Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и выделение поверхностных антигенов лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированных Theileria annulata (Dshunkowsky et Luhs, 1904)

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и выделение поверхностных антигенов лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированных Theileria annulata (Dshunkowsky et Luhs, 1904)"

российская академия сельскохозяйственных наук

ВСЕРОССИЙСКИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО

Р Г 5 ОД

На правах рукописи

ШУЛЕПОВА Нина Николаевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ВЫДЕЛЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ИНВАЗИРОВАННЫХ THEILERIA ANNULATA (Dshunkowsky et Lühs, 1904)

03.00.19 — паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко.

Лауреат Государственной премии СССР,

доктор биологических наук, профессор В. Т. Заблоцкий

кандидат биологических наук Г. А. Надточей

доктор биологических наук, профессор О. Ф. Гробов кандидат биологических наук В. Г. Меньшиков

Ведущая организация: Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Защита диссертации состоится « ^^ы? 1994 г в часов на заседании Диссертационшж) Совета Д 020.28.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я- Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан

1994 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

Г. А. Трондина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тейлериоз - это широко распространенное во многих стрнах мира протозойное заболевание крупного рогатого скота, наносящее огромный материальный ущерб, который связан, в первую очередь, со значительной смертностью животных, достигающей 90%, особенно среди высокопродуктивных животных. Хотя на территории России оно регистрируется в осноеном'в южных областях ( Астраханской, Волгоградской, Ростовской), в Калмыкии, Дагестане, Ингушетии, Краснодарском и Ставропольском краях, а также на Дальнем Востоке, это не умаляет его отрицательного влияния на развитие скотоводства в нашей стране, так как заболевание имеет тенденцию к медленному , но неуклонному распространению.

Основное средство борьбы с тейлериозом - иммунизация живой культуральной противотейлериозной вакциной. Только" в государствах Среднеазиатского региона, по данным В.Т.Заблоцкого /1988/, живой культуральной вакциной против тейлериоза, разработанной и внедренной в производство лабораторией протозоологии ВИЭВ, в настоящее время иммунизировано около 3,5 млн. голов крупного рогатого скота. При этом эффективность вакцины составляет не менее 94,58 / Р.Х.НЬраев,1991/.

Однако использование этой вакцины полностью не решает проблемы из - за ряда ограничений. Живая вакцина способствует циркуляции прививочного штамма возбудителя во внешней среде, - что ограничивает ее применение лишь стационарно неблагополучной по тейлериозу зоной; в энзоотических же очагах введение "живой вакцины не разрешено. Применение этой вакцины нередко

сопровождается поствакцинальными осложнениями, обусловленными нарушениями "Наставления по применению противотейлериозной вакцины" ( иммунизация ослабленных животных, больных,животных ниже средней упитанности ). Хранение и транспортировка вакцины возможны только при температуре - 196° С

Принимая во внимание перечисленные недостатки живой вакцины, напрашивается вывод о необходимости замены этого метода иммунизации на не менее эффективный и более безопасный.

Принципиальным решением этой проблемы является конструирование химических, и в том числе субъединичных вакцин. В зарубежной литературе последних лет неоднократно высказывалось мнение о возможности создания субъединичной вакцины против тейлериоза, вызываемого гл. parva, из поверхностных антигенов спорозоитов, шизонтов и инвазированных культуральных лимфоидных клеток / Eatery D.L. et al.,1986; Hall P.R.,1988; Jungmann R. et al.,1989; Glaeoodine J. et al.,1990 /. При этом особсо внимание уделялось поверхностным антигенам трансформированных тейлериями клеток культуры / Baldwin C.L. et al.,1987; Chandhri S.S. et al.,1991 /.

Исходя из вышесказанного, представляют интерес исследования поверхностных антигенов культуральных лимфоидных клеток, инвазированных Th. annulata, с целью конструирования на их основе , субъединичной вакцины.

Цель работы. Основная цель настоящей работы - идентификация и разработка метода выделения поверхностных антигенов лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированных Th. annulata, и изучение ультраструктуры этого возбудителя в культуре лим5оидных клеток, пунктатах из лимфатических узлов и в эритроцитах

периферической крови больных тейлеризом животных.

Задачи исследования.

1. Идентифицировать тейлериоспецифические антигены на мембрвне лимфоидных 'клеток крупного рогатого скота, инвазированных Th. annulata, методами:

а/ иммуноэлектронной микроскоши с использованием поликлональных антител и биоспецифического маркера;

б/ иммунопероксидазного теста ' с использованием поликлональных антител и биоспецифического маркера.

2. Разработать метод выделения плазматических мембран трансформированных Th- annulata лимфоидных клеток крупного рогатого скота.

3. Выявить способность комплексного поверхностного антигена выделенных плазматических мембран лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированных Th. annulata. индуцировать тейлериоспецифические антитела in vivo.

4. Изучить ультраструктуральные особенности возбудителя Th. annulata в культуре лимфоидных клеток, в пунктатах из лимфатических узлов и в эритроцитах периферической крови больного тейлеряозом животного.

Научная новизна работы. Впервые идентифицированы тейлериоспецифические поверхностные ■ антигены плазматической мембраны лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированных Th. annulata, при культивиовании In vitro.

Разработан метод выделения поверхностного антигена культуральных лимфоидных клеток крупного рогатого скота, трансформированных Th. annulata.

Установлена способность получ!шых антигенов индуцировать in

vivo антитела, специфичные к Th. annulata.

Уточке шш дашше об ультраструктуре Th. annulata в культуре лимфоидных клеток крупного рогатого скота, в пунктатах из лимфатических узлов и в эритроцитах периферической кроЕИ Сольного тейлориозом животаого.

Практическая ценность. Разработан технологически приемлемый метод выделения комплексного поверхностного антигена культуральных клеток, трансформированных возбудителем тейлериоза.

Установлена способность выделенного антигена _ к индукции тейлериоспецифических антител, что служит основой дальнейших исследований, направленных на изучение его физико-химических и протективных свойств с целью конструирования противотейлериозной субъединичной вакцины.

Апробация работы. Материалы доложены и получили положительную оценку на:

- шждупгродной научной конференции "Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии" / Витеоск, 1003 г. /;

республиканской научно-практической конференции по животноводству и ветеринарной медицине / Витебск, 19Э4 г. /;

меклабораториом совещании сотрудников / 1994 г. /;

- Учаном Совете Всероссийского научно - исследовательского института экспериментальной ветеринарии / 1994 г. /.

На защиту быносятся следующие положения диссертации:

1. Методы идентификации поверхностных антигенов лимфоидных клеток крупного рогатого скота, трансформированных Th. annulata.

2. Метод получения нефракционированного поверхностного антигена культуральннх лимфоидных клеток, трансформированных йг. annulata.

3. Результаты исследования способности кафракцяонированного поверхностного антигена культуральных лимфошшых клеток, трансформированных №. аппи^а, к индукции тейлериоспецифических антител.

4. Результаты исследования ультраструктуры №. аппи1ага.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации

опубликована 4 статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах мэшнописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 20 рисунками. Список литературы включает 219 источников, из них 65 отечественных и 154 зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы.

Работа .выполнена в период с 1990 г. по 1993 г- в лабораториях протозоологии, физико-химических методов и биотехнологии, иммунологии и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко.

Культура клеток. Трансформированная шизоятами тъ. аппЫага линия лимфоидных клеток была получена в лаборатории протозоологии ВИЭВ. Лимфоидаые клетки крупного рогатого скота, инвазированные пшзонтами таг. аппи^а, культивировали по стандартной методике

__■ П

при температуре 37иС на среде Игла с добавлением глигамина, 20% сыворотки крови крупного рогатого скота, бензилпвнициллипа

натриевой соли и стрептомицина сульфата по 100 ЕД/мл среды. Клеточную линию поддерживали субкультивированием каждые 4-5 дней в стеклянных 1,5-литровых матрах с частичной заменой питательной среда. Полную замену среда осуществляли через каждые 20-25 дней. Перед проведением каждого исследования клетки культуры проверяли на жизнеспособность путем окрашивания 0,556 раствором трипанового синего и подсчетом в камере Горяева.

Экспериментальные животные. При экспериментальном заражении стабилятом клещей Hyalomma anatolioum и Hyalomma detritum, инвазированных №. annulata, с целью получения гипериммунной сыворотки, пунктатов лимфатических узлов и эритроцитов периферической 1фови использовали двух телят 6 месячного возраста черно-пестрой порода. Исследование способности полученного поверхностного антигена индуцировать специфичные Th. annulata антитела 2 организме неспецифических хозяев провели на 6 кроликах породы серый великан в возрасте 1-1,5 года, весом 4-4,5 ;;г.

Стабилят клещей Hyalomma anatolioum И Hyalomma detritum, инвазированных Th. annulata. Популяцию клещей рода Hyalomma, используемую для производства стабилята, поддерживали культивированием в лаборатории протозоологии ВИЭВ. Инвазированных клещей в асептических условиях гомогенизировали, разводили средой Игла так, чтобы на каждого клеща приходилось по 0,5 мл среды, затем добавляли равный объем защитной среды следующего состава: 20% ДМСО, 40% сыворотки крови крупного рогатого скота и 40% среда Игла. Хранение осуществляли в запаяных ампулах в криогенных условиях ( - 196°С ). Перед использованием стабилят исследовали на стерильность и безвредность.

Сыворотки крови.I. Сыворотка крови крупного рогатого , скота.

экспериментально зараженного стабилятом клещей н. апа^Ноит, инвазированных ТЬ. аппи!а1а / таджикский штамм /.

2. Сыворотка крови крупного рогатого скота, .спонтанно зараженного ТЬ. аппиЗ^а / казахский птамм/.

3. Контрольная сыворотка крови серонегативных телят, полученных из благополучной по тейлериозу местности.

4. Гипериммунная сыворотка к комплексному мембранному антигену трансформированных Иг. аппи1а£а лимфоидных клеток крупного рогатого скота.

Иммуноглобулины класса а крупного рогатого скота. Исходным материалом для их получения служила сыворотка • крови экспериментально зараженного №. аппиО^а крупного рогатого скота. Тейлериоз был воспроизведен путем введения телятам стабилята инвазированных ТЪ. аппиЛ^а клещей Н. апагоНоит и Н. 4е1;гИ;ш>.

Сыворотку крови -получали по общепринятой методике. Уровень антител в сыворотках крови определяли в реакции длительного связывания комплемента с тейлерийным антигеном по стандартной методике.

1йО выделяли методом 'ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ - целлюлозы, предварительно обработав сыворотку по методу Н.В.Кленовой ( 1971 ).

Активность выделенных о проверяли в реакции длительного связывая комплемента о тейлерийным антигеном, количество белка устанавливали методом Лоури.

Лймфэидные клетки здорового крупного рогатого скота выделяли из селезенки по стандартной методике способом трипсинизацки, ресуспендировали в растворе Дульбекно ( рН 7,3 ) и хранили в

п

криогенных условиях < - 196° С ).

Биоспецифический маркер на основе коллоидного золота. Для проведения иммуноэлектронной микроскопии использовали стафилококковый реагент, содержащий Селок А,моченный коллоидным золотом со средним размером частиц 5 нм ( лаборатория физической химии клеточных структур института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН России, г. Саратов ), -Рабочая концентрация комплекса протеин А + коллоидное золото в растворе соответствовала 0,1ед. оптической плотности при длине еолны Б20 нм.

Иммунопероксидазный коньюгат. В исследованиях использовали антивидовой иммунопероксидазный коньюгат против иммуноглобулинов крупного рогатого скота ( производство МПО "Инициатива"', г. Щелково ).

идентификацию тейлериоспецифических поверхностных антигенов культуральных клеток, ШБазирсЕЕННкх Th. annulata, проводили по Dirk А.Е. et al. ( 1985 ) методом иммуноэлектронной микроскопии с применением стафилококкового реагента, содержащего белок А, и методом Cowan K.M. et ai.( 1984 ) с использованием пероксидазного коньюгата.

Специфичность проводимых реакций подтверждалась следующими отрицательными . контролями: I) лимфоциты здорового крупного рогатого скота, обработанные положительной сывороткой; 2) культуральные лимфоидные клетки, обработанные серонегативной сывороткой крови.' Обработка контролей проводилась аналогично и парадельно с исследуемым материалом.

способность комплексного поверхностного антигена выделенных плазматических мембран лимфоидгшх клеток крупного рогатого скота.

инвазированных Th.annulata,индуцировать специфические к данному возбудителю антитела выявили путем получения гнпериммунншс сывороток.

Изучение морфологии Th. annulata в культуре лимфоидных клеток методом световой микроскопии проводили под микроскопом АУ 26 при увеличении» в 900 раз, предварительно окрасив фиксированные мазки методом Романовского - Гимза.

Для изучения ультраструктуральной организации Th. annulata префиксацию материала осуществляли

параформальдегид-глутаральдегидным фиксатором, приготовленным по методу Komoveky M.I. ( 1965 ).Постфиксацию проводили раствором тетраоксидв осмия на s-коллидиновом буфере ( pH 7,2 ) по Bennet H.s. et Luft J.H.( 1961 ).Обезвоживали в растворах этанола возрастающей концентрации по Woirarth-Bottermann ( 1957). Пропитывали смесью эпоксидных смол и ацетона по методу Luit J.H. (1961 ).Исследуемый материал вносили в капсулы, заключали в смесь смол, приготовленную методом Mollenhauer H.H. t 1964 ) и полимеризовали. Ультратонкие срезы толщиной 200 - Б00 А, приготовленные на ультратоме LKB-III ( Швеция >, помещали на медные сеточки - подлоккй, предварительно покрытые свежеионизированной формваровой пленкой nö методу Peaee D.s. ( 1964 ), и контрастировали по методу Palado O.E. ( 1962 ) . Приготовленный материал изучали под электронном микроскопом ЛМ-100 в при ускоряющем напряжении 80 кВ .

2.2. Результаты исследований

Результаты идентификации поверхностных антигенов трансформированных Th. annulata лимфоидных клеток крупного рогатого скота методом иммуноэлектронной М1Пфоскопии.

Выбор Сиоспецифического маркера объясняется тем, что комплекс протеин А + коллоидное золото обладает высокой специфичностью связывания с IgG / Frens С., 1986; Park К. et al., 1987 / и обеспечивает высококонтрастное выявление этого комплекса.

Оптимальную концентрацию поликлональных антител для идентификации поверхностных антигенов определяли методом подбора.

Ig с крупного рогатого скота с содержанием белка 1,24 мг/мл и титром специфических антител 1:20 брали по отношению к суспензии инввзированных клеток в'следующих пропорциях 1:1, 1:2, 1:3, 1:4. Концентрация клеток в каждой пробе соответствовала 2 - а х IG6.

Анализ исследований ультратонких срезов показал, что максимальная интенсивность мечения наблюдается на препаратах, обработанных поликлональными антителами, используемыми в соотношении 1:2, после 30-минутной инкубации при комнатной температуре и двукратного отмывания.

Клеточный материал ресуспендировали в 0,2 мл протеина А, меченного коллоидным золотом 30 минут при температуре 37°С. Увеличение объема маркера более указанного количества не приводило к усилению интенсивности мечения на препаратах.

При исследовании ультратонких срезов под электронным микроскопом на мембране трансформированных лимфоцитов отчетливо округлые гранулы темного цвета. Гранулы в основном располагаются на поверхности лимфоидных клеток равномерно.

1U

эффекты "шапочки" и "пятен" отсутствуют. однако нередко прослеживаются агрегаты из 2 - 4 частиц золота. Наиболее часто отмечена агрегация таких комплексов в инвагинационных углублениях клеточной мембраны.

Метку можно определить на мембранах как трансформированных лимфоцитов, так и на мембранах мерозоитов внеклеточных шизонтов. Обращает на себя внимание тот факт, что интенсивность мечения мембран мерозоитов в 45 - 60 раз превышает интенсивность мечения мембран трансформированных лимфоидных клеток. Гранулы по поверхности плазматичекой мембраны мерозоитов располагаются строго равномерно, агрегация частиц золота отсутствует.

Частицы золота практически отсутствуют над всеми другими структурами ( погибшие лимфоидные клетки, разрушенные внутриклеточные органоиды ).

Отсутствие агрегации частиц золота на поверхности плазматических мембран лимфоцитов от здоровых животныхл инвазированных ТЬ. аппи^а лимфоидных клеток, обработанных негативной сывороткой в контролях, а также инвазированных ть. аппи^а лимфоидных клеток, ресуспендироввнных лишь с биоспеци1ическим маркером^позволяет констатировать специфичность проведенной реакции.

Более высокая интенсивность агрегации, частиц золота на сформировавшихся мерозоитах объясняется том, что плазматическая мембрана мерозоитов, вероятно, несет на себе больше тейлерийных антигенов на единицу поверхности, чем инвазированные лимфоидные клетки.

На основе полученных результатов можно предположить, что на поверхности трансформированных Th.amul.ata лимфоидных клеток

крупного рогатого скота формируются тейлериоспецифические антигены, причем того же происхождения, что и на мембране мерозоитов тейлерий.

Идентификация поверхностных антигенов лиыфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазиросанных тп. аппиЛаЪа иммунопероксидазтшм методом.

Материалом для исследований служила 5 - 7-дневная субкультура лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированная ть. аппи1а1а. Ресуспендирование клеток осуществляли в ПЕРЕС-буферном

с

растворе ( рН 7,4 ). Концентрацию клеток доводили до 4 - 5 х 10° кл/мл.

Исследования проводили в пробирках для микропроб объемом 0,5 мл. отечественного производства ( Ленинградский завод "Медполимер" ).В пробирку вносили по 0,2 мл. суспензии клеток и сыворотки крови. Инкубацию реагентов на всех стадиях анализа осуществляли в течение 30 минут в термостате при температуре + 37° С в условиях влажной камеры.На отмытые нерез-буфером с 0,1% раствором БСА путем цантркфугаровашш клетки наносили 0,2 мл. иммунопероксидазного антивидового ( против о крупного рогатого скота ) коньюгата в разведении 1:500. Суспензию клеток инкубировали, отмывали и вносили по 0,2 мл. субстратной смеси (0,4 мг/мл ортофенилендиамина, 0.06Ж перекиси водорода в цитратно-фосфатном буфере рН ' 5,0 ).При соблюдении прежних условий суспензию вновь инкубировали и отмывали. Реакцию останавливали внесением в пробирки 2-3 капель 50$ глицерина" с 0,1Ж раствором глутаральдегида в фосфатно - буферном растворе.

Используемые сыворотки крови предварительно исследовали в реакции длительного связывания комплемента на наличие

специфических антител с тейлерийным антигеном. Титр специфических антител позитивных сывороток составлял обычно 1:20 - 1:40.

Преследуя цель выявить оптимальное разведение положительных сывороток для выявленных антигенов их вносили в следующих разведениях: 1:5; 1:10; 1:50; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800.

Поскольку целью нашего исследования была лишь идентификация специфического поверхностного антигена на мембране трансформированных лимфоцитов, то уют результатов проводился визуально, по интенсивности окраски продукта пероксидазной реакции.

Положительная реакция характеризовалась ярко выраженным золотисто-коричневым окрашиванием. Отрицательная - легко дифференцируемым слабо - желтым фоновым окрашиванием.

Условно оценивая фоновую реакцию одним "крестом",

положительная реакция в разведениях сывороток 1:5 давала четыре "креста", 1:10, Г:50, реже 1:100 - три "креста" и большие разведения 1:200 и 1:400 - два "креста".

Все дальнейшие работы проводили с использованием положительных сывороток, в разведении 1:5. Параллельно исследовали по три пробы сывороток. Разброс в полученных результатах не превышал одного "креста".

Специфичность реакции 'была подтверждена . контролями. Результаты многочисленных исследований с различными позитивными сыворотками крови стабильно характеризовались слабо - желтым фоновым окрашиванием продукта пероксидазной реакции контролей.

Таким образом, иммунопероксидазная реакция, как и иммуноэлектронная микроскопия, однозначно констатировала наличие

тейлериоспецифических антигенов на мембране трансформированных возбудителем тейлериоза культуральннх клеток.

Разработка метода приготовления комплексного мембранного-

антигена.

Для получения мембран лимфоцитов крупного рогатого скота, трансформированных Th. annulata, использовали 5-7 - дневную субкультуру.

В качестве промывочного раствора применяли фосфатно-буфершй раствор Дульбекко ( р1Г 7,3 ).

В качестве гомогенизирующего раствора использовали 46Р ( pH 7,3 ) с добавлением 30 мМ NaCZ, 1 mM MgCl£, 5 шМ СЫСФ, 0,02% раствора азида натрия и 2 мг./мл. ДНКазы ( "Serva", USA ).

Результаты ряда исследований, указывающие на высокую прочность плазматической мембраны лимфоцитов ( Сгветегв Р. 1931; Allsopp В.А.,1982; Taraos B..19S3 ), шслуяили основанием дли разработки двухэталного способа дезинтеграции клеточной оболочки.

Первый этап разрушения клеточной оболочки осуществили путем гомогенизации в гомогенизаторе Портера. Для предотвращения чрезмерной дестабилизации этих мембран и получения в конечном счете крупных фрагментов разрушение проводили 3-4 осторожными вращениями стеклянного пестика. Разрушение клеток не превышало 21%. .

Дальнейшую . дестабилизацию проводили воздействием ультразвукового дезинтегратора. Исследовали три режима ультразвуковой обработки. Оптимальная кратность и продолжительность обработок была определена контролем степени дестабилизации клеточных оболочек путем исследования окрашенного ■

методом Романовского - Гимза мазка под световым микроскопом и способностью выделенных после ультрацентрифугирования мембран индуцировать In vivo тейлериоспецифические антитела. Последующее получение антигена осуществляли обработкой взвеси клеток короткими импульсами ( по 10 сек. каждый ) при частоте 22 кГц (аппарат УЗДН - 2Т ). Проводили по 5 обработок с 50 сек. интервалами между импульсами. Степень разрушения составляла от 9Ъ% ДО 9755.

Мембраны разрушенных клеток выделяли методом Emery ' D..L. et al, ( 1988 ) центрифугированием в одноступенчатом градиенте плотности сахарозы на ультрацентрифуге / "Beotanan" L7-55. USA /. В качестве градиента использовали 41% раствор сахарозы. Центрифугирование проводили в течение 2,5 часов при 95 тыс. g. Применяемый режим центрифугирования был контролирован

степенью чистоты мазков выделенной фракции и полученного осадка,окрашенных методом Романовского-Гимза под световым микроскопом.

Фракцию мембран, собранную в интерфазе между буферным раствором и раствором сахарозы, дважды отмывали раствором Дульбекко, центрифугируя при тех же условиях в течение 30 минут. Осадок ресуспендировала в ФБР ( рН ?,3 ),содержащем 1мМ lígci2, и хранили в замороженном состоянии пра температуре -70°с,предварительно исследовав его на степень чистота..

Исследование способности комплексного

поверхностного антигена мембран трансформированных Th. annuiata лимфоидных клеток крупного рогатого скота индуцировать тейлериоспецифические антитела in vivo .

П

Иммунизацию кроликов проводили методом М.А. Мисшшовой / 1976 /. За весь цикл иммунизации каждому животному введено по 2,5 мг. белка. Полученные сыворотки крови кроликов исследовались спустя 15 дней после последнего введения комплексного антигена и затем двукратно, с интервалом 7 дней, в реакции длительного связывания комплемента. Сыворотки имели титр специфических антител от 1:10 до 1:40. Исследование проводили с использованием тейлерийного антигена.

В качестве контроля использовался материал из плазматических мембран лимфоцитов, полученных из селезенки здорового крупного рогатого скота. Во всех случаях в контролях реакция была отрицательной.

Таким образом, ' проведенные исследовшшя позволили установить, что разработанный нами технологический прием получения комплексного антигена но приводит к деструктивным изменениям его детерминант, в результате чего антиген способен' индуцировать в организма кролика специфические антитела.

Изучение морфологии различных стадий развития Th.

annulate в культура лимфоидных клоток методом световой

микроскопии. .

Несмотря на однородность ■ клеточной популяции в перевиваемой культура размеры и форма клеток значительно варьируют. Доминируют многоядерные клетки ( количество ядер от 2 до 4 и реке более ) округлой формы. Ядра культуральных клеток, окрашенные на мазках в темно-фиолетовый цвет, в основном, занимают центральное положение. Превалируйте Форш ядер - полу лунная, серповидная, округлая. Нуклесплазма имеет вид гранул'различной величины.

Цитоплазма большенства клеток Оазофильна, но встречаются

клетки с менее интенсивной окраской.

Количество шизонтов в клетках различно, чаще от одного до пяти. В цитоплазме шизонтов отчетливо просматривается ядра темно - фиолетового цвета, форма их разнообразна. Количество ядер может достигать 20 и более. Достаточно часто обнаруживаются внеклеточные шизонты. Формы их, как и внутриклеточных, разнообразны, однако чаще встречается округлая. Границы таких шизонтов четкие, цитоплазма окрашена в синевато - голубоватый цвет, количество ядер различно- от 5 до 10 и более.

При просмотре мазков наблюдали единичные неинвазированные клетки. В основном они имели четкие Гранины с ровной поверхность» плазматической мембраны и ядро , чаще расположенное в центре, по периферии которого просматривается узкий ободок цитоплазмы.

Ультраструктуральная организация ТЬ. аппи1а1а в культуре лимфоидных клеток, пунктатах из лимфатических узлов и в эритроцитах периферической крови больного тейлериозом животного.

Как правило, трансформированные ТЬ. . апг.и1а1а культуралыше лимфоидные клетки имели округлую форту. Цитоплазматическая оболочка часто характеризовалась наличием большого количества отростков различной формы и длины и глубоких инвагинаций.

Доминировали многоядерные клетки. Расположение ядер не отличалось строго определенным положением внутри клетки. Процесс трансформации сопровождался уменьшением плотности хроматина в ядрах, его маргинацией, а увеличением числа ядрышек < до 5 а более ), которые иногда становилась диффузными. Внутри ядра наблвдали формирование■тяжей концентрированного хроматина.

" Цитошгазиа культуральшх клеток по плотности не однородна.

Отмечается увеличешше количества митохондрий / пятьдесят и более в одной клетке/ и рибосом. Аппарат Гольдам четко выражен и представлен системой плоских цистерн и мелких пузырьков.

По периферии вокруг шзонтов часто выявлялись образования, состоящие в плоскости среза из кольцевидных пластинок разного размера. Величина этих пластинок варьировала от 20 до 100 нм.

В исследованных клетках достаточно четко просматривались от одного до трёх и' более обособленных собственной одиночной мембраной шизонтов. Расположение и форма шизонтов в лимфоидной клетке и за ее пределами отличались широким разнообразием. Величина шизонтов обычно находилась в- пределах 11000-13000 х 6000-10000 нм.

В ряде шизонтов можно различить мерозоиты на различных стадиях формирования. Размер мерозоитов достигал 650-1500 х 500-1000 нм. Превалировала овальная форма. Ядро довольно крупное ( 600-950 х 300-350 нм ) и занимает до 1/3 - 1/2 клетки паразита! Форма ядра овальная, оболочка его не всегда выявляется, внутриядерная структура мелкозернистая, неравномерно окрашенная. В цитоплазма мэрозоита определяются светлые округлые образования, напоминающие вакуоли и митохондрии, а рядом с ядром на одном из полюсов два темно окрашенных овальных образования - роптрии. Трехслойность Плазматической мембраны достаточно четко просматривалась в плоскости разреза.

Исследование ультраструк-уры свободных шизонтов не позволяет констатировать какие-либо различия их с внутрилимфоцитарными формами.

На ультратонких срезах пунктата из лимфатического узла при просмотре под электронным микроскопом были выявлены внеклеточные

и внутршшМфоцитарные шзонты.

Инвазированныэ лимфоциты имеют, как правило, округлую форму. Цитоплазматическая мембрана ровная и гладкая, за редким исключением, когда отмечаются ее Еыросты и впячивания.

Пораженные клетки имели одно или два ядра, форма которых в плоскости среза значительно варьировала, характерна марпшация хроматина и просветление ядерного матрикса в центре ядра.

Цитоплазма клеток по плотности не однородна, отмечены случаи ее вакуолизации.В цитоплазме определяется огромное количество рибосом, митохондрий с хорошо просматриваемыми кристами. Комплекс Гольджи четко выражен и представлен системой расширенных плоских цистерн и пузырьков. Нередко по периферии шизонтов выявляли структуры, напоминающие прерывистую мембрану, состоящую из продолговатых каналов.

В плоскости среза одной клетки определяли от одного до трех шизонтов, нередко на различных стадиях своего развития. Расположение и форма шизонтов в инвазированной клетке разнообразны.

Основу макрошизонтов ( 10000-13000 х 6000-9000 нм. ) составляет мелкозернистая цитоплазма.В некоторых участках ее обнаруживаются округлой формы уплотнения. Ясно просматриваются отдельные мембранные структуры, мелкие пузырьки и множество рибосом.

У иикрошизоитов ( 5000-7000 х 3000-5000 нм. )превзлирует округлая или овальная форма. Плазматическая мембрана имеет четко выраженную трехслойную структуру. Количество ядер и форма их широко варьируют.Ядра в шизонте располагаются неравномерно, имеются свободные более светлые участки. Кроме ядер внутри

пизонта видно большое количество вакуолей различной фарт II ЕСЛИЧИЩ.

Мэрозоиты представляют собой округлые образования ( 700-1300 х 650-1000 нм. ) с четко выраженной трехслойной мембраной. Ядро мерозоитов в плоскости среза чаще округлой формы и занимает до 1/3 - 1/2 клетки паразита. На переднем более тонком конце тела обнаруживаются парные округлые образования темного цвета роптрии. В цитоплазме содержится большое количество рибосом и вакуолей.

Ультраструктура • свободных шизонтов аналогична их внутритфоцитарным формам.

Ыерозоиты на ультратонких срезах эритроцитов периферической крови больных тейлериозом животных имеют разнообразную форму, превалирует продолговато-овальная. Четко выражена одиночная наружная мембрана. Цитоплазма по плотности не однородна. В ней определяются многочисленные рибосомы, пищеварительные вакуоли,' канальцы эндоплазматической сети. На переднем • конце обнаруживаются парные роптрии, микронемы и ультрацистотом. Ядра в плоскости среза чаще имеют овальную форму, занимают до 1/3 - 1/2 клетки паразита. Внутриядерная структура мелкозернистая, неравномерно, окрашенная, ядрышки просматриваются не достаточно четко.

Полученные данные исследований, проведенных на световом и электронном уровнях, достаточно убедительно констатируют отсутствие морфологических различий в структуре внутриклеточных и внеклеточных шизонтов, отсутствие вырешенной паразитофорной вакуоли при внутриклеточном, паразитировании и указывают, что процесс развития паразита • сопровождается рядом морфологических

изменения клетки-хозяина, свидетельствующих об активности обмена веществ трансформированной клетки ( увеличение количества митохондрий и рибосом, расширение канальцев эндоплазматической сети и цистерн аппарата Гольдки ); морфологическое различие мерозоитов т. аппиЗ^а в пунктатах лимфатических узлов и в эритроцитах периферической крови указывает на способность возбудителя претерпевать ряд существенных изменений после выхода в кровенное русло, приспосабливаясь тем самым к новому характеру питания. Обращает на себя внимание тот факт, что в процессе культивирования происходит дифференциация макрошиэонтов в мерозоиты. Подобное явление описано ИазссхИпе .г.е1; а1.( 1990 ) и БЫе1з в. ег ах. С 1991 ) при культивировании трансформированных" тн. аппи1ага лимфоидных клеток крупного рогатого скота при температуре 41°С. В условиях нашего эксперимента это необычное явление представляется возможным объяснить лишь причиной длительного культивирования.

ВЫВОДЫ

1. Иммуноэлектронным микроскопированием установлено, что лимфоидные клетки крупного рогатого скота, инвазированные ть. аппиз^а, экспрессируют на поверхности своей плазматической мембраны тейлериоспецифические антигены.

2. Дополнительным методом идентификации специфических поверхностных антигенов лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированных тЬ. алпи1а!а, является иммунолероксидазкыЯ метод .

, 3. Разработан метод выделения поверхностного антигена

инвазированных Th. amulata лимфоидных клеток, который позволяет получать тейлерийный антиген без разрушения его антигенных детерминант.

4. Поверхностный антиген лимфоидных клеток крупного рогатого скота, трансформированных Th. annulata, способен индуцировать тейлериоспецифические антитела in vivo.

5. Развитие макрошизонтов Th. annulata в культуре лимфоидных клеток крупного* рогатого скота в отличии от цикла развития этого паразита в организме специфического хозяина завершается образованием "мерозоитов, минуя стадию микрошизонтов.

6. Паразитирование шзонтов Th. annulata в лимфоидной клетке крупного рогатого скота сопровождается рядом морфологических изменений клетки - хозяина, свидетельствующих об активности в ней обменных процессов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

I. Метод выделения комплексного поверхностного антигена культуральных клеток, трансформированных возбудителем тейлериоза, предлагается использовать при проведении дальнейших исследований, направленных на изучение его физико-химических и протективных свойств с целью конструирования противотейлериозной субъединичной вакцины.

2. Результаты исследований по ультраструктуре Th. annulata в культуральных лимфоидных клетках крупного рогатого скота рекомендовано использовать в научно-исследовательской работе, а также для руководств при подготовке специалистов, работающих в области биологии и ветеринарии. -,

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

I Шулепова H.H. Иммуноцитологический метод идентификации поверхностных антигенов у инвазированных Th. annuiata лимфоидных клеток. // Тезисы докладов международной научной конференции "Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии". Витебск, 1993, с.126.

2. Надточей Г.А., Шулепова H.H. Идентификация поверхностных антигенов лимфоидных клеток крупного рогатого скота, трансформированных Th. . annuiata, методом иммуноэле'ктронной микроскопии. // Тезисы докладов республиканской научно-практической конференции по животноводству и ветеринарной медицине. Витебск, 1994, с.73-74.

3. Шулепова H.H., Заблоцкий В.Т., Надточей Г.А. Идентификация специфических поверхностных антигенов на инвазированных Th. annuiata лимфоидных клетках. // Тезисы докладов научной конференции "Проблемы изыскания, синтеза и производства новых препаратов для ветеринарии". Самарканд, 1994, с.123-124.

4. Shulepova N.N., Zablotsky V.T., Nadtoohey G.A. Identification of epeoifio surface antigens on T.annuiata invaded lymphoid oelis. // European Onion 3 Coordination Meeting on Tropical TheilerioBis., Turkey, 1994, p.26.