Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona

ВАК РФ 03.02.04, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona"

На правах рукописи

Вакурин Алексей Александрович

Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитаюших на примере представителей родов Спсе1и1и.ч, Тхс/гегякга и ОсИоЮпа

03.02.04 - зоология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2014

005556068

Работа выполнена в лаборатории эволюционной зоологии и генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Картавцева Ирина Васильевна

Официальные оппоненты: Якименко Людмила Владимировна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Владивостокский государственный университет экономики и сервиса" профессор кафедры экологии и природопользования

Морева Ирина Николаевна кандидат биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН научный сотрудник лаборатории популяционной биологии рыб

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего профессионального образования "Дальневосточный федеральный университет"

г. Владивосток

Защита состоится «30» октября 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.003.03 при ФГБУН Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159. Факс: 8 (423) 2310-193. E-mail: info@biosoil.ru

Отзывы на автореферат в двух экземплярах с заверенными подписями просим направлять по адресу: 690022, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ученому секретарю диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН. Текст диссертации размещен на официальном сайте ФГБУН Биолого-почвенного института ДВО РАН - http://www.biosoil.ru

Автореферат разослан июля 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ^

кандидат биологических наук '—— Е. М. Саенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Большинство таксонов выделено по морфологическим признакам. Развитие биохимических и генетических методов анализа породило в зоологии множество новых вопросов и идей о видообразовании, неравномерности эволюции на различных уровнях организации и соответственно видовых критериях (Воронцов, 1999, 2004; Лашин и др., 2012). При формировании новых взглядов на систематику возникает вопрос о сопоставлении результатов, полученных различными методами. Нередко происходит пересмотр родственных отношений и ревизия таксономии многих групп животных. Кариологические исследования остаются актуальными, так как рассматривают организм на своем особом уровне. Кариологические характеристики являются хорошим диагностическим и, следовательно, таксономическим признаком для многих видов животных. Методы кариологического анализа применяют для распознавания близкородственных видов и видов-двойников, выявления сходства и родства видов внутри рода, а также оценки эволюции кариотипа (Matthey, 1973).

В некоторых группах млекопитающих значительную роль может играть хромосомное видообразование (Воронцов, 1999). Эволюционные преобразования хромосом могут приводить к генетической изоляции и к расхождению близких форм (Ларкин, 2007). Поэтому изучение меж- и внутривидовой хромосомной изменчивости позволяет проследить генетическую дифференциацию таксонов в процессе видообразования (Лухтанов, Кузнецова, 2009; White, 1973; Zima, 2000).

В связи с этим, нами выбрано несколько групп мелких млекопитающих, проблематика которых сочетает таксономические и цитогенетические аспекты. Эти группы активно исследуются морфологическими и молекулярно-генетическими методами, что позволяет нам провести актуальное исследование методами кариосистематики, в рамках комплексного подхода. Рассмотренные нами виды родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona имеют обширные ареалы, в том числе, на Дальнем Востоке России, где они малочисленны и недостаточно изучены в плане границ распространения, внутривидового разнообразия и цитогенетической изменчивости. Также эти виды являются носителями опасных инфекционных заболеваний человека. Поэтому изучение хромосомной изменчивости необходимо для выяснения внутривидовой структуры, которая может быть связана с природной циркуляцией различных штаммов патогеннов.

Степень разработанности темы. Хомячки надвида Cricetulus barabensis морфологически слабо дифференцируются, но имеют различную структуру кариотипов: С. barabensis 2n=20, NF=38, С. griseus 2n=22, NF=38, С. pseudogriseus 2n=24, NF=38, С. sokolovi 2n=20, NF=40 (Орлов, Малыгин, 1988; Громов, Ербаева, 1995; Картавцева, 2002а). Их таксономический статус остается дискуссионным. Результаты краниометрии показали самостоятельность С. sokolovi, остальные кариоформы отнесены к подвидам С. barabensis (Лебедев, Лисовский, 2008). По молекулярно-генетическим данным кариоформы соответствовали либо подвидам, либо близким видам (Поплавская и др., 2012а,б). Нами решено более детально

проанализировать кариотипические различия С. barabensis и С. pseudogriseus, и получить новые данные для решения вопроса об их таксономическом статусе.

Крысовидный хомячок Tscherskia triton de Winton, 1899 - одно из немногих животных, в кариотипе которого обнаружены B-хромосомы (Борисов, 1980, 2012; Картавцева и др., 1980). На территории Приморского края описаны два подвида (Костенко, 1984; Картавцева, Алексеева, 1987): T. t. albipesu T. t. nestor, которого сближают с крысовидными хомячками Китая и Корейского п-ова. Нами предпринята попытка установить цитогенетические различия подвидов, а также определить наличие B-хромосом в их кариотипах.

Виды пищух рода Ochotona Link, 1795 хорошо дифференцируются по кариотипическим характеристикам. Внутриродовая систематика пищух активно разрабатывается морфологическими, молекулярно-генетическими и биоакустическими методами (Лисовский, 2005; Формозов и др., 2006; Hoffmann, Smith, 2005; Lissovsky et al., 2007; Lanier, Olson, 2009). Однако затруднения связаны с недостатком информации по центрально-азиатским видам пищух. Другой аспект касается слабой изученности внутривидового разнообразия таких широкоареальных видов как О. hyperborea Pallas, 1811. На Дальнем Востоке цитогенетические характеристики этого вида известны из Магаданской области России (Иваницкая, 1991) и о-ва Хоккайдо Японии (Hayata, Shiraba, 1969). Наша работа направлена на получение новых данных по кариологии и изменчивости пищух, и их использование для дополнения внутриродовой системы.

Цели и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучить хромосомную изменчивость и цитогенетическую дифференциацию близких таксонов представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona. Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Исследовать кариотипы подвидов С. barabensis и вида С. pseudogriseus для выявления внутривидовой изменчивости;

2. Установить дополнительные дифференцирующие критерии видов С. barabensis и С. pseudogriseus на основе анализа распределения гетерохроматина в хромосомах;

3. Проанализировать кариотипы и выявить цитогенетические различия подвидов T. triton из Приморского края;

4. Описать кариотип О. huangensis, провести сравнительный анализ с кариотипами представителей подродов Pika и Ochotona, и использовать эти данные для дополнения внутриродовой системы пищух с уточнением границ подродов по хромосомным числам;

5. Провести цитогенетический анализ пищух Забайкальского края и юга Дальнего Востока России для обнаружения хромосомной изменчивости. Научная новизна. Впервые получены цитогенетические данные,

подтверждающие обитание С. barabensis в Новосибирской и Еврейской Автономной областях (Картавцева, Вакурин, Высочина, 2013; Вакурин и др., 2014). В результате С-окрашивания хромосом С. barabensis из различных частей ареала, впервые выявлена изменчивость окрашивания гетерохроматиновых блоков (С-блоков) на двух парах аутосом, без выраженной дифференциации между подвидами. Показана стабильность хромосомных характеристик С.

pseudogriseus из 10 локалитетов Забайкальского края. Для двух видов хомячков установлены дифференцирующие критерии кариотипов по С-исчерченности хромосом. Показано, что в кариотипах этих видов, при Робертсоновских слияниях акроцентрических аутосом, происходит потеря гетерохроматинового материала (Vakurin et al., 2011; Вакурин и др., 2014).

Впервые установлены цитогенетические характеристики и распределение С-блоков О. huangensis - циньлинской пищухи (2n=42, NF=84), выявлен гетероморфизм локализации С-блоков на 8-й паре аутосом (Vakurin et al., 2012). Впервые проведен сравнительный анализ кариотипа О. huangensis с кариотипами пищух из подродов Pika и Ochotona. Диплоидное число (42) О. huangensis расширяет значения хромосомных чисел для видов подрода Ochotona (2п=46-50, 68), что нарушает разграничение по этому показателю с подродом Pika (2п=38-42, 68). Впервые определена таксономическая принадлежность пищух Еврейской Автономной области (из заповедника «Бастак») к виду О. hyperborea - северная пищуха (Фрисман и др., 2013; Vakurin et al., 2013). Выявлена изменчивость кариотипа О. hyperborea из Амурской области по морфологии Х-хромосомы, соотношению мелких пар мета-субметацентрических и субтело-акроцентрических аутосом. Впервые в семействе Пищуховых Ochotonidae Thomas, 1897 выявлена изменчивость числа половых хромосом (у самки О. mantchurica из Забайкальского края обнаружен кариотип Х0 - с одной половой хромосомой).

