Идентификация сортов косточковых культур с помощью ПЦР - анализа

Романова, Ольга Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Идентификация сортов косточковых культур с помощью ПЦР - анализа
ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Идентификация сортов косточковых культур с помощью ПЦР - анализа"

На правах рукописи

□030В83В9

РОМАНОВА

Ольга Витальевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ СОРТОВ КОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НЦР - АНАЛИЗА

Специальность: Об. 01. 07- плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 2007

003068369

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Высоцкий Валерий Александрович

доктор сельс: старший нау|г Атрощенко кандидат биб. Карлов Генн i,

Ведущая организация: ГНУ Bcepoccní ский научно-исследовательскии институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина

Защита диссертации состоится «17» мая 2007 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 006.35.01 в ГНУ Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства по адресу: 115598, Москва, пос. Загорье, ул. Загорьевская, 4, ГНУ ВСТИСП; тел. (495) 329-51-66, факс (495) 329-31-66.

сохозяйственных наук, ный сотрудник Геннадий Парфёнович; логических наук дай Ильич

С диссертацией можно ознакомиться селекционно-технологический институт а Россельхозакадемии.

библиотеке ГНУ Всероссийский йдоводства и питомниководства

Автореферат разослан « » P-flflCAví 2007 года

Ученый секретарь диссертационного сс доктор сельскохозяйственных наук

вета,

JI.A. Принева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Косточковые культуры, как и большинство плодовых растений, являются в основном вегетативно размножаемыми культурами. Поэтому актуальными становятся проблемы однородности и стандартности посадочного материала.

Возникшие вопросы могут быть решены применением молекулярных маркеров на основе ДНК. В отличие от морфологических признаков, которые варьируют при разных агроклиматических условиях, ДНК - маркеры не зависят от влияния окружающей среды. По сравнению с другими молекулярными маркерами (белковыми или иными биохимическими) маркеры на основе ДНК обладают огромным, «почти безграничным», потенциалом полиморфизма.

ДНК - маркеры позволяют ускорить селекционный процесс, так как идентификация исходного материала и анализ результатов скрещивания могут быть выполнены в достаточно короткий период времени. Таким образом, облегчается подбор родительских пар для скрещивания, поиск родительского материала в гибридных формах и анализ интрогрессии полезных признаков от исходных форм потомкам.

Маркирование сортового материала обеспечит контроль за его однородностью и стандартностью при закладке маточных насаждений, сортовой прочистке садов и при реализации посадочного материала.

ДНК - технологии позволят оценить значительное разнообразие аборигенных и интродуцированных, дикорастущих и культурных форм растений и на основе молекулярных исследований создать коллекцию зародышевой плазмы для селекционного использования. Применение молекулярных подходов в изучении филогении уточнит спорные вопросы систематики плодовых культур. Установление родственных связей прояснит происхождение многих сортов с неизвестными родословными.

Наконец, молекулярная идентификация и паспортизация сортов и ценных форм плодовых культур расширит возможности системы защиты авторских прав селекционеров.

В качестве ДНК - маркеров могут быт или мобильные генетические элементы, ш:

е> использованы ретротранспозоны фоко представленные в геномах

всего царства эукариот и составляющие огромную часть геномной ДНК (до половины генома у растений). Для некоторых ретротранспозонов насчитывается до десятка тысяч копий на геном, причем каждая копия может быть использована как генетический маркер.

Для проведения идентификации сортов и форм косточковых культур мы применяли праймеры, фланкирующи] умеренно повторяющиеся последовательности ретротранспозонов семейства R 173 (Rogowsky, Shepherd, 1992). Ранее данные праймеры использовались для сортовой идентификации зерновых и овощных культур (Забродина и др., 1998; Зайцев, Хавкин, 2001; Корнеева, Цветков, 2004; Корнеева и др., 2004; 2005; Бирюкова и др., 2006), а также показали свою перспективность и для косточковых культур (Зайцев и др., 2005).

Цель диссертационных исследований - проведение молекулярной идентификации сортов косточковых культур ¡(сливы, алычи, вишни и черешни), используя праймеры, фланкирующие семейство ретротранспозонов R 173. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) модифицировать методику выделения ДНК для косточковых культур;

2) подобрать праймеры для сортовой идентификации сливы, алычи, вишни и черешни;

3) провести сравнительный анализ и оценку полиморфизма сортов сливы, алычи, вишни и черешни по ДНК - профилям;

4) оценить используемые праймеры и их комбинации на пригодность для проведения сортовой идентификации;

5) изучить генетическое родство сортов сливы, алычи, вишни и черешни на основе ДНК - маркеров.

Научная новизна. Адаптирована различных тканей и органов косточковых

черешни), модифицирован буфер для лидирования растительных тканей.

методика выделения ДНК из культур (сливы, алычи, вишни и

Предложено использовать для экстрагирования ДНК из саженцев растений, находящихся в состоянии покоя, камбиальные ткани растений.

Отобраны праймеры и их комбинации для проведения сортовой идентификации внутри каждого вида. Определены оптимальные температурные режимы отжига олигонуклеотидов. Выполнена идентификация сортов сливы, алычи, вишни и черешни. Впервые получены данные о сортовом полиморфизме косточковых культур на основе результатов молекулярных исследований. Выявлены праймеры и их комбинации, позволяющие получить уникальные профили ДНК каждого сорта. У ряда сортов получены уникальные фрагменты. Проведена оценка изученных праймеров и их комбинаций на пригодность для проведения сортовой идентификации косточковых культур. Впервые продемонстрированы данные родства сортов косточковых культур на уровне анализа ДНК.

Практическая значимость. Предложена методика, включающая протокол выделения ДНК и набор необходимых праймеров, позволяющая проводить сортовую идентификацию косточковых культур. Получены результаты для создания базы данных сортов сливы, алычи, вишни и черешни, которая в дальнейшем позволит проводить сортовую идентификацию, оценивать гибридные формы и выполнять анализ родословных различных образцов растений. Уникальные наборы фрагментов ДНК сортов косточковых культур помогут осуществлять независимую экспертную оценку сортов с целью защиты прав селекционеров. Выявленное генетическое родство сортов может быть использовано для уточнения вопросов их происхождения.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005 г.), международной научно-практической конференции «Развитие наследия И.В. Мичурина и подготовка кадров» (Мичуринск - наукоград, 8-9 сентября 2005 г.), на I Всероссийской конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 26-29 августа 2006 г.), на 7-ой молодежной

научной конференции (Москва, 4 апреля 2007 и секции ягодных культур ГНУ ВСТИСП (20С

г.), на заседаниях Ученого совета 4 -2007 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на /^страницах машинописного текста, состоит из введения, 3-х глав, выводов, рекомендаций для практического использования, списка использованной литературы изг^^наименований, в том числе /¿9- на иностранных языках, содержит/^ таблиц и ^рисунков и 5 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы, методы и условия проведения экспериментов. Исследования проводились в 2003-2007 годах на базе отдела биотехнологии ГНУ ВСТИСП. В работе было использовано 72 образца растений семейства розоцветных (Rosaceae Juss.), рода слива (Prunus L.): вида слива домашняя (Prunus domestica L.)\ Алексий, Величавая, Венгерка московская, Десерт урожайный, Евразия 21, Еникеевская, Занятяая, Кантемировка, Нарач, Опал, Память Тимирязева, Ранняя желтая, Ренклод колхозный, Ренклод тамбовский, Сизый голубок, Синий дар, Скороспелка красная, Смолинка, Сухановская, Тулица, Урожайная Бабича, Утро, Фиолетовая, Личная синяя, Яхонтовая; вида сливы китайской (Prunus salicina L.)\ Красный шар, Скороплодная; вида алыча гибридная (Prunus cerasifera Ehrh.) или сли!а русская (Prunus rossiea Erem.): Кубанская комета, Найдена, Путешественница, Шатер; рода вишня (Cerasus Mili), вида вишня обыкновенная (Cerasus vilgaris L.)\ Ассоль, Апухтинская, Багряная, Брюнетка, Булатниковская, Владимирская, Волочаевка, Гриот московский, Жуковская, Загорьевская, Ком!омольская, Ливенская, Любская,

стар, Память Еникеева, Память :инка, Сания, Склянка розовая, ; вида черешня (Cerasus avium (L.)

Малиновка, Молодежная. Мценская, Норд Сахарова, Превосходная Колесниковой, Ру: Тургеневка, Шакировская, Ширпотреб черная; Моепск)-. Гастинец, Итальянка, Крымская, Ленинградская черная, Мулатка, Орловская янтарная, Сюбаровская, Фатеж, Черная, Чермашная; рода

микровишни (Microcerasus Webb. emend Spach), вида вишня войлочная (Microcerasus tomentosa (Thunb.) Erem. et Juschev): Натали; гибрида между вишне и сливой и терном ((Р. cerasus L. х Р. salicina L.) х Р. spinosa L.): гибрид Пчелка х терн. Образцы растений для анализа были любезно предоставлены сотрудниками ГНУ ВСТИСП: Морозовой Н.Г., Метлицкой К.В., Упадышевой Г.Ю., Симоновым В.С.

Растительную ДНК выделяли из камбиальных тканей образцов в трех повторностях набором для выделения ДНК Diatom DNA Ргер 200 (ООО "Компания Биоком") с модификацией лизирующего буфера.

Для анализа полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей использовали праймеры к концевым повторам ретротранспозонов семейства R 173: Paw S5 (AACGAGGGGTTCGAGGCC), Paw S6 (GAGTGTCAAACCCAACGA), Paw Sil (GAATTCTTGGAAAATGTA), Paw S16 (ACCTCTGCGCTTGGAGGC), Paw S17 (CTACACGGACTGGGTCCG), а также их комбинации (НПО "СибЭнзим"). ПЦР проводили в пробирках с сухой универсальной смесью "ПЦР - ядро" (ООО "Компания Биоком"). Амплификации выполняли в трех повторностях в термоциклере "Терцик" (АО "ДНК - Технология"), используя следующий температурный профиль: начальная денатурация при 94°С в течение 4 минут, затем следовали 40 циклов (денатурация при 94°С в течение 45 секунд, отжиг праймеров в течение 45 секунд, элонгация при 72°С в течение 80 секунд), заключительный этап элонгации проходил при 72°С в течение 4 минут. Температуры отжига праймеров и их комбинаций определяли экспериментально: Paw S5 - 55°С, Paw S6 - 49°С, Paw SI 1 - 40°С, Paw S16 - 56°С, Paw S17 - 54°С, Paw S5 + Paw S6 -53°C, Paw S5 + Paw Sil - 48°C, Paw S5 + Paw S16 - 56°C, Paw S6 + Paw Sil -45°C, Paw S6 + Paw SI6 - 53°C, Paw SI 1 + Paw SI6 - 48°C.

Продукты амплификации разделяли электрофоретически в 1,5% агарозном геле, содержащим бромистый этидий, в ТВЕ буфере при 120 В (40 минут). Профили ДНК визуализализировали с помощью гель документирующей видеосистемы "ViTran Foto" (ООО "Компания Биоком") и

регистрировали в памяти компьютера. Длину фрагментов ДНК определяли с помощью маркера молекулярной массы Gene Ruler™ 1 kb DNA Ladder (НПО «СибЭнзим»).

Все этапы ПЦР - анализа выполнялись с учетом рекомендаций производителя коммерческих наборов (ООО « Компания Биоком»),

Обработка результатов анализа. На полученных профилях ДНК подсчитывали процент полиморфных фрагментов. В выборках изученных сортов выявляли уникальные профили ДНК и уникальные фрагменты ДНК, свойственные только отдельным сортам.

Для количественной оценки полиморфизма ретротранспозонов семейства R 173 и определения степени родства между изученными образцами растений ДНК - профили анализировали на наличие (|) или отсутствие (0) одинаковых по размеру полос на геле, соответствующих определенным фрагментам. Результаты были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, на основе которых были рассчитаны матрицы различий, используя коэффициенты Ней и Ли (Nei, Li, 1979).

Дендрограммы, определяющие степень родства между образцами растений, строили при помощи кластерного анализа (UPGMA) на основе компьютерной программы STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Модификация протокола выделения ДНК из растений косточковых культур (слива, алыча, вишня, черешня). В растительных тканях косточковых культур содержатся большие количества полисахаридов и фенольных соединений, препятствующих получению препаратов ДНК, пригодных для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Нами был выбран набор для выделения ДНК Diatom DNA Prep 200 (ООО «Компания Биоком»), для которого была проведена модификация лизирующего буфера. Данные изменения обеспечивают получение воспроизводимых и четких электрофореграмм изученных сортов для дальнейшего анализа. Кроме того, модифицированная методика позволяет проводить экстракцию ДНК в течение

2,5 часов и использовать для этих целей любые части растения, в том числе и камбиальные ткани (рис. 1). Таким образом, сортовую идентификацию косточковых культур можно проводить в любое время года и независимо от физиологического состояния растения.

