Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESM01-04

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESM01-04"

На правах рукописи

ПРОХОРОВИЧ МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ХРОМОСОМНЫЕ АНОМАЛИИ В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ЬЕБМОЫМ

Генетика-03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2009

003458922

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Рубцов Николай Борисович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Серов Олег Леонидович

кандидат биологических наук Лебедев Игорь Николаевич

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится^% tJUlib&^ht р, 2009 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защит^ диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: dissov@, bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « Atr. » ^Lt^Mhh

г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальпость проблемы. В настоящее время возможности практического использования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека привлекают все более пристальное внимание. Все существующие линии ЭСК человека имеют такие общие характеристики, как способность к самовоспроизведению, экспрессия специфических маркёров, способность к дифферепцировке. В то же время появляется всё больше работ, в которых выявляются различия между разными линиями ЭСК. Несомненно, что генетическая нестабильность и связанное с ней изменение паттерна экспрессии генов могут давать вклад как в потенциал дифференцировки линий ЭСК человека, так и в процесс формирования клетками опухолевого фенотипа (Enver et al., 2005). Это существенно ограничивает возможности практического применения клеточных технологий на основе ЭСК. В то же время при условии детального описания перестроенных хромосом, сублинии ЭСК с аномальным кариотипом могут оказаться мощным инструментом для изучения роли конкретных хромосомных районов в поддержании плюрипотентности ЭСК и определении спектра их возможной дифференцировки, а также механизмов формирования ряда патологий, сопровождающих раннее развитие эмбрионов, клетки которых отягощены аналогичными аномалиями.

Несмотря на интенсивные исследования в этой области, информация в отношении стабильности кариотипа ЭСК человека остается весьма ограниченной и противоречивой. В литературе наряду с данными, свидетельствующими о стабильности кариотипа ЭСК человека при их культивировании in vitro, представлены факты появления в кариотипе ЭСК хромосомных аномалий и описаны примеры изменения ряда свойств ЭСК, сопутствующие таким аномалиям.

В настоящее время актуальным является не только детальный анализ хромосомных перестроек и сопутствующих им изменений экспрессии генов, но также и выяснение влияния хромосомных перестроек на общую архитектонику интерфазных ядер ЭСК человека. Результаты исследований, проведенных в последние годы, показали, что трёхмерная организация интерфазного ядра является одним из факторов регуляции генной экспрессии (Cremer, Cremer,

2001). Однако пока опубликована всего одна работа, посвящённая исследованию трёхмерной организации интерфазных ядер ЭСК человека (Wiblin et al, 2005). Полученные в этой работе результаты указывают на то, что архитектоника ядер ЭСК имеет ряд особенностей в сравнении с организацией ядер других типов клеток. В связи с этим исследования локализации и пространственной организации хромосом в ядрах ЭСК человека представляют особый интерес. Цели и задачи работы.

Целью настоящей работы является определение закономерностей реорганизации кариотипа эмбриональных стволовых клеток человека серии hESM и сопутствующих им изменений в процессе культивирования in vitro.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) провести на разных пассажах кариотипирование четырёх независимо полученных линий ЭСК человека (hESMOl, hESM02, hESM03 и hESM04) при культивировании их в виде набора индивидуальных сублиний;

2) при выявлении аномальных хромосом провести их детальный молекулярно-цитогенетический анализ;

3) провести сравнительный анализ характеристик ЭСК исходных линий hESMOl-04 и сублиний с выявленными хромосомными перестройками;

4) разработать метод визуализации и идентификации хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога в трёхмерном пространстве интерфазного ядра ЭСК;

5) провести оценку влияния хромосомных перестроек на положение хромосом в интерфазных ядрах ЭСК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показана возможность сохранения нормального кариотипа эмбриональными стволовыми клетками человека серии hESM при длительном культивировании, что является необходимым условием для получения большого количества этих клеток и их практического использования.

Выявлены и детально охарактеризованы аномальные хромосомы, являющиеся производными хромосом 9 и 18, аналогичные ранее описанным аномалиям у пациентов с рядом патологий. Выделенные сублинии ЭСК с соответствующими хромосомными перестройками могут способствовать

созданию экспериментальной модели для изучения механизмов развития таких патологий и способов их профилактики.

Разработаны методы, которые впервые позволили провести одновременную визуализацию хромосомных территорий перестроенных хромосом и их нормальных гомологов в трёхмерном пространстве интерфазных ядер ЭСК. Впервые для визуализации целых хромосомных территорий были использованы микродиссекционные ДНК-пробы. Впервые проведено сравнение положения отдельных хромосом и их перестроенных гомологов в интерфазных ядрах ЭСК человека, а также расположение гомологичных районов в составе хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её' нормального гомолога.

Апробация работы. Результаты работы были представлены: на конференции "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты", Москва, 17-18 ноября 2005; на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток, Звенигород, 12-16 декабря 2005; на первом конгрессе Германского общества исследователей стволовых клеток, Cologne, Германия, июль 2006; на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 17 - 19 октября 2006; на отчётной сессии ИЦиГ, Новосибирск, февраль 2007; на Британско-Российском совещании "Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации", Москва, март 2007; на XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, апрель 2007; на II Региональной конференции молодых учёных им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 27 апреля 2007; на Международной молодёжной научно-методической конференции, Томск, 9-12 мая 2007; на II съезде Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 в рецензируемых журналах из списка ВАК. Ещё одна работа принята в печать в журнал "Cell cycle".

Вклад автора. Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, по результатам которых написана данная

работа. Культивирование ЭСК проводилось совместно с к.б.н. М.А. Лагарьковой (ИОГен РАН). Получение микродиссекционных проб и визуализация хромосомных территорий в трёхмерном пространстве интерфазного ядра проводилось совместно с д.б.н. Н.Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В. Карамышевой. Большая часть экспериментов была проведена автором самостоятельно. Личный вклад автора в работу является определяющим.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (133 ссылки). Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы четыре исходные линии ЭСК человека: hESMOl, hESM02, hESM03 и hESM04, полученные в Институте биологии гена РАН (Киселёв и др., 2006; Lagarkova et al., 2006). На момент начала настоящей работы было показано, что клетки hESMOl-04 в ходе длительного культивирования (десятки пассажей) сохраняют маркёры, типичные для плюрипотентных клеток (Oct4, Nanog, Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4, щелочная фосфатаза), способны формировать эмбриоидные тельца, при введении бестимусным мышам формируют опухоли, в состав которых входят тканеподобые структуры, аналогичные производным трёх зародышевых листков (Киселёв и др., 2006; Lagarkova et al., 2006).

Получение эмбриоидных телец и иммуноокрашивание на специфические маркёры проводилось по общепринятым методикам с некоторыми модификациями (Киселёв и др., 2006; Lagarkova et al., 2006). Дифференциальное окрашивание хромосом также проводили по общепринятым методикам с некоторыми модификациями (Seabright, 1971; Samner, 1972; Bayani, Squire, 2004). Микродиссекцию хромосом проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном микроманипулятором IR (Zeiss) (Rubtsov et al., 2000). Амплификацию ДНК диссектированного материала проводили в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером MW6 (Karamysheva et al., 2001). Супрессионную гибридизацию in situ проводили, как описано в работе

Пинкеля с соавторами (Pinkel et al, 1986), с модификациями. Изображения метафазных пластинок регистрировали и обрабатывали с помощью программы ISIS5 фирмы METASystems GmbH. 3D FISH и иммуноокрашивание проводили так, как описано в работе Соловей с соавторами (Solovei et al, 2002). Микроскопию в светлом поле, флуоресцентную и лазерную сканирующую микроскопию проводили на микроскопе AXIOPlan2 Imaging (ZEISS), оборудованном Paco CCD-камерой и системой фильтров CHROMA, микроскопе AXIOSKOPE 2 Plus (ZEISS) с охлаждаемой CCD-камерой AXIOCAM HRc. Лазерную сканирующую микроскопию проводили на конфокальном микроскопе LSM510META (ZEISS). В работе было использовано оборудование Центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кариотнпирование линий hESMOl-04 и полученных из них фибробластоподобных производных

С помощью GTG- и DAPI-дифференциального окрашивания хромосом был проведён анализ кариотипа четырех линий клеток hESMOl-04, каждая из этих линий была представлена серией сублиний, выделенных на разных пассажах. Для каждой линии анализ кариотипа был проведен на нескольких, разнесённых во времени, пассажах. Было показано, что в ходе культивирования в большинстве сублиний сохранялся нормальный кариотип. На основе клеток hESMOl, hESM03 и hESM04, сохранивших нормальный кариотип, был получен ряд культур дифференцированных фибробластоподобных . клеток. Цитогенетический анализ таких клеток не выявил хромосомных аномалий.

В одной из сублиний hESMOl (сублиния hESM01rl8) после 20-го пассажа были выявлены клетки, несущие аномальную хромосому г(18) (рис. 1а), которые уже через несколько пассажей составляли подавляющее большинство клеток этой сублинии. В одной из сублиний hESM03 после 30-го пассажа была выделена сублиния hESM03der9, отягощённая перестроенными хромосомами del(4) и der(9) (рис. 16). С помощью иммуноокрашивания было показано, что в клетках hESM01rl8 и hESM03der9 присутствует тот же набор «маркёров плюрипотентности», который был выявлен ранее в клетках исходных линий

hESMOl и hESM03 с нормальным кариотипом (Oct4, Nanog, Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4, щелочная фосфатаза). Как было показано в результате анализа эмбриоидных телец, несмотря на сохранение этих маркёров, способности к дифференцировке клеток hESM01rl8 оказались существенно снижены, а пролиферативные свойства повышены по сравнению с аналогичными свойствами клеток исходной линии. Это указывает на то, что данных по изучению экспрессии только перечисленных выше «маркёров плюрипотентности» может оказаться недостаточно для полной характеристики свойств ЭСК.

Рисунок 1. Метафазные пластинки клеток сублиний hESMOl г18 и hESM03der9. а-Сублиния hESM01rl8. Кариотип 46,ХХ,г(18). GTG-дифференциальное окрашивание. Объектив хбЗ. Стрелки указывают на хромосомы 18 и г(18). б - Сублиния hESM03der9. Кариотип 46,XX,del(4),der(9). Окраска DAPI (инвертированный бэндинг). Объектив хЮО. Стрелки указывают на хромосомы 4, del(4), 9 и der(9).___

Молекулярно-цитогенетический анализ хромосомных аномалий в клетках hESMOlrlS и hESM03der9

Молекулярно-цитогенетический анализ аномальной хромосомы в клетках hESMOlrlS

Для детального описания хромосомы г(18) была получена микродиссекционная ДНК-проба (г 18) из материала этой хромосомы. FISH полученной пробы с метафазными хромосомами клеток линии hESM01rl8 (рис. 2) и метафазными хромосомами здорового донора показала, что аномальная хромосома представляет собой r(18)(::pll.31—»q21.2::q21.2—>р11.31::). В литературе представлены данные о многочисленных аномалиях развития пациентов с врождённой хромосомной патологией г(18). В нескольких случаях

9 т *

m tsc^-We?

точки разрывов, сопровождавших формирование перестроенных хромосом в клетках пациента, произошли в районах 18р11.3 и 18ц2]. В связи с этим, клетки ЬЕ8М01г18 представляют особый интерес при изучении механизмов развития аномалий, ассоциированных с дериватами хромосомы 18.

Рисунок 2. FISH ДНК-пробы г18 (зелёный) с хромосомами клеток линии hESM01rl8 (окраска DAPI). Стрелки указывают на хромосомы 18 и г(18).

Молекулярно-цитогенетический анализ аномальных хромосом в клетках liESM03der9

На основании анализа GTG-дифференциальной исчерченности хромосом (рис. 16) во всех клетках сублинии hESM03der9 было выявлено по две аномальные хромосомы. Одна из них была идентифицирована как del(4), вторая - dup(9). Для уточнения точек разрывов и воссоединений, которые имели место при реорганизации хромосом, были получены специальные микродиссекционные ДНК-пробы и проведена FISH.

тггж

I /

з ^^У4 * ^ а

7) ^

ЧЧ 4

\ 9 \ „ 4

Рисунок 3. Определение границ района делении в хромосоме der(4): а - FISH ДНК-пробы del4 (зелёный сигнал), с хромосомами лимфоцитов взрослого человека (синий -окраска DAPI); б - инвертированный DAPI-бэндинг тех же хромосом. Стрелки указывают наточки разрывов, имевших место при возникновении делении.

ДНК-проба для анализа района делении в хромосоме 4 (deI4) была получена сбором из одной метафазной пластинки пяти хромосом, по морфологии совпадающих с del(4), и последующей амплификацией ДНК собранного материала. Такой подход обеспечил наличие в ДНК-пробе материала хромосомы del(4) и исключил попадание в него ДНК из района делеции хромосомы 4. FISH этой ДНК-пробы с метафазными хромосомами клеток hESM03der9 и хромосомами здорового донора позволил описать аномальную хромосому как del(4)(q25q31.1) (рис. 3).

Молекулярно-цитогенетический анализ хромосомы der(9) включал получение четырех районоспецифичных ДНК-проб (одна - из нормальной хромосомы 9 здорового донора, три - из der(9) клеток hESM03der9) и двух хромосомоспецифичных ДНК-проб: из нормальной хромосомы 9 и из хромосомы der(9). Схема микродиссекций для получения этих ДНК-проб приведена на рисунке 4. Результаты проведённой серии FISH с использованием полученных ДНК-проб позволили описать кариотип клеток hESM03der9 как 46,XX,del(4)(q25q31.1 ),dup(9)(q 12q33).

Сравнительный анализ положения в интерфазном ядре нормальных хромосом и их дериватов

В настоящее время получены многочисленные и разнообразные данные о наличии связи между положением хромосом и хромосомных районов относительно оболочки ядра, ядрышка, межхроматинового пространства с уровнем транскрипционной активности входящих в хромосомные районы генов (Gasser, 2002; Parada, Misteli, 2002; Mateos-Langerak et al., 2007). В этом отношении выявленные в hESM01r!8 и hESM03der9 перестроенные хромосомы

]РСР9С WCP9

Рисунок 4. Схема микродиссекций при получении ДНК-проб из хромосом 9 и der(9). На рисунке приведены наименования ДНК-проб, и скобками обозначены районы хромосом, из материала которых были получены ДНК-пробы.

der(9)

представляют особый интерес: хромосома г(18), сохранив исходное общее соотношение числа GC и AT пар и размер, потеряла теломеры и приобрела форму кольца; der(9) в результате перестройки не только значительно увеличилась в размере, но также приобрела дополнительный С-позитивный район. В большинстве типов клеток человека центромерные районы располагаются на периферии интерфазного ядра (Gilbert er а/., 2005). В единственной работе, посвященной трёхмерной характеристике интерфазного ядра ЭСК человека (Wiblin et al., 2005), приведены данные о том, что в клетках HI, 7 и 9 наблюдается более часто расположение центромер во внутреннем компартменте ядра. Остаётся неизвестным, какие факторы обуславливают тот или иной тип локализации центромер.

■

/

/ *•

! * «

Рисунок 5. FISH ДНК-пробы, Рисунок 6. Ортогональная проекция

приготовленной на основе результатов микроскопии 3D FISH с ядрами

клонированного фрагмента ДНК из клеток линии hESM01rl8: хромосомы 18 и

района делеции, (красный сигнал) с г(18) (зелёный сигнал). Ядра окрашены

хромосомами клеток линии hESM0Irl8 DAPI, красный сигнал маркирует

(окраска DAPI). Стрелки указывают на нормальный гомолог хромосомы 18.

хромосому г(18) и её нормальный Аксиальный оптический срез - в центре,

гомолог. фронтальный - сверху, сагиттальный -

L справа.

Разработка методов идентификации хромосомных территорий нормальных гомологов и дериватов хромосом

При выполнении этой работы впервые микродиссекционные пробы были использованы для визуализации целых хромосомных территорий в иптерфазных ядрах, сохранивших свою трехмерную организацию.

ДНК-проба для идентификации хромосомной территории нормальной хромосомы 18 и её деривата была получена на основе ВАСа, содержащего фрагмент ДНК, отсутствующий в хромосоме r(18). FISH этой ДНК-пробы с метафазными хромосомами клеток hESM01rl8 давал интенсивный сигнал на хромосоме 18 и не давал сигнала на хромосоме г(18) (рис. 5). Использование этой ДНК-пробы совместно с ДНК-пробой, окрашивающей всю хромосому 18, позволило визуализировать и различать территории хромосомы 18 и её деривата (рис. 6).

Для визуализации и идентификации в интерфазном ядре хромосомных территорий хромосом 9 и её деривата были использованы ДНК-пробы WCP9 и РСР9С, одна из которых (РСР9С) окрашивала С-позитивные районы хромосом 9 и её деривата, а другая (WCP9) - обе хромосомы полностью (рис. 7). FISH РСР9С с сохранившими трехмерную организацию интерфазными ядрами давала на территории der(9), в отличии от хромосомы 9, два сигнала (рис. 8).

Рисунок 8. ЗО-РКН проб \VCP9 (зелёный) и РСР9С (красный) с интерфазным ядром клеток линии 11Е5М(Шег9 (серый цвет -окраска ОАР1). Реконструкция трехмерной организации ядра из серии оптических срезов._

Рисунок 7. FISH проб WCP9 (красный) и РСР9С (зелёный) с хромосомами клеток линии hESM03der9 (окраска DAPI). Жёлтый цвет - результат совмещения красного и зелёного сигналов близкой интенсивности.

Сравнительный анализ локализации хромосом 18 н г(18)

Данные многочисленных исследований (Croft et al., 1999; Cremer et al, 2001; Cremer, Cremer, 2001) указывают, что транскрипционо неактивный хроматин и хроматин с низкой транскрипционной активностью локализованы преимущественно в районах, прилежащих к ядерной мембране и ядрышку. В

связи с этим при выполнении данной работы был проведён анализ положения хромосомных территорий или их районов относительно периферической области ядра и ядрышек. Для определения границы ядра при проведении конфокальной микроскопии анализировали ядра окрашенные ЭАР1. Периферическую область ядра определяли как границу окрашенного ОАР1 материала (Сгетег е1 а1, 2001). Иммуноокрашивание с использованием антител, специфичных к протеину В23, являющемуся белковым компонентом ядрышка, и последующая конфокальная микроскопия 45-ти ядер клеток ЬЕ8М01г18 показали, что локализация протеина В23 совпадает с внутриядерными областями, неокрашивающимися БАР1. Аналогичные результаты были получены при анализе ядрышек в клетках ЬЕ8М01, ИЕБМОЗ, ИЕ8М03с1ег9 и их дифференцированных производных.

Сравнение положения хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата в клетках ЬЕ5М01г18 было выполнено на основании данных конфокальной микроскопии 90 диплоидных интерфазных ядер клеток «молодых» колоний, занимающих в колониях сходные позиции. Для каждой из 180-ти проанализированных хромосомных территорий был определён район локализации относительно границы ядра и ядрышек. Из всех теоретически возможных положений были обнаружены только пять вариантов, которые приведены на рисунке 9.

Рисунок 9. Варианты локализации хромосомы 18 и её деривата. Хромосомная территория (ХТ) прилегает одновременно к верхней, нижней и боковой границе ядра (1); ХТ прилегает к верхней и нижней границе ядра (2); ХТ

прилегает к границе ядра и граничит с ядрышком (3); ХТ прилегает к ядрышку (4); ХТ прилегает к двум ядрышкам (5). Чёрным цветом обозначены ядрышки (Я).

Полученные данные сведены в таблицу 1. Сравнение представленных в таблице 1 результатов с помощью критерия х позволяет утверждать, что положение хромосомных территорий нормального и перестроенного гомологов различаются с уровнем значимости менее 0,01.

Таблица 1. Локализация территорий хромосомы 18 и её деривата в ядрах клеток ЬЕ8М01г18. Обозначения вариантов локализации приведены на рисунке 9.

Число хромосом с соответствующим вариантом локализации

Вариант локализации 1 2 3 4 5

хромосома 18 10 19 56 2 3

хромосома г(18) 16 35 34 5 0

Материал хромосомы г(18) чаще локализован в районах, прилежащих к границе ядра, чем материал нормального гомолога этой хромосомы. Причины таких различий остаются невыясненными. Возможно, это связано с отсутствием в г(18) теломерных районов и (или) кольцевой организацией хромосомы. Так, кольцевая форма может способствовать более компактному расположению материала хромосомы в интерфазном ядре. Неясна и роль теломерных районов хромосом в определении положения хромосомы в ядрах эмбриональных стволовых клеток человека. Однако можно с уверенностью утверждать, что сублинии hESMOl и hESM01rl8 различаются не только наличием в hESM01rl8 частичной трисомии и частичной моносомии по хромосоме 18, но и по некоторым характеристикам трёхмерной организации их интерфазных ядер.

Сравнительный анализ положения хромосом 9 и der(9)

Анализ положения хромосом 9 и der(9) показал, что в большинстве проанализированных ядер клеток hESM03der9 хромосома der(9) занимает такое положение, при котором один её район прилегает к верхней границе ядра, а другой - к нижней. Это, вероятно, обусловлено уплощенной формой ядер hESM03der9 и большим размером хромосомы der(9). При анализе особое внимание было уделено локализации С-позитивных районов хромосом 9 и der(9). Эти районы интенсивно окрашивались FISH ДНК-пробы РСР9С (рис. 7, 8). С помощью конфокальной микроскопии и двухцветной FISH ДНК-проб РСР9С и WCP9 была изучена локализация прицентромерных районов нормального гомолога и der(9), а также дополнительного С-позитивного района хромосомы der(9), который значительно уступал им по размеру. Положение этих районов относительно периферической области ядра и ядрышек было проанализировано в 97 ядрах клеток hESM03der9 и в 87 ядрах их дифференцированных фибробластоподобных производных. Было показано, что

в клетках обоих типов все они локализуются предпочтительно вблизи границы ядра (рис. 10, табл. 2).

Рисунок 10. Локализация хромосом 9 и её деривата. Чёрным цветом обозначены ядрышки (Я).

0 - район не прилегает ни к границе ядра, ни к ядрышку; 1 - район прилегает к верхней, нижней или боковой границе ядра; 2 - район прилегает и к верхней, и к нижней границе ядра; 3 - район прилегает одновременно и к границе ядра, и к ядрышку; пи - район граничит с ядрышком.

Таблица 2. Локализация С-позитивных районов хромосом 9 и с!ег(9) в ядрах клеток ЬЕ8М03(1ег9 и их дифференцированных производных.

Число районов с соответствующим вариантом локализации

районы Дополнительный район с!ег{9) Прицентромерный район с!ег(9) Прицентромерный район хромосомы 9

Вариант локализации* 0 1 2 3 пи 0 1 2 3 пи 0 1 2 3 пи

Диф- ные клетки 0 72 0 13 2 0 50 15 21 0 0 54 12 20 0

ЬЕвМ 03с1ег9 11 52 0 16 18 4 40 4 32 17 1 60 2 21 13

Обозначения приведены на рисунке 10.

Полученные данные свидетельствуют о том, что для всех С-позитивных районов наиболее характерным является положение в периферической области ядра. Однако, как и в исследовании, представленном Виблин с соавторами С^Ыт е1 а!., 2005), в клетках ЬЕ8М03(1ег9 приценгромерные районы и дополнительный С-позитивный район, оказывались локализованными во внутреннем компартменте несколько чаще, чем в случае полученных из ЬЕ8М03<1ег9 дифференцированных клеток. Связано ли это с неизвестными особенностями организации интерфазного ядра эмбриональных стволовых клеток или причиной являются различия в размере и форме ядер, остается не ясно. Тем не менее, полученные в настоящем исследовании результаты указывают на необходимость при изучении эмбриональных стволовых клеток учитывать не только численные и структурные изменения хромосом, но и возможные изменения архитектоники интерфазных ядер.

выводы

1. Показано, что возникновение аномальных хромосом в культурах hESM01-04 может сопровождаться их быстрой фиксацией в отдельных сублиниях, что, однако, не является следствием общей дестабилизации кариотипа исходной культуры. При культивировании, проводимом с регулярной криоконсервацией клеток и их хромосомным анализом, возможно длительное поддержание линий ЭСК hESM01-04 с сохранением нормального кариотипа.

2. Получены две сублинии ЭСК, отягощенные аномальными хромосомами, которые были детально охарактеризованы с помощью комплекта микродиссекционных ДНК-проб и флуоресцентной гибридизации in situ. Показано, что кариотип сублинии hESM01rl8 представляет собой 4б,ХХ,г( 18)(: :р 11.31 —*q21.2: :q21.2—>р 11.31::), а сублинии hESM03der9 -46,XX,del(4)(q25q31.1 ),dup(9)(q 12q33).

3. Показано, что при сохранении «маркёров плюрипотентности» способности к прохождению дифференцировки ЭСК, отягощённых выявленными хромосомными аномалиями, снижены по сравнению с клетками исходных линий.

4. Создан набор ДНК-проб и разработан вариант проведения трёхмерной гибридизации in situ, позволяющие визуализировать и идентифицировать в интерфазных ядрах клеток hESM01rl8 и hESM03der9 территории аномальных хромосом г(18) и der(9) и их нормальных гомологов.

5. Показано, что положение аномальной хромосомы г(18) относительно периферической области ядра и ядрышек в интерфазных ядрах клеток hESM01rl8 отличается от положения нормального гомолога хромосомы 18 в этих же ядрах; дуплицированный район хромосомы der(9), содержащий ДНК, гомологичную ДНК прицентромерного С-позитивного района, локализуется предпочтительно в периферической области ядра, также как и С-позитивные прицентромерные районы хромосом 9 и der(9).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) М.А. Прохорович. А.Г. Шилов, Н.Б. Рубцов, С.Л. Киселев, М.А.Лагарькова «Метод быстрого и эффективного кариотипирования эмбриональных стволовых клеток человека». "КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ" Информационный бюллетень, С.-Петербург.

2006. Вып. 21. Стр 65-68;

2) С.Л. Киселев, П.Ю. Волчков, Е.С. Филоненко, М.А. Прохорович, И.А. Муфазалов, A.B. Лякишева, М.А. Лагарькова «Молекулярная и клеточная биология линий ЭСК человека». Молекулярная медицина. 2006. №2. Стр. 6-11;

3) П.Ю. Волчкоз, М.А. Лагарькова, М.А. Прохорович. С.Л. Киселев «Двойной негативный контроль генов, контролирующих направленную дифференцировку ЭСК человека в эндотеолий». Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. №2. Стр. 34-39;

4) М.А. Прохорович. М.А.Лагарькова, А.Г. Шилов, Т.В. Карамышева, С.Л. Киселёв, Н.Б. Рубцов «Культуры эмбриональных стволовых клеток человека: хромосомные перестройки и стабильность кариотипа». Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007, №3. Стр. 43-46;

5) Н.Б. Рубцов, М.А. Прохорович. М.А. Лагарькова, Т.В. Карамышева, С.Л. Киселёв «Цитогенетика стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека hESMOl-04». Медицинская генетика. 2007. Т. 6. №8(64). Стр. 11-16.

6) (In print.) М.А. Lagarkova, Р. Y. Volchkov, E.S. Philonenko, K. Pfannkuche, M.A. Prokhorovich. T. Zabotina, J. Hescheler, S.L. Kiselev «CD 30 is a marker of undifferentiated human embryonic stem cells rather than a biomarker of transformed hESCs». Cell Cycle. 2008. V. 7(22) P. 3475-3480.

7) М.А. Прохорович. Т.В. Карамышева, М.А. Лагарькова, Н.Б. Рубцов «Структурная реорганизация хромосомы 18 и её положение в интерфазном ядре эмбриональной стволовой клетки человека» Международная молодёжная научно-методическая конференция. Сборник материалов Конференции, стр. 150. Томск 9-12 мая 2007;

8) Т.В. Карамышева, М.А. Прохорович. М.А. Лагарькова, С.Л. Киселёв, Н.Б. Рубцов «Получение микродиссекционных хромосомо- и районоспецифичных зондов для анализа хромосомных перестроек в эмбриональных стволовых клетках человека». II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Санкт-Петербург, 16-19 октября

2007. Цитология. 2007. Т. 49. №9. Стр. 752;

9) Н.Б. Рубцов, Т.В. Карамышева, М.А. Прохорович. М.А. Лагарькова, С.Л. Киселёв «Положение аномальных хромосом в интерфазных ядрах эмбриональных стволовых

клеток человека». И съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007. Цитология. 2007. Т. 49. №9. Стр. 789;

10) А.А. Болтенгаген, В.В. Дёмина, М.А. Прохорович «Сравнение особенностей роста и протяжённости контактирующих поверхностей стволовых клеток разных типов». XI.V Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-техничес,кий прогресс». Сборник материалов Конференции, стр. 41. Новосибирск, 2007;

11) Т.В. Карамышева, М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, Н.Б. Рубцов «Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа в диагностике онкологических заболеваний». II Региональной конференции молодых учёных им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии». Сборник материалов Конференции, стр. 32. Томск, 27 апреля 2007;

12) М.А. Прохорович. А.Г. Шилов, Е.С. Филоненко, М.А. Лагарькова, С.Л. Киселёв «Разработка быстрого метода кариотипирования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека». Конференция ."Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты". Сборник материалов Конференции, стр. 23. Москва, 17-18 ноября 2005;

13) С.Л. Киселев, М.А. Лагарькова, Е.С. Филоненко, М.А. Прохорович. П.Ю. Волчков "Молекулярная генетика линий ЭСК человека и проблемы направленной дифференцировки". VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток. Сборник материалов Конференции, стр 72. Звенигород, 12-16 декабря 2005;

14) М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, Т.В. Карамышева, А.И. Железова, А.Г. Шилов, Н.Б. Рубцов, С.Л. Киселев «Особенности культивирования, дифференцировки и цитогенетические характеристики линий эмбриональных стволовых клеток человека, имеющих хромосомные аберрации» Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре». Санкт-Петербург, 17 - 19 октября 2006. Цитология. 2006. Т. 48. №9. Стр. 794;

15) М.А. Лагарькова, М.А. Прохорович. А.Г. Шилов, С.Л. Киселев, С. М. Закиян «Создание коллекции линий эмбриональных стволовых клеток человека: сравнительные характеристики клеточных линий» Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре». Санкт-Петербург, 17 - 19 октября 2006. Цитология. 2006. Т. 48. №9. Стр. 776.

Подписано к печати 10.11. 2008 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. Изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 125.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прохорович, Мария Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Линии ЭСК человека.

1.1.1 Транскриптомные портреты линий ЭСК.

1.1.2 Импринтинг в линиях ЭСК.

1.1.3 Статус X хромосомы в линиях ЭСК.

1.1.4 Стабильность кариотипа в линиях ЭСК.

1.2 Культивирование и стабильность кариотипа ЭСК человека.

1.2.1 Методы хромосомного анализа ЭСК.

1.2.2 Фидер.

1.2.2.1 Растворимые факторы фидера.

1.2.2.2 Нерастворимый матрикс.

1.2.2.3 Тип фидера.

1.2.3 Способы пересева.

1.2.3.1 Появление аномалий кариотипа ЭСК, культивировавшихся с помощью ферментативного пересева.

1.2.3.2 Сохранение нормального кариотипа ЭСК, культивировавшихся с помощью ферментативного пересева.

1.2.3.3 Кариотип ЭСК, культивировавшихся с помощью механического пересева.

1.2.4 Проблема неопределённости факторов культивирования.

1.3 Хромосомная изменчивость в линиях ЭСК человека.

1.3.1 Особенности цитогенетического анализа ЭСК.

1.3.2 Аномалии кариотипа ЭСК.

1.3.2.1 Численные хромосомные аномалии.

1.3.2.1.1 Наиболее распространённые численные аномалии хромосом.

1.3.2.1.2 Редкие численные аномалии хромосом.

1.3.2.2 Структурные хромосомные аномалии.

1.4 Возможные последствия хромосомных аномалий.

1.4.1 Возможные эффекты численных и структурных хромосомных аномалий.

1.4.2 Эффект положения и трёхмерная структура ядра как фактор регуляции генной экспрессии.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реагенты.

2.1.2. Антитела, использованные для проведения иммуноокрашивания клеток и криосрезов эмбриоидных телец.

2.1.3. Ферменты.

2.1.4. Линии ЭСК.

2.2. Методы.

2.2.1. Приготовление фидера.

2.2.1.1. Культивирование мышиных эмбриональных фибробластов.

2.2.1.2. Инактивация митотической активности мышиных эмбриональных фибробластов.

2.2.1.3. Предварительное культивирование фидера перед использованием

2.2.2. Культивирование ЭСК.

2.2.2.1. Культивирование ЭСК.

2.2.2.2. Пересев ЭСК.

2.2.3. Криоконсервация и размораживание клеток.

2.2.4. Получение эмбриоидных телец.

2.2.5. Получение криосрезов и измерение диаметра эмбриоидных телец.

2.2.6. Иммуноокрашивание клеток и криосрезов эмбриоидных телец.

2.2.7. Получение фибробластоподобных производных на основе клеток hESMOl, hESM03, hESM04.

2.2.7.1. Получение сублинии FhESMO 1.3.

2.2.7.2. Получение сублиний дифференцированных клеток при спонтанной дифференцировке ЭСК in vitro.

2.2.8. Получение препаратов метафазных хромосом ЭСК.

2.2.9. Получение препаратов метафазных хромосом фибробластоподобных клеток.

2.2.10. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом с помощью DAPI.

2.2.11. GTG-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом.

2.2.12. С-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом.

2.2.13. Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH.

2.2.14. Микродиссекция.

2.2.14.1. Приготовление игл.

2.2.14.2. Приготовление микропипеток.

2.2.14.3. Приготовление покровных стекол.

2.2.14.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом.

2.2.14.5. Микродиссекция метафазных хромосом.

2.2.15. Приготовление ДНК-пробы из ВАС клона RP-11-4В17.

2.2.16. ПЦР с частично вырожденными праймерами.

2.2.17. Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК - библиотек.

2.2.18. Супрессионная гибридизация in situ.

2.2.19. Детекция на цитологических препаратах ДНК - проб.

2.2.20. Микроскопический анализ препаратов после иммуноокрашивания и FISH.

2.2.21. Получение препаратов для проведения трёхмерной гибридизации.

2.2.22. 3D FISH и иммуноокрашивание.

2.2.23. Лазерная сканирующая микроскопия.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Кариотип клеток hESM01-04 и характеристика клеток производных сублиний, полученных на их основе.

3.1.1. Кариотип клеток hESM01-04 и их фибробластоподобных производных.

3.1.1.1. Кариотип клеток hESMO 1-04.

3.1.1.2. Хромосомы дифференцированных клеток, полученных на основе hESMO 1-04.

3.1.2. Особенности сублиний дифференцированных клеток, полученных на основе клеток hESMO 1-04.

3.1.2.1. Особенности культивирования сублиний дифференцированных клеток, полученных на основе hESMOl, hESM03 и hESM04.

3.1.2.2. Анализ наличия тканеспецифических маркёров в дифференцированных клетках сублиний, полученных на основе hESMOl, hESM03 и hESM04.

3.1.3. Характеристика ЭСК, несущих аномальные хромосомы.

3.1.3.1. Выделение сублиний ЭСК, несущих аномальные хромосомы.

3.1.3.2. Ростовые свойства клеток hESM01rl8 и hESM03der9.

3.1.3.3. Анализ наличия маркёров, характерных для плюрипотентных клеток, в клетках hESM01rl8 и hESM03der9.

3.1.3.4. Особенности получения сублиний дифференцированных клеток на основе hESM01rl8 и hESM03der9.

3.1.3.5. Анализ наличия тканеспецифических маркёров в эмбриоидных тельцах и дифференцированных клетках сублиний, полученных на основе hESM01rl8 и hESM03der9.

3.1.3.6. Кариотип дифференцированных клеток, полученных на основе hESM01rl8 и hESM03der9.

3.2. Молекулярно-цитогенетический анализ хромосомных аномалий в клетках hESM01rl8 и hESM03der9.

3.2.1. Анализ аномальной хромосомы в клетках hESMOlr 18.

3.2.2. Анализ аномальных хромосом в клетках hESM03der9.

3.3. Сравнительный анализ положения в интерфазном ядре нормальных хромосом и их аномальных дериватов.

3.3.1. Разработка методов идентификации хромосомных территорий в интерфазных ядрах ЭСК.

3.3.2. Сравнительный анализ локализации хромосом 18 и r( 18).

3.3.3. Сравнительный анализ положения хромосом 9 и der(9).

3.3.3.1. Сравнительный анализ положения хромосом 9 и der(9).

3.3.3.2. Сравнительный анализ объёма ядер клеток hESM03der9 и дифференцированных клеток сублиний, полученных на их основе97 3.4. Обсуждение.

3.4.1. Основные направления изучения стабильности кариотипа ЭСК

3.4.2. Фиксация аномальных хромосом в клеточных популяциях ЭСК. Q

3.4.3. Особенности хромосом недифференцированных клеток и мете ~">ды хромосомного анализа."х

3.4.4. Хромосомные аномалии, выявленные в клетках hESMO 1 г 1 *** и hESM03der9. .1Q

3.4.5. Влияние хромосомных аномалий на общую архитекгошшш^^к^ ку интерфазного ядра. IZZHX

3.4.6. Возможности использования ЭСК, несущих аномальные хромоссхая^^ьявд в качестве экспериментальных моделей.щ q^

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESM01-04"

Актуальность проблемы

В настоящее время возможности практического использования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека привлекают все более пристальное внимание. Все существующие линии ЭСК человека имеют такие общие характеристики как способность к самовоспроизведению, экспрессия специфических маркёров, способность к дифференцировке. В то же время появляется всё больше работ, в которых выявляются различия между разными линиями ЭСК. Несомненно, что генетическая нестабильность и связанное с ней изменение паттерна экспрессии генов могут давать вклад как в потенциал дифференцировки линий ЭСК человека, так и в процесс формирования клетками опухолевого фенотипа (Enver et al., 2005). Это существенно ограничивает возможности практического применения клеточных технологий на основе ЭСК. В то же время, при условии детального описания перестроенных хромосом, сублинии ЭСК с аномальным кариотипом могут оказаться мощным инструментом для изучения роли конкретных хромосомных районов в поддержании плюрипотентности ЭСК и определении спектра их возможной дифференцировки, а также механизмов формирования ряда патологий, сопровождающих раннее развитие эмбрионов, клетки которых отягощены аналогичными аномалиями.

Несмотря на интенсивные исследования в этой области информация в отношении стабильности кариотипа ЭСК человека остается весьма ограниченной и противоречивой. В литературе наряду с данными, свидетельствующими о стабильности кариотипа ЭСК человека при их культивировании in vitro, представлены факты появления в кариотипе ЭСК хромосомных аномалий и описаны примеры изменения ряда свойств ЭСК, сопутствующие таким аномалиям.

В настоящее время актуальным является не только детальный анализ хромосомных перестроек и сопутствующих им изменений экспрессии генов, но также и выяснение влияния хромосомных перестроек на общую архитектонику интерфазных ядер ЭСК человека. Результаты исследований, проведенных в последние годы, показали, что трёхмерная организация интерфазного ядра является одним из факторов регуляции генной экспрессии (Cremer, Cremer, 2001). Однако пока опубликована всего одна работа, посвящённая исследованию трёхмерной организации интерфазных ядер ЭСК человека (Wiblin et al., 2005). Полученные в этой работе результаты указывают на то, что архитектоника ядер ЭСК имеет ряд особенностей в сравнении с организацией ядер других типов клеток. В связи с этим исследования локализации и пространственной организации хромосом в ядрах ЭСК человека представляют особый интерес. Цели и задачи работы

Целью настоящей работы является определение закономерностей реорганизации кариотипа эмбриональных стволовых клеток человека серии hESM и сопутствующих им изменений в процессе культивирования in vitro.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) провести на разных пассажах кариотипирование четырёх независимо полученных линий ЭСК человека (hESMOl, hESM02, hESM03 и hESM04) при культивировании их в виде набора индивидуальных сублиний;

2) при выявлении аномальных хромосом провести их детальный молекулярно-цитогенетический анализ;

3) провести сравнительный анализ характеристик ЭСК исходных линий hESMOl-04 и сублиний с выявленными хромосомными перестройками;

4) разработать метод визуализации и идентификации хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога в трёхмерном пространстве интерфазного ядра ЭСК;

5) провести оценку влияния хромосомных перестроек на положение хромосом в интерфазных ядрах ЭСК.

Научная новизна и практическая ценность работы

Показана возможность сохранения нормального кариотипа эмбриональными стволовыми клетками человека серии hESM при длительном культивировании, что является необходимым условием для получения большого количества этих клеток и их практического использования.

Выявлены и детально охарактеризованы аномальные хромосомы, являющиеся производными хромосом 9 и 18, аналогичные ранее описанным аномалиям у пациентов с рядом патологий. Выделенные сублинии ЭСК с соответствующими хромосомными перестройками могут способствовать созданию экспериментальной модели для изучения механизмов развития таких патологий и способов их профилактики.

Разработаны методы, которые впервые позволили провести одновременную визуализацию хромосомных территорий перестроенных хромосом и их нормальных гомологов в трёхмерном пространстве интерфазных ядер ЭСК. Впервые для визуализации целых хромосомных территорий были использованы микродиссекционные ДНК-пробы. Впервые проведено сравнение положения отдельных хромосом и их перестроенных гомологов в интерфазных ядрах ЭСК человека, а также расположения гомологичных районов в составе хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога.

Апробация работы

Результаты работы были представлены: на конференции "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты", Москва, 17-18 ноября 2005; на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток, Звенигород, 12-16 декабря 2005; на первом конгрессе Германского общества исследователей стволовых клеток, Cologne, Германия, июль 2006; на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 17 -19 октября 2006; на отчётной сессии ИЦиГ, Новосибирск, февраль 2007; на Британско-Российском совещании "Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации", Москва, март 2007; на XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, апрель 2007; на II Региональной конференции молодых учёных им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 27 апреля 2007; на Международной молодёжной научно-методической конференции, Томск, 9-12 мая 2007; на II съезде Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 в рецензируемых журналах из списка ВАК. Ещё одна работа принята в печать в журнал "Cell cycle".

Вклад автора

Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, по результатам которых написана данная работа.

Культивирование ЭСК проводилось совместно с к.б.н. М.А. Лагарьковой (ИОГен РАН). Получение микродиссекционных проб и визуализация хромосомных территорий в трёхмерном пространстве интерфазного ядра проводилось совместно с д.б.н. Н.Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В. Карамышевой. Большая часть экспериментов была проведена автором самостоятельно. Личный вклад автора в работу является определяющим.

Структура и объём диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (133 ссылки). Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Прохорович, Мария Александровна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что возникновение аномальных хромосом в культурах hESM01-04 может сопровождаться их быстрой фиксацией в отдельных сублиниях, что однако не является следствием общей дестабилизации кариотипа исходной культуры. При культивировании, проводимом с регулярной криоконсервацией клеток и их хромосомным анализом, возможно длительное поддержание линий ЭСК hESMOl -04 с сохранением нормального кариотипа.

2. Получены две сублинии ЭСК, отягощенные аномальными хромосомами, которые были детально охарактеризованы с помощью комплекта микродиссекционных ДНК-проб и флуоресцентной гибридизации in situ. Показано, что кариотип сублинии hESM01rl8 представляет собой 46,XX,r( 18)(: :р 11.31 —>q21.2: :q21.2—>р 11.31::), а сублинии hESM03der9 -46,XX,del(4)(q25q31.1),dup(9)(ql2q33).

3. Показано, что при сохранении «маркёров плюрипотентности» способности к прохождению дифференцировки ЭСК, отягощенных выявленными хромосомными аномалиями, снижены по сравнению с клетками исходных линий.

4. Создан набор ДНК-проб и разработан вариант проведения трёхмерной гибридизации in situ, позволяющие визуализировать и идентифицировать в интерфазных ядрах клеток hESM01rl8 и hESM03der9 территории аномальных хромосом г(18) и der(9) и их нормальных гомологов.

5. Показано, что положение аномальной хромосомы г(18) относительно периферической области ядра и ядрышек в интерфазных ядрах клеток hESM01rl8 отличается от положения нормального гомолога хромосомы 18 в этих же ядрах; дуплицированный район хромосомы der(9), содержащий ДНК, гомологичную ДНК прицентромерного С-позитивного района, локализуется предпочтительно в периферической области ядра, так же как и С-позитивные прицентромерные районы хромосом 9 и der(9).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прохорович, Мария Александровна, Новосибирск

1. Гилберт СФ: Биология развития. Издательство «Мир», Москва (1993).

2. Жимулёв ИФ: Общая и молекулярная генетика. Издательство Новосибирского университета: Сибирское университетское издательство, Новосибирск (2002).

3. Киселев CJI, Волчков ПЮ, Филоненко ЕС, Прохорович МА, Муфазалов ИА, Лякишева АВ, Лагарькова МА: Молекулярная и клеточная биология линий ЭСК человека. Молекулярная медицина №2 стр. 6-11 (2006).

4. Лебедев ИН, Никитина ТВ, Суханова НН, Назаренко СА: Ранняя эмбриональная гибель: реальные масштабы мозаичных форм аномалий кариотипа. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Вып. 1 стр. 49-57 (2001).

5. Abeyta MJ, Clark AT, Rodriguez RT, Bodnar MS, Pera RA, Firpo MT: Unique gene expression signatures of independently-derived human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet 13:601-608 (2004).

6. Allegrucci C, Denning CN, Burridge P, Steele W, Sinclair KD, Young LE: Human embryonic stem cells as a model for nutritional programming: An evaluation. Reprod Toxicol 20:353-367 (2005).

7. Amit M, Itskovitz-Eldor J: Sources, derivation, and culture of human embryonic stem cells. Semin Reprod Med 24:298-303 (2006).

8. Amit M, Shariki C, Margulets V, Itskovitz-Eldor J: Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod 70:837-845 (2004).

9. Baker DE, Harrison NJ, Maltby E, Smith K, Moore HD, Shaw PJ, Heath PR, Holden H, Andrews PW: Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol 25:207-215 (2007).

10. Bayani J, Squire J: Multi-color FISH techniques Curr Protoc Cell Biol. 22:22-25 (2004).

11. Ben-Yosef D, Malcov M, Eiges R: Pgd-derived human embryonic stem cell lines as a powerful tool for the study of human genetic disorders. Mol Cell Endocrinol 282:153158 (2008).

12. Ben-Yosef D, Malcov M, Eiges R: Pgd-derived human embryonic stem cell lines as a powerful tool for the study of human genetic disorders. Mol Cell Endocrinol 282:153158 (2008).

13. Bigdeli N, Andersson M, Strehl R, Emanuelsson K, Kilmare E, Hyllner J, Lindahl A: Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol 133:146-153 (2008).

14. Blelloch R, Hochedlinger K, Yamada Y, Brennan C, Kim M, Mintz B, Chin L, Jaenisch R: Nuclear cloning of embryonal carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 101(39): 13985-13990 (2004).

15. Bochkov NP, Voronina ES, Kosyakova NV, Liehr T, Rzhaninova AA, Katosova LD, Platonova VI, Gol'dshtein DV: Chromosome variability of human multipotent mesenchymal stromal cells. Bull Exp Biol Med. 143(l):122-6 (2007).

16. Bolzer A, Kreth G, Solovei I, Koehler D, Saracoglu K, Fauth C, Muller S, Eils R, Cremer C, Speicher MR, Cremer T: Three-dimensional maps of all chromosomes in human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes. PLoS Biol 3:el57 (2005).

17. Brandenberger R, Khrebtukova I, Thies RS, Miura T, Jingli C, Puri R, Vasicek T, Lebkowski J, Rao M: Mpss profiling of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol 4:10 (2004).

18. Brown KE, Guest SS, Smale ST, Hahm K, Merkenschlager M, Fisher AG: Association of transcriptionally silent genes with ikaros complexes at centromeric heterochromatin. Cell 91:845-854 (1997).

19. Buzzard JJ, Gough NM, Crook JM, Colman A: Karyotype of human es cells during extended culture. Nat Biotechnol 22:381-382; author reply 382 (2004).

20. Byun HM, Wong HL, Birnstein EA, Wolff EM, Liang G and Yang AS: Examination of IGF2 and H19 loss of imprinting in bladder cancer Cancer Res 67:10753-10758 (2007).

21. Caisander G, Park H, Frej K, Lindqvist J, Bergh C, Lundin K, Hanson C: Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res. 14(2): 131-7 (2006).

22. Carpenter MK, Rosier ES, Fisk GJ, Brandenberger R, Ares X, Miura T, Lucero M, Rao MS: Properties of four human embryonic stem cell lines maintained in a feeder-free culture system. Dev Dyn 229:243-258 (2004).

23. Chen CP, Lin SP, Lin CC, Li YC, Chern SR, Chen WM, Lee CC, Hsieh LJ, Wang W: Perinatal findings and molecular cytogenetic analysis of de novo partial trisomy 16q (16q22.1—>qter) and partial monosomy 20q (20ql3.3~>qter). Prenat Diagn 25:112-118(2005).

24. Chow JC, Hall LL, Baldry SE, Thorogood NP, Lawrence JB and Brown CJ: Inducible XIST-dependent X-chromosome inactivation in human somatic cells is reversible Proc Natl Acad Sci U S A 104:10104-10109 (2007).

25. Clark AT, Bodnar MS, Fox M, Rodriquez RT, Abeyta MJ, Firpo MT and Pera RA: Spontaneous differentiation of germ cells from human embryonic stem cells in vitro Hum Mol Genet 13:727-739 (2004).

26. Cowan С A, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, Zucker JP, Wang S, Morton CC, McMahon AP, Powers D, Melton DA: Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350:1353-1356 (2004).

27. Cremer M, von Hase J, Volm T, Brero A, Kreth G, Walter J, Fischer C, Solovei I, Cremer C, Cremer T: Non-random radial higher-order chromatin arrangements in nuclei of diploid human cells. Chromosome Res 9:541-567 (2001).

28. Cremer T, Cremer C: Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet 2:292-301 (2001).

29. Croft JA, Bridger JM, Boyle S, Perry P, Teague P, Bickmore WA: Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. J Cell Biol 145:1119-1131 (1999).

30. D'Achille P, Seymour JF, Campbell LJ: Translocation (14;18)(q32;q21) in acute lymphoblastic leukemia: A study of 12 cases and review of the literature. Cancer Genet Cytogenet 171:52-56 (2006).

31. Darnfors C, Flodin A, Andersson K, Caisander G, Lindqvist J, Hyllner J, Wahlstrom J, Sartipy P: High-resolution analysis of the subtelomeric regions of human embryonic stem cells. Stem Cells 23:483-488 (2005).

32. Dean W, Bowden L, Aitchison A, Klose J, Moore T, Meneses JJ, Reik W and Feil R: Altered imprinted gene methylation and expression in completely ES cell-derived mouse fetuses: association with aberrant phenotypes Development 125:2273-2282 (1998).

33. Dhara SK, Benvenisty N: Gene trap as a tool for genome annotation and analysis of x chromosome inactivation in human embryonic stem cells. Nucleic Acids Res 32:3995-4002 (2004).

34. Dietzel S, Eils R, Satzler K, Bornfleth H, Jauch A, Cremer C, Cremer T: Evidence against a looped structure of the inactive human x-chromosome territory. Exp Cell Res 240:187-196(1998).

35. Dietzel S, Eils R, Satzler K, Bornfleth H, Jauch A, Cremer C, Cremer T: Evidence against a looped structure of the inactive human x-chromosome territory. Exp Cell Res 240:187-196(1998).

36. Draper JS, Pigott C, Thomson JA, Andrews PW: Surface antigens of human embryonic stem cells: Changes upon differentiation in culture. J Anat 200:249-258 (2002).

37. Draper JS, Smith K, Gokhale P, Moore HD, Maltby E, Johnson J, Meisner L, Zwaka TP, Thomson JA, Andrews PW: Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 22:53-54 (2004).

38. Evans MJ, Kaufman MH: Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292:154-156 (1981).

39. Fong CY, Richards M, Manasi N, Biswas A, Bongso A: Comparative growth behaviour and characterization of stem cells from human wharton's jelly. Reprod Biomed Online 15:708-718 (2007).

40. Fujimoto A, Mitalipov SM, Kuo HC, Wolf DP: Aberrant genomic imprinting in rhesus monkey embryonic stem cells. Stem Cells 24:595-603 (2006).

41. Garagna S, Merico V, Sebastiano V, Monti M, Orlandini G, Gatti R, Scandroglio R, Redi CA, Zuccotti M: Three-dimensional localization and dynamics of centromeres in mouse oocytes during folliculogenesis. J Mol Histol 35:631-638 (2004).

42. Gasser SM: Visualizing chromatin dynamics in interphase nuclei. Science 296:14121416 (2002).

43. Gilbert N, Gilchrist S, Bickmore WA: Chromatin organization in the mammalian nucleus. Int Rev Cytol 242:283-336 (2005).

44. Ginis I, Luo Y, Miura T, Thies S, Brandenberger R, Gerecht-Nir S, Amit M, Hoke A, Carpenter MK, Itskovitz-Eldor J and Rao MS: Differences between human and mouse embryonic stem cells Dev Biol 269:360-380 (2004).

45. Goto T, Monk M: Regulation of x-chromosome inactivation in development in mice and humans. Microbiol Mol Biol Rev 62:362-378 (1998).

46. Hajkova P, Erhardt S, Lane N, Haaf T, El-Maarri O, Reik W, Walter J, Surani MA: Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells. Mech Dev 117:15-23 (2002).

47. Hailing КС, Kipp BR: Fluorescence in situ hybridization in diagnostic cytology. Hum Pathol 38:1137-1144 (2007).

48. Hannula K, Lipsanen-Nyman M, Scherer SW, Holmberg C, Hoglund P and Kere J: Maternal and paternal chromosomes 7 show differential methylation of many genes in lymphoblast DNA Genomics 73:1-9 (2001).

49. Harrison NJ, Baker D, Andrews PW: Culture adaptation of embryonic stem cells echoes germ cell malignancy. Int J Androl 30:275-281; discussion 281 (2007).

50. Hattori N, Abe T, Suzuki M, Matsuyama T, Yoshida S, Li E, Shiota K: Preference of DNA methyltransferases for cpg islands in mouse embryonic stem cells. Genome Res 14:1733-1740(2004).

51. Heins N, Englund MC, Sjoblom C, Dahl U, Tonning A, Bergh C, Lindahl A, Hanson C, Semb H: Derivation, characterization, and differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 22:367-376 (2004).

52. Henegariu O, Heerema NA, Lowe Wright L, Bray-Ward P, Ward DC, Vance GH: Improvements in cytogenetic slide preparation: Controlled chromosome spreading, chemical aging and gradual denaturing. Cytometry 43:101-109 (2001).

53. Hoffman LM, Hall L, Batten JL, Young H, Pardasani D, Baetge EE, Lawrence J, Carpenter MK: X-inactivation status varies in human embryonic stem cell lines. Stem Cells 23:1468-1478 (2005).

54. Hook ЕВ: Exclusion of chromosomal mosaicism: Tables of 90%, 95% and 99% confidence limits and comments on use. Am J Hum Genet 29:94-97 (1977).

55. Hook SS, Lin JJ, Dutta A: Mechanisms to control rereplication and implications for cancer. Curr Opin Cell Biol 19:663-671 (2007).

56. Huang SF, Hsu HC, Fletcher J: Investigation of Chromosomal Aberrations in Hepatocellular Carcinoma by Fluorescence In Situ Hybridization. Cancer Genetics and Cytogenetics 111:21-27 (1999).

57. Imreh MP, Gertow K, Cedervall J, Unger C, Holmberg K, Szoke K, Csoregh L, Fried G, Dilber S, Blennow E, Ahrlund-Richter L: In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human es cells. J Cell Biochem 99:508-516(2006).

58. Jain KK: Current status of fluorescent in-situ hybridisation. Med Device Technol 15:14-17(2004).

59. Josephson R, Sykes G, Liu Y, Ording C, Xu W, Zeng X, Shin S, Loring J, Maitra A, Rao MS, Auerbach JM: A molecular scheme for improved characterization of human embryonic stem cell lines. BMC Biol 4:28 (2006).

60. Kantaputra PN, Limwongse C, Tochareontanaphol C, Mutirangura A, Mevatee U, Praphanphoj V: Contiguous gene syndrome of holoprosencephaly and hypotrichosis simplex: Association with an 18pll.3 deletion. Am J Med Genet A 140:2598-2602 (2006).

61. Karamysheva TV, Matveeva VG, Shorina AP, Rubtsov NB: Clinical and molecular cytogenetic analysis of a rare case of mosaicism for partial monosomy 3p and partial trisomy lOq in human. Genetika 37(6):811-6 (2001).

62. Kawakami T, Okamoto K, Ogawa O, Okada Y: Xist unmethylated DNA fragments in male-derived plasma as a tumour marker for testicular cancer. Lancet 363:40-42 (2004).

63. Keohane AM, O'Neill L P, Belyaev ND, Lavender JS, Turner BM: X-inactivation and histone h4 acetylation in embryonic stem cells. Dev Biol 180:618-630 (1996).

64. Kim SJ, Lee JE, Park JH, Lee JB, Kim JM, Yoon BS, Song JM, Roh SI, Kim CG, Yoon HS: Efficient derivation of new human embryonic stem cell lines. Shin HS. Mol Cells 28;21(1): 166 (2006).

65. Kimura F, Florl AR, Seifert HH, Louhelainen J, Maas S, Knowles MA, Schulz WA: Destabilization of chromosome 9 in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Br J Cancer 85:1887-1893 (2001).

66. Lagarkova MA, Volchkov PY, Lyakisheva AV, Philonenko ES, Kiselev SL: Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines. Cell Cycle 5:416-420 (2006).

67. Ludwig ТЕ, Levenstein ME, Jones JM, Berggren WT, Mitchen ER, Frane JL, Crandall LJ, Daigh CA, Conard ICR, Piekarczyk MS, Lianas RA, Thomson JA: Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol 24:185-187 (2006).

68. Luke S, Shepelsky M: Fish: Recent advances and diagnostic aspects. Cell Vis 5:49-53 (1998).

69. Mahy NL, Perry PE, Bickmore WA: Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by fish. J Cell Biol 159:753-763 (2002).

70. Martin GR: Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78:7634-7638(1981).

71. Mateos-Langerak J, Goetze S, Leonhardt H, Cremer T, van Driel R, Lanctot C: Nuclear architecture: Is it important for genome function and can we prove it? J Cell Biochem 102:1067-1075 (2007).

72. Migeon BR: X chromosome inactivation: Theme and variations. Cytogenet Genome Res 99:8-16(2002).

73. Mikkola M, Olsson C, Palgi J, Ustinov J, Palomaki T, Horelli-Kuitunen N, Knuutila S, Lundin K, Otonkoski T, Tuuri T: Distinct differentiation characteristics of individual human embryonic stem cell lines. BMC Dev Biol 6:40 (2006).

74. Mitalipova MM, Rao RR, Hoyer DM, Johnson JA, Meisner LF, Jones KL, Dalton S, Stice SL: Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 23:19-20 (2005).

75. Neusser M, Schubel V, Koch A, Cremer T, Muller S: Evolutionarily conserved, cell type and species-specific higher order chromatin arrangements in interphase nuclei of primates. Chromosoma 116:307-320 (2007).

76. Noaksson K, Zoric N, Zeng X, Rao MS, Hyllner J, Semb H, Kubista M and Sartipy P: Monitoring differentiation of human embryonic stem cells using real-time PCR Stem Cells 23:1460-1467 (2005).

77. Parada L, Misteli T: Chromosome positioning in the interphase nucleus. Trends Cell Biol 12:425-432 (2002).

78. Pera MF, Trounson AO: Human embryonic stem cells: Prospects for development. Development 131:5515-5525 (2004).

79. Perrin A, Douet-Guilbert N, Laudier B, Couet ML, Guerif F, Royere D, Le Bris MJ, De Braekeleer M, Morel F: Meiotic segregation in spermatozoa of a 45,xy,-14,derl8t(14;18)(qll;pll.3) translocation carrier: A case report. Hum Reprod 22:729-732 (2007).

80. Pinkel D, Gray JW, Trask B, van den Engh G, Fuseoe J, van Dekken H: Cytogenetic analysis by in situ hybridization with fluorescently labeled nucleic acid probes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51 Pt 1:151-157 (1986).

81. Pombo A, Branco MR: Functional organisation of the genome during interphase. Curr Opin Genet Dev 17:451-455 (2007).

82. Rao RR, Stice SL: Gene expression profiling of embryonic stem cells leads to greater understanding of pluripotency and early developmental events. Biol Reprod 71:17721778 (2004).

83. Richards M, Tan S, Fong CY, Biswas A, Chan WK, Bongso A: Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells 21:546-556 (2003).

84. Richards M, Tan SP, Tan JH, Chan WK and Bongso A: The transcriptome profile of human embryonic stem cells as defined by SAGE Stem Cells 22:51-64 (2004).

85. Rosier ES, Fisk GJ, Ares X, Irving J, Miura T, Rao MS and Carpenter MK: Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions Dev Dyn 229:259-274 (2004).

86. Rubtsov NB, Karamysheva TV, Matveeva VG, Sablina OV, Sosnitskaia SV, Andreenkova OV, Gainer ТА, Degtiareva MM: Reverse in situ hybridization of DNA probes of anomalous chromosomes in diagnosing chromosome pathologies. Genetika 37(11):1545-52 (2001).

87. Rugg-Gunn PJ, Ferguson-Smith AC, Pedersen RA: Epigenetic status of human embryonic stem cells. Nat Genet 37:585-587 (2005).

88. Ronne M.: Chromosome preparation and high resolution banding (review) In vivo 4(6):337-65 (1990).

89. Scheuermann MO, Tajbakhsh J, Kurz A, Saracoglu K, Eils R, Lichter P: Topology of genes and nontranscribed sequences in human interphase nuclei. Exp Cell Res 301:266-279 (2004).

90. Seabright M: A rapid banding technique for human chromosomes Lancet. 2(7731):971-2 (1971).

91. Sidhu KS and Tuch BE: Derivation of three clones from human embryonic stem cell lines by FACS sorting and their characterization Stem Cells Dev 15:61-69 (2006).

92. Skottman H, Mikkola M, Lundin K, Olsson C, Stromberg AM, Tuuri T, Otonkoski T, Hovatta O, Lahesmaa R: Gene expression signatures of seven individual human embryonic stem cell lines. Stem Cells 23:1343-1356 (2005).

93. Stalker HJ, Ayme S, Delneste D, Scarpelli H, Vekemans M, Der Kaloustian VM: Duplication of 9ql2-q33: A case report and implications for the dup(9q) syndrome. Am J Med Genet 45:456-459 (1993).

94. Sumner AT: A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin Exp Cell Res. 75(l):304-6 (1972).

95. Sun Y, Li H, Yang H, Rao MS, Zhan M: Mechanisms controlling embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 16:211-231 (2006).

96. Szabo PE, Hubner K, Scholer H, Mann JR: Allele-specific expression of imprinted genes in mouse migratory primordial germ cells. Mech Dev 115:157-160 (2002).

97. Taddei A, Maison C, Roche D, Almouzni G: Reversible disruption of pericentric heterochromatin and centromere function by inhibiting deacetylases. Nat Cell Biol 3:114-120 (2001).

98. Tajbakhsh J, Luz H, Bornfleth H, Lampel S, Cremer C, Lichter P: Spatial distribution of gc- and at-rich DNA sequences within human chromosome territories. Exp Cell Res 255:229-237 (2000).

99. Teller K, Solovei I, Buiting K, Horsthemke B, Cremer T: Maintenance of imprinting and nuclear architecture in cycling cells. Proc Natl Acad Sci USA 104:14970-14975 (2007).

100. Thomson JA, Itskovitzeldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM: Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts Science 282:1145-1147(1998).

101. Verlinsky Y, Strelchenko N, Kukharenko V, Rechitsky S, Verlinsky O, Galat V, Kuliev A: Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reprod Biomed Online 10:105-110(2005).

102. Verlinsky Y, Strelchenko N, Kukharenko V, Rechitsky S, Verlinsky O, Galat V, Kuliev A: Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reprod Biomed Online 10:105-110(2005).

103. Walter J, Joffe B, Bolzer A, Albiez H, Benedetti PA, Muller S, Speicher MR, Cremer T, Cremer M, Solovei I: Towards many colors in fish on 3d-preserved interphase nuclei. Cytogenet Genome Res 114:367-378 (2006).

104. Ware CB, Nelson AM and Blau CA: A comparison of NIH-approved human ESC lines Stem Cells 24:2677-2684 (2006).

105. Weaver В A, Cleveland DW: Aneuploidy: Instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Res 67:10103-10105 (2007).

106. Weise A, Liehr T, Efferth T, Kuechler A, Gebhart E: Comparative m-fish and cgh analyses in sensitive and drug-resistant human t-cell acute leukemia cell lines. Cytogenet Genome Res 98:118-125 (2002).

107. Wiblin AE, Cui W, Clark AJ, Bickmore WA: Distinctive nuclear organisation of centromeres and regions involved in pluripotency in human embryonic stem cells. J Cell Sci 118:3861-3868 (2005).

108. Williams RR, Broad S, Sheer D, Ragoussis J: Subchromosomal positioning of the epidermal differentiation complex (edc) in keratinocyte and lymphoblast interphase nuclei. Exp Cell Res 272:163-175 (2002).

109. Xu C, Jiang J, Sottile V, McWhir J, Lebkowski J and Carpenter MK: Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth Stem Cells 22:972-980 (2004).

110. Zeng X, Cai J, Chen J, Luo Y, You ZB, Fotter E, Wang Y, Harvey B, Miura T, Backman C, Chen GJ, Rao MS, Freed WJ: Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 22:925-940 (2004).

111. Zhong JF, Chen Y, Marcus JS, Scherer A, Quake SR, Taylor CR, Weiner LP: A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab Chip 8:68-74 (2008).

112. Zwaka TP, Thomson JA: A germ cell origin of embryonic stem cells? Development 132:227-233 (2005).