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработка систематики и выявление дифференцирующих критериев близких видов направлено на анализ биоразнообразия и механизмов видообразования. Установление таксономической принадлежности пищух на Дальнем Востоке необходимо для определения их ареала, что в дальнейшем позволит строить гипотезы о путях распространения вида. Полученные данные дополняют внутриродовую систему пищух и могут быть использованы для дальнейшей ревизии. Описание кариотипа О. huangensis существенно для подтверждения видового статуса и составления диагноза. Новые сведения о хромосомной изменчивости могут быть включены в сводки по млекопитающим и атласы хромосом. Исследование таких эндемичных видов, как циньлинская пищуха, позволит установить места и условия их обитания, оценить степень антропогенного влияния, формировать охранные зоны, например, при планировании развития сельского хозяйства. Результаты нашей работы могут быть включены в курс цитогенетики биологических специальностей вузов.

Личный вклад автора. С участием автора проводили приготовление суспензий метафазных хромосом, забор материала у части крысовидных хомячков Вакурин А.А. осуществил лично. Автор готовил хромосомные препараты (более 250), проводил их окрашивание различными методами. Самостоятельно выполнил микроскопический анализ, фотографирование метафазных клеток (более 1400), обработку данных и построение кариограмм. Автором проведен анализ полученных результатов и подготовка публикаций. Дополнительные данные, полученные молекулярно-генетическими и биоакустическими методами, проанализированы при участии автора.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 6 всероссийских и региональных научных конференциях и симпозиумах: IX Съезд Териологического общества РАН (Международное совещание Териофауна России и сопредельных территорий, Москва, 1-4 февраля 2011 г.), Современные достижения в популяционной, эволюционной и экологической генетике - Modern Achievements in Population, Evolutionary and Ecological Genetics: International Symposium (MAPEEG, Владивосток, 2009, 2011 и 2013 гг.), Конференция конкурс молодых ученых БПИ ДВО РАН (Владивосток, 8-9 ноября 2012 г.) и 10-ая Дальневосточная конференция по заповедному делу (Благовещенск, 25-27 сентября 2013 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ: 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах; 1 статья в региональном научном журнале; 1 статья в сборнике; 5 работ в материалах научных конференций.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 124 страницах, содержит 6 таблиц и проиллюстрирован 16 рисунками. Список литературы включает 134 наименований, из них 56 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю - д.б.н. И.В. Картавцевой за неоценимый опыт и наставление в ходе исследования, и замечания при написании рукописи. Особая благодарность к.б.н. В.П. Кораблёву за введение в цитогенетическую науку и обучение методам. За совместные работу и публикации благодарю коллег: доктора Цзян (Куньминский институт зоологии, Китай), Т.В. Григорьеву и к.б.н. Н.А. Формозова (МГУ, Москва), к.б.н. А.А. Лисовского (Зоологический музей МГУ, Москва), д.б.н. JI.B. Фрисман и м.н.с. Л.В. Капитонову (ИКАРП ДВО РАН, Биробиджан), Н.П. Высочину (Хабаровская противочумная станция), вед. инж. В.Ю. Гуськова (БПИ ДВО РАН, Владивосток), м.н.с. Е.В. Кумакшеву (НИИЭМ имени Г.П. Сомова СО РАМН, Владивосток), А.А. Аверина (заповедник «Бастак», Биробиджан). Благодарю д.б.н. И.В. Картавцеву, к.б.н. В.П. Кораблёва, к.б.н. М.В. Павленко, к.б.н. И.Н. Шереметьеву, к.б.н. А.А. Лисовского - за предоставленный материал для исследования. Также благодарю всех сотрудников лаборатории эволюционной зоологии и генетики Биолого-почвенного института - за рабочую атмосферу, поддержку и советы при подготовке диссертационной работы.

Гранты РФФИ и ДВО. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ №: 06-04-39015, 06-04-48969а, 12-04-00662а; ДВО РАН №: 09-II-С0-06-007, 12-II-CO-06-018 и фанта «Комплексные экспедиционные исследования природной среды бассейна р. Амур в 2004-2007 гг.».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении обоснована актуальность темы исследования, сформулированы цели и задачи работы, указаны научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.

Глава 1. Структура кариотипа в фокусе проблем таксономии 1.1. Краткая характеристика объектов исследования

В разделе представлены сведения по биологии объектов исследования. Приведены данные о распространении, морфологические и физиологические особенности хомячков С. barabensis, С. pseudogriseus и Т. triton. Дана общая характеристика пищух рода Ochotona.

1.2. Цитогенетические характеристики в изучении мелких млекопитающих

1.2.1. Кариологическая изученность хомячков Cricetulus barabensis и С.

pseudogriseus

Среди хомячков рода Cricetulus Milne-Edwards, 1867 выделяют 8-10 видов (Smith et al., 2010). Изучение хромосомных наборов ряда видов показало, что различия в структуре кариотипов обусловлены перестройками Робертсоновского типа (Раджабли, Крюкова, 1973; Gamperl et al., 1976; Krai et al., 1984). Морфологически слабо различающиеся хомячки надвида Cricetulus barabensis являются интересным объектом для рассмотрения дивергенции близких форм, их таксономический статус остается дискуссионным. Существуют две точки зрения на таксономию данной группы. Одна из них предполагает существование в пределах одного вида С. barabensis нескольких подвидов (Лебедев, Лисовский, 2008; Лебедев, 2012) и их возможную гибридизацию в зонах контакта популяций (Поплавская и др., 2011, 2012а). По другой точке зрения, в эту группу входят четыре вида (Орлов, Малыгин, 1988; Малыгин и др., 1992; Громов, Ербаева, 1995; Картавцева, 2002а; Кораблёв и др., 2013), которые были выделены на основании цитогенетических различий (кариоформы): С. barabensis (2п=20, NF=38), С. griseus (2n=22, NF=38), С. pseudogriseus (2n=24, NF=38), С. sokolovi (2п=20, NF=40). Данные виды имеют аллопатрические ареалы. Краниометрический анализ показал существование пяти групп у вида С. barabensis, которые частично соответствуют кариоформам, и вида С. sokolovi (Лебедев, Лисовский, 2008).

Молекулярно-генетический анализ гена цитохрома b мтДНК и гена DBY1 Y-хромосомы показал различия между кариоформам "barabensis" и "pseudogriseus" по р-дистанции на уровне 2,3-4,1% (Поплавская и др., 2012а) - подобные различия могут характеризовать как подвиды, так и близкие виды-двойники (Bradley, Baker, 2001; Картавцев, Ли, 2006). При экспериментальной гибридизации С. barabensis и С. pseudogriseus были получены плодовитые гибриды (Поплавская и др., 2011, 20126). Однако число выводков от числа спариваний в контроле было выше, чем при гибридном спаривании. Кроме того, при обратном скрещивании гибридов потомство получено не во всех вариантах. Это может свидетельствовать о пониженной плодовитости при гибридизации.