Выбор праймеров. Для проведения сортовой идентификации 72 сортов косточковых культур (32 сорта сливы и алычи, 40 сортов вишни и черешни) определены 9 праймеров и их комбинаций (Paw S3, Paw S6, Paw Si 3, Paw S16, Paw S5 + Paw S6, Paw S5 + Paw SI 1, Paw S6 + Paw Sil, Paw S6 + Paw S16, Paw Si 1 + Paw S16). Праймер Paw S17 и комбинация праймеров Paw S5 + Paw S16 оказались не пригодными для решения поставленных задач. В экспериментах с сортами вишни и черешни также не использовали праймер Paw Sil, поскольку полученные профили были не четкими и не воепроизеодимыми,

Идентификация сортов и ценных форм косточковых культур. С помощью 8 праймеров и их комбинаций всего было идентифицировано 63% сортов сливы и алычи гибридной, вишни и черешни, получено 364 уникальных профиля фрагментов ДНК косточковых культур (табл. 1). Самые высокое значение данного показателя было отмечено на сортах черешни - 79% и сортах вишни - 77%, тогда как сорта сливы и алычи гибридной были различены на 45%.

Рисунок 1 - Профили фрагментов ДНК сливы сорт Память Тимирязева, полученные с прайм ером Paw S6. Дорожки 1-3 - растения, культивируемые /я vitro, 4-6 - зелёные листья, 7-9 - высушенные листья, 10-12- камбиальная ткань.

Идентификация сортов черешни была успешно выполнена 5-тью

' S16, Paw S5 + Paw S6, Paw S5 + 3-мя (Paw SI6, Paw S5 + Paw S6,

праймерами и их комбинациями (Paw S5, Paw Paw SI 1, Paw S6 + Paw S16), сортов вишни - : Paw S6 + Paw SI6), сортов сливы и алыч* - совместным использованием комбинаций праймеров Paw S5 + Paw S6 и Paw S6 + Paw S16.

Для идентификации любого сорта слквы, алычи, вишни или черешни предложено использовать комбинации праймеров Paw S5 + Paw S6 и Paw S6 + Paw SI6.

На основе результатов сортовой идентификации косточковых культур составлен каталог электрофореграмм сливы, алычи, вишни и черешни (рис. 2). Применение этой базы данных позволит проводить анализ соответствия образца растения заявленному сорту, оценивать гибридные формы и выполнять анализ их родословных.

.тур по 8 системам праймеров

Название культуры Слива, алыча Вишня Черешня Сумма Среднее

Прайме] зы, показавшие уникальные профили и уникальные фрагменты

Paw S5 9 (28%) 1 (0,68%) 26 (87%) 0 (0%) 10 (100%) 2 (2,99%) 45 (63%) 3 (0,72%) 15(21%) 1,0 (0,24%)

Paw S6 5(16%) 0 (0%) 4 (13%) 2 (2,63%) 4 (40%) 2 (6|25%) 13 (18%) 4 (1,45%) 4 (6%) 1,3 (0,48%)

Paw S16 10(31%) 2(1,15%) 30 (100%) 2 (0,75%) 10 (100%) 2 (2^33%) 50 (69%) 6(1,14%) 17 (23 %) 2,0 (0,38 %)

Paw S5 + Paw S6 26 (81%) 1 (0,42%) 30 (100%) 2 (0,82%) 10 (100%) 3 (3,41%) 66 (92%) 6(1,05%) 22(31%) 2,0 (0,35%)

Paw S5 + Paw SI 1 10(31%) 3 (1,17%) 26 (87%) 0 (0%) 10 doo%) 0 (0%) 46 (64%) 3 (0,58%) 15 (21%) 1,0 (0,19%)

Paw S6 + Paw SI 1 4 (13%) 0 (0%) 14 (47%) 2 (1,24%) 4 (40%) 1 фо%) 22 (31%) 3 (0,82%) 7 (10%) 1,0 (0,27%)

Paw S6 + Paw S16 28 (88%) 0 (0%) 30 (100%) 0 (0%) 10 (100%) 1 (lj64%) 68 (94%) 1 (0,18%) 23(31%) 0,3 (0,06%)

Paw SI 1 + Paw S16 24 (75%) 2 (0,73%) 25 (83%) 1 (0,52%) 5 (50%) 1 (Ц52%) 54 (75%) 4 (0,75%) 18(25%) 1,3 (0,25%)

Всего 116(45%) 9 (0,53%) 185 (77%) 9 (0,59%) 63 (19%) 12 (2,26%) 364 (63%) 30 (0,80%) 121 (21%) 10(0,27%)

Среднее 15 (45%) 1,1(0,52%) 23 (77%) 1,1(0,74%) 8 (79%) 1,5 (2,58%) 46 (63%) 3,8 (0,84%) 15 (21%) 1,3 (0,28%)

з: f-

§ e

г «

£ и

& >>

< w Oi

о ж о

X g

к) Г

8. с |

О I

R с

is 3

« s x о

Ч и Ш со я

ю я из

а.

Я *— "'f tfbKH СОН |JHU MEEJ

«ас aunt vssa

а ккяш cisjje Mfi*e '* ^с

1250 п.н. ] ООО ii.El. 900 it.я. 850 л.н, 800 п.н. 625 п.н. 620 п.н. 5S0n.n. 445 П н 400 п.н, JI0n.ii. 300 n.H. ISO п.н.

Рисунок 2 - Электрофореграммы сортов сливы и алычи, полученные с помощью праймера Paw S5

Применение изученных праймеров позволило обнаружить уникальные фрагменты, свойственные только профилям ДНК отдельных сортов (табл. 2). Всего на 72 сортах было обнаружено 32 подобных фрагмента. Самое большое количество уникальных фрагментов было получено на сортах черешни - 12, сливы и алычи - 11, на сортах вишни - 9. Таблица 2 - Уникальные фрагменты ДЙК, выявленные на косточковых культурах

Размер ун йкальных фрагментов ДНК, п.н.

№ п/п Название сорта Ралу 85 Ра\у Б6 Ра\у БИ Ралу 816 Ра\у 85 + Ра\у 86 Ра\у 85 + Раад^П Ра\у 86 + Ра\у 811 Ра\у 86 + Paw 816 Paw 811+ Ра\у 816

Слива и алыча

1 Занятная 65(

2 Евразия 21 680

3 Кубанская комета 270

4 Нарач 1400

5 Величавая 700

6 Красный шар 120

7 Скороплодная 1500

8 Гибрид Пчелка х Терн 50(

9 Венгерка московская 1000

10 Шатер 1000 500

Вишня

1 Склянка розовая 900

2 Гриот московский 300

3 Память Еникеева 1500

4 Память Сахарова 1500

5 Ширпотреб черная 1230

6 Натали 1160 400 550 400

Черешн Я

1 Орловская янтарная 1000 1030 1120 1500

2 Мулатка 500

3 Крымская 550 1310 1000

4 Фатеж 950 570

5 Гасгинец 1300

6 Итальянка 1050

Подходы к сортовой идентификации косточковых могут быть различными, особенно, если выборка для анализа небольшая. Так, например, с помощью комбинации прайм ер о в Paw SI] + Paw SI 6 были получены уникальные фрагменты ДНК, позволяющие проводить идентификацию близкородственных сортов (рис. 3). На электрофоретраммах полосы размером 600 п.н. и 380 п.н. (п.н. - пары нукпеотидов), соответственно, отличают сорта Фиолетовая и Ранняя желтая от остальных изученных сортов сливы. Различение сортов может проводиться и по отсутствию полос. Так, сливу Яичная синяя можно идентифицировать по отсутствию на электрофореграмме фрагмента размером 300 П.н., который имеется у остальных сортов этой группы.

Для идентификации сортов вишни использовали другую комбинацию праймеров Paw S5 + Paw S6 (рис. 4). Яркие фрагменты (650 п.н. и 250 п.н.) позволяют различить сорта Ассоль и Молодежная, соответственно. Для анализа также используются определенные комбинации полос. По отсутствию двух полос размером 400 п.н. и 440 п.н. сорт Багряная может быть отличен от сорта Сания, имеющего эти полосы.

Рисунок 3 - Профили фрагментов ДНК сортов сливы, полученные с помощью гграймера Paw SI 1 + Paw S16. M - маркер молекулярной массы i 00 bp + 1,5 Kb, 1 - Фиолетовая (Виктория х Скороспелка красная).. 2 - Памш*. Тимирязева (Виктория * Скороспелка красная), 3 - Ренклод тамбовский (Ренклод зеленый х Скороспелка красная), 4 - Суханоеская (Скороспелка красная х Ренклод зеленый), 5 - Скороспелка красная (ссрт народной селекции), 6 - Ранняя желтая (Скороспелка красная * Ренклод Улленса), 7 - Утро (Скороспелка красная * РенклодУлленса), 8 - Яичная синяя (Скороспелка красная х Ренклод Улленса). Стрелками покаоаны фрагменты в п,н.,иденшфи1!ируюшие copra.

Рисунок 4 - Профили фрагментов ДНК сортов вишни, полученные с помощью праймера Paw S3 + Paw S6. М - маркер молекулярной массы 100 bp f 1,5 Kb, 1 -Ассоль (Владимирская * Жуковская), 2 - Багряная (Владимирская > Шубинка), 3 - Сания (Багряная * Владимирская), 4 - Владимирская (сорт народной селекции), 5 - Волочаевка (Владимирская * Любская), 6 - Молодежная (Любская х Владимирская), 7 - Любская (сорт народной селекции), 8 -Загорьевская (Ширпотреб черная * Любская). Стрелками показаны фрагменты в п,н., идентифицирующие сорта.

В профилях ДНК сортов сливы, алычи, вишни и черешни определены 29 мономорфных фрагментов для проведения идентификации косточковых культур. Однозначную идентификацию культур позволяет провести праймер Paw SI 6. Установлено, что комбинация прайм ер on Paw S5 + Paw S6 различает культуры по полиморфным фрагментам.

Таблица 3 - Мономорфные фрагменты косточковых культур

Праймер Размер мономорфных фрагментов, в п.н.

Слива и алыча 1 Вишня Черешня

Paw S5 310 350 -

Paw S6 650 850 850

Paw SU 730; 600; 315

Paw SI 6 1500; 680 - -

Paw SS + Paw S6 - - 600

Paw S5 + Paw SI 1 310; 200; 100 - 600

Paw S6 + Paw Sil 720; 520; 150 600 720;600

Paw S6 + Paw S16 650; 480 300 300

Paw S11 + Paw S16 650; 480 - 1400;850

Примечание. Прочерк означает, что мономорфные фрагменты не обнаружены.

Обнаружение гибридов косточковых культур. Полиморфизм умеренных рассеянных повторов позволил провести анализ гибридов косточковых культур. Выявление гибридной природы проводили по наличию фрагментов ДНК, унаследованных гибридами от исходных сортов. На рисунке 5 показаны электрофореграммы гибридов, полученных в результате скрещивания сортов Нарач и Кубанская комета. Так, сорта Тулица и Величавая имеют отцовский фрагмент (800 п.н.)- Полоса размером 300 п.н. унаследована сортом Величавая от Кубанской кометы.

Рисунок 5 - Профили фрагментов ДГК сортов сливы и алычи, полученные с помощью праймера Ра\у 55. М - маркер молекулярной массы 100 Ьр + 1,5 КЬ. 1 - Тулица (Кубанская комета * Нарач), 2 - Кубанская комета, 3 - Нарач, 4 -Величавая (Кубанская комета * Нарач). Стрелками показаны фрагменты в п.н., унаследованные гибридами от одного из родителей.

Кластерный анализ косточковых культур. Степень родственных отношений между изучаемыми сортами определяли с помощью метода иРвМА. Анализ объединенной лендрограммы сортов сливы и алычи (рис. 6) показал, что все сорта разделены на 2 кластера (группы): гексаплоидные и диплоидные сорта.

Самый большой кластер включает 26 сортов сливы домашней, распределенных по нескольким группам. В первую группу входят сорта, одной из родительских форм которых является Скороспелка красная. Наиболее близкое родство с родительской формой показывает сорт Ранняя желтая. Кроме того, внутри этой группы прослеживается родство сортов и по второй родительской форме. Так, Сухаиовская и Ренклод тамбовский объединены

происхождением от Ренклода зеленого, Утро и Яичная синяя - от Ренклода Улленса. Но данная тенденция не отмечается у сортов Фиолетовая и Память

Тимирязева, имеющих по литературным данным одинаковое происхождение.

