Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Хемотерапия вирусов плодовых и ягодных растений в комбинации с культурой изолированных апексов

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Хемотерапия вирусов плодовых и ягодных растений в комбинации с культурой изолированных апексов"

со

сг>

егс О

»зс

^ На правах рукописи

ЦУБЕРА Людмила Васильевна

ХЕМОТЕРАПИЯ ВИРУСОВ ПЛОДОВЫХ И ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ В КОМБИНАЦИИ С КУЛЬТУРОЙ ИЗОЛИРОВАННЫХ АПЕКСОВ

Специальность - 06.01.11 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 1998

Работа выполнена во Всероссийском селекционно-технологическо институте садоводства и питомниководства.

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук,

старший научный сотрудник Приходъко Ю Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Романенко Н.Д;

кандидат биологических наук

Белошапкина О.О,

Ведущее предприятие - Республиканская научно-исследовательская

Защита состоится "Л" 1998г. в /3_ часов на заседай!

диссертационного совета Д 020.20.01 во Всероссийском селекционн технологическом институте садоводства и питомниководства по адрес 115598, Москва, М-598, Загорье, ул. Загорьевская 4, ВСТИСП,.ученый сове С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийско селекционно-технологического института садоводства и питомниководства

станция питомниководства садовых культур

Автореферат разослан "

1998г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат с.-х. наук

Л.А.Принева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из лимитирующих факторов получения лсоких урожаев плодовых и ягодных культур являются вирусные болезни, нижение их вредоносности достигается закладкой насаждений ¡ртифицированным безвирусным посадочным материалом, щоравливаемым в специализированных лабораториях и научных центрах.

Основные методы оздоровления плодовых и ягодных культур -/ховоздушная термотерапия и культура апикальных меристем, являясь >удоёмкими и технологически сложными,, не гарантируют освобождения астений от целого ряда трудноискоренимых вирусов. Это обуславливает гобходимость разработки, альтернативных приёмов оздоровления, среди зторых весьма перспективным представляется метод хемотерапии, :обенно в сочетании с культурами изолированных меристематических тексов и микропобегов in vitro.

Как известно, хемотерапия и хемопрофилактика вирусных болезней, е. применение различных лекарственных противовирусных препаратов, jbho и успешно используется в медицине и ветеренарии. Для итопатогенных вирусов, несмотря на ряд ранее достигнутых Энадёживающих результатов (А.Д.Бобырь, 1976; О.О.Белошапкина, 1986; М.Малыхин, 1987; G.Schuster, 1983; I.J.Bogush ,et al„ 1986 и др.), данный етод всё ещё недостаточно разработан, что задерживает его внедрение в рактику.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось зучение возможности повышения эффективности оздоровления плодовых и -одных растений от ряда различающихся по биологии трудноискоренимых ярусов путём сочетания хемотерапии и культуры меристематических тексов in vitro.

В конкретные задачи исследований входило:

1) Оценить эффективность природных и синтетических антивирусны: препаратов против местных изолятов трудноискоренимых вирусо: косточковых и ягодных культур.

2) Отработать способы обработки антивирусными препаратам! инициальных эксплантов перед их введением в культуру in vitro.

3) Разработать технологическую схему применения наиболе( эффективных антивирусных препаратов в процессе микроразмножени* против важнейших вирусов косточковых и ягодных культур.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в культуре in vitro сливы, ежевики и малины против иларвирусов - некротической кольцевой пятнистости косточковых, хлоротической кольцевой пятнистости косточковых и неповирусов - кольцевой пятнистости малины, латентной кольцевой пятнистости земляники, мозаики резухи и черной кольцевой пятнистости томата, изучена эффективность ингибиторов 2-тиоурацила, РНК азы, ацетилсалициловой и салициловой кислот. Против иларвирусов -интерферона и кампозана, против рабдовируса хлороза жилок малины -интерферона, кампозана, акриловой и ацетилсалициловой кислот, против потивируса шарки слив - цианогуанидина, ДГТ и биназы.

Разработаны технологические схемы применения наиболее эффективных ингибиторов против иларвирусов в процессе клонального микроразмножения сливы, неповирусов - в культуре in vitro ежевики и вируса хлороза жилок малины в культуре in vitro малины, обеспечивающие высокий выход безвирусных регенерантов без предшествующей суховоздушной термотерапии. Разработан новый способ применения антивирусных препаратов - инкубирование в их водных растворах инициальных эксплантов перед введением в стерильную культуру, который был эффективен во всех испытанных комбинациях вирус-хозяин.

Реализация результатов исследований. В результате проведённых исследований с использованием антивирусных препаратов получены Зезвирусные клоны 2"сортов сливы, 3 сортов малины и 1 сорта ежевики, которые использованы для закладки оздоровленных маточников.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на Всероссийском съезде по защите растений (г.Санкт-Петербург, ВИЗР, 1995), Международном совещании по защите растений (г.Москва, ВСТИСП, 1998), заседаниях Ученого Совета и секции ягодных культур ВСТИСП.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации эпубликовано четыре печатные работы.

Объём и содержание диссертации. Диссертация изложена на 130 ^границах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, выводов, 1редложений производству, списка использованной литературы из 167 «именований, в том числе 105 - зарубежных авторов, содержит 46 таблиц и I рисунка.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава представляет собой анализ мировой литературы по осматриваемой проблеме. Особое внимание уделено основным группам »еществ, обладающих антифитовирусной активностью и их применению для гемотерапии вирусных болезней плодовых и ягодных культур. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в 1994-1997 гг. на базе лаборатории 1ирусологии отдела размножения плодовых, ягодных и декоративных гультур ВСТИСП .

Объектами исследований являлись иларвирусы некротической юльцевой пятнистости косточковых (РЫЯЗУ) и хлоротической кольцевой 1ЯТНИСТОСТИ косточковых (РСЛБУ), потивирус шарки слив (РРУ) на сливе юмашней сортов Евразия-21, Память Тимирязева и терносливе сорта "ернослив Турсукский, рабдовирус хлороза жилок малины (КУСУ) на

малине красной сортов Новость Кузьмина и Шоша, неповирусы мозаики резухи (AMV), латентной кольцевой пятнистости земляники (SLRV), кольцевой пятнистости малины (RRV) и черной кольчатоста томата (TBRV) на малине красной сорта Бальзам и ежевике сорта Смутстем.

В качестве антивирусных препаратов (АВП) были изучены следующие вещества: ДГТ (2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин), цианогуанидин, 2-тиоурацил, интерферон человеческий лейкоцитарный, РНКаза, биназа (бактериальная РНК-деполимераза), гипорамин, салициловая, ацетилсалициловая, 2-хлор-зтилфосфоновая (в виде препарата "кампозан"), акриловая и никотиновая кислоты.

С системно заражённых вирусами растений отбирали верхушки побегов и пазушные почки, которые высаживали на питательную среду Мурасиге-Скуга (P.Murashige, F.Skoog, 1962) с добавками в модификации В.А.Высоцкого и jap. (1976). Регенераты подвергали клональному микроразмноженшо до получения требуемого для проведения экспериментов количества микропобегов, контролируя их заражённость вирусами методом иммуноферментного анализа (ИФА). Затем микропобеги пересаживали на среды с ингибиторами, где культивировали на протяжении 35-40 дней, после чего тестировали на наличие вирусов. В большинстве экспериментов на средах с АВП проводили 2-3 субкультавирования. В дальнейшем микропобеги с сероотрицательной реакцией укореняли in vitro и адаптировали к нестерильным условиям. Горшечные адаптированные регенераты содержали в остеклённой теплице, периодически контролируя их зараженность вирусами методом ИФА.

Антивирусные препараты вводили в состав питательных сред или до автоклавирования последних: 2-тиоурацил, цианогуанидин, ДГТ, ацетилсалициловая, салициловая, 2-хлор-этилфосфоновая, никотиновая кислоты, или после автоклавирования: биназа, интерферон, РНКаза, гипорамин. Вместо очистки последних препаратов через бактериальные

фильтры был разработан способ их совместного применения с антисептиком DF-100 (цитрицидал), что позволило эффективно предотвращать контаминацию сапрофитной микрофлорой.

В нескольких экспериментах АВП применяли путём предпосадочного инкубирования инициальных эксплантов в их растворах в течение 2 или 16 1асов (ацетилсалициловая и акриловая кислоты, ДГТ, интерферон, <ампозан). '

Выявление вирусов PNRSV, PCRSV, PPV.SLRV, TBRV, AMV и RRV гсуществляли прямым сэндвич-вариантом ИФА по стандартной методике M.Clark, A.Adams, 1977) с использованием' диагностических наборов на юнове полйклональных антител, полученных в лабораториях вирусологии ЗСТИСП и Института садоводства Молдовы. Результаты тестирования >егистрировали на автоматическом абсорбциометре фирмы "Dynatech" США) при длине волны 45() нм. Наличие RVCV определяли по наличию ярактерных симптомов на адаптированных к нестерильным условиям «генерантах,

Для анализа цифровых данных был использован критерий знака Д.У.Снедекор, 1961; R.Elandt, 1964) с поправкой на двусторонний характер ритерия и расчёт ошибки выборочной средней.

Автор выражает глубокую признательность доктору биологических аук И.Г.Яковлеву (Институт молекулярной биологии РАН), кандидатам иологических наук О.О.Белошапкиной (Московская сельскохозяйственная кадемия), П.М.Малыхину (Республиканская научно-исследовательская ганция питомниководства садовых культур), Л.Д.Шипулиной и ► П.Шейченко (Всероссийский институт лекарственных и ароматических ультур), предоставивших для испытаний антивирусные препараты.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эффективность ингибиторов против нларвирусов некротической кольцевой пятнистости косточковых (Р>ГЯ8У) и хлоротической кольцевой пятнистости косточковых (РСЯ8УУ

Испытание против РЫНБУ и РСЛБУ аналогов нуклеиновых оснований цианогуанидина, ДГТ и 2-тиоурацила показало, что ни один из этих препаратов при однократном применении в составе питательных сред не обеспечивает стабильного ингибирования вирусов. Выход регенерантов, свободных от РСЯБУ, в различных экспериментах с ДГТ (400-500 мг/л) и 2-тиоурацилом (5 мг/л) колебался от 0 до 75%, а с цианогуанидином (400 мг/л) - от 0 до 67%. Эффективность этих ингибиторов, в особенности ДГТ, существенно повышается после их двух- или трёхкратного применения. Выявлена перспективность использования салициловой кислоты в сочетании с ДГТ.

Установлено, что человеческий лейкоцитарный интерферон эффективен против РСЯЭУ в концентрациях от 4 до 18 медицинских доз на 1 литр (м.д./л), обеспечивая получение 17-67% оздоровленных регенерантов терносливы. Эффективность этого препарата повышается на фоне предшествующего применения ацетилсалициловой кислоты (100 мг/л), но не кампозана. При использовании сочетания интерферона (2 м.д./л) с цианогуанидином (400 мг/л) получено 45% безвирусных регенерантов, а совместное введение в состав питательных сред интерферона (2 м.д/л) и 2-тиоурацила (5 мг/л) полностью ингибирует РСНБУ. Напротив, сочетание интерферона с ДГТ не было эффективным.

После введения в состав питательных сред биназы в концентрации 5 мг/л получено 50% регенерантов терносливы, свободных от РСИБУ. Ещё более эффективным оказались сочетания биназы (3,2 мг/л) с цианогунидином (300 мг/л) или ДГТ (300 мг/л), обеспечившие получение 100% оздоровленных регенерантов. Эти сочетания ингибиторов превосходили по

эффективности вариант с 2-кратным применением ДГТ в высокой дозировке (500 мг/л). Другой нуклеотический фермент - РНКаза - в испытанных концентрациях (10-50 мг/л) не оказывал ингибирующего действия на PCRSV.

Влияние на иларвирусы 2-хлор-этилфосфоновой кислоты (в форме препарата "кампозан") и ацетилсалициловой кислоты было нестабильным и не зависело от кратности их применения.

Следует отметить, что в подавляющем большинстве случаев эффективность препаратов была более высокой, если они применялись с интервалом не более чем в одну субкультуру. Сочетание ингибиторов с различным механизмом действия на вирусы позволяло использовать их в иенее высоких концентрациях, чем при раздельном применении.

Через 12 месяцев после двукратного применения ДГТ (400 мг/л) и адаптации к нестерильным условиям регенерантов, имеющих :ероотрицателькуто реакцию, PCRSV и PNRSV были выявлены лишь в 12 и 23% горшечных растений соответственно. После двукратной обработки хианогуанидином (400 мг/л) восстановление концентрации PCRSV и PNRSV габлюдалось соответственно у 19 и 21% адаптированных растений.

Наряду со стандартным применением антивирусных препаратов в ;оставе питательных сред проведено испытание другой технологии -шкубирования инициальных эксплантов ■ (почек и верхушек побегов) в юдных растворах ингибиторов перед введением в стерильную культуру.

После инкубации почек сливы в растворах ДГТ, цианогуанидина и штерферона в течение 16 часов и их последующем культивировании in vitro •а средах без АВП в ходе трёх субкультур было получено соответственно 33, iO и 67% регенерантов, свободных от PNRSV (Табл.1). В аналогичном жсперименте с PCRSV выход безвирусных регенерантов сливы после [рименения ДГТ, цианогуанидина и интерферона составил соответственно !8, 43 и 61%.

Таблица 1

Влияние антивирусных препаратов на PNRSV в культуре in vitro сливы после инкубации инициальных эксплантов в растворах этих веществ (сорт Евразия-21, 1997 г.)

Варианты Количество растений ♦) % здоровых растений х Ашоб разцов:

Серотрица-тельных Серополо-жительных

Вода (контроль) 9/9 0 0 0,640 ±0,017

ДГТ-300 мг/л 4/6 33 0,271 ±0,021 0,405 ±0,029

Цианогуанидин -500 мг/л 3/6 50 0,220 ±0,016 0,390 ± 0,025

Интерферон -10 м.д./л 2/6 67 0,249 ±0,013 0,425 ± 0,046

Примечание: *) в числителе - количество растений с сероположительной реакцией; в знаменателе - общее число протестированных растений.

Проведённые эксперименты позволяют рекомендовать для дальнейшей отработки и испытания в производственных условиях две следующих технологические схемы применения АВП против иларвирусов на косточковых культурах.

По первой схеме ингибиторы используются лишь путём введения в состав питательных сред (Рис.1). Заражённые илавирусами регенеранты необходимо дважды пересадить на среды с АВП и в конце второй субкультуры протестировать их базальные части на наличие вирусов методом ИФА. Верхушки мнкрорастеннй при этом пересаживаются на среду без АВП. В дальнейшем регенеранты с сероотрицательной реакцией можно адаптировать к нестерильным условиям и в следующий вегетационный сезон подвергнуть тестированию на наличие вирусов с использованием комплекса методов. Регенеранты с сероположительной реакцией после

юращивания на стандартной среде затем целесообразно рекультивировать на :редн с ингибиторами и ретестировать методом ИФА. При этом наиболее терспективным представляется следующее чередование ингибиторов: 1-я - субкультура - ДГТ - 400-500 мг/л; цианогуанидин - 400-500 мг/л

или 2-тиоурацил - 5 мг/л; 1-я - субкультура - биназа - 3-5мг/л или интерферон - 10-18 м.д./л; 5-я - субкультура - ДГТ - 200 мг/л + салициловая кислота - 75 мг/л;

ДГТ - 200 + цианогуанидин - 200 мг/л или ДГТ - 300 мг/л + биназа - 3 мг/л.

По второй схеме инициальные экспланты (почки или верхушки побегов) с заражённых иларвирусами растений необходимо вначале инкубировать в течение 16 часов в водных растворах ингибиторов (ДГТ -500 мг/л, цианогуанидина - 500 мг/л или интерферона - 10 м.д./л), а затем простерилизовать и высадить на питательную среду без АВП. После получения регенерантов их базальные части следует протестировать методом ИФА, а растения с сероположительной реакцией - рекультивировать на питательной среде с АВП. При этом, если инициальные экспланты инкубировались в растворах ДГТ или цианогуанидина, то в состав питательных сред целесообразно ввести интерферон или биназу в указанных выше концентрациях, а при инкубации в растворе интерферона -рекультивировать регенераты на среде с аналогами нуклеиновых оснований. Дальнейшие операции следует проводить согласно первой схеме.

Применение метода хемотерапии для оздоровления сливы от иларвирусов позволяет получить экономический эффект в размере 17824 руб. на 100 полученных регенерантов по сравнению со стандартной технологией, предусматривающей комбинирование суховоздушной термотерапии и культуры меристематических апексов. Фактически экономический эффект является в три раза более высоким, поскольку в течение одного цикла

РИС.1. Технологическая схема применения антивирусных препаратов против иларвирусов в культуре in vitro сливы путём их введения в состав питательных сред.

¡тандартной технологии (470-480 дней) можно провести три цикла гемотерапии (150- ¡60 дней).

Влияние ингибиторов на потивирус шарки слив (PPV).

Установлено, что двукратное культивирование заражённых PPV ликропобегов на питательных средах с ДГТ (400 мг/л) обеспечивает юобратимое ингибирование этого вируса. Через 13 месяцев после адаптации с нестерильным условиям все растения данного варианта по-прежнему имели :ероотрицательную . реакцию. После аналогичной обработки щаногуанидином (400 мг/л) получен 81% регенерантов, свободных от PPV. предварительные результаты свидетельствуют также о возможности шгибирсвания PPV с помощью биназы.

Эффективность ингибиторов против рабдовируса

хлороза жилок малины (RVCV)

Ранее во ВСТИСП уже была установлена высокая эффективность шгибитороп ДГТ, цианогуанидина, 2-тиоурацила и биназы против RVCV в «ультуре in vitro микропобегов малины (Ю.Н.Приходько, 1995).

Нами констатировано, что при сочетании с цианогуанидином, шкотиновой и ацетилсалициловой кислотами препарат ДГТ можно «пользовать в более низкой концентрации (200 мг/л) без снижения >ффективности ингибирования RVCV (Табл.2). Применение же минимально юзможных концентраций ингибиторов из группы аналогов нуклеиновых оснований является весьма важным в плане возможного мутагенного цействия этих веществ.

Высокоэффективным для оздоровления малины от RVCV оказался также метод предпосадочного инкубирования инициальных эксплантов в эастворах ингибиторов. Использованные по данной технологии интерферон 2 м.д./л), акриловая кислота (0,005 М/л) и кампозан (40 мг д.в./л) не

Таблица 2,

Эффективность двукратного применения ингибитров в оздоровлении in vitro регенерантов малины от вируса хлороза жилок малины (сорт Шоша, 1995 - 1997 гг.)

№ вар Варианты Адаптировано регенерантов Проявило сиптгомы вироза % здоровых растений

1. Контроль (без АВП) 35 29 17,1 »)

2. ДГТ - 400 мг/л (эталон) 35 12 65,7

3. ДГТ- 200 мг/л + цианогуани-дин - 200 мг/л 35 11 68,6

4. ДГТ - 200 мг/л + никотиновая кислота - 5 мг/л 35 14 60,0

5. ДГТ- 200 мг/л + ацетилсалициловая кислота -100 мг/л 35 5 85,7«)

Примечание: *) Все различия с контролем существенны L=0,05;

**) Различия с вариантами №№ 2,3,4 .существенны при L=D,05. уступали по эффективности ДГТ при его введении в состав питательных сред и обеспечивали получение 86 - 100% безвирусных регенерантов.

Эффективность ингибиторов против неповирусов кольцевой пятнистости малины (RRV1 паггентной кольцевой пятнистости земляники. fSLRVV мозаики резухи (AMV) и черной кольчатости томата (TBRV).

В культуре in vitro микропобегов малины RRV эффективно ингибировали ДГТ и РНКаза, причём как в отдельности, так и при совместном применении. Несколько менее эффективно (на уровне 50%) сочетание ДГТ с органическими кислотами (Табл.3).

В экспериментах с тремя другими неповирусами РНКаза лишь снижала их концентрацию, но не освобождала от этих патогенов регенеранты малины.

Аналогичное действие на TBRV и SLRV оказывал 2-тиоурацил. Совместное введение в состав питательных сред РНКазы и ДГТ ингибировало AMV и SLRV.

Таблица 3.

Влияние некоторых АВП на вирус кольцевой пятнистости малины (RRV) в культуре in vitro микропобегов малины (сорт Бальзам, 1996).

Варианты Кол - во растений *) % здоровых растений X А450 образцов:

Серотрицате-льных Серополо-жительных

Контроль (без АВП) 6/6 0 0 0,193± 0,004

ДГТ - 200 мг/л 3/9 67 0,102± 0,000 0,150± 0,000

ДГТ-200 мг/л + РНКаза - 25 мг/л 0/6 100 0,095± 0,003 0

РНКаза -25 мг/л 0/6 100 0,126±0,012 0

ДГТ-200 мг/л + АСК-75 мг/л +никотиновая кислота -10 мг/л 3/6 50 0,088 ±0,000 0,203± 0,000

2-тиоурацил - 5 мг/л 0/4 0 0 0,170 ±0,000

Примечание: *) См. таблицу 1.

Предварительные испытания против неповирусов в культуре in vitro ежевики человеческого лейкоцитарного интерферона и гипорамина выявили несомненную перспективность этих препаратов. Гипорамин в использованных кбнцентрациях (1,0 - 5,0 мг/л) не уступал по эффективности ДГТ (500 мг/л) в ингибировании RRV, TBRV и SLRV, а интерферон (10 м.д./л) был высокоэффективен против AMV и TBRV.

В последующем эксперименте с RRV на ежевике установлено, что однократное использование аналогов нуклеиновых оснований (на этапе введения в стерильную культуру) обеспечивает довольно высокий выход безвирусных регенерантов, но у некоторых из них ингибирование вируса было обратимым (Табл.4). Двукратное применение аналогов нуклеиновых оснований (с обязательным включением ДГТ) и их сочетание или

Таблица 4

Наличие RRV в адаптированных к нестерильным условиям регенератах ежевики после однократного применения АВП в их культуре in vitro (Сорт Смугстем, J 996 -1997 гг.)

Продолжительность культивирования: Итоги по вариантам:

5 субкультур 6 субкультур 7 субкультур

Варианты Коли- % здо- Количе- % здо- Количе- % здо- Количест- %

ство ровых ство ровых ство ровых во расте- здоровых

рас-й*) рас-и рас-й *) рас-й рас-й *) рас-й ний *) растении

ДГТ-400 мг/л 0/10 100 1/10 90 1/20 95

Цианогуанидин- 400 мг/л 4/28 86 3/40 93 3/76 96 10/144 93

2-тиоурацил - 5 мг/л 0/7 100 0/10 100 4/35 88 4/52 92

Примечание: *) Количество растений: в числителе - количество растений с сероположительной реакцией; в знаменателе - обшее число протестированных адаптированных регенерантов; ^ **)- адаптацию не проводили.

Таблица 5

Влияние двукратного применения ингибиторов на вирус кольцевой пятнистости малины (RRV) в культуре in vitro ежевики (сорт Смутстем, 1996 - 1997 гг.)

Варианты Количество растений *) % здоровых растений х А450 образцов:

1 субкультура 4 субкультура Сероотрица-тельных Сероположи-тельных

Контроль (без АВП) Контроль (без АВП) 6/6 0 0 0,207 ± 0,003

Контроль ДГТ + цианогуанидин 0/6 100 0,097 ± 0,007 0

Контроль Салициловая кислота (СК) 2/6 67 0,090 ± 0,002 0,152 ±0,004

| Контроль Ацетилсалициловая к-та (АСК) 6/6 0 0 0,169 ± 0,015

Цианогуанидин Контроль (без АВП) 5/6 17 0,104 ±0,000 0,227 ±0,0 Ii

Цианогуанидин ДГТ + цианогуанидин 0/6 100 0,080 ± 0,002 0

Цианогуанидин Салициловая кислота 0/6 100 0,109 ±0,005 0

Цианогуанидин ДГТ + цианогуанидин + СК 0/6 100 0,106 ±0,004 0

Цианогуанидин ДГТ + цианогуанидин + АСК 1/6 83 0,090 ± 0,008 0,193 ±0,000

Цианогуанидин " ДГТ + цианогуанидин + Никотиновая кислота (НК) 1/6 83 ■ 0,083 ± 0,003 0,152 ±0,000

Примечание: В 1-й субкультуре цианогуанидин применяли в концентрации 400 мг/л; в 4-й субкультуре препараты применяли в следующих концентрациях: ДГТ и цианогуанидин - по 200 мг/л; СК - 75 мг/л; АСК - 75 мг/л; никотиновая кислота - 10 мг/л.

Таблица 6

Влияние двух- и трехкратного применения ингибиторов на вирус кольцевой пятнистости малины (RRV) в культуре in vitro ежевики (сорт Смутстем, 1996 - 1997 гг.)

! № ! пп Варианты Количество растений*) % здоровых растений X Aw образцов:

1 субкультура 4 субкультура 7 субкультура Сероотрица-тельных Серополо-жительных

i Контроль АСК **) Цианогуанидин - 400 мг/л 3/8 63 0,079 ± 0,004 0,166±0,010

! 2: » j • Контроль АСК ДГТ -200 мг/л + цианогуанидин -200 мг/л + СК**) 0/8 100 0,084 ± 0,006 0

3. Контроль АСК ДГТ -200 мг/л + цианогуанидин -200 мг/л + НК**) 0/8 100 0,093 ±0,010 0

4. Цианогуанидин * *) АСК Контроль 2/8 7 S 0,082 ± 0,006 0,283±0,017

5. Цианогуанидин АСК Цианогуанидин - 400 мг/л 0/8 100 0,076 ± 0,008 0

6. Цианогуанидин АСК ДГТ -200 мг/л + цианогуанидин -200 мг/л + НК**) 0/8 100 0,091 ±0,006 0

Примечание: *) Количество растений: в числителе - количество растений с сероположительной реакцией;

в знаменателе - общее число протестированных растений. **) Ингибиторы применяли в следующих концентрациях: цианогуанидин в 1 -й субкультуре - 400 мг/л, ацетилсалициловую кислоту (АСК) в 4-й субкультуре -75 мг/л, салициловую (СК) и никотиновую (НК) кислоты в 7-й субкультуре соответственно в дозах 75 мг/л и 10 мг/л.

ередование с салициловой, ацетилсалициловой и никотиновой кислотами ысокоэффективио освобождает регенеранты ежевики от RRV (Табл.5,6). (альнейшие исследования показали, что разработанная схема применения тих ингибиторов гарантирует также освобождение регенерантов от AMV, LRV и TBRV.

ВЫВОДЫ

1. Отработаны методические и технологические аспекты применения яда веществ с антифитовирусной активностью (ДГТ, цианогуанидина, 2-юурацила, интерферона, биназы, РНКазы, гипорамина, кампозана, шнциловой, ацетилсалициловой, акриловой и никотиновой кислот) против вличающихся по биологии илар-, непо-, пота- и рабдовирусов в процессе ¡опального микроразмножения сливы, терносливы, малины и ежевики.

2. Впервые разработана технологическая схема применения 1Гибиторов против иларвирусов в культурах in vitro микропобегов сливы и рносливы, предусматривающая чередование препаратов с различным ¡ханизмом антифитовирусного действия в двух- трёх последовательных бкультурах.

3. Введение в состав питательных сред ингибиторов ДГТ и 2-оурацила, а также ДГТ в сочетании с цианогуанидином и салициловой слотой существенно увеличивает выход регенерантов сливы и терносливы, ободных от PNRSV и PCRSV.

4. Эксперимегггы с человеческим лейкоцитарным интерфероном казали возможность устойчивого получения не менее 50% регенерантов ивы, свободных от PCRSV. Эффективность интерферона повышается на не предшествующего использования ацетилсалициловой кислоты и при «местном применении с 2-тиоурацилом.

5. Совместное или последовательное введение в состав питательных :д биназы и аналогов нуклеиновых оснований ДГТ и цианогуанидина

обеспечивает необратимую инактивацию PCRSV в регенерантах терносливы При таком сочетании ингибиторы можно применять в более низки; концентрациях.

6. Разработан новый способ применения антивирусных препаратов -инкубирование в их водных растворах инфицированных инициальны; эксплантов, который был эффективен во всех испытанных комбинация: вирус-хозяин.

7. Разработана технология оздоровления малины от термотолерантноп рабдовируса хлороза жилок малины. Эффективное ингибирование этоп вируса достигается двукратным культивированием микропобегов н; питательных средах с ДГТ или при комбинировании ДГТ < цианогуанидином, никотиновой и ацетилсалициловой кислотами, а такж< инкубированием инициальных эксплантов в растворах интерферона кампозана и акриловой кислоты.

8. Впервые разработана технологическая схема применена ингибиторов для хемотерапии нёповирусов в культуре in vitro ежевики. Он; предусматривает чередование применения аналогов нуклеиновых основани{ ДГТ или цианогуанидина с ацетилсалициловой или салициловой кислотами i двух-трёх последовательных субкультурах.

9. Ингибирующее действие на неповирусы в стерильных культура? ежевики и малины оказывают также интерферон, гипорамин и РНКаза.

10. Предварительные результаты свидетельствуют о возможное™ хемотерапии потивируса шарки слив путём двукратного культивирование инфицированных регенерантов на питательных средах с цианогуанидином ДГТ и биназой.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Практиковать для оздоровления культивируемых in vitro регене-)антов сливы от иларвирусов разработанную нами технологическую схему фименения ингибиторов, согласно которой в состав питательных сред в 1ервой субкультуре следует вводить ДГТ в концентрации 400-500 мг/л; циа-югуанндин - 400-500 мг/л или 2-тиоурацил - 5 мг/л; во второй субкультуре - применять биназу - 3-5 мг/л или интерферон - 10-18 м.д./л, а в третьей ;убкультуре (при необходимости) - использовать сочетание ДГТ в 'меньшеинои концентрации (200 - 300 мг/л) с салициловой кислотой 75 мг/л), цианогуанидином (200 мг/л) или биназой (3 мг/л).

2. Использовать для получения свободных от иларвирусов клонов :ливы разработанный нами метод инкубации инициальных эксплантов в ра-ггворах ДГТ (500 мг/л), цианогуанидина (500 мг/л) или интеферона 1 Ом.д./л).

3. Для оздоровления малины от рабдовируса хлороза жилок вводить в :остав питательных сред один из следующих ингибиторов: ДГТ (400 мг/л), шаногуанидин (400 мг/л), 2-тиоурацил (5 мг/л), биназу (J мг/л), либо прак--иковать двукратное использование ДГТ (200 мг/л) совместно с ацетил-:алициловой кислотой (100 мг/л) или никотиновой кислотой (5 мг/л). В сачестве альтернативного приёма применять инкубирование инициальных «сплантов в растворах интерферона (2 м.д./л), кампозана - 40 мг/л (по д.в.) ши акриловой кислоты (0.005 М/л).

4. Оздоравливать регенеранты ежевики и малины от неповирусов 1утём двух- трёхкратного введения в состав питательных сред АВП по ¡ледующей схеме: 1-я субкультура - ДГТ или цианогуанидин (по 400 мг/л); !-я субкультура - ацетилсалициловая или салициловая кислоты (по 75 мг/л); 1-я субкультура (при необходимости) - одновременное использование ДГТ,

цианогуанидина (в уменьшенной вдвое дозировке) и одной из вышеназванных кислот.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ.

1. Приходько Ю.Н., Цубера Л.В. Хемотерапия вирусов плодовых и ягодных культур в сочетании с культурой изолированных апексов //Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность / Тез.докладов Всерос. съезда по защите растений, Санкт-Петерб.-1995.-С.453-454.

2. Приходько Ю.Н., Цубера Л.В. Разработка метода хемотерапии вирусов в процессе микроклонального размножения плодовых и ягодных культур II Плодоводство и ягодоводство России /Сб.науч.трудов ВСТИСП-1996-Т.З.-С.96-101. (Л"

3. Метлицкая К В., Приходько Ю.Н., Цубера Л.В. Вирусные болезни сливы в средней полосе России и вопросы совершенствования технологии получения безвирусных клонов этой культуры // Плодоводство и ягодоводство России / Сб.науч.трудов ВСТИСП.-1997.-Т.4.-С.90-95.

4. Волков Ф.А., Высоцкий В.А., Приходько Ю.Н., Алексеенко Л.В., Цубера Л.В. Использование критерия знака в качестве оценки различий между вариантами // Методика исследований и вариационная статистика в научном плодоводстве / Сб.докл.Международной научно-методической конференции. Мичуринск.-1998.-Т.1.-С.76-79.