Различий по числу хромосом и хромосомных плеч между подвидами С. barabensis из 30 локалитетов (1 в Алтайском крае, 6 в Туве, 6 в Бурятии, 10 в Забайкальском крае, 1 в Амурской области, 1 в Приморском крае и 5 в Монголии)

не описано. Географической изменчивости кариотипов у С. pseudogriseus из 31 локалитета (4 в Бурятии, 16 в Забайкальском крае и 11 в Монголии) обнаружено не было (Раджабли, Крюкова, 1973; Орлов, Исхакова, 1975; Малыгин и др., 1992; Картавцева, 2005; Кораблёв и др., 2006, 2010, 2013; Поплавская и др., 2011; Kral et al., 1984). Хромосомы хомячков были исследованы методами G-, NOR- и FISH окрашивания. При сравнении G-окраски хромосом С. barabensis, С. griseus и С. pseudogriseus было установлено, что плечи аутосом и Y-хромосомы полностью гомологичны, а различия морфологии Х-хромосом связано с перицентрической инверсией (Раджабли, Крюкова, 1973; Kral et al., 1984). В дальнейшем эти данные были подтверждены FISH анализом (Romanenko et al., 2007). В эволюции кариотипов хомячков принимали участие центрические слияния аутосом по Робертсоновскому типу. Окрашивание хромосом С. barabensis и С. pseudogriseus на наличие районов ядрышкового организатора показало, что при хромосомных перестройках локализация NOR участков не изменилась (Kral et al., 1984). Сведения по окрашиванию на структурный гетерохроматин хромосом С. barabensis и С. pseudogriseus представлены только в Atlas of mammalian chromosomes (2006) по неопубликованным данным Раджабли с соавторами. Локалитеты, откуда изучены экземпляры хомячков, не указаны. Хромосомные наборы всех трех кариоформ хорошо различаются и, хотя не имеют критических изменений, в совокупности с аллопатрическим распространением, могут свидетельствовать об эволюционной молодости этих видов-двойников.

1.2.2. Структура кариотипа и замечания по систематике Tscherskia triton

Первоописание кариотипа Tscherskia triton de Winton, 1899 с 2n=30 проведено из корейской популяции (Makino, 1951). В дальнейшем стало известно, что кариотип крысовидного хомячка может содержать добавочные хромосомы (В-хромосомы). Нормальный кариотип этого вида имеет 2п=28. Кариотипы T. triton изучены на небольшой части ареала: из трех провинций Китая - Шаньдун, Цзилинь и Шэньси (Wang et al., 1999), на Корейском полуострове (Makino, 1951; Tsuchiya, Won, 1976), в Приморском крае России из окр. г. Уссурийск и пос. Пограничный (Борисов, 1978, 1980, 2012; Борисов, Кораблёв, 1978; Картавцева и др., 1980). Хромосомы T. triton исследованы методами С-, G-, Q-, NOR-окрашивания (Борисов, Кораблёв, 1978; Wang et al., 1999). Для хромосомного набора T. triton описано наличие 1-2 мелких акроцентрических B-хромосом. Они встречаются у малого числа особей и лишь в небольшом количестве клеток. Сходство по размерам, морфологии и С-, G-, Q-окраскам B-хромосом и короткого плеча Y-хромосомы, возможно, указывает на их происхождение путем дупликации этого участка Y-хромосомы (Борисов, 1980, 2012).

С. И. Огнев отнес крысовидного хомячка к отдельному роду с описанием Tscherskia albipes Ognev, 1914 из Приморского края. Для хомячков из окр. Уссурийска (Приморский край) H. Н. Воронцов и С. И. Раджабли (1969) описали кариотип с 2п=28, что дало основание отнести их к самостоятельному виду Т. albipes. Дальнейшие исследования кариотипов крысовидных хомячков (Борисов, 1978; Картавцева и др., 1980; Tsuchiya, Won, 1976; Wang et al., 1999) и

обнаружение у этого вида B-хромосом (Борисов, 1980) показало конспецифичность T. triton и T. albipes (Картавцева и др., 1980; Борисов, 2012).

На территории Китая выделяют до пяти подвидов: T. t. triton, T. t.fuscipes, T. t. collinus, T. t. incanus и T. t. canus (Wang et al., 1999). У одного из подвидов T. t. canus описана иная структура кариотипа с 2n=24, NF=44-46 и преобладанием двуплечих хромосом, на основании чего он был выделен в самостоятельный вид Cansumys canus Allen, 1928 (Yang et al., 2003). Однако по морфологическим и молекулярным данным анализа D-петли мтДНК его рассматривают как подвид (Liao et al., 2007). На территории Приморского края России выделено два подвида: T. t. albipes Ognev, 1914 и T. t. nestor Thomas, 1907 (Костенко, 1984; Картавцева, Алексеева, 1987). B-хромосомы обнаружены в кариотипах хомячков только из популяций T. t. albipes. Нами предпринята попытка установить, связаны ли подвидовые различия с изменчивостью кариотипов и В-хромосом.

1.2.3. Внутриродовая структура и цитогенетическая характеристика рода Ochotona

В настоящее время выделяют до 30 видов пищух, объединяемых в три подрода: Pika Lacepede, 1799, Ochotona Link, 1795 и Conothoa Lyon, 1904 (Hoffmann, Smith, 2005). Описаны кариотипы 19 видов пищух. В фауну России включены 7 видов: О. alpina, О. dauurica, О. hoffmanni, О. hyperborea, О. mantchurica, О. pallasi и О. pusilla (Соколов и др., 1994; Формозов, Баклушинская, 1999, 2011; Lissovsky et al., 2008). Для сравнения, в Китае обитает 24 вида пищух (Wang, 2003). Пищухи обладают довольно четкой межвидовой дифференциацией кариотипов по числу хромосом (2п=38-68) или числу хромосомных плеч. Такая специфика помогает в решении спорных таксономических вопросов. Информация по С-, G-, NOR-окрашиванию хромосом имеется для 14 видов пищух. (Иваницкая, 1991; Формозов, Баклушинская, 1999, 2011; Stock, 1976; Tan, Bai, 1987; Capanna et al., 1991). Для пищух характерна эволюционная тенденция в увеличении двуплечих пар аутосом, уменьшении количества гетерохроматина и диплоидного числа хромосом. В настоящее время отсутствует информация по кариотипам многих центрально-азиатских видов пищух, что затрудняет построение предкового кариотипа и оценку филогенетических связей (Иваницкая, 1991).

Надвидовая система рода Ochotona окончательно не разработана. Первая надвидовая структура была основана на сходстве диплоидных чисел (Воронцов, Иваницкая, 1969, 1973). В следующих работах на основе кариологических данных, по методу кладистики, было выделено только два подрода: Ochotona и Pika (Иваницкая, 1985, 1989, 1991). С привлечением молекулярно-генетических методов систематика пищух получила новое развитие. Исследования гена цитохрома b мтДНК (Yu et al., 2000; Niu et al., 2004; Lanier, Olson, 2009) показали разделение рода Ochotona на три подрода: Pika, Ochotona и Conothoa. На основе анализа гена контрольного региона (С-регион) мтДНК была рассмотрена систематика подрода Pika и сделана попытка прояснить таксономический статус ряда форм; Ochotona sp. из Центральной Якутии, О. alpina turuchanensis с плато Путорана, Ochotona alpina ssp. из окр. пос. Едяй (Якутия) (Формозов и др., 2006).

На Дальнем Востоке России обитает один вид пищух - северная пищуха О. hyperborea. На данной территории ареал этого вида простирается от Чукотского полуострова до южных отрогов хр. Сихотэ-Алинь в Приморском крае, включает о-ва Сахалин и Хоккайдо (Япония) (Соколов и др., 1994; Лисовский, 2012). Таксономический статус и изменчивость пищух, на дальневосточной части ареала, изучены слабо. Для О. hyperborea выделяют от 5 до 12 подвидов (Формозов и др., 2006) и 3-4 биоакустические формы (Формозов, 1991; Lissovsky et al., 2007). Проникновение другого вида (О. mantchurica) в горные массивы Малого Хингана в России не исследовано.

1.3. Гетерохроматин: структура, функции и роль в изменчивости кариотипа

Изложена краткая история изучения гетерохроматина, его основные свойства, структурная организация и функции (Жимулёв, 1993, 2000; Коряков, Жимулёв, 2009; Mattel, Lucianí, 2003). Также приведены сведения о роли гетерохроматина в хромосомных перестройках, его изменчивости и применении в кариосистематике как диагностического признака (Прокофьева-Бельговская, 1986). Описано участие гетерохроматина в видообразовании и появлении репродуктивной изоляции (Ferree, Barbash, 2009; Hughes, Hawley, 2009).

1.4. Методы цитогенетических исследований

В обзорном разделе рассмотрены уровни развития кариологии и предпосылки появления методов дифференциального окрашивания хромосом. Дана характеристика методов: Q-, G-окрашивание (Casperson et al., 1969; Seabright, 1971), R-сегментация (Dutrillaux, Lejeune, 1971), С-окрашивание (Sumner, 1972), Ag-NOR (Goodpasture, Bloom, 1975). Указаны биохимические принципы взаимодействия красителей с компонентами хромосом и соответствующие варианты формирования сегментации хромосом. Также описаны различные типы клеточного материала для цитогенетических исследований: используемые напрямую и в культуре (Макгрегор, Варли, 1986).

Глава 2. Материал и методы исследования 2.1. Материал исследования

В качестве материала использовали препараты метафазных хромосом от 8 видов трех родов: род Cricetulus Milne-Edwards, 1867 - серые хомячки (2 вида), род Tscherskia Ognev, 1914 - крысовидные хомячки (1 вид) и род Ochotona Link, 1795 - пищухи (5 видов). В кариотипический анализ были включены 94 особи из 38 локалитетов семи географических регионов России и 1 локалитета Китая. Точки отлова животных указаны на карте (рис. 1а-в). Всего исследовано 278 хромосомных препаратов. Проанализировано более 1400 метафазных клеток. Построены кариограммы, по крайней мере, от одной особи на локалитет.

Cricetulus barabensis Pallas, 1773 (n=34):

С. b. barabensis Новосибирская область - 1 локалитет {2SS, 19) С. b. tuvinicus Республика Бурятия - 1 локалитет (2<33) С. barabensis ssp. Забайкальский край - 6 локалитетов (6<Sâ, 399) С. b. xinganensis Амурская область - 4 локалитета (4<Sâ, 999) С. barabensis ssp. Еврейская Автономная область - 2 локалитета (399) С. b. ferrugineus Приморский край - 3 локалитета (3ö'ö', 19)

С. pseudogriseus Orlov et Iskhakova, 1975 (n=25): Забайкальский край - 10 локалитетов 499) и потомство виварного разведения (6öö, 6$ $).

Tscherskia triton de Winton, 1899 (n=25): Приморский край - 6 локалитетов (Sö'cj , 17$$).

Ochotona alpina Pallas, 1773 Красноярский край; O. dauurica Pallas, 1776 (leí) и О. mantchurica Thomas, 1909 (1$) Забайкальский край; О. hyperborea Pallas, 1811 (lcî) Амурская обл. и (1¿\ 4$$) Еврейская Автономная обл.; О. huangensis Matschie, 1908 (leí) Китай, пр. Шэньси (Shaanxi), хр. Циньлин (Qinling).

Материал предоставлен автору сотрудниками лаборатории эволюционной зоологии и генетики ФГБУН Биолого-почвенного института ДВО РАН: д.б.н. Картавцевой И.В., к.б.н. Кораблёвым В.П., к.б.н. Павленко М.В., к.б.н. Шереметьевой И.Н. по сборам 2003-2013 гг. и к.б.н. Лисовским A.A. (Зоомузей МГУ, г. Москва).

2.2. Методы цитогенетического анализа

Метафазные хромосомы получали методом стимуляции деления клеток красного костного мозга раствором пекарских дрожжей (Lee, Elder, 1980). Хромосомные препараты готовили по общепринятой методике (Ford, Hamerton, 1956). Препараты окрашивали в течение 10-15 минут 5 % раствором красителя Гимза (азур-эозин по Романовскому). При данном окрашивании анализировали число и морфологию хромосом. Для выявления структурного гетерохроматина и ядрышкообразующих районов (NOR) использовали методы С-окрашивания (Sumner, 1972) и Ag-NOR-окрашивания (Howell, Black, 1980), соответственно.

Препараты анализировали на световом микроскопе AxioSkop40. Фотоснимки получены на цифровой камере AxioCamHR при помощи программы AXIOVISION 4.7 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Германия). Работа выполнена на оборудовании центра коллективного пользования «Биотехнология и генетическая инженерия» ФГБУН Биолого-почвенного института ДВО РАН (г. Владивосток). Кариограммы составляли по номенклатуре В.Н. Орлова. Хромосомы оценивали визуально без промеров, по относительному соотношению плеч (Орлов, 1974).

Дополнительные методы использованы для подтверждения наших данных. Полученные по ним результаты являются частью совместной работы с нашими коллегами и соавторами. Идентификация пищухи с хр. Циньлин проведена китайскими коллегами по морфологическим признакам. Для подтверждения видовой принадлежности этого экземпляра (GenBank NCBI № JN645147) T.B.

Григорьевой (МГУ, Москва) использован молекулярный анализ гена цитохрома b мтДНК (Vakurin et al., 2012). Запись криков пищух из заповедника «Бастак» проведена сотрудником заповедника A.A. Авериным и проанализирована A.A. Лисовским (Зоомузей МГУ, Москва) (Фрисман и др., 2013; Vakurin et al., 2013).

Рис. 1. Карта точек отлова исследованных экземпляров животных: а -хомячки • Cricetulus barabensis, О С. pseudogriseus; б - пищухи ■ Ochotona alpina. О. dauurica, О. mantchurica, О. hyperborea, □ О. huangensis', в - хомячки ▲ Ts cher skia triton.

МОНГОЛИЯ

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Степень цитогенетических различий и уровень дивергенции молодых видов на примере хомячков СпсеШШв ЬагаЬешк и С. pseudogriseus

Для выявления возможной внутривидовой изменчивости кариотипированы барабинские хомячки пяти подвидов: С. Ь. ЬагаЬет^я, С. Ь. 1тт1ст, С. ЬагаЬети ввр., С. Ь. х/и^аяеит, С. Ь. ferrugineus. Хомячки разделены на подвиды по географическим регионам согласно представлениям Лебедева и Лисовского (2008) на внутривидовую структуру С. ЬагаЬеИ5И.

3.1.1. Рутинное окрашивание хромосом С. ЬагаЬепэ'к

Все исследованные особи С. ЬагаЬеп818 имели кариотип 2п=20, №=38 (рис. 2а). Во всех локалитетах кариотипы подвидов С. багабега« стабильны по диплоидному числу и морфологии хромосом. Впервые для барабинского хомячка получены цитогенетические данные из Новосибирской и Еврейской Автономной областей (Картавцева, Вакурин, Высочина, 2013: Вакурин и др., 2014).

((!Г XI

(18 хх л» I. АЛ

1 2 3 45 б 7 8 9 X X

ИII п и п II «I.... >1

1 2 3 45 б 7 8 9 X У

Рис. 2. Кариотип С. ЪагаЬетгз". а - рутинное окрашивание (самка из окр. пос. Пограничный, Приморский край); б - С-окрашивание (самец из окр. пос. Ошурково, Республика Бурятия). Ваг = 5 цт (из Вакурин и др., 2014).

3.1.2. С-окрашивание хромосом С. ЬагаЬетгв

В кариотипе С. ЬагаЬет15 выявлены как изменчивые, так и стабильные блоки гетерохроматина (С-блоки). На самой крупной паре аутосом № 1 расположены два интеркалярных блока: ¡р в коротком плече и ¡ц в длинном плече. Пара № 5 и пара № 7 мета-субметацентриков имеют центромерные С-блоки. У акроцентрической пары № 6 обнаружен слабо окрашенный блок в прицентромерном районе и редко проявляющийся интеркалярный блок. Одно плечо пары № 8 всегда интенсивно окрашено, а другое плечо одного из гомологов окрашивается либо интенсивно, либо менее ярко. На самой мелкой паре № 9 прицентромерный гетерохроматин занимает большую часть обоих плеч. X-

хромосома имеет гетерохроматиновое короткое плечо и примерно 1/3 длинного плеча. У-хромосома полностью состоит из гетерохроматина, на некоторых метафазных пластинках короткое плечо может быть менее интенсивно окрашено (рис. 26) (Вакурин и др., 2014).

На первой и второй парах аутосом С. ЬагаЬет1э наблюдается изменчивость интенсивности окрашивания блоков гетерохроматина. Первая пара аутосом имеет ярко окрашенные интеркалярные С-блоки (¡р и iq) у трех особей (Новосибирской области - 1, Республики Бурятия - 1, Забайкальского края - 1) и четырех особей из Амурской области. У остальных хомячков эти С-блоки слабо окрашены или отсутствуют в локалитетах № 3 (Сохондинский заповедник, Забайкальский край) и № 15 (пос. Пограничный, Приморский край) (табл.) (Вакурин и др., 2014).

Интеркалярный гетерохроматин (блоки ¡р и iq) второй пары аутосом выявляется слабо или отсутствует у большинства особей. Наиболее часто и интенсивно теломерный блок (Ц) в длинном плече окрашивается на второй паре у особей из Амурской области и одного хомячка из Республики Бурятия (рис. 3, табл.) (Вакурин и др., 2014).

НВ БР ЗБ1 ЗБ2 АМ ЕВ ЛР

гШ

0597 0637 1106 1691 0572 2545 12-79

Рис. 3. С-окраска 2-й пары аутосом С. barabensis из различных географических регионов: HB - Новосибирская обл., БР - Республика Бурятия, ЗБ1 - Забайкальский кр., ЗБ2 - Сохондинский заповедник, AM - Амурская обл., ЕВ - Еврейская Автономная обл., ПР - Приморский кр. - С-блоки. Под хромосомами - зоологические номера животных (из Вакурин и др., 2014).

В более объемном материале из Амурской области присутствуют все варианты интенсивности окрашивания, а некоторые особи этой популяции характеризуются наиболее интенсивной окраской С-блоков ip, iq и tq (табл.). Четкой географической дифференциации по локализации гетерохроматина между подвидами С. barabensis пока не наблюдается (Вакурин и др., 2014). Остальные пары аутосом (№№ 3-9) и половые хромосомы всех особей С. barabensis имеют стабильную картину С-исчерченности (рис. 26) (Вакурин и др., 2014).

3.1.3. Рутинное окрашивание хромосом С. pseudogriseus

У всех изученных нами особей С. pseudogriseus хромосомные наборы имели 2n=24, NF=38 (рис. 4а) (Вакурин и др., 2014) и не отличались от ранее описанных в литературе (Орлов, Исхакова, 1975; Kral et ai., 1984; Малыгин и др., 1992; Поплавская и др., 2012а; Кораблёв и др., 2010, 2013).

Таблица. Интенсивность окрашивания блоков гетерохроматина на 1-й и 2-й парах аутосом барабинских хомячков С. barabensis (из Вакурин и др., 2014).

Подвид и географический регион № Зоологический номер Пол Пара аутосом \ Интенсивность окраски С-блоков

1 2

Ф ¡q ¡Р iq tq

С. Ь. ЬагиЬтшъ Новосибирская область 1 0597 самец ++ ++ + + -

0598 самец + + - - -

0603 самка + + - - -

С. Ь. ШуШсих Республика Бурятия 2 2004 самец + + - - -

0637 самец ++ ++ + +++ +++

С. ЬагаЬеп515 ввр. Забайкальский край 3 1686 самка - - - - -

1687 самец - - - - -

1691 самка - - - - -

4 0801 самка + + + + +

7 1106 самец ++ ++ + + +

8 09115 самец + + + + -

С. Ъ. х1п%апе1К1$ Амурская область 11 0571 самка +++ + + + +

0802 самка + + + + +

0803 самец + + - - -

0904 самец + + + + +

12 0572 самец +++ ++ + + +++

0573 самка ++ ++ + + ++

0677 самка + + - - -

0823 самка ++ ++ + + ++

С. ЬагаЬепяк ввр. Еврейская Автономная область 13 2510 самка + + - - -

14 2544 самка + + - - -

2545 самка + + - + -

С. Ь. ferrugineus Приморский край 15 12-79 самка - - - - -

17-99 самец - - - - -

Примечание: № — номер локалитета; С-блоки: ¡р — верхний интеркалярный; ¡ц — нижний интеркалярный; гя - нижний теломерный; +++- ярко окрашенный; ++ -средне окрашенный; + —слабо окрашенный; - - практически отсутствует.

3.1.4. С-окрашивание хромосом С. pseudogriseus и сравнительный анализ кариотипов С. barabensis и С. pseudogriseus

У 12 исследованных особей С. pseudogriseus из 6 локалитетов №№ 18-20, 2325 достоверно выявляется одинаковое количество блоков гетерохроматина (Вакурин и др., 2014). Первая пара аутосом несет два интеркалярных блока на коротком (ip) и длинном плечах (iq), по-видимому, идентичных блокам на той же паре аутосом С. barabensis. На паре № 2 выявлены два интеркалярных С-блока (ip и iq). Две пары (№ 3 и № 9) мета-субметацентриков и пять пар (№№ 4-8) акроцентрическов имеют прицентромерные С-блоки. У пары № 10 темноокрашены оба плеча, иногда одно плечо одного гомолога менее ярко окрашено. Пара аутосом № 11 полностью гетерохроматиновая. Длинное плечо X-хромосомы целиком состоит из гетерохроматина, при этом центромера не

окрашивается. У-хромосома С-положительна, на некоторых метафазах короткое плечо менее интенсивно окрашено (рис. 46) (Вакурин и др., 2014).

IIII П II н и »1 м х« «I .« (|

3 4 5 6 7 S 9 10 11 X Y

II И И «I II »...О

3 4 5 б 7 89 10 И XX

Рис. 4. Кариотип С. pseudogriseus: а - рутинное окрашивание (самец из окр. с. Ундино-Поселье, Забайкальский край); б - С-окрашивание (самка виварного потомства). Ваг = 5 цт (из Вакурин и др., 2014).

Сравнительный анализ С-окрашенных хромосом (рис. 5) показывает, что кариотип С. pseudogriseus отличается от кариотипа С. barabensis наличием центромерного гетерохроматина на четырех парах акроцентрических аутосом. В результате слияния этих пар произошла потеря гетерохроматинового материала, и образовались две пары мета-субметацентриков С. barabensis без гетерохроматиновых блоков. Кроме того, у С. pseudogriseus на второй паре аутосом не обнаружено теломерного гетерохроматина. Остальные пары аутосом С. pseudogriseus и С. barabensis имеют сходную С-окраску (рис. 5). Перицентрическая инверсия Х-хромосом хомячков произошла с разрывом в районе центромеры и примерно нижней трети гетерохроматинового плеча X-хромосомы С. pseudogriseus (Вакурин и др., 2014).

Среди исследованных нами хомячков из природных популяций гибридов по хромосомам не обнаружено (Вакурин и др., 2014). Однако мы придерживаемся мнения, что хомячки С. barabensis и С. pseudogriseus являются, возможно, молодыми и близкими, но самостоятельными видами. Описанные нами различия по распределению гетерохроматина в кариотипах барабинских и забайкальских хомячков не выглядят критическими. Но эволюция кариотипов хомячков рода Cricetulus происходила при слиянии хромосом по Робертсоновскому типу и других перестройках (Раджабли, Крюкова, 1973; Kral et al., 1984; Romanenko et al., 2007), которыми нельзя пренебречь для обоснованного заключения. Наряду с этим, изменения гетерохроматина могли оказать влияние на стабильность генома и участвовать в формировании механизмов изоляции (Вакурин и др., 2014).

Для более четкого определения внутри- и межвидовой дифференциации между С. barabensis и С. pseudogriseus необходимо дальнейшее комплексное исследование хомячков. На наш взгляд важно изучение путей расселения, поведенческих особенностей этих видов, анатаз причин репродуктивной изоляции, в том числе и этологических. Следует продолжить работы по гибридизации и молекулярные исследования, прежде всего ядерных генов.

С. barabensis (2п=20)

S

С. pseudogriseus (2п=24)

Si

X Y 1

îl

3 5 9 10 11 X Рис. 5. Хромосомные перестройки в кариотипах С. barabensis (а) и С. pseudogriseus (б). С-блоки: ip - верхний интеркалярный; iq - нижний интеркалярный; tq - нижний теломерный; с - центромерный; * - пары аутосом, состоящие из гетерохроматина. •*- - соответствия аутосомных пар и перицентрическая инверсия Х-хромосомы С. pseudogriseus. + - слияния аутосом.

3.2. Единообразие кариотипов у подвидов Tscherskia triton из изученных локалитетов Приморского края

Все особи T. triton имели кариотип с 2n=28, NF=34 (рис. 6). Все акроцентрические пары аутосом имеют крупные прицентромерные блоки гетерохроматина, которые разделяются на два участка: первый - менее ярко окрашенный на коротком микроплече и части центромеры; второй - более темный и крупный, переходящий на длинное плечо. На двух мелких парах аутосом выявлены центромерные С-блоки. На Х-хромосомах ярко окрашены короткое и около 1/3 длинного плеча, а также более темный центроменый С-блок. Y-хромосома имеет прицентромерный С-блок, занимающий часть короткого плеча. Длинное плечо Y-хромосомы окрашено ярче эухроматиновых участков.

6А II 0« H II H

АД le «к м

я * * «

1

13 X Y

Рис. 6. Кариотип крысовидного хомячка Tscherskia triton - рутинное окрашивание (самец из окр. с. Новониколаевка, Приморский край). Ваг = 5 цт.

В кариотипах исследованных T. triton нами не обнаружено В-хромосом. По литературным данным, лишь у небольшого числа хомячков в кариотипах присутствуют В-хромосомы (Борисов, 1978, 1980, 2012; Картавцева и др., 1980). Добавочные хромосомы также обнаружены у T. triton из популяций Южной

Кореи (2n=28+2B) (Makino, 1951) и провинции Шаньдун Китая (2п=28+1В) (Wang et al., 1999). Возможно, новообразование В-хромосом происходит при неблагоприятных условиях и критических изменениях окружающей среды. В частности, их появление может индуцироваться инфекционными заболеваниями, как это предполагается для некоторых морфотипов В-хромосом восточноазиатской мыши Apodemus peninsulae Thomas, 1906 (Kartavtseva, Roslik, 2004). В случае T. triton неизвестно, может ли возникновение В-хромосом быть реакцией на вирусную инфекцию, срабатывания механизма защиты генома и удаления вирусных частиц или процессом сверхрепликации вирусного генома, «задевающего» соседние участки генов хозяина. Поэтому наблюдение добавочных хромосом возможно после пика эпидемии и выживания адаптированных особей, но при низкой численности малый процент особей, имеющих В-хромосомы, может вовсе не обнаруживаться. Исследованные особи из популяций подвидов T. triton albipes и T. triton nestor на территории Приморского края не имеют цитогенетических различий. Изменчивости кариотипов и В-хромосом нами не обнаружено. Таким образом, установить подвидовую принадлежность или подвидовые различия, по кариотипическим характеристикам, не удалось.

3.3. Кариологические особенности пищух и дополнение внутриродовой системы рода Ochotona

3.3.1. Первоописание кариотипа О. huangensis и уточнение цитогенетических границ между подродами Pika и Ochotona

3.3.1.1. Цитогенетическое описание пищухи О. huangensis

О. huangensis - это эндемичный вид территории Китая, ранее считался подвидом О. thibetana Milne-Edwards, 1871. Независимость таксона О. huangensis была обоснована по результатам молекулярных исследований (Yu et al., 2000; Niu et al., 2004). Для проверки видовой принадлежности нашего образца использован анализ гена цитохрома b мтДНК. Как и ожидалось, последовательность нашего образца (GenBank NCBI № JN645147) сходна с последовательностью экземпляра из ГенБанка (Yu et al., 2000), указанного как О. huangensis (Vakurin et al.. 2012).

Диплоидное число хромосом (2п) О. huangensis равно 42, NF=84 (NFa=80). Морфологически выделено две группы аутосом (рис. 7а). Первая группа состоит из 15 пар (3 крупных, 8 средних и 4 мелких) мета-субметацентрических (M-Sm) хромосом. Вторая группа содержит 5 пар субтелоцентрических (St) хромосом. X-хромосома — средний субметацентрик, Y-хромосома - мелкий акроцентрик (рис. 7а) (Вакурин, Кораблёв, 2011; Korablev et al., 2009; Vakurin et al., 2012).

На всех аутосомах О. huangensis выявлены прицентромерные гетерохроматиновые участки, примерно одинакового размера (рис. 8а). Для 8-й пары аутосом обнаружен гетероморфизм по локализации блоков гетерохроматина (рис. 8в). Для пищух наличие интеркалярного гетерохроматина не характерно, подобный гетероморфизм также не описан. Х-хромосома имеет только

прицентромерный блок гетерохроматина. На Y-хромосоме гетерохроматиновый участок занимает 2/3 длинного плеча (рис. 8а) (Vakurin et al., 2012).

3.3.1.2. Сравнительный анализ кариотипов О. huangensis и О. alpina

В кариотипе О. alpina 2n=42, NF от 70 до 78, так как затруднено различение мелких пар субтело- и акроцетрических аутосом. По литературным данным, прицентромерные С-блоки расположены на 6 парах субметацентрических и 5 парах субтелоцентрических аутосом О. alpina (Иваницкая, 1991). Кариотипы О. huangensis и О. alpina из подрода Pika сходны по диплоидному числу хромосом (2п=42), но отличаются по NF и распределению гетерохроматина, а также в кариотипе О. huangensis нет мелких пар субтело-акроцентрических аутосом.

M-Sin и 1 2 Kit 3 К» 4 а 5 KB 6 хк 7 а 8

*л А* кх х х X к * я • Я

9 10 11 12 13 14 15

« И йй М ЯА ъп Ü.

16 17 18 19 20 X Y

M-Sm п i ** 8 п 2 Л* 9 п 3 ■ А 10 XX 4 XX 5 XI 6 X X 7 б 1—1

St-Ac (IЙ и йЛ ЛА 12 13 А» 14 дл 15 АЛ 16 * » 17

АЛ 18 АЛ 19 * #• 20 Л А 21 А Д 22 * л 23 * А 24 JÍ. X Y

Рис. 7. Кариотипы Ochotona huangensis (а) и О. dauurica (б) - рутинное окрашивание. Ваг = 5 цш (из Vakurin et al., 2012).

3.3.1.3. Сравнительный анализ кариотипов О. huangensis и О. dauurica

Даурскую пищуху, как и О. huangensis, относят к подроду Ochotona (Hoffmann, Smith, 2005). Кариотип О. dauurica содержит 50 хромосом, NF от 80 до 86 (рис. 76) (Vakurin et al., 2012). На всех аутосомах О. dauurica окрашиваются крупные, прицентромерные С-блоки. Гетерохроматиновые короткие плечи имеют 10-я и 15-я - 22-я пары аутосом. Последние две мелкие пары аутосом (23-я и 24-я) полностью состоят из гетерохроматина. Прицентромерный С-блок Х-хромосомы занимает треть длинного плеча. Гетерохроматиновая структура Y-хромосомы, по сравнению с литературными данными (Иваницкая, 1991), не выявлена (рис. 86) (Vakurin et al., 2012). Распределение гетерохроматина у О. dauurica из

Забайкальского края (окр. станции Армаготуй) и Монголии (Селенгинский аймак, окр. Шамар) (Иваницкая, 1991) несколько отличается от исследованной нами особи из Забайкальского края (окр. с. Цаган Олуй) (Уакипп й а1., 2012).

У циньлинской и даурской пищух более близкие значения № за счет крупных субтелоцентриков. Кариотипы обоих видов имеют прицентромерные С-блоки на всех аутосомах, но у даурской пищухи они более крупные (Уакипп й а1., 2012). При сравнении общей картины С-исчерченности хромосом О. с1аииг1са и О. Ниа^ет18 подтверждается тенденция уменьшения количества гетерохроматина у пищух - от видов с большим числом хромосом к видам с меньшим числом (Баклушинская, Формозов, 2000; Формозов и др., 2004).

Ц

I 2

If II

9 10

16 17

f • § t

1 2

• С | «

8 9

ti и

11 12

* • • •

is 19

Рис. 8. Кариотипы О. huangensis (а) и О. dauurica (б) - С-окрашивание: -интеркалярные С-блоки, * - аутосомы, состоящие из гетерохроматина. Bar=5 щп. Схема локализации С-блоков на 8-й паре аутосом О. huangensis (в): 1 - первый гомолог, II и III - второй гомолог в двух вариантах (из Vakurin et al., 2012).

По молекулярным данным (Yu et al., 2000; Формозов и др., 2003) пищух рода Ochotona разделяют на три подрода: Pika, Ochotona и Conothoa. Н. А. Формозов с соавторами (2003) предположили наличие уровня варьирования диплоидных чисел хромосом для каждого подрода пищух: подрод Pika - 38-42 хромосомы, подрод Ochotona - 46-50 хромосом, подрод Conothoa - 60-62 хромосомы. При этом в каждом подроде присутствуют виды с 2п=68, такой хромосомный набор считается плезиоморфным. В настоящее время О. huangensis (2п=42) относят к подроду Ochotona (Hoffmann, Smith, 2005). Если точка зрения Хоффманна и Смита верна, то наши данные расширяют значения диплоидных чисел хромосом

1 ' I! § » * I f i »1 1

3 4 5 6 7 8

? л Ч t 4 t « * « * a

11 12 13 14 15

< 4 1 "i f t К

18 19 20 x y 1 I

f | f $ * * • • * ft 1—1

3 4 5 6 7

• * 10 6

f * » • * » • f ♦ •

13 14 15 16 17

» • Ч » • * * • • * Щ • 1

20 21 22 23 24 x y

ш

i i гш

:

для подрода Ochotona. В этом случае нарушается разграничение по этому показателю с подродом Pika. Таким образом, О. huangensis дивергировал от основной группы видов подрода Ochotona по основным кариотипическим характеристикам (2n, NF), что согласуется с данными по изучению мтДНК (Yu et al., 2000; Niu et al., 2004). К настоящему моменту не исследованы кариотипы ещё восьми видов из подрода Conothoa и трёх видов из подрода Ochotona. Не исключено, что новые цитогенетические данные могут изменить границы по диплоидным числам между всеми подродами. Таким образом, гипотеза о построении внутриродовой кариологической системы рода Ochotona по значению 2п (Формозов и др., 2003) не подтверждается (Vakurin et al., 2012).

3.3.2. Диагностика пищух О. hyperborea государственного заповедника «Бастак» с использованием цитогенетических методов

На территории Дальнего Востока России картина распространения пищух достаточна сложна. Один из наиболее распространенных видов - северная пищуха О. hyperborea Pallas, 1811. Другой близкий вид - маньчжурская пищуха О. mantchurica Thomas, 1909 обитает в междуречье Шилки и Аргуни Забайкальского края России, а также на хребтах Большой Хинган и Малый Хинган в Китае. Вероятная симпатрия этих двух видов на левобережье р. Шилка не подтверждена (Формозов, Баклушинская, 2011). Таким образом, оба вида, разделенные рекой Амур, могут образовывать зону симпатрии на юге Дальнего Востока России, в частности на территории заповедника «Бастак» в Еврейской Автономной области. Таксономическая принадлежность пищух на этой территории до наших исследований не была определена.

M-Sm | If 1 n 2 и n 3 4 П XI tx 5 6 7 l l X X S 9 1 X 10 a я « il

St-Ac | У 12 ¿à 13 46 14 15 16 17 18 19 i. X Y

M-Sm j S! i S9 2 fil SI 3 4 5 6 7 л л * m 8 9 • Л 10 б Il • • » » 11 12 13

St-Ac | ЯК 14 О и 15 * « 16 4 • » « • » 17 18 19 * * |_| X Y 1 1

M-Sm | I! i u 2 НИ 3 4 Il II«! 5 6 7 • • «a 8 9 10 • • B 11

St-Ac | il 12 II 13 H 14 • » «1 • • 15 16 17 • О • • 18 19 A X

Рис. 9. Кариотипы О. ЬурегЬогеа с Буреинского хр., заповедник «Бастак» (а), О. ЬурегЬогеа с хр. Соктахан, Амурская область (б) и О. таШсЬигка с правого берега р. Шилка, Забайкальский край (в) - рутинное окрашивание. Ваг = 5 цт.

Для установления видовой принадлежности кариотипированы 5 особей пищух (рис. 1 б). Кариотипы всех особей содержали 40 хромосом, № от 70 до 76 в зависимости от подсчета плеч на мелких парах. Выделено две группы аутосом: 11 пар мета-субметацентрических (М-8т) и 8 пар субтело- и акроцентрических (81:-Ас). Х-хромосома субтелоцентрическая средних размеров. У-хромосома мелкий акроцентрик (рис. 9а) (Фрисман и др., 2013; Уакипп е1 ей., 2013).

При Ag-NOR окрашивании ядрышкообразующие районы локализуются на двух парах мелких мета-субметацентриков, в прицентромерных районах одной пары средних мета-субметацентриков и одной пары средних субтелоцентриков (рис. 10). На этой паре субтелоцентриков блок выявляется на одном гомологе с разной частотой у разных особей. В целом на 66 просмотренных пластинок этот блок выявляется не более чем в 19,6%. Е.Ю. Иваницкой (1985) описаны ТМСЖ-блоки О. курегЬогеа курегЬогеа (Чукотка) на двух парах мелких субтелоцентриков. Наши данные совпадают с данными по 1Ч(Ж-окраске О. курегЬогеа с плато Путорана, Хараелахских гор в Сибири и окрестностей г. Читы в Забайкалье (Формозов и др., 1999). В данной работе не указана стабильность или частота выявления МЖ-блока на паре субтелоцентриков.

Рис. 10. Метафазные пластинки О. курегЬогеа из заповедника «Бастак» (Буреинский хребет) - А§-ЫОЯ окрашивание. Стрелками указаны МСЖ-блоки (ядрышкообразующие районы).

На Дальнем Востоке России цитогенетическое исследование О. курегЬогеа известно только из Магаданской области (Воронцов, Иваницкая, 1973; Иваницкая, 1991). Для сопоставления кариотипов пищух «Бастака» с кариотипом северной пищухи, в анализ включен 1 самец О. курегЬогеа из Амурской области. В кариотипе этого экземпляра 40 хромосом: 13 пар мета-субметацентрических аутосом (М-8т) и 6 пар субтело- и акроцентрических аутосом (81-Ас). X-хромосома субмета-субтелоцентрическая средних размеров. У-хромосома мелкий акроцентрик (рис. 96). Кариотип особи из Амурской области отличается от типичного кариотипа О. курегЬогеа и пищух «Бастака» соотношением мелких мета-субметацентриков и субтело-акроцентриков. По литературным данным (Воронцов, Иваницкая, 1973; Иваницкая, 1991) у северных пищух, как и у пищух «Бастака», 4 пары М-вш и 5 пар Б^Ас мелких аутосом. У пищухи из Амурской области 6 пар М-Бт и 3 пары ЗЬАс, также сложно точно установить морфологию

* 1 $ « * ....

А

Х-хромосомы. Географической изменчивости кариотипов О. hyperborea не описано (Hayata, Shimba, 1969; Воронцов, Иваницкая, 1973; Иваницкая, 1991; Формозов и др., 1999). При отсутствии статистических данных невозможно установить насколько данная изменчивость зависит от спирализации хромосом.

По морфологии и размерам хромосом кариотип пищух из заповедника «Бастак» соответствует кариотипу как северной пищухи О. hyperborea, так и маньчжурской О. mantchurica. Недавно описанный кариотип маньчжурской пищухи О. mantchurica имеет такое же диплоидное число (2п=40) и сходную морфологию аутосом как О. hyperborea (Формозов, Баклушинская, 2011). Авторы указывают, что значимых различий кариотипов по С- и Ag-NOR окрашиванию между двумя видами не было обнаружено. Исходя из опубликованных данных, можем предположить, что кариотип О. mantchurica отличается только более субметацентрической Х-хромосомой. Нами изучен кариотип О. mantchurica с правого берега р. Шилка: 2п=39, морфология и размеры аутосом сходны с описанными ранее для вида (Формозов, Баклушинская, 2011). У данной самки выявлена только одна половая Х-хромосома (рис. 9в). Элиминация одной X-хромосомы и сохранение кариотипа Х0 нередкое явление для животных (Amleh et al., 2013), но в семействе Пищуховых Ochotonidae подобное обнаружено впервые.

Наши выводы о видовой принадлежности пищух из заповедника «Бастак» согласуются с результатами по другим методам. По данным молекулярного анализа субъединицы I цитохром с оксидазы (COI) мтДНК (проведено Лисовским А.А., Зоомузей МГУ, Москва) пищухи «Бастака» (2 экз.) и О. hyperborea (4 экз.) с хребтов Соктахан и Джаки-Унахта-Якбыяна (Амурская область, Россия) отличаются по р-дистанции на 0.5-1.2% (Фрисман и др., 2013; Vakurin et al., 2013). По данным биоакустического анализа пищухи заповедника «Бастак» схожи с О. hyperborea хребтов Тукурингра, Соктахан, Сихотэ-Алинь и острова Сахалин. Также в репертуаре пищух обследованной колонии выявлены характерные только для О. hyperborea глубоко модулированные по частоте элементы песни (Лисовский, 2005; Фрисман и др., 2013; Vakurin et al., 2013).

Кариотипическая диагностика и результаты других методов позволяют нам заключить, что на территории заповедника «Бастак» обитает вид - северная пищуха О. hyperborea (Фрисман и др., 2013; Vakurin et al., 2013). Единственный ли это вид рода Ochotona, представленный в заповеднике, Еврейской Автономной области и юге Дальнего Востока России, может показать дальнейшая ревизия и диагностика пищух по генетическим и биоакустическим характеристикам.

Выводы

1. Изменчивость кариотипов у шести подвидов Cricetulus barabensis по диплоидному числу и морфологии хромосом (2n=20, NF=38) не обнаружена. На двух парах аутосом выявлена изменчивость интенсивности окрашивания С-блоков гетерохроматина, без выраженной дифференциации между подвидами. Хомячки Cricetulus pseudogriseus имеют стабильные кариотипы по числу и локализации С-блоков в хромосомах.

2. Дополнительным дифференцирующим критерием видов Cricetulus barabensis и Cricetulus pseudogriseus является С-исчерченность хромосом. Эти данные свидетельствуют, что в эволюции кариотипов этих видов Робертсоновские слияния акроцентрических аутосом происходили с потерей гетерохроматинового материала.

3. Крысовидные хомячки из популяций подвидов Tscherskia triton albipes и T. triton nestor не имеют цитогенетических различий (2n=28, NF=34, В-хромосом не обнаружено). Подвидовая принадлежность и дифференциация, по данным характеристикам, не установлены.

4. Впервые установлены цитогенетические характеристики циньлинской пищухи Ochotona huangensis из Китая (2n=42, NF=84). Кариотипы О. huangensis из подрода Ochotona и О. alpina из подрода Pika сходны по диплоидному числу хромосом (2п=42), что нарушает разграничение между подродами. Таким образом, гипотеза о построении внутриродовой кариологической системы рода Ochotona только по значению 2п не подтверждается.

5. Кариотипы Ochotona huangensis (NF=84) и Ochotona dauurica (2n=50, NF=80-86) из подрода Ochotona имеют близкие значения NF, оба вида имеют прицентромерные С-блоки на всех аутосомах. Общая картина С-исчерченности хромосом О. dauurica и О. huangensis подтверждает тенденцию уменьшения количества гетерохроматина у пищух - от высокохромосомных к низкохромосомным видам.

6. Кариотипы пищух из заповедника «Бастак» (Еврейская Автономная область) соответствуют Ochotona hyperborea или Ochotona mantchurica. Привлечение молекулярно-генетических и акустических данных помогло отнести этих пищух к виду О. hyperborea - северная пищуха.

7. У пищухи О. hyperborea из Амурской области выявлена изменчивость по морфологии Х-хромосомы и соотношению мелких пар мета-субметацентрических и субтело-акроцентрических аутосом. У самки О. mantchurica из Забайкальского края обнаружен кариотип ХО - с одной половой хромосомой, что впервые свидетельствует об изменчивости числа половых хромосом в семействе Пищуховых Ochotonidae.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1. Вакурин, A.A. Особенности цитогенетической дифференциации хомячков Cricetulus barabensis и С. pseudogriseus (Rodentia, Cricetidae) / A.A. Вакурин, И.В. Картавцева, В.П. Кораблёв, М.В. Павленко // Зоологический журнал. - 2014. - Т. 95,-№7.-С. 877-886.

2. Картавцева, И.В. К уточнению таксономического положения северной пищухи Ochotona hyperborea Сихотэ-Алиня / И.В. Картавцева, И.Н. Шереметьева, В.Ю. Гуськов, A.A. Вакурин, Е.В. Кумакшева, JI.B. Фрисман // Вестник ДВО РАН. - 2014. - № 2. - С. 79-85.

3. Vakurin, A.A. The chromosomes of Tsing-Ling pika, Ochotona huangensis Matschie, 1908 (Lagomorpha: Ochotonidae) / A.A. Vakurin, V.P. Korablev, Jiang Xue-Long, T.V. Grigor'eva // Comparative cytogenetics. - 2012. - Vol. 6. - № 4. - P. 347358. doi: 10.3897/CompCytogen.v6i4.3183.

Статьи, опубликованные в региональных научных журналах и сборниках

4. Картавцева, И.В. Хромосомные исследования барабинского хомячка (Cricetulus barabensis) на территории Еврейской Автономной области / И.В. Картавцева, А.А. Вакурин, Н.П. Высочина // Региональные проблемы. - 2013. - Т. 16.-№ 1.-С. 62-65.

5. Фрисман, J1.B. Идентификация видов серых полевок и пищухи в заповеднике "Бастак" / J1.B. Фрисман, И.В. Картавцева, А.А. Лисовский, И.Н. Шереметьева, А.А. Вакурин, Л.В. Капитонова, А.А. Аверин // Материалы 10-ой Дальневосточной конференции по заповедному делу. Сборник статей. - 2013. — С. 313-315.

Работы, опубликованные в материалах региональных, всероссийских и международных научных конференций

6. Вакурин, А.А. Кариотип Циньлинской пищухи - Ochotona huangensis Matschie, 1908 (Lagomorpha: Ochotonidae) / А.А. Вакурин, В.П. Кораблёв // Материалы международного совещания Териофауна России и сопредельных территорий (IX Съезд Териологического общества РАН). - Москва, 1-4 февраля 2011 г. - М.: Товарищество научных изданий КМК. - С. 83.

7. Вакурин, А.А. Первые сведения о кариотипе пищухи Ochotona huangensis Matschie, 1908 / А.А. Вакурин, В.П. Кораблёв, Jiang Xue-long, Т.В. Григорьева // Конференция конкурс молодых ученых БПИ ДВО РАН. - Владивосток, 8-9 ноября 2012г.- С. 27-28.

8. Korablev, V.P. Karyotypes of some small mammals from the Qinling mountain (China) / V.P. Korablev, A. A. Vakurin, M.V. Pavlenko // Program and Abstracts of the Modern Achievements in Population, Evolutionary and Ecological Genetics: International Symposium (MAPEEG - 2009). - Vladivostok, Marine Biological Station "Vostok", September 6-11,2009. - P. 33.

9. Vakurin, A.A. Cytogenetic study of striped hamsters Cricetulus barabensis Pallas, 1773 (preliminary data) / A.A. Vakurin, V.P. Korablev, I.V. Kartavtseva // Program and Abstracts of the Modern Achievements in Population, Evolutionary and Ecological Genetics: International Symposium (MAPEEG - 2011). - Vladivostok, June 19-24, 2011.-P. 47.

10. Vakurin, A.A. The complex solution of pikas identification from «Bastak» Reserve / A.A. Vakurin, I.V. Kartavtseva, A.A. Lissovsky, A.A. Averin, L.V. Frisman // Program and Abstracts of the Modern Achievements in Population, Evolutionary and Ecological Genetics: International Symposium (MAPEEG - 2013). - Vladivostok, Marine Biological Station "Vostok", September 2-6, 2013. - P. 74.

Вакурин Алексей Александрович

Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona

Специальность 03.02.04 - Зоология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 19.07.2014. Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,00. Уч.-изд. л. 1,00. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «Copy&Paste» (Индивидуальный предприниматель Трифонова Е.С.) 690002, г. Владивосток, Океанский проспект, 87/1