Вторую группу образуют сорта, для получения которых использовалась слива Очаковская черная. Присутствие юрта Ренклода тамбовского в этой группе обусловлено наличием в его родословной Ренклода зеленого, который также входит в родословную сорта Кантемировка.

Третья группа сформирована сортам I Алексий и его материнской формой Занятная.

Следующая четвертая группа основана сортом Нарач и его гибридами с Кубанской кометой - Тулица и Величавая. Сорт народной селекции Венгерка московская связан с сортом Нарач общим происхождением, поскольку в их родословных присутствует Венгерка обыкновенная. Сорт Сизый голубок также входит в эту группу, так как был получен : участием сорта Ренклода зеленого, который также присутствует в родословной сорта Нарач и, следовательно, в родословных его потомков.

Объединение сортов в пятую групп) родство сорта Десерт урожайный с сортом от сортов американской селекции. Шестая

объяснить сложно, хотя, вероятно, Опал связано с их происхождением группа включает сорт Яхонтовая и его материнскую форму - сорт Евразия 21. Группировка сорта сливы

Еникеевская с вишне - сливовым гибридом Второй кластер образован 6 сор

грудно поддается объяснению, ами алычи гибридной и сливы

китайской. Сорта Путешественница и Найдена связывает общая родительская

айской сливы Красный шар и зт уссурийской сливы Красная 386. Скороплодная: Кубанская комета и

форма - алыча Десертная. Сорта юг: Скороплодная объединяет происхождение Также в этот кластер входят потомки сорта' Найдена. Алыча Шатер связана с другими сортами этого кластера только видовым происхождением, и поэтому кластеризуется отдельно.

Дендрограмма сортов вишни показь: вает их разделение на 3 кластера (рис. 7). В первый кластер входят сорта, полученные с участием вишни

Любской и Владимирской: Ассоль, Багряная, Сания, Волочаевка, Молодежная и Загорьевская. В одной группе с сортом Любская оказался сорт Молодежная.

Во втором кластере можно выделить несколько групп. Общую группу образовали сорта народной селекции (Апухтинская, Склянка розовая), сорта, полученные от сортов западно-европейской селекции, (Норд стар, Гриот московский, Светлая Острейко), а также сорта, в родословных которых присутствует степная вишня (Шатсировская, Видновская). В отдельную группу входят сорт Жуковская и его потомки: Брюнетка, Ливенская, Мценская, причем ближе всех с Жуковской группируется сорт Ливенская.

Третий кластер образует вишня Ширпотреб черная и сорта, полученные при ее участии: Булатниковская, Превосходная Колесниковой и Малиновка.

Положение на дендрограмме сортов Русинка и Натали также связано с их происхождением. Так, в родословной Русинки присутствует вишня Маака, а Натали является вишней войлочной.

Фиолетовая Память Тимирязева Ренклод тамбовский Сухановская Скороспелка красная Ранняя желтая Утро Яичная синяя Смолинка Синий дар Кантемировка Ренклод колхозный Занятная Алексий Тулица Сизый голубок Венгерка московская Нарач Величавая Десерт урожайный Опал

Урожайная Бабича Евразия 21 Яхонтовая Гибрид Пчелка х Терн Еникеевская Комета кубанская Найдена Путешественница Красный шар Скороплодная Шатер

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 Расстояния сцепления

Рисунок 6 - Объединенная дендрограмма сортов сливы и алычи

Ассоль Багряная Сания Воломаевка Молодежная Любская Загорьевская Владимирская Апухтинская Склянка розовая Видновская Шакировская Сильва Норд стар Гриот московский Светлая Острейко Брюнетка Жуковская Ливенская Мценская Тургеневка Комсомольская Память Еникеева Память Сахарова Ширпотреб черная Булатниковская Превосходная Колесниковой Малиновка Русинка Натали

Е=>

4,5

5,0

5,5

6,0 6,5 7,0 Расстояния сцепления

7,5

8,0

Рисунок 7 - Объединенная дендрограмма сортов вишни

Орловская янтарная Мулатка Черная Крымская Ленинградская черная Сюбаровская Фатеж Чермашная Итальянка Гастинец

5,5

6,0

6,5

7,0 7,5

4,0 4,5 5,0

Расстояния сцепления

Рисунок 8 - Объединенная дендрограмма сортов черешни Сорта черешни на дендрограме разделились на 2 кластера. В первый кластер вошли южные сорта: Орловская янтарная, Мулатка, Черная, Крымская (рис. 8). Во втором кластере выделяется группа, включающая сорта Фатеж и Чермашная, которые ведут свою родословную от черешни Ленинградская желтая. Близкое положение сортов Итальянка и Гастинец связано с тем, что при их создании использовался сорт черешни Козловская.

Генетические расстояния на дендрограммах косточковых культур варьировали от 2,6 до 7,6. Данные расстояний сцепления, особенно сортов вишни и черешни, свидетельствуют о том, что при создании данных сортов использовался исходный материал с широкой генетической основой.

Результаты кластеризации, кроме того, подтверждают общепризнанные родословные ряда сортов косточковых культур и их видовую принадлежность.

Характеристика эффективности праймеров и их комбинаций. Согласно результатам амплификации праймеров, фланкирующих ретротранспозоны семейства R 173, всего было обнаружено 1705 фрагментов ДНК на сортах сливы и алычи, 1514 - на сортах вишне и 531 - на сортах черешни. Самое большое количество полиморфных фрагментов амплифицировано на сортах вишни - 1394, что составило 92% от общего количества.

Четырьмя праймерами и комбинациями праймеров (Paw SI6, Paw S5 + Paw S6, Paw S5 + Paw SI 1, Paw Sll + Paw SI6) мономорфных фрагментов на сортах вишни обнаружено не было. Только полиморфные фрагменты на сортах черешни амплифицировали праймеры Paw S5 и Paw SI6. Мономорфные фрагменты отсутствовали в профилях сортов сливы и алычи, полученных комбинацией праймеров Paw S5 + Paw S6.

Самый низкий процент полиморфных фрагментов ДНК был обнаружен комбинацией праймеров Paw S6 + Paw Sll на сортах сливы и алычи (43%) и сортах черешни (50%). Остальные праймеры и комбинации праймеров амплифицировали не менее 60% полиморфных фрагментов.

Самый высокий показатель по среднему количеству фрагментов на праймер был установлен на сортах черешни (9,1) комбинацией праймеров Paw S5 + Paw Sll. В среднем размер фрагментов ДНК варьировал от 1500 до 100 пар нуклеотидов.

Таблица 4 - Результаты амплификации праймеров на косточковых культурах

Праймер, культура

Количество фрагментов ДНК

й я -е-

и о в

к ^

а, о

■0J

2 СП

И е-

и в г

1 | & w |

•е-

О «J

S я

о «

§ 1 5> Я о. о, U •©-

аз

I «ä

Я в

Paw S5:

слива и алыча вишня _черешня

116(78%) 170 (85%) 67 (100%)

148 200 67

3-8

3-11

4-11

4.6

6.7 6,7

1250-180 1190-250 1310-300

Paw S6:

слива и алыча вишня _черешня

135 (81%) 46 (61%) 22 (69%)

167 76 32

2-6

1-5

2-6

5,2 2,5 3,2

1300-470 1500-640 1500-640

Paw Sil : слива и алыча вишня

150(61%)

246

5-9 7,7 1500-315

Paw S16: слива и алыча вишня черешня 110(63%) 64 174 268 (100%) 0 268 86 (100%) О 86 3-7 5,4 1550-550 4-14 8,9 1500-300 6-12 8,6 1500-350

Paw S5 + Paw S6: слива и алыча вишня черешня 236 (100%) р 236 245 (100%) О 245 78 (89%) io 88 4-10 7,4 1500-250 5-11 8,2 1500-200 6-12 8,8 1500-300

Paw S5+ Paw Sil: слива и алыча вишня черешня 161 (63%) 96 257 172(100%) О 172 81 (89%) io 91 6-10 8,0 1250-100 2-13 5,7 1400-350 5-12 9,1 1400-350

Paw S6 + Paw Sil: слива и алыча вишня черешня 71 (43%) 96 167 131 (81%) 30 161 20 (50%) 20 40 4-8 5,2 720-100 2-8 5,4 900-200 2-6 4,0 1500-250

Paw S6 + Paw S16: слива и алыча вишня черешня 218(77%) ( 168 (85%) : 51 (84%) 1 4 282 0 198 0 61 6-12 8,8 1500-100 3-14 6,6 1500-200 3-9 6,1 1400-280

Paw Sil +PawS16: слива и алыча вишня черешня 210 (77%) б 194 (100%) 46 (70%) 2 4 274 ) 194 0 66 6-12 8,6 1500-100 3-10 6,5 1500-450 3-10 6,6 1500-450

Всего: слива и алыча вишня черешня 1257 (74%) 448 1705 1394(92%) 120 1514 451 (85%) 80 531 2-12 6,7 1500-100 1-14 6,3 1500-200 1-14 6,6 1500-250

Примечание. Символом * обозначен праймер, данное которого в расчетах не использовались

Процент полиморфных фрагментов ДНК изученных сортов сливы и алычи, обнаруженный в нашей работе (74%), превосходил данные AFLP -анализа (63%), но был ниже данных ISSR - анализа (87%) (Goulao et al., 2001). Среднее количество уникальных фрагментов ДНК на праймер, выявленных на сортах сливы и алычи в нашей работе (1,1) оказалось сравнимым с литературными данными (1,1) (Ortiz et al., 1999).

Кроме того, уровень полиморфности - 74% (слива, алыча), 92% (вишня) и 85% (черешня), обнаруживаемый с помощью праймеров, фланкирующих последовательности ретротранспозонов, оказался выше подобного показателя, полученного с помощью RAPD - анализа: 24% (Shimada et al., 1999), 37% (Heinkel et al., 2000) для сортов сливы и алычи и 33% (Shimada et al., 1999) для сортов вишни и черешни. Число фрагментов на праймер по нашим данным также было выше - 6,7 (слива и алыча), 6,3 (вишня) и 6,6 (черешня), по сравнению сданными других авторов - 5,1 (Shimada et al., 1999), 6,2 (Heinkel et al., 2000) для сортов сливы и алычи и 5,0 (Shimada et al., 1999) сортов для вишни и черешни.

Таким образом, применение праймеров, к концевым последовательностям ретротранспозонов семейства R 173, позволяет обнаружить более высокий уровень полиморфности изучаемых сортов, чем AFLP - анализ или RAPD -анализ. Изученные праймеры и их комбинации еще раз подтвердили свою гетероморфность, то есть данные олигонуклеотиды являются всего рода «универсальными». В литературе описано их применение для зерновых и овощных культур, нами же показано их эффективное применение для косточковых культур.

Экономические затраты на проведение анализов для сортовой идентификации косточковых культур. Материальные затраты при идентификации сортов молекулярными методами достаточно большие, поскольку метод является дорогостоящим.

В таблице 5 приведены затраты на выполнение анализа одного образца растения. Данные Ю.В. Чеснокова (2005), приведенные в таблице, получены

дьзовании коммерческих наборов и е1А е1 а1. (2002) в своей статье их наборов для выделения ДНК,

при обобщении стоимости анализа при испо! наборов собственного изготовления. Licki' приводит данные применения коммерчески тогда как A.B. Фортэ (2002) в своих исследованиях использовал наборы собственного изготовления.

Несмотря на то, что исследователи в своих работах использовали разные типы наборов для экстракции ДНК, затрлы на реактивы при проведении анализа одного образца в лаборатории ПДР - анализа ВСТИСП примерно сравнимы с затратами других исследователей. Утверждать, что стоимость одного анализа (36,30 рублей), согласно нашим данным, выше или ниже стоимости одного анализа по данным дру ~их исследователей мы не можем, поскольку в нашей работе использовалась ДНК.

Нами также были рассчитаны необходимые для проведения различения соЬтов косточковых культур (табл. 6). Материальные затраты на проведение сортовой идентификации 100 образцов косточковых культур составили 40 086,62 рубля, на проведение сортовой идентификации одного образца - 400,87 рублей. Таблица 5 - Материальные затраты молекулярного метода анализа при сортовой идентификации (на один образец в ■

только одна методика выделения

прямые материальные затраты,

рублях)

Процедура ПЦР -анализа Данные ПЦР -лаборатории (ВСТИСП) Дануте по Чеснокову (2005) Данные по Lickfeldt et al. (2002) Данные по Фортэ (2002)

Экстракция ДНК Амплификация Электрофорез и детекция 21,95 4,0811,10 44, 3,25 10, 2,58 10,14-79,04 20 20

Всего 36,30 58,48- 66,98 - 22,00

Примечание. Прочерк означает, что данные отсутствуют.

