С. pyrenoidosa сохраняют способность к фотосинтезу. У всех исследованных клеток сохраняется эстеразная активность и целостность цигоплазматических мембран.

4. Разработанный метод позволяет иммобилизовать наноматериалы на поверхности клеток и модифицировать клетки эукариот и прокариот наноматериалами и полимерными пленками с целью их последующего использования в идентификации микрорганизмов методом поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (наночастицы благородных металлов), разработке электрохимических клеточных биосенсоров (углеродные нанотрубки) и применении магнитно-модифицированных клеток в микроаналитических устройствах (магнитные наночастицы).

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Zamaleeva, A. I. Polyelectrolyte-mediated assembly of multi-walled caibon nanotubes on living yeast cells I A. I. Zamaleeva, L R. Sharipova, A. V. Porfireva, G. A. Evtugyn, R. F.Fakhrullin // Langmuir. - 2010. - V. 26. - P. 2671-2679.

2. Fakhrullin, R. F. Interfacing living unicellular algae cells with biocompatible poiyelectrolyte-stabilised magnetic nanoparticles / R. F. Fakhrullin, L. V. Shlykova, A. I. Zamaleeva, D. K. Nurgalicv, Y. N. Osin, J. García-Alonso, V. N. Paunov // Macromol. Biósci. - 2010. - V. 10. - DOI: 10.1002/mabi.201000161

3. Замалеева, А.И. Микроскопические методы для характеристики наномодифицированных клеток микромицетов / А.И. Замалеева. Ф.К. Алимова, Д.Г. Ишмухаметова, Р.Ф. Фахруллин // Ученые записки Казанского государственного университета. - 2010. - Т. 152. Серия «Естественные науки». - С. 110-120.

4. Fakhrullin, R.F. living fungi cells encapsulated in polyelectrolyte shells doped with metal nanoparticles / R.F. Fakhrullin, AJ. Zamaleeva. M.V. Morozov. D.L Tazetdinova, F.K. Alimova, A.K. Hilmutdinov. R.I. Zhdanov, M. Kahraman, M. Culha // Langmuir. - 2009. -V. 25. - P. 4628-4634.

5. Замалеева, А.И. Наномодифицированные бактерии: детекция единичных клеток методом поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии / А.И. Замалеева, М. Kahraman, М. Qulha, Р.Ф. Фахруллин // Ученые записки Казанского государственного университета. - 2009. - Т. 151. Серия «Физико-математические науки». -С. 82-89.

6. Kahraman, М. Layer-by-layer coating of bacteria with noble metal nanoparticles for surface-enhanced Raman scattering / M. Kahraman, A. I. Zamaleeva, R. F. Fakhrullin, M.Culha // Anal. Bioanal. Chem. - 2009. - V. 395. - P.2559-2567.

7. Fahrullin, R.F. Quartz eiystal microbalance immunosensor for the detection of antibodies to double-stranded DNA / R.F. Fahrullin, V.G. Vinter, AJ. Zamaleeva. M.V. Matveeva. R.A. Kouibanov, B.K. Temesgen, D.G. Ishmuchametova, ZL Abramova. O.A. Konovalova, M.K. Salakhov // Anal. Bioanal. Chem. - 2007. - V. 388. - P. 367-375.

Патенты:

8. Замалеева, А.И. Способ модификации живой клетки / А.И. Замалеева, Ф.К. Алимова. Р.Ф. Фахруллин II Патент РФ № 2377310. - 2009. - Бюл.№36.

Тезисы докладов и материалов конференций:

9. Замалеева. А.И. Иммобилизация наноматериалов на поверхности клеток и и характеристика методами микроскопии / А.И. Замалеева, И.Р. Шарипова, JI.E Шлыкова, М. Kahraman. М. Qulha, Р.Ф. Фахруллин // IV Международная конференци "Современные достижения биоианоскопии". Сб. тезисов. -Москва. - 2010. -С.26.

10. Замалеева. А.И. Наномодифицированные микроорганизмы: нанесение полимерны оболочек и наночастиц на поверхность клеточных стенок / А.И. Замалеева, И.1 Шарипова. Р.Ф. Фахруллин// XIII Международная конференция молодых учены: студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработк высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения». Сб. тезисов. - Казан1 -2009.-С. 342.

1 l.Zamaleeva, A. I. Encapsulation of individual living cells in polymer shells doped wit inorganic nanoparticles and microparticles / A. I. Zamaleeva, R. T. Minullina, R. I Fakhrullin. M. Culha, M. Kahraman, F. K. Alimova, J. Garcia-Alonso. V.N. Paunov // IV Ul Polymer Colloids Forum. Abstract book. - Hull. - 2009. - P. 17.

12.3амалеева. A.M. Инкапсуляция живых клеток в полиэлектролигные нанопленк! содержащие металлические наночастицы и углеродные нанотрубки / А.И. Замалеев; И.Р. Шарипова, Р.Ф. Фахруллин // Всероссийская конференция с элементами научно школы для молодежи «Структура и динамика молекулярных систем». Сб. тезисов Казань,-2009.-С.24.

13.Zamaleeva. A.I. Encapsulation of individual living cells in polyeleclolyte shells doped wit inoiganic nanoparticles and catbon nanotubes / A.I. Zamaleeva, R.F. Fakhmllin // 13h annu; symposium for biology students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion t Bordeis». Abstract book. - Kazan. - 2009. - P. 97.

14. Минуллина, P.Т. Модификации живых клеток полиэлекгролитными нанопленками металлическими наночастииами / Р.Т. Минуллина, А.И. Замалеева, Р.Ф. Фахруллин Всероссийская школа-сем инар для студентов, аспирантов и молодых учены «Нанотехнологии: проблемы и перспективы». Сб. тезисов. - Белгород. - 2008. - С. 9.' 97.

15.Замалеева. А.И. Поверхностная структура клеток дрожжей, покрытых полимерным тонкими пленкями и золотыми наночастицами/ А.И. Замалеева, Д.И. Тазетдинова, M.I Морозов, Ф.К. Алимова, А.Х. Гильмутдинов, Р.Ф. Фахруллин // II Международна конференция "Современные достижения бионаноскопии". Сб. тезисов. - Москва. 2008.-С.26.

16. Fakhmllin, R.F. Anisotropic microcapsules coated with metal nanoparticles / R.F. Fakhrullii AJ.Zamaleeva. ZI. Abramova, V.N. Paunov // II Saint-Peteisburg international conferenc of NanoBioTechnologies "NanoBio'08". Book of abstracts. - S.-Peteisburg. - 2008. - P.65.

17.Коннова, C.A. Микросферы и микрокристаллы, содержащие металлически наночастицы / С.А. Коннова, Р.Х. Хакимова. А.И. Замалеева. Р.Ф. Фахруллин // Международная научно-практическая конференция «Постгеномная эра в биологии проблемы биотехнологии». Материалы конф. - Казань. - 2008. - С. 55.

18.Мамаков. Т.В. Микрокристаллы и микросферы с магнитными свойствами /Т.1 Мамаков, А.Г. Бикмуллин, А.И. Замалеева. Р.Ф. Фахруллин //И Международна конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». Материал конф. - Казань. - 2008. - С. 77.

19.Минуллина, Р.Т. Модификация живых клеток неорганическими микросферами металлическими наночастицами / Р.Т. Минуллина, Р.К. Вафина, А.И. Замалеева, Р.<1 Фахруллин // II Международная научно-практическая конференция «Постгеномная эр в биологии и проблемы биотехнологии». Материалы конф. - Казань. - 2008. - С. 85.

20.Замалеева, А.И. Модификация микроорганизмов наночастицами для их детекци методом поверхностно-усиленной Рамановской спектроскопии / А.И. Замалеева, \ Kahraman, М. Qulha, Р.Ф. Фахруллин // XXII Международная молодежная научнг школа «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия». Сб. статей. - 2008. - С. 15' 160.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность доц. М. Culha. М. Kahraman и коллективу ueirrpa нанотехнологий университета Yedilepe (Стамбул, Турция) за техническую помощь при работе с системой рам а но не кой микроспекгроскопии, Ю.Н. Осину и К. Tatlidil за техническую помощь при работе с СЭМ, д.б.н. В.В. Сальникову и A. Lowry за техническую помощь при работе с ПЭМ, проф. Ф.К. Алимовой и коллективу лаборатории сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии каф. биохимии за предоставление культуры Т. asperellum, проф. университета г. Халл В.Н. Паунову (Великобритания) за предоставление химических реактивов, проф. А.П. Киясову за предоставление возможности работы на микроскопах на базе каф. анатомии КГМУ, проф. А.Х. Гильмутдинову и М.В. Морозову за предоставление возможности работы на атомно-силовом микроскопе, проф. Г. А. Евтюгину за помощь в проведении электрохимических исследований, проф. Д. К. Нургалиеву за помощь в проведении магнитометрических исследований, инж. B.C. Гаврилову за квалифицированную техническую помощь, проф. Д.М. Зубаирову, проф. Г.Ф. Сигдиковой и к.б.н. A.B. Яковлеву за консультации при написании диссертации, а также лаборатории биоматериалов и наноматериалов и всему коллективу кафедры биохимии КФУ.

Искреннюю благодарность и признательность автор выражает научному руководителю проф. Дипяре Галимовне Ишмухаметовой и научному консультанту к.б.н. Равилю Фаридовичу Фахруллину за руководство работой, помощь в выполнении исследований и моральную поддержку при написании диссертации.

Автор также благодарит семью - папу, маму, сестру, своих родных и близких за постоянну ю поддержку и любовь.

Отзывы на автореферат просьба отправлять по адресу 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18, КФУ, Отдел аттестации научных кадров, Диссертационный совет Д 212.081.08, Ученому секретарю З.И. Абрамовой, факс: (843)238-76-01

С авторефератом диссертации также можно ознакомиться на сайте КФУ http://www.ksu.pj/uni/sank/mdex.pbp7ids7

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Замалеева, Алсу Ильгизовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Многослойные тонкие пленки из полимеров как инструмент модификации поверхностей

1.1. 1. Конструирование многослойных полимерных тонких пленок для модификации планарных поверхностей

1.1.2. Трехмерные композитные конструкции, состоящие из полимерных пленок и коллоидных частиц

1.2. Клетки эукариот и прокариот как объекты для иммобилизации наноматериалов

1.2.1. Формирование оболочек из тонких полимерных пленок на поверхности клеток

1.2.2. Клетки, модифицированные наноматериалами, как компоненты функциональных устройств

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммобилизация наноматериалов на поверхности живых клеток эукариот и прокариот"

Актуальность проблемы

В течение последних лет функциональные наноструктуры привлекают все больший интерес ученых благодаря уникальным свойствам и возможности их широкого применения в различных областях: электронике (Murray et al., 2000; Lee et al., 2009), оптике (Schmid et al., 1998) и биосенсорах. (Bottomley et al., 2004; Mani et al., 2009). Применение наноматериалов в сочетании с биологическими макромолекулами позволяет создавать новые методы диагностики заболеваний (Gao et al., 2004.; Park et al., 2009) и разрабатывать новые биологически совместимые материалы с необычными свойствами (Krol et al., 2005; Safarik et al., 2007).

Кроме того, многочисленные исследования в течение последнего десятилетия были посвящены созданию и изучению гибридных систем, построенных с применением наноматериалов на основе биологических клеток. Эти работы, в основном, сфокусированы на создании микро- и наноконтейнеров для направленной доставки лекарств (Mohwald 2000), микроэлектронных устройств (Berry et al., 2004) и контролируемой иммобилизации клеток (Krol et al., 2005).

Наноматериалы рассматриваются как перспективные модификаторы поверхностных структур клеток. Например, широко используются полимеры, микрочастицы, наночастицы и их всевозможные комбинации (Dahne et al., 2004). На сегодняшний день имеются лишь несколько работ, в которых описывается иммобилизация наночастиц на поверхности различных клеток. В частности, было показано нанесение золотых наночастиц на поверхность клеток Е. coli с целью создания электрических микроконтактов (Berry et al., 2004). Получены и охарактеризованы комплексы никелевых наночастиц и клеток бактерий для создания на их основе магнитных микроустройств (Jing et al., 2007). Поверхность клеток дрожжей Kluveromyces fragilis была модифицирована магнитными наночастицами с целью создания систем сорбции токсичных веществ с последующим удалением магнетизированных клеток (Safarik et al., 2007). Однако в указанных работах клетка не рассматривается как живая функционирующая система, хотя очевидно, что находящиеся в непосредственной близости от поверхности живой клетки наноматериалы могут оказать существенное влияние на функционирование биохимического аппарата клетки и межклеточные взаимодействия. Очевидно, что изучение взаимодействия живых клеток с наноматериалами представляет особый интерес, и обусловлено это тем, что гибридные системы, полученные на основе наноматериалов и живых клеток, могут быть использованы для выявления токсичных свойств наноматериалов, для направленного изменения свойств клеток, регуляции физиологической активности клеток, визуализации клеточных органелл и высокоточной спектральной идентификации живых клеток, основанной на различиях в биохимическом составе их поверхностных структур. В связи с этим является весьма актуальным разработать такие методы иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток, которые позволяют сохранить их физиологическую активность.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилась иммобилизация наноматериалов на поверхности живых клеток и характеристика модифицированных клеток. Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод иммобилизации сферических наночастиц благородных металлов, магнитных наночастиц, а также углеродных нанотрубок на поверхности клеток прокариот и эукариот с использованием послойного нанесения биосовместимых синтетических и биогенных полиэлектролитов.

2. Охарактеризовать распределение наноматериалов на клеточных стенках и цитоплазматических мембранах клеток.

3. Исследовать влияние иммобилизованных наноматериалов на жизнеспособность модифицированных клеток.

4. Оценить возможность использования метода иммобилизации наноматериалов на клеточных стенках и цитоплазматических мембранах живых клеток для модификации клеток с целью их идентификации спектроскопическими методами, а также использования модифицированных клеток в электрохимических биосенсорах и микроаналитических устройствах.

Научная новизна

В работе впервые описан универсальный метод иммобилизации наноматериалов на поверхности живых клеток путем включения наноструктур в состав многослойных полимерных и биополимерных полиэлектролитных пленок, что позволило привести их в контакт с клетками в непосредственной близости от поверхностных клеточных структур без проникновения наноструктур в цитоплазму.

Показано, что формирование наноструктурированных пленок на поверхности клеток разработанным нами методом не влияет на жизнеспособность модифицированных клеток.

Впервые были получены и охарактеризованы гибридные системы, состоящие из живых клеток и наноматериалов различной природы.

Практическая значимость

Разработанный метод иммобилизации наночастиц благородных металлов на поверхности живых клеток может быть использован для изучения биохимического состава клеток с применением поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии.

Модифицированные углеродными нанотрубками клетки могут быть использованы в качестве чувствительного элемента электрохимических биосенсоров для определения цитотоксичных веществ.

Клетки, модифицированные полиаллиламин гидрохлорид-стабилизированными магнитными наночастицами, могут найти применение в микроканальных устройствах, так как после модификации возникает возможность пространственного манипулирования ими с помощью внешнего магнитного поля.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный универсальный метод модификации живых клеток позволяет эффективно иммобилизовать широкий спектр наноматериалов на поверхности клеток эукариот и прокариот.

2. Клетки, модифицированные наноматериалами, сохраняют физиологическую активность, что позволяет использовать их в качестве структурных элементов биоэлектронных устройств.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2008-2010 гг.), IV международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2008), II международной" научно-практической конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2008), XII международной научной молодежной школе "Когерентная оптика и оптическая спектроскопия" (Казань, 2008), всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2008), II Saint -Petersburg international conference of NanoBioTechnologies «NanoBio'08» (С.Петербург, 2008), XIII всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Казань, 2009), XIII международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений — V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009), XIII европейском симпозиуме студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз 2009» (Казань, 2009), 14th

UKPCF Annual Meeting «UK Polymer Colloids Forum» (Великобритания, 2009). Работа была поддержана молодежным грантом Академии Наук Республики Татарстан (№ 14-15/2009(Г)) и Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса» («УМНИК») (№ 19-У-08-6).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, включает 78 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 203 источника.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Замалеева, Алсу Ильгизовна

ВЫВОДЫ

1. Разработанный метод иммобилизации наноматериалов путем их включения в состав биосовместимых полиэлектролитных многослойных пленок позволяет эффективно присоединить сферические наночастицы и углеродные нанотрубки к поверхности прокариотических и эукариотических клеток.

3. После покрытия клеток полимерными пленками и наночастицами дрожжи S. cerevisiae сохраняют способность к почкованию, конидии Т. asperellum сохраняют способность к прорастанию и формированию мицелия, одноклеточные водоросли С. pyrenoidosa сохраняют способность к фотосинтезу. У всех исследованных клеток сохраняется эстеразная активность и целостность цитоплазматических мембран.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Замалеева, Алсу Ильгизовна, Казань

1. Кондратьева, И.А. Практикум по иммунологии / под ред. И.А. Кондратьевой, А.А. Ярилина // М.: «Академия». 2004. - 272 с.

2. Ревин, В.В., Биофизика / В.В. Ревин, Г.В. Максимов, О.Р. Колье // Мордов. ун-т. 2002. - 156 с.

3. Ai, H. Electrostatic layer-by-layer nanoassembly on biological microtemplates / H. Ai, M. Fang, S.A. Jones, Y. Lvov // Platelets Вiomacromolecules. 2002. - V. 3. - P. 560-564.

4. An, Z. Fabrication and characterization of human serum albumin and L- a -dimyristoylphosphatidic acid microcapsules based on template technique / Z. An, C. Tao, G. Lu, H. Mohwald, S. Zheng, Y. Cui and J. Li // Chem. Mater. -2005-V. 17(10). P. 2514-2519.

5. Anzai, J. Construction of multilayer thin-films of enzymes by means of sugar-lectin interactions /J. Anzai, Y. Kobayashi // Langmuir — 2000. V. 16 — P.2851—2856.

6. Arida, A.I. Encapsulation of ketoprofen for controlled drug release / A. I. Arida, M.M. Al-Tabakha // Eur. J. Pharm.'Biopharm. 2007. - V. 66. - P. 48-54.

7. Aruoja, V. Toxicity of nanoparticles of CuO, ZnO and Ti02 to microalgae Pseudokirchneriella subcapitata / V. Aruoja, H.-C. Dubourguiera, K. Kasemetsa, A. Kahrua // Science Tot. Environ. 2009. - V.40 (7). - P. 14611468.

8. Asharani, P.V. Cytotoxicity and genotoxicity of siver nanoparticles in human cells / P.V. Asharani, Kah Mun G.L., Hande M.P. and Valiyaveettil S. // ACS nano. 2009. - V.3. - P. 279-290.

9. Baronian , K.H.R. The use of yeast and moulds as sensing elements in biosensors / К. H. R. Baronian // Biosens. and Bioelectr. 2004. - V.19. — P.953-962.

10. Baumler, H. Biological cells as templates for hollow microcapsules / H. Baumler, B. Neu, A. Voigt, R. Mitlohner, S. Leporatti, C.Y. Gao, E. Donath, H. Kiesewetter, H. Mohwald, H.J. Meiselman // J. Microencapsulation. — 2001. V. 18(3). - P. 385-395.

11. Ben-Yoav, H. A whole cell electrochemical biosensor for water genotoxicity bio-detection / H. Ben-Yoav, A. Biranb, R. Pedahzurb, S. Belkinb, Se. Buchingerc, G. Reifferscheidc, Y. Shacham-Diamanda // Electrochim. Act. -2009.-V. 54.-P. 6113-6118.

12. Bekyarova, E. Functionalized single-walled carbon nanotubes for carbon fiber-epoxy composites / E. Bekyarova, T. Thostenson, A. Yu, M. E. Itkis, D. Fakhrutdinov, T-W. Chou, R. C. Haddon // Phys. Chem. 2007. - V.lll (48).-P. 17865-17871.

13. Bergbreiter, D.E. Polyvalent hydrogen-bonding functionalization of ultrathin hyperbranched films on polyethylene and gold / D.E. Bergbreiter, G.L. Tao, J.G. Franchina, L. Sussman // Macromol. 2001. - V. 34 - P. 3018-3023.

14. Berry, V. Highly selective, electrically conductive monolayer of nanoparticles on live bacteria / V. Berry, S. Rangaswamy, R. F. Saraf // Nano Letters. —2004.-V. 46. -P.939 -942.

15. Berry, V. Self-assembly of nanoparticles on live' bacterium: an avenue to fabricate electronic devices / V. Berry, R. F. Saraf // Angew. Chem. Int. Ed. —2005. V. 44. - P. 6668 -6673.

16. Blodgett, К. B. Monomolecular films of fatty acids on glass / К. B. Blodgett // J. Am. Chem. 1934. - V.56. - P.495- 513.

17. Blodgett, К. B. Build-up films of barium stearate and their optical properties / К. B. Blodgett, I. Langmuir//Phys. Rev. 1937. - V.51. - P. 964-982.

18. Bottomley, L. A. Impact of nano- and mesoscale particles on the performance of microcantilever-based sensors / L. A. Bottomley, M. A. Poggi, S. Shen // Anal. Chem. 2004. - V.76 (19). - P. 5685-5689.

19. Brynda, E. Characterization of flexibility of ultrathin protein films by optical sensing / E. Brynda, M. Houska, A. Wikerstal, Z. Pientka, J. E. Dyr, A. Brandenburg // Langmuir. 2000. - V. 16. - P. 4352-4357.

20. Caruso, F. Assembly of alternating polyelectrolyte and protein multilayer films for immunosensing / F. Caruso, K. Niikura, N. Furlong, Y.Okahata // Langmuir. 1997. -V. 13. - P. 3427-3433.

21. Caruso, F. Magnetic nanocomposite particles and hollow spheres constructed by a sequential layering approach / F. Caruso, M. Spasova, A. Susha, M. Giersig, R.A. Caruso//Chem. Mater. 2001.-V. 13(1).-P. 109-116.

22. Caruso, F. Enzyme encapsulation in layer-by-layer engineered polymer multilayer capsules / F.Caruso, D. Trau, H. Mohwald, R. Renneberg // Langmuir. -2000. V.16(4). -P.1485-1488.

23. Cayre, O.J. Fabrication of novel colloidosome microcapsules with gelled aqueous cores / O.J. Cayre, P.F Noble, V.N. Paunov // J. Mater. Chem. -2004.-V. 14.-P. 3351-3355.

24. Chang, R. K. Surface enhanced raman scattering / R. K. Chang, Т. E. Furtak // Plenum Press. 1982. - P. 432.

25. Cheng, L. Electrochemical-behavior and electrocatalytic properties of ultrathin films containing silicotungstic heteropolyanion SiWl 20404 / L. Cheng, S. J. Dong // J.Electrochem. — 2000. — V. 147. — P. 606-612.

26. Cheung, J.H. Molecular-level processing of conjugated polymers. Layer-by-layer manipulation of polyaniline via electrostatic interactions / J.H. Cheung, W.B. Stockton, M.F. Rubner // Macromolecules. 1997. - V. 30(9). -P.2712-2716.

27. Chong, K.F. Whole cell environmental biosensor on diamond / K.F.Chong , K.P. Loh, K. Ang ,Y.P. Ting // Analyst. 2008. - V. 133(6). - P. 739-743.

28. Chouteau, C. A bi-enzymatic whole cell conductometric biosensor for heavy metal ions and pesticides detection in water samples / C. Chouteau, S. Dzyadevych, C. Durrieu, J.M. Chovelon // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 21.-P. 273-281.

29. Choy, K.L. Vapor processing of nanostructured materials. In: nalwa HS (ed) handbook of nanostructured material and nanotechnology / K.L. Choy // Academic Press, New York. 2000. - 389 p.

30. Chu, L.Y. A molecular-recognition microcapsule for environmental stimuli-responsive controlled release'/ L.Y. Chu; T. Yamaguchi, S. Nakao // Adv. Mater. 2002. -V.14.- P. 386-389.

31. Correa-Duarte, M.A. Layer-by-layer assembly of multiwall carbon nanotubes on spherical colloids / M.A. Correa-Duarte, A. Kosiorek, W. Kandulski, M. Giersig and L.M. Liz-Marzan // Chem. Mater. 2005 - V. 17(12). - P. 3268 -3272.

32. Cortez, C. Targeting and uptake of multilayered particles to colorectal cancer cells / C. Cortez, E. Tomaskovic-Crook, A.P.R. Johnston, B. Radt, S.H. Cody , A.M. Scott, E.C. Nice, J.K. Heath, F. Caruso // Adv. Mater. 2006. - V.18. -P. 1998-2003.

33. Crespilho, F. N. Electrochemistry of layer-by-layer films: a review / F. N. Crespilho, V. Zucolotto, O. N. Oliveira Jr., F. C. Nart // Int. J. Electrochem. Sci. -2006. V.l. - P. 1194-1214'.

34. Culha, M. Characterization of thermophilic bacteria using surface-enhanced raman scattering / M. Culha, A. Adigtizel, M.M. Yazici, M. Kahraman, F. Sahin, M. Gulluce // Appl. Spectrosc. 2008. - V. 62. - P.1226-1232.

35. Dahne, L. Tailor-made polyelectrolyte microcapsules: from multilayers to smart containers / L. Dahne, C.S. Peyratout // Angew. Chem. Int. Ed. — 2004. -V. 43.-P. 3762-3783.

36. Dai, Z.F. Highly stable and biocompatible nafion-based capsules permeability for low molecular weight species / Z.F. Dai and H. Mohwald // Chem. Eur. J. 2002 - V. 8. - P. 4751-4755.

37. Daligault, F. Microalga Chlorella sorokiniana: a new sulfoxidation biocatalyst / F. Daligault, C. Nugier-Chauvin, H. Patin // Org. Biomol. Chem. 2006. -V. 4.-P. 1474-1477.

38. Damosa, F. S. Dissolved oxygen amperometric sensor based on layer-by-layer assembly using host-guest supramolecular interactions / F. S. Damosa, R. C.S. Luza, A. A. Tanakac, L. T. Kubota // Anal. Chim. Acta. 2010. - V. 664. — P.144-150.

39. Davidson, M.W. Optical microscopy / M.W. Davidson, M. Abramowitz // Molecular expressions: optical microscopy primer. 1999. — 41p.

40. Decher, G. Fuzzy nanoassemblies: toward layered polymeric multicomposites /G. Decher //Science. 1997.- V.277. - P. 1232-1237.

41. Decher, G. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolyte / G. Decher, J. Schmitt//Hog. Colloid Polym. Sci. 1992. - V.89. - P. 160-164.

42. Decher, G. New nanocomposite films for biosensors: layer-by-layer adsorbed films ofpolyelectrolytes, proteins or DNA / G. Decher, B. Lehr, K. Lowack, Y. Lvov, J. Schmitt//Biosens. Bioelectron. 1994. - V. 9. - P. 677-684.

43. Decher, G. Multilayer thin films / G. Decher, J. B. Schlenoff// Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. 2002. -P. 535.

44. Diaspro, A. Single living cell encapsulation in nano-organized polyelectrolyte shells / A. Diaspro, D. Silvano, S. Krol, O. Cavalleri, A. Gliozzi // Langmuir. 2002. - V.l 8. - P.5047-5050.

45. Ding, L. Trends in cell-based electrochemical biosensors / L. Ding, D. Du, X. Zhang, H. Ju// Cur. Med. Chem.-2008. V. 15.-P. 3160-3170.

46. Donath, E. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes / E. Donath, G. B. Sukhorukov, F. Caruso, S. A. Davis, H. Mohwald // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. - V. 37(16). - P. 2202-2205.

47. Dubas, S.T. Polyelectrolyte multilayers containing a weak polyacid -construction and deconstruction / S.T. Dubas, Schlenoff // J. B.Macromolecules. 2001. - V. 34. - P. 3736-3740.

48. Eckle, M. Tuning the performance of layer-by-layer assembled OLEDs by controlling the position of isolating clay barrier sheets / M. Eckle, G. Decher // Nanoletters. 2001. - V. 1. - P.45-49.

49. Efrima, S. Understanding SERS of bacteria / S. Efrima, L. Zeiri // J. Raman Spectrosc. 2009. - V. 40. - P. 277-288.

50. EGFR antibody conjugated gold nanoparticles in cancer diagnostics: applications in oral cancer / I.H. El-Sayed, X. Huang, M.A. El-Sayed // Nano Lett. 2005. - V. 5. - P. 829-834.

51. Fahrner, W. R. Nanotechnology and nanoelectronics: materials, devices, measurement techniques / W. R. Fahrner. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. - 2005. - P.254.

52. Fakhrullin, R.F. Fabrication of living cellosomes of rod-like and rhombohedral morphologies based on magnetically responsive templates / R.F. Fakhrullin, V.N. Paunov // Chem. Comm. 2009. - P. 2511-2513.

53. Fakhrullin, R.F. A direct technique for preparation of magnetically functionalised living yeast cells / R.F. Fakhrullin, J. Garcia-Alonso, V.N. Paunov // Soft Matter. 2010. - V.6. - P.391 - 397.

54. Gabier, A.-C. Intracellular physiological events of yeast Rhodotorula glutinis during storage at +4 / A.-C. Gabier, P. Gourdon , J. Reitz , J.-Y. Leveau, M. Bouix // Int. J.Food Microb. 2005. - V. 105. - P. 97-109.

55. Gao, X. H. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots / X. H. Gao, Y.Y.Cui, R. M. Levenson, L. W. K. Chung & S. M. Nie // Nature Biotech. 2004. - V.22 (8). - P.969-976.

56. Garcia-Alonso, J. A prototype microfluidic chip using fluorescent yeast for detection of toxic compounds / J. Garcia-Alonso, G. Greenway, J. Hardege, S. Haswell //Biosens. Bioelectr. 2009. - V. 24. - P. 1508-1511.

57. Garcia-Alonso, J. Rapid and direct magnetization of GFP-reporter yeast for micro-screening systems / J. Garcia-Alonso, R.F. Fakhrullin, V.N. Paunov // Biosens. Bioelectron. 2010. - V.25. - P.l816-1819.

58. Glinel, К. Influence of polyelectrolyte charge density on the formation of multilayers of strong polyelectrolytes at low ionic strength / K. Glinel, A. Moussa, A.M. Jonas, A. Laschewsky // Langmuir. 2002. - V.18(4). -P.1408-1412.

59. Green ,V.S. Assay for fluorescein diacetate hydrolytic activity: optimization for soil samples / V.S. Green, D.E. Stott, M. Diack // Soil Biology & Biochemistry. 2006. - V.38. - P.693-701.

60. Haixia, Y. Carbon nanotube capsules self-assembled by W/O emulsion technique / Y. Haixia, S. Huaihe, C. Xiaohong // Langmuir. 2007. - V. 23. -P. 3199-3204.

61. Handley, D.A. In colloidal gold: principles, methods, and applications. — N.Y: Academic. 1989.- 13 lp.

62. He, P. Layer-by-layer fabrication and characterization of DNA-wrapped single-walled carbon nanotube particles / P. He, M. Bayachou // Langmuir. -2005. V.21. - P.6086-6092.

63. Hillberg, A. L. Biorecognition through layer-by-layer polyelectrolyte assembly: in-situ hybridization on living cells /А. L. Hillberg, M. Tabrizian // Biomacromol. 2006. - V.7. - P. 2742-2750.

64. Hoogeveen, N. G. Formation and stability of multilayers of polyelectrolytes / N. G. Hoogeveen, M. A. C. Stuart, G. Fleer, M. R. Bohmer // Langmuir. -1996.-V. 12.-P. 3675-3681.

65. Hyde, K. Layer-by-layer deposition of polyelectrolyte nanolayers on natural fibres: cotton / K. Hyde, M. Rusa, J. Hinestroza // Nanotechnology. 2005. -V. 16.-P. 422-428.

66. Inacker, O. Manipulation in molecular dimensions / O. Inacker, H. Kuhn, D. Mubius, G. Debuch, // Z. Phys. Chem. 1976. - V. 101. - P.337-360.

67. Jain, P.K. Noble metals on the nanoscale: optical and photothermal properties and some applications in imaging, sensing, biology, and medicine / Jain, P.K. X. Huang, I.H. El-Sayed, M.A. El-Sayed / Acc. Chem. Res. 2008. - V. 41. -P. 1578-1586.

68. Jan, E. Successful differentiation of mouse neural stem cells on layer-by-layer assembled single-walled carbon nanotube composite / E. Jan, N. A. Kotov // Nano Lett. 2007. - V. 7. - P. 1123-1128.

69. Jarvis, R. M. Rapid analysis of microbiological systems using SERS / R. M. Jarvis, A. Brooker, R. Goodacre // Anal. Chem. 2004. - V. 76. - P. 51985202.

70. Jarvis, R.M. Rapid discrimination of bacteria using surface enhanced Raman spectroscopy/ R.MJarvis, R. Goodacre // Anal. Chem. 2004. - V. 76. -P.40-47.

71. Jarvis, R.M. Surface-enhanced Raman scattering from intracellular and extracellular bacterial locations / R. M. Jarvis, N. Law, I. T. Shadi, P.O'Brien, J. R. Loyd, R.Goodacre // Anal. Chem. 2008. - V.80 (17). - P.6741-6746.

72. Jing, W. Transmission electron microscopy and atomic force microscopy characterization of nickel deposition on bacterial cells / W. Jing., H. ShiYing, X. LiNa, G. Ning //Chin. Sc. Bulletin. 2007. - V.52. - P.21-27.

73. Joel, I. Theory of enhance I light scattering from molecules adsorbed at the metal-solution interface / I. Joel, L. Ronald, R. John // Phys. Rev. Lett. -1979.-V. 43.-P. 147-150.

74. Johnson, A.P.R. Layer-by-layer ingineered capsules and their applications / A.P.R Johnson, C. Cortez, A.S. Angelatos, F. Caruso // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2006. - V. 11(4). - P. 203-209.

75. Kotov, NA: Ordered layered assemblies of nanoparticles / N. A. Kotov // MRS Bulletin. 2001. - V. 26 (12). - P.992-997.

76. Krol, S. Encapsulated living cells on microstructured surfaces / S. Krol, M. Nolte, A. Diaspro, D. Mazza, R. Magrassi, A. Gliozzi, A. Fery //Langmuir. -2005.-V. 21. P.705-709.

77. Krol, S. Encapsulated yeast cells inside Paramecium primaurelia: a modelsystem for protection capability of polyelectrolyte shells / S. Krol, O. Cavalleri, P. Ramoino, A. Gliozzi, A. Diaspro // Microscopy. — 2003. — V. 212.-P. 239-243.

78. Kahraman, M. Reproducible surface-enhanced raman scattering spectra ofbacteria on aggregated silver nanoparticles / M. Kahraman, M.M. Yazici, F. Sahin, O.F. Bayrak, M. Culha // Appl. Spectrosc. 2007. - V. 6Г. - P. 479485.

79. Kahraman, M. Convective assembly of bacteria for surface-enhanced raman scattering / M. Kahraman, M. M. Yazici, F. Siiahin, M. Culha // Langmuir. -2008.-V. 24.-P. 894-901.

80. Kayushina, R. Construction and X-ray reflectivity study of self-assembled lysozyme/ polyions multilayers / R. Kayushina, Y. Lvov, N. Stepina, Y.Khurgin // Thin Solid Films. 1996. - V. 284. - P. 246-248.

81. Kim B.-S., Hydrogen-bonding layer-by-layer assembled biodegradable polymeric micelles as drug delivery vehicles from surfaces / B.-S. Kim, S. W. Park, P. T. Hammond // ACS Nano. 2008. - V.2. - P.386-392.

82. Klabunde, К. J. Nanoscale materials irr chemistry / K. J: Klabunde. John Wiley & Sons, Inc. - 2001.

83. Knauer , M. Surface-enhanced Raman scattering-based label-free microarray readout for the detection of microorganisms / M. Knauer, N. P. Ivleva, X.Liu, R. Niessner, C. Haisch // Anal. Chem. 2010. - У.82 (7). - P. 2766-2772.

84. Kneipp, J. Optical probing and imaging of live cells using SERS labels / J.Kneipp, H. Kneipp, A. Rajadurai, R.W. Redmond, K. Kneipp // J. Raman Spectrosc. 2009. - V. 40. - P. 1-5.

85. Kong, W. Immobilized bilayer glucose isomerase in porous trimethylamine polystyrene based on molecular deposition / W. Kong, L. Wang, M. Gao, H. Zhou, X. Zhang, W. Li, J. Shen //J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1994. - V. 11.-P. 1297-1298.

86. Kuhn, H. Systeme aus monomolekularen schichten- zusammenbau und chemisches verhalten / H. Kuhn, D; Mubius // Angew.Chem. 1971. - V.83. - P.672-690.

87. Kurth, D.G. Ultrathin composite films incorporating the nanoporous isopolyoxomolybdate keplerate (NH4)(42)(Mol320372(Ch3Coo) (30)(H20)(72)) / D.G. Kurth, D. Volkmer, M. Ruttorf, B. Richter, A. Muller// Chem. Mater. 2000. - V. 12. - P. 2829.

88. Lebedeva, O.V. Mechanical properties of polyelectrolyte-filled multilayer microcapsules studied by atomic force and confocal microscopy / O.V.1.bedeva, B.S. Kim, O.I. Vinogradova // Langmuir. 2004. - V. 20(24). -P.10685-10690.

89. Lee C.-W. Study of gold nanoparticles and live cells interactions by using planar evanescent wave excitation / C.-W. Lee, E.-H. Lin, J.-Y. Cheng // J. Biomed. Opt. -2009. V. 14.-P. 1-6.

90. Lee, M.-J. Electrical manipulation of nanofilaments in transition-metal oxides for resistance-based memory/ M.-J. Lee, S. Han, S. H. Jeon // Nano Lett. — 2009. V.9 (4). - P.1476-1481.

91. Lee, PC Adsorption and surface-enhanced Raman of silver and gold sols / PC Lee, D. Meisel // J. Phys. Chem. 1982. - V.86. - P.3391-3395.

92. Leor, J. Cells, scaffolds, and molecules for myocardial tissue engineering / J. Leor ,Y. Amsalem, S. Cohen // Pharmacology & Therapeutics. 2005. -V. 105.-P. 151-163.

93. Lewinski, N. Cytotoxicity of nanoparticles / N. Lewinski, V. Colvin, R. Drezek // Small. 2008. - V.4. - P. 26- 49.

94. Li, C. Controlling the growth behaviour of multilayered films via layer-by-layer assembly with multiple interactions / C. Li, J. Zhang, S. Yang, B.-L. Li, Y.-Y. Li, X.-Z. Zhang R.-X. Zhuo // Phys. Chem. Chem. Phys. 2009. -V.ll.-P. 8835-8840.

95. Li, J. Amplifying the electrical hybridization signals of DNA array by multilayer assembly of Au nanoparticle probes / J. Li, M. Xue, H. Wang, L. Cheng, L. Gao, Z. Lu, M. Chan // Analyst. 2003. - V.128. - P. 917-923.

96. Li, J. An electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen • enhanced by self-assembled nanogold coatings on magnetic particles / J. Li,

97. H. Gao, Z. Chen, X. Wei, C. F. Yang // Anal. Chim. Acta. 2010. - V. 665. -P. 98-104.

98. Liu, C. Direct toxicity assessment of toxic chemicals with electrochemical method / C. Liu, T. Sun, X. Xu, S. Dong, //Anal. Chim. Acta 2009. - V. 641. -P. 59-63.

99. Liu, Z. Carbon nanotubes in biology and medicine: in vitro and in vivo detection, imaging and drug delivery / Z. Liu, S. Tabakman, K. Welsher, H. Dai // Nano Res. 2009. - V. 2. - P. 85-120.

100. Lu, Z., Effects of the concentration of tetramethylammonium hydroxide peptizer on the synthesis of Fe304/Si02 core/shell nanoparticles / Z. Lu, G. Wang, J. Zhuang, W. Yang // Colloids Surf. 2006. - V. 278. P. 140-143.

101. Liu, Z.-Y. Synthesis of gold nanoparticles on the cell wall of Bacillus megatherium / Z.-Y. Liu, J.-M. Wu, B.-Q. Fu, R. Xue, J.-Z. Zhou, Q.-X. Zheng, Y.-Y. Liu, J.-K. Fu // Acta Chim. Sin. 2004. - V. 62. - 1829-1834.

102. Luo, L. Fabrication of layer-by-layer deposited multilayer films containing DNA and its interaction with methyl green / L. Luo, J. Liu, Z. Wang, X. Yang, S. Dong, E. Wang, // Biophys Chem. 2001. - V.94. - P. 11-22.

103. Lvov, Y. Assembly of thin films by means of successive deposition of alternate layers of DNA and poly(allylamine) / Y. Lvov, G. Decher, G. Sukhorukov // Macromolecules. 1993. - V. 26. - P. 5396-5399.

104. Lvov, Y., Layer-by-layer assembly of alternate protein-polyion ultrathin films / Y. Lvov K. Ariga, T. Kunitake // Chem. Lett. 1994. - P. 2323-2326.

105. Lvov, Y. Assembly of multicomponent protein films by means of electrostatic layer-by-layer adsorption / Y. Lvov, K. Ariga, I. Ichinose, T. Kunitake // J. Am. Chem. Soc. 1995. - V. 117. - P. 6117-6123.

106. Lvov, Y. In protein architecture: interfacial molecular assembly and immobilization biotechnology / Y. Lvov, H. Mohwald // Dekker, New York. 2000.-P.251-286.

107. Lvov, Y. Protein architecture: assembly of ordered films by means of alternated adsorption of oppositely charged macromolecules / Y.Lvov, G.B. Sukhorukov // Membr. Cell. Biol. 1997. - V. 11. - P. 277-303.

108. Ma, H. A novel electrochemical DNA biosensor fabricated with layer-by-layer covalent attachment of multiwalled carbon nanotubes and gold nanoparticles / H. Ma, L. Zhang, Y. Pan, K. Zhang, Y. Zhang // Electroanalysis. 2008. - V.20. - P. 1220-1226.

109. Maheshwari, V. Ion mediated monolayer deposition of gold nanoparticles on microorganisms: discrimination by age / V. D. Maheshwari, E. Fomenko, G. Singh, R. F. Saraf// Langmuir. 2010. - V. 26. - V. 371-377.

110. Manna, U. Layer-by-layer self assembly of modified hyaloronic acid/chitosan based on hydrogen bonding / U. Manna, S. Bharani, S. Patil // Biomacromol.- 2009. V.10. -P. 2632-2639.

111. Mathews, C.K. Biochemistry. Chapter 9 / C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern // San Francisco: Addison-Wesley. 1999. -305 p.

112. Miura, N. Cytotoxic effect and apoptosis induction by silver nanoparticles in HeLa cells / N. Miura, Y. Shinohara // Biochem. and Biophys. Res. Commun.- 2009. V. 390. - P. 733-737.

113. Morris, K. Ferricyanide mediated biochemical oxygen demand development of a rapid biochemical oxygen demand assay / K. Morris, K. Catterall, H. Zhao, N. Pasco, R. John// Anal. Chim. Acta - 2001. - V. 442. - P. 129-139.

114. Mohwald, H. From langmuir monolayers to nanocapsules / H. Mohwald // Colloid Surface A Physicochemical and Engineering Aspects. 2000. - V. 171 (1-3).-P. 25-31.

115. Mueller, R. Melting of PDADMAC/PSS. capsules investigated with AFM force spectroscopy / R. Mueller, K. Kohler, R. Weinkamer, G. Sukhorukov, A. Fery // Macromolecules. 2005. - V. 38(23). - P. 9766-9771.

116. Mugweru, A. Voltammetric sensor for oxidized DNA using ultrathin films of osmium and ruthenium metallopolymers / A. Mugweru, B.Wang, J. Rusling // Anal. Chem. 2004. - V.76. - P.5557-5563.

117. Murray, С. B: Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assembles / С. B. Murray, C. R. Kagan, M. G. Bawendi // Ann. Rev. of Mat. Science. 2000. - V. 30 (1). - P.545-610.

118. Naessens, M. Fiber optic biosensor using Chlorella vulgaris for determination of toxic compounds / M. Naessens, J.C. Leclerc, G. Tran-Minh // Ecotox. Environ. Safe. 2000. - V. 46.-P. 181-185.

119. Naumann, D. The characterization of microorganisms by Fourier transorm infrared spectroscopy (FT-IR) / D Naumann, D. Helm, H. Labischinski, P.Giesbrecht, // In Modern Techniques for Rapid Microbiological Analysis. -1991. -P.133-141.

120. Nguyen-Ngoc, H. Sol-gel process for vegetal cell encapsulation / H. Nguyen-Ngoc, C. Tran-Minh // Mater. Sci Eng. 2007. - V. 27. - P. 607-611.

121. Nolte, M. Coupling of individual polyelectrolyte capsules onto patterned substrates / M. Nolte, A. Fery // Langmuir. 2004. - V. 20(8). - P. 29952998.

122. Onda, M. Sequential reactions by glucose oxidase/peroxidase molecular films assembled by layer-by-layer alternate adsorption / M. Onda, Y. Lvov, K. Ariga, T. Kunitake // Biotechnol.Bioeng. 1996. - V.51. - P. 163-166.

123. Onda, M. Sequential reaction and product separation on molecular films of glucoamylase and glucose oxidase assembled on an ultrafilter / M. Onda, Y. Lvov, K. Ariga, T. Kunitake // J. Ferment. Bioengin. 1997. - V.82. - P.502-506.

124. Operation and Service Manual: QCM200 Quartz Crystal Microbalance, Digital Controller QCM25 5 MHz Crystal Oscillator// Stanford Research Systems, USA. 2005. .

125. Otto, A. Investigations of electrode surfaces in acetonitrile solutions using surface-enhanced Raman spectroscopy / A.Otto // Light Scattering. In Solids. -V. 4.-P. 289.

126. Palath, N. Polypeptide multilayer nanofilm artificial red blood cells / N. Palath, S. Bhad, R. Montazeri, C. A. Guidry, D. T. Haynie // J. Biomed. Mat. Res.: Appl. Biomat. 2006. - V. 81. - P. 261-268.

127. Paloniemi, H. Layer-by-Layer Electrostatic Self-Assembly of Single-Wall Carbon Nanotube Polyelectrolytes / H. Paloniemi, M. Lukkarinen, T. Aaritalo, S. Areva, J. Leiro, M. Heinonen, K. Haapakka, J.Lukkari // Langmuir. 2006. - V. 22. - P. 74-83.

128. Park, J.-H. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications / J.-H. Park, L. Gu, G. Maltzahn, E. Ruoslahti, S. N. Bhatia, M. J. Sailor // Nature Mat. 2009. - V. 8. - 331-336.

129. Park, M.K. Sustained release control via photo-cross-linking of polyelectrolyte layer-by-layer hollow capsules / M.K. Park, S. Deng, R.C. Advincula // Langmuir. 2005. - V. 21(12). - P. 5272-5277.

130. Paunov, V. N. Fabrication of carbon nanotube-based microcapsules by colloid templating technique / V. N. Paunov, M. Panhuis // Nanotechnology. 2005. -V. 16. - P.1522-1525.

131. Pei, R. Assembly of alternating polycation and DNA multilayer films by electrostatic layer-by-layer adsorption / R. Pei, X. Cui, X. Yang, E. Wang // Biomacromolecules. 2001. - V.2. - P.463-468.

132. Podola, B. Selective real-time herbicide monitoring by an array chip biosensor employing diverse microalgae / B. Podola, M. Melkonian // J. Appl. Phyc. -2005.-V. 17. P.261-271.

133. Premasiri, W. R. Characterization of the surface enhanced raman scattering (SERS) of bacteria / W. R. Premasiri, D.T. Moir, M.S. Klempner, N. Krieger, G. Jones, L.D. Ziegler // J. Phys. Chem. 2005. - V. 109. - P.312-320.

134. Puppels, G. J. Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy / G. J. Puppels, F. F. De Mul, C. Otto, J. Greve, M. Robert-Nicoud, D. J Arndt-Jovin // Nature (London). 1990. - V. 347. - P. 301-303.

135. Rao, C.N. Synthesis of inorganic nanomaterials / C.N. Rao, S.R.C. Vivekchand, K. Biswas, A. Govindaraj // Dalton. Trans. 2007. - P. 37283749.

136. Rhee, S.W. Patterned cell culture inside microfuidic channels / S.W. Rhee, A.M. Taylor, C.H. Tu, D.H. Cribbs, C.W.Cotman, N.L. Jeon // Lab Chip. -2004.-V. 5.-P. 102-107.

137. Ricardo, R. Counting and determining the viability of cultered cells R./ Ricardo, K. Phelan // J. Vis. Exp. 2008. - P. 752-758.

138. Rouse, J. H. Sol-gel processing of ordered multilayers to produce composite films of controlled thickness / Rouse, J. H., Macneill, B. A., Ferguson, G. S. // Chem. Mater. 2000. - V. 12. - P. 2502-2507.

139. Rusling, J.F. Biochemical applications of ultrathin films of enzymes, polyions and DNA / J.F. Rusling, E.G. Hvastkovs, D.O. Hull, J.B. Schenkman // Chem.commun. 2008. - P. 141-154.

140. Sano, M. Formation of ultrathin polymer layers on solid substrates by means of polymerizationinduced epitaxy and alternate adsorption / M. Sano, Y. Lvov, T. Kunitake // Annu. Rev. Mater. Sci. 1996. - V. 26. - P. 153-187.

141. Safarik, I. Magnetically modified microbial cells: A new type of magnetic adsorbents / I. Safarik, M. Safarikova // China Particuology. 2007. - V. 5. -P. 19-25.

142. Safarikova, M. Dye adsorbtion on magnetically modified Chlorella vulgaris cells / M.Safarikova, B.M.R. Pona, E. Mosiniewicz-Szablewska, F. Weyda, I. Safarik // Fresenius Environmental Bulletin. -2008. V.17 (4). - P.486-492.

143. Schmid, G. Metal clusters and colloids / G. Schmid, L.F. Chi //Adv. Mater. -1998. V. 10. - P.515-526.

144. Selhuber-Unkel, C. Tracking cell-nanoparticle interactions / C. Selhuber-Unkel // J. Biomed. Nanotechnol. 2009. - V. 5. - P. 634-640.

145. Sengupta, A. Detection of bacteria by surface-enhanced Raman spectroscopy / A. Sengupta, M. Mujacic, E. Davis // J. Anal. Bioanal. Chem 2006. - V. 386.- 1379-1388.

146. Serizawa, Т. A novel-approach for fabricating ultrathin polymer-films by the repetition of the adsorption drying processes / T. Serizawa, M. Akashi // J. Polym. Sci. 1998. - V. 37. - P. 1903-1906.

147. Serizawa, T. Alternating bioactivity of polymeric layer-by-layer assemblies: anticoagulation vs procoagulation of human blood / T. Serizawa, M. Yamaguchi, M. Akashi // Biomacromolecules. 2002. - V. 3. - P. 724-731.

148. Shimazaki, Y. Molecular-weight dependence of alternate adsorption through charge-transfer interaction / Y. Shimazaki, R. Nakamura, S. Ito, Mi Yamamoto // Langmuir. 2001. - V. 17. - P. 953-956.

149. Stroeve, P. Transfer in supported films made by molecular self-assembly of ionic polymers / P. Stroeve, V. Vasques,, M.A. Coelho, N. Rabolt // Gas Thin Solid Films. 1996. - V. 284/285. - P. 708-712.

150. Sugunan, A. Nutrition-driven assembly of colloidal nanoparticles: growing fungi assemble gold nanoparticles as microwires /А. Sugunan, P. Melin, J. Schnurer, J. G. Hilborn, J. Dutta // Adv. Mater. 2007. - V. 19. - P. 77-81.

151. Sukhorukov, G.B. Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles / G.B. Sukhorukov, E. Donath, H. Lichtenfeld , E. Knippel , M. Knippel, A. Budde and H. Mohwald // Colloid Surface A. 1998. - V. 137 (1-3).-P. 253-266.

152. Sukhorukov, G. Layer-by-layer assembly of DNA and polynucleotides films by means of alternate adsorption with polycations / G. Sukhorukov, H. Mohwald, G. Decher, Y. Lvov // Thin Solid Films. 1996. - V. 284. - P. 220-223.

153. Tang, H.W. Probing intrinsic and extrinsic components in single osteosarcoma cells by near-infrared surface-enhanced raman scattering / H.W.

154. Tang, X.B. Yang, J. Kirkham, D.A. Smith // Anal. Chem. 2007. - V. 79. -P. 3646-3653.

155. Trubetskoy, V. S. Layer-by-layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles /V. S. Trubetskoy, A. Loomis, J. E. Hagstrom, V. G Budker, J. A.,Wolff // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 3090-3095.

156. Vanduffel, B. Fuzzy assembly and 2nd-harmonic generation of clay/polymer/dye monolayer films / B. Vanduffel, T. Verbiest, S. Vanelshocht, A. Persoons, F. Deschryver, R. A. C.Schoonheydt // Langmuir. -2001. V. 17.-P. 1243-1249.

157. Veerabadran, N. G. Nanoencapsulation of stem sells within polyelectrolyte multilayer shells / N. G. Veerabadran, P. L. Goli, S. S. Stewart-Clark, Y. M. Lvov, D.M. Mills // Macromol. Biosci. 2007. - V. 7. - P. 877-882.

158. Wan, C.A.A. Nanomaterials for in situ cell delivery and tissue regeneration / C.A. A. Wan, J. Y. Ying // Advanced Drug Delivery Reviews. 2010. - V. 62.-P. 731-740.

159. Wang, F. Layer-by-layer assembly of aqueous dispersible, highly conductive poly(aniline-co-o-anisidine)/poly(sodium 4-styrenesulfonate)/MWNTs core-shell nanocomposites / F.Wang, G. Wang, S. Yang, C. Li // Langmuir. 2008. -V. 24.-P. 5825-5831.

160. Wang, Q. Enhanced surface plasmon resonance for detection of DNA hybridization based on layer-by-layer assembly films / Q. Wang, X. Yang, K. Wang // Sensors Actuators B. 2007. - V.123. - P. 227-232

161. Winterton, L. US Patent Appl. № 20010048975 / L. Winterton, J. Lally, M. Rubner, Y.Qui// US Patent Appl. 2001.

162. Xing, Q: Cellulose fiber-enzyme composites fabricated through layer-by-layer nanoassembly / Q. Xing, S. RJ. Eadula, Y. M. Lvov // Biomacromol. -2007.-V. 8.-P. 1987-1991.

163. Yang, P. The chemistry of nanostructured materials / P. Yang. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. - 2003.

164. Yoon; H.C. Multilayered assembly of dendrimers with enzymes on gold -thickness-controlled' biosensing interface / H.C. Yoon, H.S Kim // Anal. Chem. 2000. - V. 72. - P. 922-926.

165. Zeringue, H.C. Early mammalian embryo development depends on cumulus removal technique / H.C. Zeringue, J.J. Rutledge, D.J. Beebe // Lab Chip. -2004.-V. 5.-P. 86-90.

166. Zeiri, L. Surface-enhanced raman spectroscopy as a tool for probing'specific biochemical components in bacteria / L.Zeiri, B.V. Bronk, Y. Shabtai, J. Eichler, S. Efrima // Appl. Spectroscopy. 2004. - V. 58. - P. 33-40.

167. Zhang, J. Layer-by-layer fabrication and direct electrochemistry of glucose oxidase on single wall carbon nanotubes / J. Zhang, M. Feng, H. Tachikawa // Biosens. Bioelectron. -2007.-V. 22. P. 3036-3041.

168. Zhang, K. Fabrication of a sensitive impedance biosensor of DNA hybridization based on-gold nanoparticles modified gold electrode / K. Zhang, H. Ma, L. Zhang, Y. Zhang//Electroanalysis. 2008. - V.20. - P. 2127-2133.

169. Zhang, Y. Fabrication of stable hollow capsules by covalent layer-by-layer self-assembly / Y. Zhang, S. Yang, Y. Guan, W. Cao, J. Xu // Macromolecules. 2003. -V. 36(11). - P. 4238-4240.

170. Zheng, S. Self-assembly and characterization of polypyrrole and polyallylamine multilayer films and hollow shells / S. Zheng, C. Tao, Q. He, H. Zhu and J. Li // Chem. Mater. 2004 - V. 16(19). - P. 3677-3681.

171. Zhi, Z.-L Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing /?-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin / Z.-L Zhi, B. Liu, P. M Jones, J. С Pickup // Biomacromol. 2010. - V. 11. - P. 610-616.

172. Zhu, L. DNA damage induced by multiwalled carbon nanotubes in mouse embryonic stem cells / L. Zhu, D. W. Chang, L. Dai, Y. Hong // Nano Lett. -2007. V.7 (12). - P.3592-3597.

Информация о работе

Замалеева, Алсу Ильгизовна
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Иммобилизация наноматериалов на поверхности живых клеток эукариот и прокариот - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы