Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хемилюминесценция, сопровождающая процессы Fe2+-индуцированного перекисного окисления липидов в мембранах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Хемилюминесценция, сопровождающая процессы Fe2+-индуцированного перекисного окисления липидов в мембранах"

министерство здравоохранения российском федерации

научно-исследовательский институт фйзико-хммическои мешшш

На правах рукописи

Дрешна Елена Сергеевна

УДК 577.352.38 : 535.379.

Хешипяяшесценция, сопровождающая процессы ге2+-ишагодров8кного перекисного окисления лкпидов в ыеибранах

03.00.02. - Биофизика.

АВТОРЕФЕРАТ диссертация па соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва 1992

Работа выполнена в отделе биомедицинской электроники Института радиотехники и электроники РАН.

Научные руководители: академик РАМН. профессор, доктор биологических наук Ю.А.Владимиров;

кандидат Сиологических наук В.С.Шаров.

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук А.Я.Потапенко; кандидат биологических наук В.И.Оленев.

Ведущая организация: Институт химической физики РАН им. Н.Н.Семенова

Защита диссертации состоится " 7- "я. 1992 г. т заседании специализированного совета Д.084.66.01 в НИ физико-химической медицины МЗ РФ, 119435, Москва М.Пироговская.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " 3 " 1992 г.

Ученый секретарь Совета, кандидат биологических наук

М.А.Мурина

ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы. В настоящее время общепринято ,что свободнорадикальное окисление липидов биологических мембран является одним из важных компонентов метаболизма клетки, а нарушение регуляции этого процесса можно считать одним из наиболее универсальных механизмов патогенеза на молекулярном л клеточном уровне (Vladlmlrov Yu.A.,1986; Halliwell В. et al.,1989). Во многих работах было показано, что в развитии ПОЛ ведущая роль принадлежит ионам металлов переменной валентности, з особенности ионам железа (Владимиров Ю.А. и др., 1972; Duniord н., 1987). Изучению механизма Ре2+-индуцированного ПОЛ посвящено большое число исследований. Однако до сих пор не существует единого представления о механизме реакций с участием ионов железа. Понимание роли Fe2+ в процессах инициирования ПОЛ и места протекания этих реакций, несомненно, должно стимулировать развитие новых подходов к профилактике, диагностике и терапии свободнорадикальных патологий.

Решение этих задач во многом зависит от развития методов контроля за скоростью процессов ПОЛ в биологических системах. Одним из наиболее перспективных методов исследования ПОЛ является измерение ХЛ, сопровождающей реакции цепного окисления органических соединений. По сравнению с традиционными биохимическими методами этот метод обладает рядом преимуществ: гораздо более высокой чувствительностью, безинерционностыо, что позволяет изучать кинетику быстропротекающих реакций в реальном масштабе времени, не требует деструкции объекта и не вносит возмущения в изучаемые процессы. Однако в настоящее время метод ХЛ недостаточно широко применяется в медико-биологических исследованиях, поскольку его нельзя отнести к прямым, количественным методам изучения ПОЛ. Это связано с тем, что механизм ХЛ в биологических и даже модельных системах до сих пор не вполне ясен. Более точное представление о связи ХЛ с процессами ПОЛ может значительно расширить возможности использования этого метода в научных исследованиях и клинической практике.

Цель и задачи исследования. Целью работы было детальное хемилюминесцентное исследование кинетики и регуляции процесса Ре2+-индуцированного ПОЛ в наиболее простой мембранной системе -суспензии липосом; изучение механизма ХЛ, сопровождающий Ре2+-индуцированное ПОЛ, в частности, вклада различных свободно-радикальных реакций в изучаемую ХЛ и возможности их селективного

количественного анализа, с целью повышения информативности ХД метода.

Задачи исследования:

1.Изучение кинетики Ре2+-индуцированного ПОЛ и сопровождающей его ХЛ в модельной мембранной системе - суспензии липосом, в отсутствие и в присутствии различных соединений, влияющих на состояние катализатора реакции - ионов Ре2+, с целью выяснения роли различных реакций с участием железа в развитии ПОЛ.

2.Изучение механизма хемилюминесцентных реакций, сопровождающих процесс Ре2+-индуцированного ПОЛ, с целью повышения информативности хемилюминесцентного метода исследования кинетики свободнорадикальных процессов в меморанных системах.

3.Поиск селективных сенсибилизаторов ХЛ, пригодных для исследования кинетики ПОЛ в мембранах и других биологических системах.

Научная новизна. Показано, что эффективность перекисного" окисления липидов зависит от величины критической концентрации ионов железа в липидной фазе, которая в свою очередь определяется концентрацией свободных ферроионов в водной фазе и способностью мембран и других лшшдных систем связывать ионы железа. Предложен хемилюминесцентный метод определения величины критической концентрации ионов железа. ,•

Впервые показано, что кинетика хемшюминесценции, сопровождающей процесс Ре2+-индуцированного перекисного окисления липидов в мембранах, является суперпозицией двух хемилюминесцентных реакций, из которых только одна непосредственно связана с реакциями липидных радикалов и отражает скорость процесса свободаорадикального окисления липидов. Предложен спектральный критерий для выделения хемилюминесценции, отражающей процессы перекисного окисления липидов в различных системах. Показано, чхо развитие ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ в фосфатном буфере в основном определяется реакциями активных форм кислорода.

Показано, что антиокислительная активность препаратов плазмы крови, измеренная при Ре2+-индуцированном перекисном окислении липидов в модельных мембранных системах, обусловлена способностью различных компонентов плазмы крови главным образом, бежов о взаимодействовать с ионами железа. Предложена ХЛ система для скрининга и определения механизма АО действия различных препаратов.

Проведен скрининг сенсибилизаторов хемилюминесценции среда

г

лазерных красителей кумаркнового ряда. Выявлены соединения, способные к селективному усилению хемилюминесценции за счет реакций свободнорадикального окисления липидов более чем на три порядка величины и не оказывающие влияния на изучаемые реакции.

Показано, что лазерные красители кумаркнового ряда могут быть использованы для хемилюминесцентного анализа перекисного окисления липидов и антиокислительной активности в мембранных системах и липопротеинах плазмы крови человека.

Практическая значимость работы. Для практического применения наибольшее значение в настоящее время имеет определение уровня перекисных продуктов и антиокислительной активности плазмы крови и суспензий биомембран с целью скрининга групп риска развития заболеваний, дифференциальной диагностики, контроля за динамикой заболевания и эффективностью лечения, а также поиска новых эффективных препаратов антиоксидантного действия. Результаты и вывода работы могут быть использованы в практике научных исследований, в частности, при изучении свободно-радикальных процессов в биологических мембранах и липопротеидах методом хемшпоминесценции с использованием селективных сенсибилизаторов хемилюминесцентных реакций; з клинико-диагностичеасих исследованиях для повышения чувствительности и информативности хемилюминесцентного анализа крови и других препаратов. Полученные данные являются базисными для дальнейших исследований в области свободно-радикальной патологии мембран и физико-химической медицины.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на 3 Всесоюзном Совещании по хемилюминесценции, г.Рига, май 1990 г., на Международной школе по кислородным радикалам, г.Ленинград, сентябрь 1991 г., на 4 Международном симпозиуме по количественной спектрометрии в биомедицинских исследованиях, Гент, Бельгия, май 1991 г., и на семинарах, отдела биомедицинской электроники ИРЭ АН СССР, кафедры биофизики 2-го ЫОЛГМИ им.Н.И.Пирогова и отдела биофизики НИИ физико-химической медицины МЗ РСФСР.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, части посвященной результатам исследований и их обсуждению, выводов и библиографического указателя, включающего 233 источника, из них 158 иностранных. В диссертации содержится 41 рисуйок и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзор литературы. В обзоре приведен анализ литературных данных о протекании процессов Fe -индуцированного ПОЛ, об основных методических подходах к изучению свободнорадикальному окислению липидов в том числе in vivo и подробно рассмотрен вопрос о механизме эмиссии ХЛ в биологических объектах и путях повышения информативности метода ХЛ.

Материалы и методы исследования. В качестве об§ектов исследования в работе использовали суспензию липосом, липопротеи-ны низкой плотности и плазму крови человека, а также некоторые биохимические и химические системы.

Суспензию липосом получали диспергированием в буферном растворе фосфолипидов, выделенных из желтка куриных яиц по методу Bligh E.G. et al.(1959). В работе использовали плазму крови, стабилизированную 1% гепарином. Липопротеины выделяли из сыворотки крови доноров методом препаративного ультрацентрифугирования.

2+

Регистрацию хемилкминесценции ХЛ в присутствии ионов Fe проводили известным способом (Владимиров Ю.А. и др., 1976). Для этого в реакционную среду общим объемом 2,5 мл добавляли определенное количество липидного материала. ПОЛ в образце инициировали введением 0,5 мл раствора íe2so4 при интенсивном перемешивании инкубационной среда.

О накоплении продуктов ПОЛ судили по спектрам поглощения диеновых коньюгатов (232 та) и по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Измерение концентрации Fe2+ проводили с помощью регистрации спектров поглощения окрашенного комплекса ионов Ре2+ с о-фенантролином (максимум 510 нм).

Результаты исследования и их обсуэдение

Глава I. Изучение ¡синеттях Fe2*-индуцированного ПОЛ в трис-буфгрной суспензии лшосол.

Мы сопоставили данны< параллельного исследования кинетики Ре2+-индуцированного ПОЛ в липосомах, полученные методом измерения ХЛ и обычными химическими методами - измерения накопления продуктов окисления липидов МДА и концентрации ферроионов. На рис.1 представлена непрерывная кинетика ХЛ суспензии липосом , из которой в определенные моменты времени о производился отбор проб для измерения концентрации МДА и 3?е2+. Видно, что развитие "медленной вспышки" ХЛ и основное накопление продуктов ПОЛ возникает после того, как происходит снижение

10 15 Время, юш

40 во во Ре(П), миЫ

о. а

120

Рис.1. Кшгетикао.ХЛ, накопления МДА (Ш5Э2)Л>(боо)) и расходования ионов Ре . Стрелкой отмечен момент добавления 100 мкМ Ре"1 к суспензии лшгосом (2 мг/мл фосфолипидов в 0,1 М ГОД, 0,02 М трис-НС1, рН 7,4). В верхней части рисунка отмечены стадии кинетики ХЛ: БВ - быстрая вспышка, Ж - латентный период, МВ -медленная вспышка, СС - стационарное свечение. ?+

Рис.2. Влияние начальной концентрации на величину

латентногопериода кинетики ХЛ (Ю, амплитуду медленной вспышки (1г) и накопление МДА (в(532)/0(600)) в липоссмах. Условия - как в подписи к рисЛ. Стрелкой указана величина критической концентрации ионов келеза.

условно называемой

концентрации Ре2+ до некоторой величины, критической концентрацией Ре2+ ([Ре2+]*).

Мл провели подробное измерение зависимостей параметров кинетики ХЛ латентного периода и амплитуда медленной.вспышки и кинетики накопления продуктов ПОЛ в липосомах от исходной концентрации добавленного Ре2+ (рис.2). Величина латентного периода кинетики ХЛ определялась как интервал времени от моменту добавления Ре2+ до максимуме медленной вспышки (т). Зависимость величины латентного периода от начальной концентрации келеза близка к линейной (т на рис.2), и точка пересечения зтой прямой с осью абсцисс указывает величину критической концентрации ?е2+ (около 40 мкМ), ниже которой латентный период отсутствовал, а медленная вспышка сливалась с 'быстрой. При концентрациях Ре ниже 40 мкМ происходило почти линейное уменьшение максимального уровня МДА, а при начальных концентрациях Ре2+ выше критической максимальная концентрация продуктов ПОЛ, как и амплитуда медленной вспышки, практически не изменялась. Все три приведенные зависимости указывают на одну и ту же величину критической концентрации Ре2+.

Таким образом, зависимость параметров кинетики ХЛ и максимального накопления МДА от начальной концентрации Ре2+, представленная на рисунке 2, показывает, что эффективность ПОЛ в суспензии липосом зависит от величины критической концентрации Ре2+. При концентрации железа выше критической максимальный уровень МДА и мплитуда медленной вспышки ХЛ остаются практически постоянными. По всей видимости, окисление избыточного количества железа не сопровождается сколько-нибудь значительным инициированием ПОЛ, вследствие преобладания антиоксидантного действия ионов железа.

Мы провели также исследование кинетики развития ХЛ и накопления МДА при добавлении избытка аскорбата.что позволяет проследить зависимость скорости процесса ПОЛ от стационарной концентрации Рег+. При увеличении концентрации Ре2+ с 20 до 50 мкМ скорость накопления продуктов ПОЛ растет, а при дальнейшем увеличении падает .Можно предположить, что полученная зависимость отражает прооксвдантное действие ионов Ре2+ в концентрациях ниже критической и антиоксидантный эффект при [Ре ]>[Ре2+1*. Максимальная скорость накопления МДА, которая наблюдалась при добавлении 50 мкМ Ре2+", по всей видимости, должна соответствовать скорости процесса ПОЛ при достижении критической концентрации железа в этой системе. Эта величина находится в хорошем соответствии с величиной [Ре2+]*, рассчитанной по данным рис.2. Параллельно измерению кинетик накопления МДА были измерены соответствующие кинетики ХЛ. Кинетики развития ХЛ при добавлении избытка аскорбата имели монотонно нарастающий характер. Зависимость скорости нарастания ХЛ от концентрации Ре2+ была совершенно аналогична зависимости скорости накопления МДА,' т.е. имела максимальное значение при концентрации Ре2+, равной 50 мкМ. Однако необходимо подчзркнуть, что нарастающий характер кинетики развития ХЛ в данной системе совершенно не согласуется с кинетикой процесса ПОЛ, поскольку постоянной скорости накопления продуктов ПОЛ должен соответствовать постоянный уровень ХЛ.

Имея в своем распоряжении метод определения величины критической концентрации железа по изменению параметров ХЛ (см. рис.2) мы изучили вопрос о том, является ли величина критической концентрации жалеза постоянной величиной при изменении концентрации липосом. Оказалось, что увеличение концентрации липосом от 0,5 мг/мл до 4 мг/мл приводило к возрастанию значения критической концентрации железа с 10 до 50 мкМ. Зависимость величины

б

критической концентрации железа от концентрации липосом представлена на рис.3. Эта зависимость близка к линейной при концентрациях липосом менее 2 мг/мл, и отношение критической концентрации ионов железа к концентрации липосом можно считать постоянной величиной (кривая 2 на том же рисунке).

Таким образом, не только скорость развития процесса, но и эффективность инициирования ПОЛ одним и тем же количеством добавленного Ке2+ в суспензиях липосом различной концентрации сильно различается. Изменение величины критической концентрации железа при изменении концентрации липосом, вероятно, можно объяснить тем, что развитие реакций ПОЛ в гетерогенных системах определяется не средней концентрацией Ре2+ в объеме образца, а локальной концентрацией железа, связанного с поверхностью мембран.

С целью изучения механизма действия различных комплексообра-■ зователей ми исследовали их влияние на кинетику ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ в трис-буферной суспензии липосом. Оказалось, что при начальной концентрации железа выше критической величины добавление хелаторов приводит к уменьшению величины латентного периода кинетики ХЛ и не влияет ни на амплитуду медленной вспышки ХЛ, ни на конечный уровень накопления продуктов ПОЛ. Эффект сокращения латентного периода уменьшался в ряду: ЭДТА > фенантролин > десферриоксамин > фосфат. Полученные нами результаты о влиянии хелаторов на кинетику процесса ПОЛ, индуцированного ионами ?е2+ в суспензии липосом, свидетельствуют о том, что добавление хелаторов приводит к ускорению развития ПОЛ без изменения конечного результата, если судить по величине медленной вспышки и максимальному накоплению продуктов ПОЛ.

В работе был исследован также механизм влияния катионов непереходных металлов на кинетику развития Ре2+-индуцированного ПОЛ. Оказалось, что добавление катионов не влияниет на амплитуду медленной вспышки ХЛ и на накопление продуктов ПОЛ, но приводит к уменьшению величины латентного периода. Сокращение латентного периода в два раза наблюдалось при концентрациях Еи3+ - 5*10 ®М, Рез+ _ ю~4м, Са2+ - 5Т0~4М. Судя по концентрации, вызывающей сокращение латентного периода в два раза, наибольшим эффектом обладают трехвалентные катионы, имеющее наибольшее сродство к мембранам. Такой эффект в данной системе полностью аналогичен уменьшению начальной концентрации добавленного железа. Механизм влияния катионов на действующую концентрацию железа, по-видимому.

?+ *

Рис.3. Шшяни§ концентрации липосом на величину [Ре ] (1) и отношение [Fe ] к концентрации липосом (2).

Рис.4. Кинетика,, ХЛ, накопления МДА (D(532)/D(600)) и расходования ионов Fe . Стрелкой отмечен момент добавления 100 мкМ Fe к суспензии липосом (2 мг/мл фосфолипидов в 0,1 Ы KCI, 0,02 М трис-HCI, рН 7,4).

мокно объяснито, исходя из представления о гетерогенности системы

и наличия мест связывания железа на липосоме. Мокно предположить,

что катионы металлов конкурируют с Fe2+ за места связывания.

Таким образом, многообразные эффекты хелаторов и катионов

металлов, включая Fe3+, могут быть объяснены, исходя из

2+

представления о существовании критической концентрации Ре , связанного с поверхностью мембран, и классического механизма Ре2+-индуцированого ПОЛ. В связи с этим нам кажется излишним привлечение гипотезы об изменении механизма реакции инициирования или химической активности Fe2+ при образовании комплексов с хелаторами и катионами металлов, в том числе Fe^+, дай объяснения-их влияния на процесс Ре2+-индуцированного ПОЛ.

Концентрация "(вободного" Fe2"1" в растворе

Конкурентные катионы -> | <- Хелаторы Fe2+

Концентрация Fe2"1" на поверхности мембран

г+ +

Скорость процесса Fe*1 -индуцированного ПОЛ

Представленная схема иллюстрирует различные механизмы регуляции Ре2+-индуцированого ПОЛ:

л I Уменьшение концентрации добавленного гелеза приводит к уменьшению концентрации связанных с мембраной ферроионов.

2)Соединения, связывающие ионы Fe2+ в водном растворе, также

400 500 е00

Длины волн, ни

п

400 500 600

Длины волн, нм

Рис.5. Спектральный состав хемилюминесценции на максимальном уровне стационарного свечения (А) и медленной вспышки (В). Условия - как в подписи к рис.1. Пунктирными линиями обозначены: коротковолновая граница пропускания светофильтра ОС-14 (А) и область пропускания светофильтра СЗС-8 (В).

вызывают уменьшение концентрации железа на поверхности мембран.

ЗЖатионы металлов, способные конкурировать с Ре2+ за места связывания на мембранах, могут вытеснять часть ионоз келеза с поверхности мебран, уменьшая их действующую концентрацию.

в

ГЛАВА 2. Кинетика и спектральный состав ХЛ при ре2+-и>иЗуцированнол ПОЛ в трис-буферной суспензии лилосол.

Изучение кинетики ХЛ на стадии стационарного свечения показало, что, несмотря на прекращение развития ПОЛ, уровень ХЛ продолжал увеличиваться и достигал максимального значения, которое превосходило амплитуду медленной вспышки в несколько раз (рис.4). Для выяснения химической природы и механизма эмиссии стационарного свечения прежде всего был исследован спектральный ® состав ХЛ на стадии стационарного свечения (рис.5А) и на стадии медленной вспышки (рис.5Б). Оказалось, что основная часть стационарного свечения находилась в красной области спектра (более 600 нм). Спектр ХЛ на стадии медленной вспышки был в основном более коротковолновым (максимум около 540 нм), но в красной области спектра также находился небольшой побочный максимум (около 630 нм).

Мы предположили, что механизм эмиссии ХЛ на этих двух стадиях кинетики различен, а красная компонента в спектре медленной вспышки является результатом наложения развивающегося стационарного свечения. Действительно, измеряя ХЛ через граничный

100

гоо

0.4

о

о

0.0

о ю го зо 4о 60 во Время, шга

о го 40 во во юо Время, мин

Рис.6. Кинетики ХЛ: интегральной (в спектральном диапазоне 400-700нм); измеренной через светофильтр ОС-14 (Х>575 нм); рассчитанной путем вычитания двух предыдущих (Я<575 нм); измеренной через светофильтр СЗС-8 (345нм<А.<590нм).

Рис.7. Кинетика интегральной ХЛ (сплошная линия), накопления МДА(0(532)Л)(600)) и ХЛ, измеренной через светофильтр ОС-14 (пкнктирная линия) при двух последовательных добавлениях 100 мкМ Ре (в моменты времени, отмеченные стрелками). Условия - как в подписи к рис.1.

светофильтр ОС-14 (А>575 нм), нам удалось выделить кинетику развития стационарного свечения (рис.6, кривая для \>575 нм), которая имела плавно нарастающий характер. При этом на стадии медленной вспышки интенсивность "красной" ХЛ была относительно невелика, а основной ее рост 'происходил уже после завершения медленной вспышки. Разность этих кинетических кривых представляет собой кинетику свечения, отражающего ход реакций ПОЛ (рис.6, кривая для \<575 нм). Аналогичный вид имеет' кинетика ХЛ, измеренной через светофильтр СЗС-8 (рис.6, кривая для 590>Л.>345 ■ нм).

Изменение концентрации JШШ^дoв слабо влияло на максимальный уровень стационарного свечения. При увеличении же начальной концентрации железа максимальный уровень стационарного свечения значительно возрастал, при этом зависимость максимального уровня стационарного свечения от начальной концентрации Ре2+ имела почти линейный характер. Зависимость прироста стационарного свечения от концентрации добавленного Ре3^ также являлась практически линейной. Однако добавление ионов Реэ+ уже на стадии стационарного свечения практически не вызывало увеличения уровня стационарной ХЛ. Таким образом, Ре3+, скорее всего, может быть участником реакции, необходимой для развития стационарного свечения, но в

Ю

:амих хемилюминесцентных реакциях на стадии стационарного звечения присутствие Ре3+ не является лиштирувдим.

Кинетика процесса ПОЛ после повторного добавления 1ег+ на стадии стационарного свечения, судя по величине латентного периода и количеству накопленных продуктов с учетом разведения образца , практически не отличалась от первой кинетики. Однако наблюдалось выраженное увеличение амплитуды второй медленной вспышки ХЛ по сравнению с первой. Сравнение кинетики интегральной ХЛ (сплошная линия) и "красного" свечения (пуктир на рис.7) показывает, что увеличение второй медленной вспышки происходит за счет "красной" компоненты свечения, которая повторяет форму медленной вспышки. Повторное добавление Ре2+ приводит к угнетению ХЛ и только после полного окисления Ре2+ по окончании второй медленной вспышки развивается новый уровень стационарного свечения, почти в два раза превышающий амплитуду стационарного свечения после окисления первой добавки железа. Этот результат можно объяснить тем, что ионы ¥е2+ являются, скорее всего, ингибиторами реакций, приводящих к стационарному свечению и одновременно источником ионов от конечной концентрации

которых максимальный уровень стационарного СЕечения зависит почти линейно. Кроме того, необходимо заметить, что увеличение уровня стационарного свечения при повторном добавлении 1?е2+ может быть связано также и с увеличением концентрации продуктов ПОЛ, накопленных во время развития второй медленной вспышки (рис.7).

С целью изучения механизма ХЛ на стадии стационарного свечения был использован ингибиторный анализ. Оказалось, что добавление хелаторов железа в начале кинетики вызывает такой же эффект, как уменьшение начальной концентрации Ре2+. Все исследованные хелаторы при добавлении в начале кинетики уменьшали максимальную амплитуду стационарного свечения, вероятно, вследствие того, что часть железа, связанного хелаторами, исключалась как из реакций ЮЛ на первых стадиях кинетики (в форме Ре2+), так и из реакций, приводящих к стационарному свечению (в форме Ре3+). Одинаковый эффект хелаторов как двух-, так и трехвалентного железа на максимальную амплитуду стационарного свечения показывает, что развитие стационарного свечения определяется концентрацией "свободных" ионов Ро3+, образующихся при автоокислении Ре2+. Эффекты хелаторов на стадии стационарного свечения были значительно менее выраженными и наблюдались при концентрациях на порядок выше, чем при добавлении этих хелаторов

в начало кинетики.

С целью выяснения роли 02'~ в развитии стационарного свечения мы измеряли кинетику ХЛ при добавлении различных концентраций СОД в суспензию липосом до введения ионов железа. В относительно небольшой концентрации 10 ед/мл СОД, практически не влияя на кинетику ХЛ на стадиях быстрой вспышки, латентного периода к медленной вспышки, в несколько раз уменьшала максимальный уровень стационарного свечения. При добавлении СОД на стадии стационарного свечения ингибирование ХЛ происходило при значительно более высоких концентрациях СОД 200 ед/мл . По всей видимости, 02*~ играет важную роль в реакциях, приводящих к развитию стационарного свечения, и вносит гораздо меньший вклад в ХЛ на стадиях кинетики, связанных с реакциями ПОЛ.

В качестве антиоксидантов, способных ингибировать реакции с участием липидных радикалов, были использованы а-токоферол и ионол. При добавлении в начале кинетики липидные антиоксиданты в несколько раз увеличивали латентный период кинетики ХЛ и незначительно уменьшали накопление продуктов ПОЛ и уровень стационарного свечения.

Для изучения возможной роли НО"-радикала в хемилюминесцент-ных реакциях были использованы ловушки гидроксильного радикала -маннитол и этанол в концентрациях до 0,1 М. Добавление их в начале кинетики и на стадии стационарною свечения совершенно не влияло на кинетику ХЛ. Поэтому можно считать участие НО'-радикала в изучаемых процессах маловероятным.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что кинетика интегральной ХЛ (в диапазоне 400-700 нм), сопровождающей Ре2+-индуцированное ПОЛ в суспензии липосом, является суперпозицией двух хемилшинесцентных реакций, имеющих различную химическую природу.и независимый механизм эмиссии.

Одна из хемилхшнесцентных реакций, по всей видимости, является следствием свободнорадикального окисления липидоз и отражает уровень липидных перекислых радикалов. Эта реакция дает максимум эмиссии в зеленой области спектра, что, вероятно, относится к излучению триплетного возбужденного кетона. Другая хемилкминесцентная реакция, которая развивается параллельно свободнорадикальному окислению липидов и отличается более медленной кинетикой развития, большей интенсивностью и продолжительностью ХЛ, имеет максимум•эмиссии в красной области спектра (более 590нм). Эта реакция полностью.определяет генерацию XI на

стадии стационарного свечения. Природа стационарного свечения в настоящее время остается неясной. Медленное развитие стационарного свечения, сменяющееся резким подъемом после окончания медленной вспышки, возможно, отражает процесс синтеза сенсибилизатора ХЛ в ходе реакций ПОЛ. В этом случае амплитуда стационарного свечения будет зависеть от уровня накопления сенсибилизатора, который з свою очередь должен коррелировать с концентрацией других продуктов ПОЛ, в частности МДА. К сожалению, ничего более определенного о механизме ХЛ реакций, определяющих стационарное свечение, на основании полученных данных в настоящее время сказать нельзя. На основании спектральной характеристики стационарного свечения можно предположить участие димольного синглетного кислорода, квантовый выход люминесценции которого увеличивается в присутствии стабилизатора, накапливающегося в процессе ПОЛ. Возможность такой стабилизации была недавно показана в работах Красновского и соавт. (1989) в модельных фотохимических системах.

Механизм генерации длинноволновой хемилюминесценции на стадии стационарного свечения, конечно, нуждается в более основательном экспериментальном изучении. Однако существование двух хемилюыинесцентных реакций при Ре2+-индуцированном ПОЛ с различными механизмами возбуждения и эмиссии ХЛ не вызывает сомнений. Этот факт следует учитывать при использовании хемилюминесцентного метода для анализа кинетики свободнорадикаль-ных процессов в мембранных системах.

ГЛАВА 3. Особенности ХЛ при Ее2+-индуцироватюл ПОЛ в фосфатол буфере.

На рис.8 представлена кинетика ХЛ суспензии липосом в фосфатном буфере при добавлении ионов Fe2+ (кривая ХЛ), а также соответствующие кинетические кривые окисления Ре2+ (кривая Pe(II) и накопления продуктов ПОЛ (кривая МДА). Кинетика ХЛ имеет иной характер, чем кинетика ХЛ в трис-буферной суспензии липосом, и не удается выделить все характерные стадии кинетики процесса, подробно рассмотренные в главе I (рис.1). При добавлении Ре2+ к липосомам в фосфатном буфере наблюдается быстрая вспышка ХЛ, после окончания которой ХЛ имеет нарастающий характер. Накопление МДА начинается с момента добавления железа и продолжается в течение длительного времени. Сопоставление кинетики ХЛ и накопления продуктов ПОЛ показывает несоответствие между этими процессами. На рис.8 видно, что уже в течение первых секунд

Рис.8. Кинетика- ХЛ, накопления МДА (ю(532)Л)(6оо)) и расходования ионов Ре. Стрелкой отмечен момент добавления I кМ Ре к суспензии липосом (2 мг/мл фосфоляпидов в 0.1 М КС1, 0,02 ЫКНгР04, рН 7,4).

Рис.9. Кинетика ХЛ (сплошная линия) и накопления МИД (пунктир) при добавлении липосом (2 мг/мл фосфолипидов) г^ЛмМ ?ес одновременно (1,3) и через 10 минут инкубации (2,4) Ре с буфером (0,1 М КС1, 0,02 М кн^РОд, рН 7,4); 5 - кинетика ХЛ при

добавлении I мМ Ре2+ к буферному раствору в присутствии 50 мкМ лшинола.

концентрация Еег+ снижается до десятков микромолей, а с 10-ой минуты фенантролиновый метод уже не позволяет определить "свободного" Ре2+. Тем не менее, процесс ПОЛ не прекращается и на этой стадии кинетики, судя по накоплению МДА.

Для того, чтобы выяснить причину этих, особенностей, мы преаде всего исследовали взаимодействие Рег+ с фосфатом. При добавлении ионов Ре2+ к раствору фосфатного буфера, не содержащего липосом, в присутствии лшинола развивается интенсивная вспышка ХЛ (рис.9, кривая 5), которая свидетельствует об образовании активных форы кислорода. Эта реакция, очевидно, не требует присутствия липидов, однако возникает вопрос о влиянии такого большого количества активных форм кислорода на протекание реакций ПОЛ и кинетику хемилюминесценции в суспензии липосом.

Для выяснения этого вопроса мы сравнили кинетики накопления ЦДА и ХЛ при добавлении липосом в фосфатный буфер до введения Ре2+ и спустя 10 минут инкубации железа с фосфатом. К этому времени происходит практически полное исчезновение свободного Ре2+ (рис.8) и завершается генерация 02~" (судя по кинетике вспышки лгашюл-зависимой ХЛ на рис.9). Оказалось, что при добавлении липосом даже спустя 10 минут после начала инкубации

железа с фосфатным буфером происходило развитие ХЛ и ПОЛ, судя по накоплению МДА (рис.9). Сравнение кинетических кривых накопления МДА (кривые 2 и 4 на рис.9) показывает, что скорость реакции ПОЛ в обоих случаях была примерно одинакова. В то же время, кинетика ХЛ в случае предварительной инкубации железа с фосфатом сильно отличалзсь от контрольной кинетики (кривые I и 3 на рис.9). По-видимому, более высокий уровень ХЛ при окислении Ре2+ в присутствии дилосом (кривая I) обусловлен не только реакциями ПОЛ.

С целью изучения механизма ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ в фосфатном буфере мы применили светофильтры СЗС-8 и ОС-14 для спектрального анализа ХЛ. Постоянный уровень "зеленой" составляющей интегральной ХЛ, которая связана со свободнорадикальным окислением липидов, действительно, находится в соответствии с кинетикой накопления МДА (кривая МДА на рис.8). Напротив, "красная" хемилхвднесценция непрерывно возрастает. Таким образом, нарастающий характер интегральной ХЛ определяется развитием "красного" свечения. Изучение влияния СОД и азида натрия на ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ суспензии липосом в фосфатном буфере подтвердило, что нарастающий характер интегральной ХЛ определяется развитием ХЛ реакций с участием Ре2+ и О^-- и, по всей видимости, имеет ту же самую природу, что и ХЛ на стадии стационарного свечения в трис-буферной системе.

Проведенный наш анализ кинетики ?б2+-индуцированного ПОЛ и сопровождающей его ХЛ суспензии липосом в фосфатном буфере позволяет выделить целый ряд особенностей этой системы, обусловленных взаимодействием железа с фосфатом. Присутствие в среде больших концентраций неорганического фосфата в качестве буфера приводит к почти полному отсутствию "свободного" Уе2+ в системе буквально с момента добавления инициатора. Вероятно, быстрое падение концентрации добавленного Ре2+ обусловлено но только хе датированием, но и быстрым окислением Ре2+, связанного с фосфатом. Поэтому в фосфатном буфере оказывается невозможным наблюдать классические стадии кинетики ПОЛ и сопровождающей его ХЛ. Вероятно, нет оснований считать возрастание уровня ХЛ в фосфатном буфере аналогом медленной вспылит ХЛ, развивающейся вследствие цепного свободнорадикального ПОЛ в трис-<5уферных суспензиях биомембран, как было ранее принято во многих работах. Уровень интегральной ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ в фосфатном буфере не соответствует скорости окисления липидов на протяжении

Рис.10. Зависимость параметров кинетики ХЛ (х и h) v накопления МДА (D(532)/D(6DO)) от объема плазмы крови, добавленной к 2 мл суспензии липосом (2 мг/мл фосфолшшдов в 0.3 Ы KCl, 0.02 М трис-HOl, pH 7.4).

всей кинетики процесса. Это объясняется наложением двуз хемшшминесцентных реакций, из которых только одна непосредственно связана с ПОЛ. С помощью спектрального разделения интегрально! ХЛ удается выделить компоненту свечения, уровень которо] соответствует скорости процесса окисления липидов.

ГЛАВА 4. Использование кинетики гв2+-инЭуцированной ХЛ в трис-буферной суспензии липосол в качестве тестовой сиапежы дл изучения леханшла АО А на прилере плазмы крови.

Среди рассмотренных нами ХЛ систем наиболео удобной дл скрининга антиокислительной активности препаратов являете кинетика ХЛ при ?е2+-индуЦированнсм ПОЛ в трис-буферной суспензи липосом. Преимущество этой системы заключается в том, чт кинетика ХЛ разделена на четко выракенные стадии, связанные протеканием различных элементарных реакций, механизм ХЛ которь был подробно изучен наш в главах I и 2. Для изучения А( наибольший интерес представляют первые три стадии кинетш быстрая вспышка, латентный период и медленная вспышка , котор1 отражают развитие процесса Ре2+-индуцированого ПОЛ.

На рис.Ю представлены зависимости параметров кинетики : (латентного периода и амплитуды медленной вспышки) и накоплен продуктов ПОЛ от количества добавленной плазмы к суспенз липосом при Ре2+-шдуцярованном ПОЛ. Оказалось, что, хотя плаз крови вызывает ускорение развития ПОЛ, судя по сокращен латентного периода, но уменьшает количество продуктов ПОЛ, ч может свидетельствовать об антиокислительном действии.

Для выяснения вопроса о том, какие компоненты плазмы крови обуславливают ее антиокислительные свойства, мы исследовали влияние различных компонент на накопление продуктов ПОЛ в суспензии липосом. Все исследованные вещества, кроме альбумина, уменьшали количества ТБК-активных продуктов. Величина этого эффекта уменьшалась в ряду: церулоплазмин (ЦП) > трансферрин (ТР) > НСОд- > а-токоферол. Таким образом, АОА плазмы может быть результатом их суммарного действия, однако механизм АОА действия этих веществ, по всей видимости, различен.

Для выяснения механизмов АО действия плазмы мы проанализировали влияние различных компонент плазмы, на кинетику ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ. Оказалось, что уменьшение латентного периода под действием плазмы может быть обусловлено четырьмя соединениями, эффект которых уменьшается в ряду: альбумин > ТР > ЦП > НСОд-. Механизм АОА действия ТР, ЦП и НСОд-, судя по эффекту уменьшения латентного периода, вероятно, определяется взаимодействием этих соединений с Ре2+ и изъятием части железа из реакций ПОЛ за счет окисления (в случае ЦП) или за счет связывания (в случае ТР и НСОд"). Поскольку альбумин не оказывал влияния на накопление продуктов ПОЛ, можно предположить, что сокращение латентного периода при его добавлении обусловлено блокированием мест связывания Fe2+ на липосомах аналогично действию катионов металлов, как было описано в главе I. Необходимо отметить, что эффект а-токоферола на кинетику ХЛ совершенно противоположен эффекту плазмы, и его действие в нашей системе на фоне других компонент плазмы крови оказывается совершенно незаметным. Таким образом, АО действие плазмы крови по отношению к Ре +-индуцированному ПОЛ в основном обусловлено содержанием в плазме крови ЦП, ТР и НСОд-.

Следует обратить внимание, что такой механизм АО действия плазмы крови справедлив только в случае Ре2+-индуцированного ПОЛ и может быть другим при других способах инициирования. Однако, учитывая ведущую роль ионов Ре2+ в свободнорадикальной патологии мембран, можно считать, что данные, полученные в предложенной наш системе отражают реальные механизмы АО действия плазмы крови in vivo. Поэтому нам представляется целесообразным использовать кинетику ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ в суспензии. липосом в трис-буфере для скрининга и изучения механизма АО действия различных препаратов.

ГЛАВА 5. Применение лазерных красителей - производных куларшю -в качестве селективных сенсибилизаторов ХЛ для исследования ге2+-индуцированного ПОЛ.

Было изучено влияние 21 соединения кумаринового ряда с различной химической структурой на ХЛ липоссм. Многие из использованных соединений оказались эффективными сенсибилизаторами ХЛ на стадиях быстрой вспышки, латентного периода и медленной вспышки, но при этом практически не оказывали влияния на стадии стационарного свечения. Таким образом, усиление ХЛ наблюдалось только на стадиях кинетики ХЛ, связанных с реакциями цепного окисления липидов. Концентрационные зависимости эффективности сенсибилизации ХЛ различными соединениями показали, что производные кумарина с хинолизиновым циклом (тип 1У) являются очень эффективными сенсибилизаторами ХЛ в липосомах. Самым сильным эффектом обладало соединение К-525, которое в концентрации 16 мкМ усиливало амплитуду медленной вспышки в 1670 раз. Другие соединения этой группы также усиливали ХЛ на 2-3 порядка величины. Сенсибилизация ХЛ соединениями с немодифицированшм кумариновым ядром и пирролидиновым циклом была значительно слабее (менее одного порядка величины). Производное кумарина с пинеридиновым циклом (тип II) занимало промежуточное положение между этими группами кумаринов (максимальное усиление медленно! вспышки в 204 раза, но при гораздо более высокой концентрации -106 мкМ). В таблице приведены величины максимального эффекта дл$ наилучших сенсибилизаторов, полученные из соответствующие концентрационных зависимостей.

Табл.]

Максимальная степень усиления ХЛ на стадии медленной вспышки для наиболее эффективных производных кумарина.

Шифр Тип Макс, степень Концентрация,

соединения усиления ХЛ мк М

К-525 IY 1670 16.8

K-5I0 IY 992 53

К-338 IY 733 0.53

К-153 IY 350 2.6

К-504 IY 585 92

К-487 IY 446 59

К-522 II 204 106

Рис.11. Зависимость степени усиления ХЛ на стадии медленной вспышки в суспензии липосом (2 мгЛш-фосфолипидов в 0,1 М КС1, 0,02 М трис-Н01, рН 7,4 + 100 мкМ Ее* ) и в реактиве Фентона (400 мкМ Н2Р2 + 100 мкМ Ре ) от концентрации К-525.

Рис.12. Зависимость амплитуды быстрой вспышки ХЛ от концентрации лшюпротеинов низкой плотности в образце, содержащем 0.1 М К01, 0.02 М Трис-НС1, рН=7.4: I - в отсутствие сенсибилизатора; 2 - в присутствии 1мкМ К-525. Концентрация добавленного РеЕТ - 1 мМ.

Для изучения механизма сенсибилизации ХЛ было выбрано наиболее аффективное соединение К-525. Чтобы ответить на вопрос, в каких реакциях происходит возбуждение ХЛ, сенсибилизированной К-525, было исследовано влияние этого соединения на ХЛ реактива Фентона. На рис.11 представлены концентрационные зависимости сенсибилизации ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ в липосомах (I) и при взаимодействии Ре2+ с Н^ (2). Оказалось, что эффективность сенсибилизации ХЛ реактива Фентона соединением К-525 на 3 порядка меньше по сравнению с ХЛ липосом. Это свидетельствует о зысокой селективности сенсибилизатора по отношению к хемилюминесцентным реакциям липидных радикалов.

Анализ физико-химических параметров соединений хвнолизиново-го цикла показал, что эффективность сенсибилизации увеличивается с увеличением длины волны максимума в спектре поглощения и коэффициента экстинкции. Наибольшей способностью к сенсибилизации ХЛ липосом обладало соединение К-525, имеющее самый длинноволновый максимум поглощения и наибольший коэффициент экстинкции. Эти данные можно рассматривать как аргумент в пользу механизма сенсибилизации за счет триплет-триплетного переноса энергии, т.е. по физическому типу.

На рис.12 представлены концентрационные зависимости

амплитуды быстрой вспышки ХЛ при добавлении избытка железа к суспензии липопротеинов, содержавших липидные перекиси, от концентрации ЛНП. Видно, что амплитуда быстрой вспышки ХЛ возрастала пропорционально концентрации ЛНП, начиная примерно с I мкг/мл липопротеинов (кривая I), Эту концентрацию для данного препарата ЛНП следует считать минимальной, ниже которой определение гидроперекисей невозможно из-за ограниченной чувствительности прибора. Линейный характер зависимости сохранялся и в случае ХЛ, сенсибилизированной К-525. Хорошо видно, что применение сенсибилизатора позволяет не только усилить амплитуду быстрых вспышек по сравнению с контролем более чем на два порядка величины, но и снизить минимальную пороговую концентрацию ЛНП, при которой возможно хекилюминесцентное определение липидных гидроперекисей, до 0.01 мкг/мл.

Таким образом, лазерные красители на основе кумарина можно считать весьма перспективными сенсибилизаторами ХЛ при ПОЛ не только в модельных системах, но и в нативных препаратах. Обнаруженное нами соединение К-525, вероятно, является лишь одним из возможных сенсибилизаторов, обладающих подходящими свойствами для применения в биологически! системах. Это позволяет рассчитывать в дальнейшем на более широкое применение'сенсибилизированной ХЛ как метода изучения ПОЛ в медико-биологических исследованиях и клинической практике.

ВЫВОДЫ:

1.Изучена кинетика ПОЛ, ивдуцированного ионами Ре2+ в трис-буферной суспензии липосом» и зависимость ее параметров от концентрации Рег+, липосом, хелаторов и катионов непереходных металлов. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что все особенности кинетики объясняются изменением реально? концентрации Ре2+, связанного с фэсфолипидными мембранами. Другие факторы влияют на кинетику процесса ПОЛ постольку, поскольку ош влияют на концентрацию Ре2+ на поверхности мембран.

2. Изучены спектральный состав ХЛ, а также влияние состав/ среды и различных ингибиторов свободнорадикальных реакций н. различные стадии кинетики ХЛ, сопровокдающей процес Ре2+-индуцированного ПОЛ в суспензии липосом. Показано, чт кинетика ХЛ, сопровождающая Ре2+-индуцированное ПОЛ в мембранны системах, является результатом суперпозиции двух жемилюминесцент ных реакций, из которых только одна непосредственно связана реакциями липидных радикалов и отражает скорость свободно

радикального окисления липидов. Предложен метод, основанный на выделении спектральной области ХЛ, связанной именно с цепными реакциями свободнорадикального окисления липидов.

3. Исследовано влияние плазмы крови и отдельных молекулярных компонентов на различных стадиях кинетики ХЛ при Рег+-индуцированном ПОЛ в трис-буферной суспензии липосом. Обнаружено, что антиокислительные свойства плазмы крови в основном определяются соединениями, удаляющими ионы Ре2+ из системы: трансферрином, церулоплазмином и карбонатом. Показано, что эта система может быть использована как удобная экспериментальная модель не только для тестирования, но и для изучения механизмов антиокислительной активности различных препаратов, в частности, плазмы крови человека.

4. Проведен скрининг сенсибилизаторов ХЛ среди лазерных красителей кумаринового ряда. Выявлены соединения, способные к селективному усилению ХЛ, сопровождающей реакции свободно-радикального окисления липидов. Наиболее активные соединения усиливали ХЛ более чем на 3 порядка величины и не влияли на изучаемые реакции.

5. Показано, что лазерные красители кумаринового ряда активируют вспышку Ре2+-индуцированной ХЛ в липопротеинах низкой плотности плазмы крови человека. Применение этих соединений позволяет более чем на два порядка величины уменьшить концентрацию липопротеинов, необходимую для измерения амплитуды вспшпки ХЛ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Дремина Е.С., Шаров B.C., Владимиров Ю.А. Роль связывания ионов железа поверхностью липидных мембран в развитии кинетики хемилюминесценции при перекисном окислении липидов в суспензии липосом. Тез.докл. 3 Всесоюзного совещания по хемилюминесценции. Рига: Латв.Ун-т, 1990. С.75.

2.Driomina E.S., Sharov V.S. Mechanism of ferrum-induced chemiluminescence of lipid systems. Abstracts of XXIII General Assembly of the URSI (Prague, Czechoslovakia, 1990), v»2, p.5.09.

3.Sharov V.S., Driomina E.S., Putvinsky A.V., Vladimirov Yu.A. Intrinsic and enchanced chemiluminescence accompanying lipid peroxidation. J. of Bioluminescence and Chemiluminescence, 1991, v.6, N 4, p.282.