Таблица 6 - Прямые материальные затраты на сортовую идентификацию 100

образцов растений

Статьи расхода Сумма, руб

Наборы для выделения ДНК, проведения ПЦР и электрофореза Амортизация лабораторного оборудования (12,5%) Основная зарплата с начислениями Энергозатраты Дистиллированная вода Спирт ректификат 10 890,00 26 704,63 2 381,39 56,82 44,00 9,78

Итого 40 086,62

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований показана возможность использования маркерной системы на основе анализа полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей для сортовой и видовой идентификации косточковых культур (слива, алыча, вишня, черешня).

2. Для косточковых культур модифицирована методика выделения ДНК с использованием оригинального лизирующего буфера и показана эффективность ее использования при проведении сортовой идентификации.

3. Дтя выделения ДНК, пригодной для ПЦР - анализа, наиболее эффективным оказалось применение коммерческого набора для экстракции ДНК Diatom DNA Prep 200 и введение в состав лизирующего буфера сорбитола.

4. Получение четких и воспроизводимых профилей ампликонов сортов косточковых культур обеспечивают праймеры и комбинации праймеров: Paw S5, Paw S6, Paw SI 1, Paw S16, Paw S5 + Paw S6, Paw S5 + Paw SI 1, Paw S6 + Paw SI 1, Paw S6 + Paw S16, Paw SI 1 + Paw S16.

5. Сортовая идентификация сливы и алычи успешно выполняется совместным использованием комбинаций праймеров Paw S5 + Paw S6 и Paw S6 + Paw SI6, сортов черешни - 5-тью праймерами и комбинациями праймеров (Paw S5, Paw S16, Paw S5 + Paw S6, Paw S5 + Paw SI 1, Paw S6 + Paw S16), вишни -3-мя (Paw SI6, Paw S5 + Paw S6, Paw S6 + Paw SI6).

6. Наиболее эффективными для идентификации любого сорта сливы, алычи, вишни или черешни оказались комбинации праймеров Paw S5 + Paw S6 и Paw S6 +Paw SI6.

7. У сортов сливы домашней (Евразия 21, Нарач, Величавая, Венгерка московская), алычи гибридной (Кубанская комета, Шатер), сливы китайской

(Красный шар, Скороплодная), вишни

обыкновенной (Склянка розовая,

Гриот московский, Память Еникеева, Память Сахарова, Ширпотреб черная).

войлочной вишни Натали, черешни

Крымская, Фатеж, Гастинец, Итальянка) з профилях ДНК было выявлено 32 уникальных фрагмента ДНК, которые

возможности для проведения сортовой идентификации.

8. В профилях ДНК сортов сливы, алычи, мономорфных фрагментов для пров косточковых культур. Установлено, что

(Орловская янтарная, Мулатка,

предоставляют дополнительные

вишни и черешни определены 29 :дения видовой идентификации комбинация праймеров Paw S5 +

Paw S6 различает культуры по полимо эфным фрагментам. Однозначную идентификацию косточковых культур обеспечивает праймер Paw SI б.

9. Использованные системы праймеров позволили провести кластеризацию сортов косточковых культур и построить дендрограммы, отражающие родословные изученных сортов и их видо зую принадлежность.

10. Материальные затраты на проведение сортовой идентификации 100 образцов косточковых культур составляют в среднем 40 086,62 рублей, на проведение сортовой идентификации одного образца - 400,87 рублей.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕ СКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1. Для экономии средств, времени и трудовых ресурсов использовать предложенную нами методику идентификации косточковых культур на разных этапах селекционных программ от подбора родительских форм до апробационных мероприятий при Госсорт

2. Для получения качественных препаратов набор Diatom DNA Prep 200 производства ООО «Компания Биоком» с модификацией лизирующего буфера.

оиспытании.

ДНК использовать коммерческий

3. В качестве растительного материала для выделения ДНК у саженцев плодовых растений косточковых культур, находящихся в состоянии покоя, использовать камбиальные ткани.

4. При проведении сортовой идентификации косточковых культур использовать комбинации праймеров Paw S5 Paw S6 и Paw S6 + Paw SI6, видовой идентификации - праймер Paw SI6.

5. Созданный сортовой каталог электрофореграмм косточковых культур использовать для паспортизации сортов, а затем и для защиты прав селекционеров.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Арклис, О.В. Применение молекулярных маркеров для идентификации косточковых культур / О.В. Арклис, В.А. Высоцкий, И.Л. Цветков // Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК: сб. мат. междунар. науч. - практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 25-летию Брянской ГСХИ (Брянск, 11-12 апреля 2005 г.). - Брянск, 2005. - Вып.1. -С.4-5.

2. Арклис, О.В. Идентификация косточковых культур с помощью молекулярных маркеров / О.В. Арклис, В.А. Высоцкий, И.Л. Цветков // Биотехнология: состояние и перспективы развития: мат. III моек, междунар. конгресса (Москва, 14-18 марта 2005 г.). - 4.1. - 2005. - С.223.

3. Арклис, О.В. Выделение ДНК из тканей косточковых культур для ПЦР -анализа / О.В. Арклис, И.Л. Цветков, В.А. Высоцкий // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. ст. ученых ВСТИСП, посвященный 150-летию со дня рождения И.В. Мичурина. - 2005. - T.XIII. - С.25-29.

4. Арклис, О.В. Молекулярное маркирование генотипов косточковых культур / О.В. Арклис // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: мат. I всерос. науч.-практ. конф. (Волгоград, 26-29 августа 2006 г.). - Волгоград, 2006. - С.119-123.

5. Арклис, О.В. Современные подходы к идентификации косточковых культур

/ О.В. Арклис, В.А. Высоцкий, И.Л. Цвета -2007.-№2.-С. 19-21. 6. Романова, О.В. Применение ДНК косточковых культур / О.В. Романова Л животноводстве и ветеринарии: мат. 7-ой молодеж. науч. конф., посвящ. памяти акад. РАСХН Г.С. Муромцева (Мссква, 4 апреля 2007 г.) / ВНИИСБ. -2007. - С.35-37.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность за поддержку, советы и участие в работе директору ООО «Компания Биоком» А.-молекулярных методов анализа ООО «К' также сотрудникам ГНУ ВСТИСП: к.

:ов // Садоводство и виноградарство.

- маркеров для идентификации Биотехнология в растениеводстве,

. Комарову, к. биол. н., зав. лаб. эмпания Биоком» И.Л. Цветкову, а с.-х. н., зав. отделом методики и математического обеспечения исследований Волкову Ф.А., к. с.-х. н., зав. лаб. косточковых культур Н.Г. Морозовой, к. биол. н., вед. науч. сотруднику отдела защиты растений К.В. Метлицкой, к. с.-х. н., вед. науч. сотруднику отдела

агротехники Г.Ю. Упадышевой, к. с.-х биотехнологии Л.В. Алексеенко, к. с.-х. г косточковых культур Симонову B.C.

, н., ст. науч. сотруднику отдела ., ст. науч. сотруднику лаборатории

Подписано в печать 11.04.2007 г. Исполнено 12.04.2007 г. Печать трафаретная.

Заказ № 284 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Романова, Ольга Витальевна

Используемые сокращения

Введение

Глава 1 Идентификация косточковых культур на основе молекулярно-генетических маркеров

1.1 Типы молекулярно-генетических маркеров

1.2 Морфологические маркеры

1.3 Биохимические маркеры

1.4 Маркеры ДНК

1.4.1 ИРЬР - маркеры

1.4.2 ПНР

1.4.3 ИАРО - маркеры

1.4.4 АРЬР - маркеры

1.4.5 БЗИ. - маркеры

1.4.6 КБЯ - маркеры

1.4.7 Ретротранспозоны

1.4.8 БЫР - маркеры

1.5 Выделение растительной ДНК

1.6. Подбор праймеров

Глава 2 Материалы и методы

2.1 Объекты исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение растительной ДНК

2.2.2 Амплификация ДНК

2.2.3 Электрофорез в агарозном геле и визуализация продуктов амплификации

2.3 Обработка результатов анализа

Глава 3 Результаты исследований и их обсуждение

3.1 Модификация протокола выделения ДНК из растений косточковых культур (слива, вишня, черешня)

3.2 Выбор праймеров

3.3 Идентификация косточковых культур

3.3.1 Идентификация сортов и ценных форм косточковых культур

3.3.2 Обнаружение гибридов косточковых культур

3.3.3 Кластерный анализ родственных связей косточковых культур

3.4 Характеристика эффективности праймеров и их комбинаций

3.5 Экономические затраты на проведение анализов для сортовой идентификации

3.6 Обсуждение результатов

Выводы

Рекомендации для практического использования

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Идентификация сортов косточковых культур с помощью ПЦР - анализа"

Косточковые культуры, как и большинство плодовых растений, имеют очень продолжительный ювенильный период, исчисляемый годами. Для описания морфологических характеристик, таких как форма плода, его окраска, вкусовые качества, химический состав и так далее, необходимо 5-6 лет, чтобы растение вступило в период плодоношения. Только на данной фазе развития создаются условия для оценки всех морфологических характеристик, используемых впоследствии для проведения апробационных мероприятий. Кроме того, для регистрации сорта необходимо его сравнение со стандартным сортом при тех же самых условиях выращивания. А в связи с быстрым развитием селекции ежегодно появляются десятки новых сортов плодовых растений, требующих паспортизации.

Возникшие проблемы могут быть решены применением молекулярных маркеров на основе ДНК. Эти маркеры используются на очень ранних фазах развития растения. Так, применение данных маркеров для идентификации молодых сеянцев в первый год развития позволит не дожидаться начала плодоношения. Для выделения ДНК подходит любой растительный материал - кора, корневые отростки, листья, почки, цветки, пыльца, и даже гербарий. Препараты ДНК хранятся длительное время и многократно применяются для анализа.

В отличие от морфологических признаков, которые варьируют при разных погодных условиях, ДНК - маркеры не зависят от влияния окружающей среды. По сравнению с другими молекулярными маркерами (белковыми или иными биохимическими) маркеры на основе ДНК обладают огромным, «почти безграничным», потенциалом полиморфизма.

ДНК - технологии позволят оценить значительное разнообразие аборигенных и интродуцированных, дикорастущих и культурных форм растений и на основе молекулярных исследований создать коллекцию зародышевой плазмы для селекционного использования Применение молекулярных подходов в изучении филогении уточнит спорные вопросы систематики плодовых культур. Установление родственных связей прояснит происхождение многих сортов с неизвестными родословными.

Научная новизна. Адаптирована методика выделения ДНК из различных тканей и органов косточковых культур (сливы, алычи, вишни и черешни), модифицирован буфер для лизирования растительных тканей. Предложено использовать для экстрагирования ДНК из саженцев растений, находящихся в состоянии покоя, камбиальные ткани растений.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005 г.), международной научно-практической конференции «Развитие наследия И.В. Мичурина и подготовка кадров» (Мичуринск — наукоград, 8-9 сентября 2005 г.), на I Всероссийской конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 26-29 августа 2006 г.), на 7-ой молодежной научной конференции (Москва, 4 апреля 2007 г.), на заседаниях Ученого совета и секции ягодных культур ГНУ ВСТИСП (2004 -2007 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Плодоводство, виноградарство", Романова, Ольга Витальевна

Выводы

3. Для выделения ДНК, пригодной для ПЦР - анализа, наиболее эффективным оказалось применение коммерческого набора для экстракции ДНК Diatom DNA Prep 200 и введение в состав лизирующего буфера сорбитола.

4. Получение четких и воспроизводимых профилей ампликонов сортов сливы, алычи, вишни и черешни обеспечивают системы праймеров Paw S5, Paw S6, Paw Sll, Paw S16, Paw S5 + Paw S6, Paw S5 + Paw SI 1, Paw S6 + Paw SI 1, Paw S6 + Paw S16, Paw SI 1 + Paw S16.

5. Сортовая идентификация сортов сливы и алычи успешно выполняется совместным использованием комбинаций праймеров Paw S5 + Paw S6 и Paw S6 + Paw SI6, сортов черешни - 5-тью праймерами и комбинациями праймеров (Paw S5, Paw SI6, Paw S5 + Paw S6, Paw S5 + Paw SI 1, Paw S6 + Paw SI6), вишни - 3-мя (Paw SI6, Paw S5 + Paw S6, Paw S6 + Paw SI6).

7. У сортов сливы домашней (Евразия 21, Нарач, Величавая, Венгерка московская), алычи гибридной (Кубанская комета, Шатер), сливы китайской (Красный шар, Скороплодная), вишни обыкновенной (Склянка розовая, Гриот московский, Память Еникеева, Память Сахарова, Ширпотреб черная), войлочной вишни Натали, черешни (Орловская янтарная, Мулатка, Крымская, Фатеж, Гастинец, Итальянка) в профилях ДНК было выявлено 32 уникальных фрагмента ДНК, которые предоставляют дополнительные возможности для проведения сортовой идентификации.

8. В профилях ДНК сортов сливы, алычи, вишни и черешни определены 29 мономорфных фрагментов для проведения видовой идентификации косточковых культур. Установлено, что комбинация праймеров Paw S5 + Paw S6 различает культуры по полиморфным фрагментам. Однозначную идентификацию косточковых культур обеспечивает праймер Paw SI6.

9. Использованные системы праймеров позволили провести кластеризацию сортов и построить дендрограммы, отражающие родословные изученных сортов и их видовую принадлежность.

Рекомендации для практического использования

2. Для получения качественных препаратов ДНК использовать коммерческий набор Diatom DNA Prep 200 производства ООО «Компания Биоком» с модификацией лизирующего буфера.

4. При проведении сортовой идентификации косточковых культур использовать комбинации праймеров Paw S5 + Paw S6 и Paw S6 + Paw SI6, видовой идентификации - праймер Paw SI6.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Романова, Ольга Витальевна, Москва

1. Алтухов, Ю.П. Мономорфная видоспецифичная ДНК, выявляемая в полимеразной цепной реакции со случайными праймерами / Ю.П. Алтухов, А.Б. Абрамова // Генетика. 2000. - Т.36. - №12. - С.1674-1681.

2. Алтухов, Ю.П. Генетический мономорфизм вида и его биологическое значение / Ю.П. Алтухов, Ю.Г. Рычков // Журн. Общ. Биол. 1972. - Т.ЗЗ. - С.281-300.

3. Алтухов, Ю.П. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике / Ю.П. Алтухов, Е.А. Салменкова // Генетика. 2002. - Т.38. - №9. - С.1173-1195.

4. Бирюкова, В.А. ДНК маркеры в селекции картофеля / В.А. Бирюкова,

5. B.C. Зайцев, Э.Е. Хавкин, JI.M. Хромова, И.А. Шилов // Достижения науки и техники АПК. 2003. - №10. - С.38-41.

6. Булат, С.А. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов / С.А. Булат, O.K. Кобаев, Н.В. Мироненко, Ф.М. Ибатуллин, JI.A. Лучкина, A.B. Суслов // Генетика. 1992. - Т.28. - №5.1. C.19-28.

7. Генофонд вишни (Cerasus Mill.) в северных широтах. Каталог коллекции ВИР / РАСХН, ГНЦ РФ ВИР. Вып. 760. - С-Пб., 2004. - 64с.

8. Глазко, В.И. Генетика изоферментов животных и растений / В.И. Глазко, И.А. Созинов. Киев: Урожай, 1993. - 528с.

9. Гостимский, С.А. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, В.К. Боброва // Генетика. 1999. - Т.35. -№11.- С.1538-1549.

10. Гречко, В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики / В.В. Гречко // Генетика. 2002. - Т.38. - №8. - С.1013-1033.

11. Гут, Р.Т. Характерные особенности выделения суммарной ДНК из листьев и почек древесных растений при изучении генетического полиморфизма / Р.Т. Гут, М.В. Радченко, Г.Т. Криницкий // ИВУЗ. Лесной журнал. 2005. - №5. - С.25-30.

12. Данилова, Т.В. Возможности использования ^БЯ ПЦР - анализа в селекции хмеля обыкновенного (НшшЬб 1ири1иБ Ь.) / Т.В. Данилова, Г.И. Карлов // Актуал. пробл. генетики. - М., 2003. - Т.2. - С. 115-117.

13. Дорохов, Д.Б. Быстрая и экономичная технология 11АРВ анализа растительных геномов / Д.Б. Дорохов, Э. Клоке // Генетика. - 1997. - Т.ЗЗ. - №4. - С.443-450.

14. Дорохов, Д.Б. ДНК идентификация: проблемы и перспективы / Д.Б. Дорохов, A.M. Сеитова, А.Н. Игнатов, И.Л. Цветков, Т.П. Супрунова, М.Н. Лаптева // Селекция и семеноводство. - 1999. - №4. - С.44-46.

15. Евстратов, А.И. Есть и черешня зимостойкая / А.И. Евстратов // Приусадебное хозяйство. 1998. - №9. - С.28-30.

16. Еникеев, Х.К. Биологические особенности сливы и выведение новых сортов / Х.К. Еникеев. М.: Изд-во АН СССР, 1960. - 322с.

17. Еремин, Г.В. Отдаленная гибридизация косточковых плодовых растений. М.: Агропромиздат, 1985. - 280с.

18. Забродина, М.В. Сравнение многолетней ржи методом ПЦР -амплификации случайных и известных последовательностей / М.В. Забродина, A.A. Шаденков, Э.Е. Хавкин // Биотехнология. 1998. - Т.З. -С.82-86.

19. Зайцев, B.C. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР -анализа рассеянных повторяющихся последовательностей R 173 / B.C. Зайцев, Э.Е. Хавкин // Докл. РАСХН. 2001. - Т.2. - С.3-5.

20. Зайцев, B.C. ДНК генотипирование сортообразцов вишни и черешни / B.C. Зайцев, Д.Н. Мицых, Э.Е. Хавкин // С. - х. биол. - 2005. - №3. - С. 123125.

21. Иванов, П.Л. Геномная дактилоскопия: гипервариабельные локусы и генетическое маркирование / П.Л. Иванов // Мол. биол. 1989. - Т.23. -Вып. 2.-С.341.

22. Исачкин, A.B. Полный сортовой каталог средней полосы России / A.B. Исачкин. М.: ЭКСМО - Пресс, Лик пресс, 2001. - 512с.

23. Календарь, Р.Н. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение / Р.Н. Календарь, В.И. Глазко // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. - Т.34. - №4. - С.279-296.

24. Каталог. Плодовые и ягодные культуры России /ВНИИС им. И.В. Мичурина. Воронеж: Кварта, 2001. - 298с.

25. Каталог. Сорта плодовых и ягодных культур, выведенных во ВСТИСП / под общ. ред. И.М. Куликова. М., 2006. - 116с.

26. Каталог. Сорта плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур / РАСХН, ВСТИСП / ред. В.И. Кашин. М.: ИНТЕРМЕКС, 2000. - 160с.

27. Каталог мировой коллекции ВИР. Выпуск 711. Селекционные достижения ВИР по плодовым культурам за 75 лет / сост. A.A. Юшев. -С.-Пб.: ВИР, 2000.- 100с.

28. Картель, H.A. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК и его использование в генетике и селекции растений / H.A. Картель, М.И. Просняк // С. х. биол. -1991. - №5. - С.41-48.

29. Козлов, H.H. Перспективы использования молекулярных маркеров в селекции кормовых культур / H.H. Козлов, Б.П. Михайличенко, С.И. Ивашута, A.A. Шаденков // С. х. биол. - 1997. - №3. - С.68-74.

30. Конарев, A.B. Белки растений как генетические маркеры / A.B. Конарев. -М.: Наука, 1983. 320с.

31. Конарев, A.B. Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства / A.B. Конарев, В.Г. Конарев, Н.К. Губарева, Т.И. Пенева // Цитология и генетика. 2000. -Т.34. - №2. - С.91-104.

32. Корзун, В.Н. Генетическое картирование с помощью ПДРФ анализа у растений / В.Н. Корзун, H.A. Картель // Физиол. и биохим. культур, раст. -1994. - Т.26. - №6. - С.545-541.

33. Малышев, C.B. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений / C.B. Малышев, H.A. Картель // Мол. биол. 1997. - Т.31. - №2. -С. 197-208.

34. Михеев A.M. Вишня и черешня / A.M. Михеев, Н.Т. Ревякина. М.: Изд. дом МСП, 2004. - 112с.

35. Михеев A.M. Слива, алыча, терн / A.M. Михеев, B.C. Симонов. М.: Изд. дом МСП, 2005. - 144с.

36. Нижников, B.C. О таксономии Cerasus pumila (L.) Michx. и C.besseyi (Bailey) Linell (Rosaceae) / B.C. Нижников // Ботан. журн. 1977. - T.62. -№4. - C.533-536.

37. Особенности изучения помологических признаков видов и сортов рода Prunus Mill в связи с созданием генетической и стержневой коллекций (Методические указания) / под ред. В.А. Драгавцева. С.-Пб., 2001. - 88с.

38. Острейко, С.А. Изомеры хлорогеновой кислоты у вишни / С.А. Острейко // Вест. с. х. науки. - 1969. - №3. - С.61-64.

39. Пономаренко, Н.С. Наследование изоферментов пероксидазы у потомства Prunus domart / Н.С. Пономаренко // Отдаленная гибридизация плодово-ягодных и других многолетних растений. Кишинев, 1994. -С.31-32.

40. Программа и методика сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур / под общ. ред. E.H. Седова, Т.П. Огольцовой. -Орел: Изд-во ВНИИСПК, 1999. 608с.

41. Серебровский, A.C. Генетический анализ / A.C. Серебровский. М., 1970.- 342с.

42. Сиволап, Ю.М. Анализ генетических дистанций методом ПДРФ у винограда / Ю.М. Сиволап, Т.Г. Вербицкая, М.И. Тулаева, И.А. Барышева // Цитология и генетика. 1993. - Т.27. - №6. - С.24-28.

43. Соболев, В.В. Использование ISSR маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины / В.В. Соболев, Г.И. Карлов, А.Г. Соболева, A.B. Озеровский, И.В. Казаков, A.A. Феськов // С. - х. биол. - 2006. - №5. - С.48-52.

44. Соболев, В.В. Сравнение методов RAPD и ISSR - ПЦР при исследовании молекулярно-генетического полиморфизма сортов и видов малины / В.В. Соболев, А.Г. Соболева // Вестн. БГСА. - 2005. - С.3-10.

45. Созинов, A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / A.A. Созинов / отв. ред. Л.И. Корочкин. М.: Наука, 1983. - 272с.

46. Смирнов В.Ф. Новые сорта косточковых культур, выведенные в СССР /

47. B.Ф. Смирнов. М.: Наука, 1972. - 258с.

48. Сорта плодовых, ягодных, орехоплодных культур и винограда селекции института HAH Белоруси / гл. ред. В.А. Самусь. Самохволовичи, 2003. -80с.

49. Сулимова, Г.Е. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК. Методология и свойства. Обзор / Г.Е. Сулимова // С. х. биол. - 1989. -№1. - С.60-67.

50. Сулимова, Г.Е. Выделение ДНК из тканей высших растений / Г.Е. Сулимова, А.Г. Слюсаренко / Строение ДНК и положение организмов в системе / под ред. А.Н. Белозерского, A.C. Антонова. М., 1972. - С. 19-34.

51. Фортэ, A.B. Применение ДНК маркеров для оценки генетического разнообразия гибридных сеянцев, сортов и видов яблони / A.B. Фортэ // Дисс. к. с. х. н. - Мичуринск, 2002. - 118с.

52. Фортэ, A.B. Применение ДНК маркеров для оценки генетического полиморфизма яблони / A.B. Фортэ, Н.И. Савельев, Д.Б. Дорохов. -Мичуринск наукоград: Изд-во ГНУ ВНИИИГиСПР им. И.В. Мичурина, 2004.- 112с.

53. Хавкин, Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве / Э.Е. Хавкин //

54. C. х. биол. -1997. - №5. - С.3-21.

55. Хавкин, Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур / Э.Е. Хавкин // С. -х. биол. 2003. - №3. - С.26-41.

56. Чесноков, Ю.В. ДНК фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений / Ю.В. Чесноков // С. - х. биол. - 2005. - №1. -С.20-40.

57. Aharon, A. DNA microarrays for functional plant genomics / A. Aharon, 0. Vorst // Plant Mol. Biol. 2001. - V.48. - P.99-118.

58. Antonius Klemova, K. Molecular markers in Rubus (Rosaceae) research and breeding / K. Antonius - Klemova // J. Hortic. Sci. BioTechnol. - 1999. - V.74. -№2.-P. 149-160.

59. Aranzana, M.J. Development and variability analysis of microsatellite markers in peach / MJ. Aranzana, J. Garsia Mas, J. Carbo, P. Arus // Plant Breed. -2002. - V. 121. - P.87-92.

60. Arulsekar, S. Isozyme analysis procedures for stone fruits, almond, grape, walnut, pistachio and fig / S. Arulsekar, D.E. Parfitt // HortSci. 1986. - V.21. -P.928-933.

61. Aruna, M. Genetic relatedness among rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei) cultivars determined by DNA amplification using single primers of arbitrary sequence / M. Aruna, P. Ozias Akins, M.E. Austin, G. Kochert // Genome. -1993. - V.36. - P.971-977.

62. Beaver, J.A. Isozyme diversity in sour, sweet and ground cherry / J.A. Beaver, A.F. Iezzoni, C.W. Ramm // Theor. Appl. Genet. 1995. - V.90. - P.847-852.

63. Becker, J. Combined mapping of AFLP and RFLP markers in barley / J. Becker, P. Vos, M. Kuiper, F. Salamini, H. Heun // Mol. Gen. Genet. 1995. -V.249. - P.65-73.

64. Bellini, E. Genetic relationships in japanese plum cultivars by molecular markers / E. Bellini, E. Giordani, V. Nencetti, D. Paffetti // Acta Hort. 1998. -V.478. - P.53-61.

65. Ben Hayyim, G. Evaluation of isozyme system in Citrus to facilitate identification of fusion products / G. Ben - Hayyim, A. Shani, A. Vardi // Theor. Appl. Genet. - 1982. - V.64. - P. 1-5.

66. Botstein, D. Construction of a genetic linkage map in man using RFLP / D. Botstein, R.L. White, M. Scolnick, R.W. Davis // Am. J. Human Genet. 1980. -V.32.-P.314-331.

67. Byrne, D.H. Electrophoretic characterization of diploid plums of the southeastern United States / D.H. Byrne, T.G. Littleton // J. Amer. Soc. Hort. Sei. 1988. - V.l 13. - P.918-924.

68. Byrne, D.H. Interspecific hybrid verification of plum x apricot hybrids via isozymes analyses / D.H. Byrne, T.G. Littleton // Hort. Sei. 1989. - V.24. -P.132-134.

69. Byrne, D.H. Characterization of isozyme variability in apricots / D.H. Byrne, T.G. Littleton // J. Amer. Soc. Hort. Sei. 1989. - V.l 14. - P.674-678.

70. Caetano Anolles, G. DNA fingerprinting: a strategy for genome analysis / G. Caetano - Anolles, B.J. Bassam, P.M. Gresshoff // Plant. Mol. Biol. Rep. -1991. - V.9. - P.292-305.

71. Cantini, C. DNA fingerprinting of tetraploid cherry germplasm using simple sequence repeats / C. Cantini, A.F. Iezzoni, W.F. Lamboy, M. Botizki, D. Struss // J. Amer. Soc. Hort. Sei. 2001. - V.l26. - P.205-209.

72. Chaparro, J.S. Targetted mapping and linkage analysis of morphological, isozyme and RAPD markers in peach / J.S. Chaparro, D.J. Werner, D. O'Malley, R.R. Sederoff// Theor. Appl. Genet. 1994. - V.87. - P.805-815.

73. Chevreau, E. Inheritance and linkage of isozyme loci in pear (Pyrus communis L.) / E. Chevreau, S. Leuliette, M. Gallet // Theor. Appl. Genet. 1997. - V.94. -P.498-506.

74. Cipriani, G. Screening RAPD primers for molecular taxonomy and cultivar fingerprinting in the genus Actinidia / G. Cipriani, R. Di Bella, R. Testolin // Euphytica. 1996. - V.90. - №2. - P.169-174.

75. Chung, K. Classification of native and cultivated Pyrus species in Korea by isozyme band patterns / K. Chung, K. Ko // J. Korean Soc. Hortic. Sci. 1995. -V.36. - P.829-835.

76. Colosi, J.C. Tissue grinding with ball bearing and vortex mixer for DNA exstraction / J.C. Colosi, B.A. Schaal // Nucl. Acid. Res. 1993. - V.21. - №4. -P.1051-1052.

77. Crowhurst, R.N. Restriction fragment length polymorphism in genus Actinidiaceae / R.N. Crowhurst, R. Lints, R.G. Atkinson, R,C. Gardner // Plant. Syst. Evol. 1990. - V.172. - P.193-203.

78. Davis, T.M. Template mixing: a method of enhancing detection in interpretation of codominant markers / T.M. Davis, H. Yu, K.M. Haigis, P.J. McGowan // Theor. Appl. Genet. 1995. - V.91. - P.582-588.

79. Degani, C. Enzyme polymorphism in mango / C. Degani, R. El Batsri, S. Gazit// J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 1990. - V.l 15. - P.844-847.

80. Degani, C. A comparison of genetic relationship measures in strawberry (Fragaria x ananassa Duck) based on AFLP, RAPD and pedigree data / C.

81. Degani, L.J. Rowland, J.A. Saunders, S.C. Hokanson, E.L. Ogden, A. Golan-Goldhirsh, G.J. Galetta // Euphytica. 2001. - V. 117. - P. 1-12.

82. Dellaporta, S.L. A plant DNA minipreparation: version II / S.L. Dellaporta, J. Wood, J.B. Hicks // Plant Mol. Biol. Rep. 1983. - V.l - P.19.

83. Deng, Z.N. Identification of in vivo and in vitro lemon mutation mutants RAPD markers / Z.N. Deng, A. Gentile, E. Nicolosi, A. Domina Vardi, E. Tribulato // J. Hort. Sci. 1995. - V.70. - P.l 17-125.

84. DeWald, M.G. Identification of pineapple cultivars by isozyme genotypes / M.G. DeWald, G.A. Moore, W.B. Sherman // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1988. -V.l 13. -P.935-938.

85. Downey, S.L. Polymorphic DNA markers in black cherry (Prunus serótina) are identified using sequences from sweet cherry, peach and sour / S.L. Downey, A.F. Iezzoni // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 2000. - V.l25. - №1. - P.76-80.

86. Doyle, J.J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue/J.J. Doyle, J.L. Doyle //Phytochem. Bull. 1987. - V. 19. - P.l 1-15.

87. Dunemann, F. Genetic relationships in Malus evaluated by RAPD "fingerprinting" of cultivars and wild species / F. Dunemann, R. Kahnau, H. Schmidt // Plant Breed. 1994. - V.l 13. - P.150-159.

88. Edwards, K. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis / K. Edwards, C. Johnstone, C. Thompson // Nucl. Acids Res. -1991. V. 19. - №6. - P. 1349.

89. Eldredge, L. Application of RFLP analysis to genetic linkage mapping in peaches / L. Eldredge, R. Ballard, W.W. Baird, A. Abbott, P. Morgens, A. Callahan, R. Scorza, R. Monet // Hort. Sci. 1992. - V.27. - P.160-163.

90. Fang, D.Q. Development of molecular markers linked to a gene controlling fruit acidity in citrus / D.Q. Fang, C.T. Federici, M.L. Roose // Genome. 1997. - V.40. - P.841-849.

91. Flavell, A.J. Retrotransposon based insertion polymorphism (RBIP) for high throughput marker analysis / A.J. Flavell, M.R. Knox, S.R. Pearse, T.H. Ellis et al. // Plant J. - 1998. - V. 16. - №5. - P.643-650.

92. Furnier, G.H. Evolution of avocados by DNA restriction fragment variation / G.H. Furnier, M. P. Cummings, M.T. Cleg // J. Hered. 1990. - V.81. - P. 183188.

93. Gannavarapu, M. Microsatellite markers in peach (Prunus persica (L.) Batsch): abundance and utility / M. Gannavarapu / MS thesis Clemson Univ. / eds. S.C. Clemsov. Clemson: Clemson Univ., 1998.

94. Gawel, N. Chloroplast DNA restriction fragment length polymorphism (RFLPs) in Musa species / N. Gawel, R.L. Janet // Theor. Appl. Genet. 1991.- V.81. -P.783-786.

95. Gerlach, N.K. Kettenreaktionen un Obstbau: Sortenidentifizierung mi Hilfe des DNA Fingerprinting / N.K. Gerlach, R. Stosser // Erwerbsobstbau. - 1998.- Jg.40. №4. - S.103-106.

96. Gianfranceschi, L. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple / L. Gianfranceschi, N. Seglias, R. Tarchini, M. Komjanc, C. Gessler // Theor. Appl. Genet. 1998. - V.96. - P.1069-1076.

97. Goffreda, J.C. Inheritance of isozymes in peach x Prunus kansuensis and peach x Prunus davidiana hybrids / J.C. Goffreda, N.J.M. Amstrong, S.A. Mehlenbacher, N. Versa // Euphytica. -1991. V.54. - P.161-168.

98. Goldring, A. Isozyme analysis of mature avocado embryos to determine outcrossing rate in a "Hass" plot / A. Goldring, S. Gazit, C. Degani // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1987. - V.l 12. - P.389-392.

99. Gogorcena, Y. RFLPs for identification of grape cultivars / Y. Gogorcena, S. Arulsekar, A. Dandekar, D.E. Parfitt // HortSci. 1990. - V25. - P. 1081.

100. Granger, A.R. Sweet cherry cultivar identification by leaf isoenzyme polymorphism / A.R. Granger, G.R. Clarke, J.F. Jackson // Theor. Appl. Genet.- 1993. V.86. - P.458-464.

101. Gregor, D. Cultivar identification in Prunus domestica using random amplified polymorphic DNA markers / D. Gregor, W. Hartmann, R. Stosser // Acta Hort. 1994. - Y.359. - P.33-40.

102. Gribbon, B.M. Phylogeny and transpositional activity of Tyl-copia group retrotransposons in cereal genomes / B.M. Gribbon, S.R. Pearce, R. Kalendar et al. // Mol. Gen. Genet. 1999. - V.26. - №6. - P.883-891.

103. Gu, W.K. Large-scale, cost-effective screening of PCR products in marker-assisted selection application / W.K. Gu et al. // Theor. Appl. Genet. 1995. -V.91. - №3. - P.465-470.

104. Guidet, F. Cloning and characterization of a new rye-specific repeated sequence / F. Guidet, P. Rogowsky, C. Taylor // Genome. 1991. - V.34. -P.81-87.

105. Guilford, P. Microsatellites in Malus x domestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar identification / P. Guilford, S. Prakash, J.M. Zhu, E. Rikkering, S. Gardiner, H. Bassett, R. Forster // Theor. Appl. Genet. 1997. -V.94. - P.249-254.

106. Gupta, P.K. DNA chips, misroarrays and genomics / P.K. Gupta, J.K. Roy, M. Prasad // Current Sci. 1999. - V.77. - P.875-884.

107. Gupta, P.K. Single nucleotide polymorphisms: a new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphisms with emphasis on their use in plants / P.K. Gupta, J.K. Roy, M. Prasad // Current Sci. 2001. - V.80. - P.524-535.

108. Haghighi, K. DNA restriction fragment length variability in the genomes of highbush blueberry / K. Haghighi, J.K. Hancock // HortSci. 1992. - V.27. -P.44-47.

109. Harada, T. DNA RAPDs detect genetic variation and paternity in Malus / T. Harada, K. Matsukawa, T. Sato, R. Ishikawa, H. Niizeki, K. Saito // Euphytica. - 1993. - V.65. - P.87-91.

110. Hoepfner, A.-S. DNA fingerprinting useful for monitoring cell identity in micropropagated raspberries / A.-S. Hoepfner, H. Nybom, U. Carlsson, R. Franzen // Acta agricult., sect. B. 1993. - V.143. - P.53-57.

111. Hormaza, J.I. Early selection in cherry combining RAPDs with embryo culture / J.I. Hormaza // Sci. Hort. 1999. - V.79. - №1-2. - P.121-126.

112. Hosaka, K. Peroxidase in various tissues for discrimination of two tuberose Solanum species / K. Hosaka, M. Matsubayasi, 0. Kamijima // Japan J. Bred. -1985. V.35. - P.375-382.

113. Jarret, R.L. Determining the interspecific origins of clones within the "Saba" cooking banana complex / R.L. Jarret, R.E. Litz // HortSci. 1986. - V.21. -P.1433-1435.

114. Jeffreys, A.J. Spontaneous mutation rates to new length alleles at tandem repetitive hypervariable loci in human DNA / A.J. Jeffreys, N.J. Royle, V. Wilson, Z. Wong //Nature. 1988. - V.332. - P.278-281.

115. John, M.E. An efficient method of isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenols / M.E. John // Nucl. Acids. Res. 1992. - V.20. -P.2381.

116. Kaemmer, D. Oligonucleotide and amplification fingerprinting of wild species and cultivars of banana (Musa spp.) / D. Kaemmer, R. Alza, K. Weising, G. Kahl, F.J. Novak // Bio. Techn. 1992. - V.10. - P.1030-1035.

117. Kalendar, R. IRAP and REMAP: Two new retrotransposon based DNA fingerprinting techniques / R. Kalendar, T. Grob, M.T. Regina, A. Suoniemi, A. Schulman // Theor. Appl. Genet. - 1999. - V.98. - P.704-711.

118. Kan, I.W. Polymorphism of DNA sequence adjacent to the P-globin structural gene. Its relation to the sickle mutation / I.W. Kan, A.M. Dozy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V.75. - P.5631-5635.

119. Koller, B. DNA markers linked to Malus loribunda 821 scab resistance / B. Koller, L. Gianfranceschi, N. Seglias et al. // Plant. Mol. Biol. 1994. - V.26. -P.597-602.

120. Koller, B. Identification of apple cultivars using RAPD markers / B. Koller, A. Lehmamn, J.M. Medermott, C. Gessler // Theor. Appl. Genet. 1993. -V.85. - P.901-904.

121. Korbin, M. Effect of DNA quality on RAPD based identification of strawberry (Fragaria x ananassa) genotypes / M. Korbin, A. Kuras, A. Golis, E. Zurawicz // J. Fruit Ornam. Plant Res. - 2000. - V.8. - №3-4. - P.105-115.

122. Krutovskii, K.V., Vollmer S.S., Sorensen F.C. et al. RAPD genome map of Douglas fir / K.V. Krutovskii, S.S. Vollmer, F.C. Sorensen et al. // J. Heredity.- 1998. V.89. - №3. - P.197-205.

123. Ky, C.L. Interspecific genetic linkage map, segregation distortion and genetic conversion in coffee (Coffea sp.) / C.L. Ky, P. Barre, M. Lorieux et al. // Theor. Appl. Genet. 2000. - V. 101. - №4. - P.669-676.

124. Kumar, A. Plant retrotransposons / A. Kumar, J.L. Bennetzen // Annu. Rev. Genet. 1999. - V.33. - P.479-532.

125. Labra, M. Extraction and purification of DNA from grapevine leaves / M. Labra, E. Carreno Sanchez, M. Bardini, B. Basso, F. Sala, A. Scienza // Vitis.- 2001. V.40. - №2. - P.101-102.

126. Lamboy, W.F. Partitioning of allozyme diversity in wild populations of Malus sieversii L. and implications for germplasm collection / W.F. Lamboy, J. Yu, P.L. Forsline, N.F. Weeden // J. Am. Soc. Hortic. Sei. 1996. - V.121. -P.982-987.

127. Landegren, U. A ligase mediated gene detection technique / U. Landegren, R. Kaiser, J. Sanders, L. Hood // Sei. - 1988. - V.241. - P.1077-1080.

128. Lanham, P.G. RAPD fingerprinting of blackcurrant (Ribes nigrum L.) cultivars / P.G. Lanham, R.M. Brennan, C. Hackett, R.J. McNicol // Theor. Appl. Genet. 1995. - V.90. - P.166-172.

129. Lanham, P.G. Estimation of heterozigosity in Ribes nigrum L. using RAPD markers / P.G. Lanham // Genetica. 1996. - V.98. - P. 193-197.

130. Lanham, P.G. Genetic characterization of gooseberry (Ribes grossularia subgenus grossularia) germplasm using RAPD, ISSR and AFLP markers / P.G. Lanham, R.M. Brennan // J. Hort. Sei. Biotechnol. 1999. - V.74. - P.361-366.

131. Lanham, P.G. Genetic diversity within a secondary gene pool for Ribes nigrum L. revealed by RAPD and ISSR markers / P.G. Lanham, A. Korycinska, R.M. Brennan // J. Hortic. Sei. Biotechnol. 2000. - V.75. - №4. - P.371-375.

132. Lashermer, P. Molecular characterization and origin of the Coffee arabica L. genome / P. Lashermes, M. C. Combes, J. Robert et al. // Mol. Gen. Genet. -1999. - V.261. - P.259-266.

133. Lavi, U. Application of DNA markers for identification and breeding of perennial fruit crops / U. Lavi, P Credan., T. Schaap, J. Hiller // Plant Breed. Rev. -N.Y., 1994. V.12. - P.195-226.

134. Lavi U., Hiller J., Vainstein A., Lahav E., Sharon D. Application of DNA markers for identification and genetic analysis of avocado / U. Lavi, J. Hiller, A. Vainstein, E. Lahav, D. Sharon // J. Amer. Soc. Hort. Sei. -1991. V.l 16. -P. 1078-1081.

135. Levi A., Rowland L.J., Härtung J.S. Production of reliable randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers from DNA of woody plants / A. Levi, L.J. Rowland, J.S. Härtung//Hort. Sei. 1993. - V.28. - P.l 188-1190.

136. Levinson, G. Slipper-strand mispairingia major mechanism for DNA sequence evolution / G. Levinson, G.A. Gutman // Mol. Biol. Evol. 1987. -V.4. -P.203-221.

137. Lickfeldt, D.W. Comparing three DNA extraction procedures for cost, efficiency and DNA yield / D.W. Lickfeldt, N.E. Hofmann, J.D. Jones, A.M.Hamblin, T.B. Voidt // Hort. Sei. 2002. - V.37. - №5. - P.822-825.

138. Litt, M. A hypervariable micosatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat with the cardiac muscle actin gene / M. Litt, J.A. Luty // Am. J. Genet. 1989. - V.44. - P.397-401.

139. Lodhi, U. Application of DNA "fingerprints" for identification and genetic analysis of avocado / U. Lodhi, J. Hillel, A. Vainstein, E. Lahav, D. Sharon // J. Amer. Soc. Hort. Sci. -1991. V.l 16. - P. 1078-1081.

140. Luo, S. Inheritance of RAPD markers in an interspecific Fj hybrid of grape between Vitis quinquangularis and V. vinifera / S. Luo, P. He, X. Zheng, P. Zhou // Sci. Hort. 2002. - V.93. - №1. - P. 19-28.

141. Maliepaard, C. Aliening male and female linkage maps of apple (Malus pumila Mill.) using multi allelic markers / C. Maliepaard, F.H. Alston, van Arkel G. et al. // Theor. Appl. Genet. 1998. - V.97. - P.60-73.

142. Markussen, T. Identification of PCR-based markers linked to the powdery-mildew-resistance gene Pli from Malus robusta in cultivated apple / T. Markussen, J. Kruger, H. Schmidt, F. Dunemann // Plant Breed. 1995. -V.l 14. - P.530-534.

143. Matsuyama, T. DNA fingerprinting in citrus cultivars / T. Matsuyama, R. Motohashi, T. Akihama, M. Omura // Japan. J. Breed. 1992. - V.42. - P. 155159.

144. Mekuria, G.T. Genetic variability between different accessions of some common commercial olive cultivars / G.T. Mekuria, G.G. Collins, M. Sedley // J. Hortic. Sci. Biotechnol. 1999. - V.74. - №3. p.309-314.

145. Menendez, R.A. Identification of apple rootstock cultivars by isozyme analysis / R.A. Menendez, F.E. Larsen, R.Jr. Fritts // Identification of applerootstock cultivars by isozyme analysis // J. Amer. Soc, Hort. 1986. - V. 111.-P.933-937.

146. Messeguer R. Identification of peach cultivars with pollen isozymes / R. Messeguer, P. Arus, M. Carrera // Sci. Hort. 1987. - V.31. - P. 107-117.

147. Microsatellites. Evolution and Application / eds. D.B. Goldstein, C. Schlotter. N.-Y.: Oxford Univ. Press. Inc. - 1999. - 352p.

148. Monte Corvo, L. Assessment of relationships among Pynus species and cultivars using AFLP and RAPD markers / L. Monte - Corvo, L. Cabrita, C. Oliveira, J. Leitao // Genet. Res. Crop. Evalut. - 2000. - V.47. - P.257-265.

149. Monte Corvo, L. ISSR analysis of cultivars of pear and suitability of molecular markers for clone discrimination / L. Monte - Corvo, L. Goulao, C. Oliveira // J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 2001. - V.126. - №5. - P.517-522.

150. Moore, G.A. Molecular markers / G.A. Moore, R.E. Durham // Biotechnology of perennial fruit crops / eds. F.A. Hammerschlag, R.E. Litz. -Wallingford: CAB International. 1992. - P.105-139.

151. Mowrey, B.D. Isozyme survey of various species of Prunus in the subgenus Amygdalus / B.D. Mowrey, D.J. Werner, D.H. Byrne // Sci. Hort. 1990. -V.44.-P.251-260.

152. Mueller, U.G. AFLP genotyping and fingerprinting / U.G. Mueller, L.L. Wolfenbarger// Trends Ecol. Svol. 1999. - V.14. - P.389-394.

153. Mulcahy, D.L. The use of random amplified polymorphic DNAs to fingerprint apple genotypes / D.L. Mulcahy, M. Cresti, S. Sansavini, G.C. Douglas, H.F. Linskens, G.B. Mulcahy, R. Vignani, M. Pancaldi // Sci. Hort. -1993. V.54. - P.89-96.

154. Mullis, K. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction / K. Mullis, F. Faloona, S. Schart, R. Saiki, G. Horn, H. Erlich // Cold spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986. - V.51. - P.263-273.

155. Murray, M.G. Rapid isolation of high molecular weight DNA / M.G. Murray, W.F. Thompson // Nucl. Acids Res. 1980. - V.8. - P.4321-4325.

156. Nei, M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases / M. Nei, W.H. Li // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1979. V.76. - P.5269-5273.

157. Nicolosi, E. Cytrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular markers / E. Nicolosi, Z.N. Deng, A. Gentile, S. La Malfa, G. Continella, E. Tribulato // Theor. Appl. Genet. 2000. - V.100. -P.l 155-1166.

158. Nybom, H. DNA fingerprinting a useful tool in fruit breeding / H. Nybom // Euphytica. - 1994. - V.77. - №1-2. - P.59-64.

159. Nybom, H. DNA fingerprints can distinguish cultivars of blackberries and raspberries / H. Nybom, B.A. Schaal, S.H. Rogstad // Acta. Hort. 1989. -V.262. - P.305-310.

160. Nybom, H. Genetic variation detected by use of the M13 "DNA fingerprint" probe in Mains, Prunus and Rubus (Rosaceae) / H. Nybom, S.H. Rogstad, B.A. Schaal // Theor. Appl. Genet. 1990. - V.79. - P.153-156.

161. Nybom, H. Minisatellite DNA "fingerprints" can distinguish Rubus cultivars and estimate their degree of relatedness / H. Nybom, H.K. Hall // Euphytica. -1991. V.53. - P.107-111.

162. Nybom, H. DNA "fingerprinting" applied to paternity analysis in apples (Malus x domestica) / H. Nybom, B.A. Schaal // Theor. Appl. Genet. 1990a. -V.79. - P.763-768.

163. Nybom, H. DNA "fingerprintings" reveal genotypic distributions in natural populations of blackberries and raspberries (Rubus. Rosaceae) / H. Nybom, B.A. Schaal // Am. J. Bot. 1990b. - V.77. - P.883-888.

164. Ohgawara, T. Somatic hybrid plants obtained by protoplast fusion between Citrus sinensis and Poncitrus trifoliate / T. Ohgawara, S. Kobayashi, E. Ohgawara, H. Uchimiya, S. Ishii // Theor. Appl. Genet. 1985. - V.71. - P. 1-4.

165. Oliveira, C.M. Molecular typing of Pyrus based on RAPD markers / C.M. Oliveira, M. Mota, L. Monte Corvo, L. Goulao, D.M. Silva // Sci. Hort. -1999. - V.79. - №3.4. p. 163-174.

166. Ortiz, A. E. Analysis of plum cultivars with RAPD markers / A. Ortiz, R. Renaud, I. Catzada, E. Ritter // J. Hort. Sci. 1997. - V.72. - №1. - p.1-9.

167. Paglia, G. PCR based multiplex DNA fingerprinting techniques for the analysis of conifer genomes / G. Paglia, M. Morgante // Mol. Breed. - 1998. -V.4 - P. 173-177.

168. Paran, J. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce / J. Paran, R.W. Michelmore // Theor. Appl. Genet. - 1993. - V.85. - P.985-993.

169. Parent, J.-G.D. Identification of raspberry cultivars by nonradioactive DNA fingerprinting / J.-G. Parent, D. Page // Hort. Sci. 1992. - V.27. - P. 1108-1110.

170. Parent, J.-G.D. Identification de cultivars de framboisier par l'analyse d'AND polymorphe amplifie au hazard (RAPD) / J.-G. Parent, M.G. Fortin, D. Page // Can. J. Plant Sci. 1993. - V.72. - P.l 115-1122.

171. Peijc, I. Comparative analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs, and AFLPs /1. Peijc, P. Ajmorne Marsan, M. Morgante et al. // Theor. Appl. Genet. - 1998. - V.97. - P.1248-1255.

172. Powell, W. The comparison of RFLP, RAPD and SSR (misrosatellite) markers for germplasm analysis / W. Powell, M. Morgante, Ch. Andre, M.

173. Hanfey, J. Vogel, S. Tingey, A. Rafalsky // Mol. Breed. 1996. - V.2. - P.225-238.

174. Qu, X. Genetic diversity in muscadine and American bunch grapes based on Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) analysis / X. Qu, J. Lu, O. Lamikanra // J. Am. Soc. Hortic. Sei. 1996. - V.121. - P.1020-1023.

175. Rafalski, J.A. Novel genetic mapping tools in plants: SNPs and LD-based approaches / J.A. Rafalski // Plant Sei. 2002. - V.162. - P.329-333.

176. Rallo, P. Development of simple sequence repeats (SSRs) in olive tree (Olea europaea L.) / P. Rallo, G. Dorado, L. Martin // Theor. Appl. Genet. 2000. -V.101. - №5/6. - P.984-989.

177. Reynders, S. Study of the genetic relationships within the subgenus Prunophora. Restriction maps of the ribosomal genes in P. cerasifera and P. spinosa / S. Reynders, G. Salesses // Acta Hort. 1990. - V.283. - P.17-25.

178. Rogowsky, P.M. The R173 Family of rye-specific repetitive DNA sequences: a structural analysis / P.M. Rogowsky, S. Manning, J.-Y. Liu, P. Langridge // Genome. 1991. - V.34. - P.88-95.

179. Rogowsky, P.M. Polymerase chain reaction based mapping of rye involving repeated DNA sequences / P.M. Rogowsky, K.M. Shepherd // Genome. 1992. - V.35. - №4. - P.621-626.

180. Saiki, R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with termostable DNA polymerase / R.K. Saiki, D.H. Gelfond, S. Stoffel, S.J.

181. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K. B. Mullis, H.A. Erlich // Sei. 1988. - V.239. -P.487-491.

182. Schierwater, B. Arbitrary amplified DNA in ecology and evolution / B. Schierwater, A. Ender, W. Schroth et al. // DNA markers: Protocols, applications and over-views / eds. G. Caetano Anolles, P.M. Gresshoff. -N.Y., 1997.-P.313-330.

183. Sharon, D. Application of DNA fingerprints for identification and genetic analysis of Carica papaya and other Carica species / D. Sharon, J. Hiller, A. Vainstein, U. Lavi // Euphytica. 1992. - V.62. - P. 119-126.

184. Shimada, T. Studies on phylogeny and phyletic evolution in Prunus species / T. Shimada / PhD Thesis. Kobe Univ. Hyogo, Japan, 1996. - P. 18-23.

185. Shimada, T. Genetic diversity of plums characterized by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis / T. Shimada, H. Hayama, T. Haji, M. Yamaguchi, M. Yoshida // Euphytica. 1999. - V.109. - P.143-147.

186. Shimada, T. Genetic diversity of cherries characterized by RAPD analysis / T. Shimada, T. Shiratory, H. Hayama, K. Nishimura, Yamaguchi, M. Yoshida // J. Japan. Soc. Hort. Sei. 1999. - V.68. - №5. p.984-986.

187. Singer, M.F. SINEs and LINEs: highly repeated short and long interspersed sequences in mammalian genomes / M.F. Singer // Cell. 1982. - V.28. - P.422-434.

188. Southern, E.M. Detection of specific DNA fragments separated by gel electrophoresis / E.M. Southern // J. Mol. Biol. 1975. - V.98. - P.503-517.

189. Stegemann, H. Potato proteins: genetic and physiological changers, evaluated by one and two - dimensional PAA - gel techniques / H. Stegemann, H. Francksen, V. Masco // Zeitschrift fur Naturforschung. - 1973. - V.23. - P.722-732.

190. Stiles, J.I. Using randomly amplified polymorphic DNA for evaluating genetic relationships among papaya cultivars / J.I. Stiles, C. Lemme, S. Sondur, M.B. Morshidi, R. Manshardt // Theor. Appl. Genet. 1993. - V.85. - P.697-701.

191. Stockinger, E.J. A linkage map of sweet cherry based on RAPD analysis of a microspore derived callus culture population / E.J. Stockinger, C.A. Mulinix, C.M. Long, T.S. Bretting, A.F. Iezzoni // J. Hered. - 1996. - V.87. - №3-4. -P.214-218.

192. Striem, M.J. Genomic DNA fingerprinting of Vitis vinifera by the use of multi-loci probes / M.J. Striem, P. Spiegel Roy, G. Ben - Hayyim, J. Beckmann, D. Gidoni // Vitis. - 1990. - Vitis. - V.29. - P.223-227.

193. Struss, D. Analysis of sweet cherry (Prunus avium L.) cultivars using SSR and AFLP markers / D. Struss, R. Ahmad, S.M. Southwich, M. Boritzki // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 2003. - V.128. - №6. - P.904-909.

194. Takeda, T. Classification of apricot varieties by RAPD analysis / T. Takeda, T. Shimada, K. Nomura, T. Ozaki, T. Haji, M. Yamaguchi, M. Yoshida // J. Japan. Soc. Hort. Sci. 1998. - V.67. - P.21-27.

195. Tautz, D. Hypervariability of simple sequence as a general source for polymorhic DNA markers / D. Tautz // Nucl. Acids Res. 1989. - V.17. -P.6463-6471.

196. Taylor, B. Isolation of plant DNA and RNA / B. Taylor, A. Powell // Focus. -1982. V.4. - P.4.

197. Tingley, S.V. Genetic analysis with random amplified polymorphic DNA markers / S.V. Tingley, J.P. del Tufo // Plant Physiol. 1993. - V.101. - P.349-352.

198. Tobe, V.O. Single well genotyping of diallelic sequence variations by a two-color ELISA-based oligonucleotide ligation assay / V.O. Tobe, S.R. Taylor, D.A. Nickerson // Nucl. Acids Res. - 1996. - V.24. - P.3728-3732.

199. Torres, A.M. Isozyme of "Duke" and its derivatives / A.M Torres, B.O. Bergh // California avocado society yearbook. 1978. - V.62. - P.l 11-117.

200. Torres Romero, A.M. Linkage among isozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba / A.M. Torres - Romero, N.F. Weeden, A. Martin // Theor. Appl. Genet. - 1993. - V.85. - P.937-945.

201. Yae, B. Classification of Malus domestica cultivars by random amplified polymorphic DNA markers / B. Yae, K. Ko // J. Korean Hort. Sci. 1995. -V.36. - P.824-828.

202. Vardi, A. Citrus cybrids: production by donor-recipient protoplast-fusion and verification by mitochondrial DNA restriction profiles / A. Vardi, A. Breiman, E. Galun // Theor. Appl. Genet. 1987. - V.75. - P.51-58.

203. Vassart, G. A sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA / G. Vassart, M. Georgies, R. Monsier, H. Brocas, A.S. Lequarre, D. Christophe // Sci. 1987. - V.235. - №4789. - P.683-684.

204. Vidal, J.R. Genetic relationships among grapevine varieties grown in different French and Spanish regions based on RAPD markers / J.R. Vidal, M. Coarer, A. Detontaine // Euphytica. 1999. - V. 109. - P. 161-172.

205. VinterHalter, D.V. The use of peroxidase polymorphism in the identification of apple scion cultivars / D.V. VinterHalter, D.J. James // SciHort. 1983. -V.18.-P.253-261.

206. Viruel, M.A. A linkage map with RFLP and isozyme markers for almond / M.A. Viruel, R. Messeguer, M.C. de Vicente, J. Garsia mas, P. Puigdomenech, F. Vagras, P. Arus // Theor. Appl. Genet. - 1995. - V.91. -P.964-971.

207. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprint / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Homes M, A. Freijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, M. Zabeau // Nucl. Acids Res. 1995. - V.23. - P.4407-4414.

208. Vos, P. AFLP analysis / P. Vos, M. Kuiper // DNA markers: Protocols, applications and over-views / eds. G. Caetano Anolles, P.M. Gresshoff. -N.Y., 1997.-P.l 15-131.

209. Wang, D. QTL analysis of flower and fruit traits in sour cherry / D. Wang, R. Karle, A.F. Iezzoni // Theor. Appl. Genet. 2000. - V.100. - P.535-544.

210. Watillon, B. Use of random cDNA probes to detect restriction fragment polymorphisms among apple clones / B. Watillon, P. Druart, P. DuJardin, R. Kettman, P. Boxus, A. Burny // Sci. Hort. -1991. V.46. - P.235-243.

211. Waungh, R. Homology of AFLP products in three mapping of barley / R. Waungh, N. Bonar, E. Baird et al. // Mol. Gen. Genet. 1997. - V.255. - №3. -P.311-321.

212. Waungh, R. The potential use of restriction fragment length polymorphism in Rubus breeding / R. Waungh, M. Van DeVan, S. Millam, R. Brennan, W. Powel // Acta Hort. 1990. - V.280. - P.541-545.

213. Weber, J.L. Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction / J.L. Weber, P.E. May // Am. J. Hum. Genet. 1989. - V.44. - P.388-396.

214. Weber, J. Mutation of human short tandem repeats / J. Weber, C. Wong // Human Mol. Genet. 1993. - V.2. - P.l 123-1128.

215. Weeden, N.F. Application of isozymes in plant breeding / N.F. Weeden // Plant Breed. Rev. 1989. - V.6. - P.l 1-54.

216. Welsh, J. M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland//Nucl. Acids Res. -1991. V.18. - P.7213-7218.

217. Werner, D.J. Catalase polymorphism and inheritance in peach / D.J. Werner // Hort.Sci. 1992. - V.27. - P.41-43.

218. Wilde, J. Genetic fingerprinting of Teobroma clones using randomly amplified polymorphic DNA markers / J. Wilde, R. Waugh, W. Powell // Theor. Appl. Genet. 1992. - V.83. - P.871-877.

219. Williams, J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski, S.V. Tingey//Nucl. Acids Res. 1990. - V.18. - P.6531-6535.

220. Wright, J.M. Microsatellites: Genetic markers for the future / J.M. Wright, P. Bentzen // Rev. Fish Biol. Fish. 1994. - V.4. - P.384-388.

221. Wunsch, A. Molecular characterization of sweet cherry (Prunus avium L.) genotypes using peach (Prunus persica L. Batsch) SSR sequences / A. Wunsch, J.J. Hormaza // Heredity. 2002. - №1. - V.89. -. P.56-63.

222. Zabeau, M. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA Fingerprinting / M. Zabeau, P. Vos / European Patent Application number: 92402629.7, Publication number: EP 0 534 858 Al. 1993. - 32p.

223. Zacharius, R.M. Concerning the constancy of the protein electrophoresis pattern of a potato tuber variety / R.M. Zacharius // Amer. Potato J. -1971. V. 48. -P.78-83.

224. Zhivotovsky, LA MIcrosatellite variability and genetic distance / LA Zhivotovsky, MW. Feldman//Proc. Natl Acad Sci. -1995. V.92. -P.l 1549-11552.

225. Zietkiewisz, E Genome fingerprinting by sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification / E Zietkiewisz, A Rafalski, D. Labuda // Genomics. - 1994. - V20. -P.176-183.

226. Zhou, L. Genetic analysis and discrimination of sweet cheny cultivars and selections using amplified fragment length polymorphism fingerprints / L. Zhou, F. KappeL, C. Hampson, PA Wiersma, G. Bakkeren//J. Amer. Soc. Hat Sci. -2002. V.127. - P.786-792.

Информация о работе

Романова, Ольга Витальевна
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва, 2007
ВАК 06.01.07

Диссертация

Идентификация сортов косточковых культур с помощью ПЦР - анализа - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы