Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика молекулярно-генетических причин возникновения синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика молекулярно-генетических причин возникновения синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена"

На правах рукописи

904605210

ЕРМАКОВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРИЧИН ВОЗНИКНОВЕНИЯ СИНДРОМОВ ПРАДЕРА-ВИЛЛИ И ЭНЖЕЛЬМЕНА

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ИЮН 2010

Москва - 2010

004605210

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских нау Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Немцова Марина Вячеславовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Носиков Валерий Вячеславович

доктор биологических наук Петрова Ника Валентиновна

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится « 2010 г. в « » часов на заседани

Диссертационного совета Д 001.016.01 при МГНЦ РАМН по адресу: 11547? Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российско академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН п адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан « ^ » ^^■<£>-2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций^

доктор медицинских наук, профессор Зинченко

Актуальность проблемы

Синдромы Прадера-Вилли (СПВ) и Энжельмена (СЭ) относятся к наиболее распространённым генетическим заболеваниям. Частота синдромов в эазличных популяциях составляет 1:10000-1:20000 новорожденных (Cassidy et. il., 2009; Van Buggenhout et. al., 2009). Эти заболевания известны, как "енетические синдромы, связанные с нарушением импринтинга, их причиной шляются повреждения различного генеза в блоке импринтированных генов, неположенных в 15qll-ql3. Основными проявлениями этих заболеваний шляются тяжелые неврологические расстройства в сочетании с умственной угсталостью, степень которой при СПВ может быть различной, а при СЭ (остигает идиотии. Исходя из высокой частоты синдромов в популяции, >азработка надежных методов ранней ДНК-диагностики СПВ и СЭ является адачей большой социальной значимости.

Исследование хромосомного набора пациентов с применением ысокоразрешающих цитогенетических методов для диагностики этих аследственных синдромов, имеет ряд недостатков. Главными из них являются ысокий риск ложноотрицательных результатов в связи с трудностями изуального обнаружения микроделеций критического района 15qll-ql3, а акже невозможность выявления функциональных нарушений этой ромосомной области, которые не сопровождаются структурными ерестройками хромосомы 15.

Наиболее частой причиной возникновения СПВ и СЭ становится «терстициальная делеция критического района хромосомы 15ql l-ql3, которая знаруживается у 70-75% пациентов. СПВ возникает в результате делеции на гцовской хромосоме, а СЭ - в случае делеции того же района на ее ггеринском гомологе.

Другой причиной развития этих синдромов является однородительская [сомия (ОРД). В 25% случаев при СПВ наблюдается однородительская 1теринская дисомия критического района 15qll-ql3, наличие отцовской [сомии этого района приводит к возникновению СЭ в 5% случаев.

Кроме структурных и функциональных нарушений критического район; существует ряд других причин, приводящих к развитию этих заболеваний. Е 20% случаев при СЭ обнаруживаются точковые мутации в гене-кандидат< иВЕЗА, который расположен в ^114(13 и имеет материнскую экспрессию. Р также, причиной развития этих наследственных синдромов являются мутации I делеции в регуляторном элементе, названном центром импринтинга (ЦИ) которые выявляются у 2% пациентов. Определение мутаций в гене иВЕЗА 1 делеций/мутаций в ЦИ необходимо при медико-генетическо* консультировании семьи и планировании рождения здорового потомства поскольку именно эти генетические причины обуславливают максимальны] риск повторного рождения ребенка с СПВ или СЭ.

Также имеются сообщения о вовлечении района д 11 -<513 хромосомы 15 инвертированные дупликации, несбалансированные и сбалансированны транслокации и инверсии, которые могут приводить к возникновению СПВ : СЭ.

Многообразие молекулярных форм патологии, приводящих к развитш этих заболеваний, ставит вопрос о разработке адекватных методов диагностик! основанных на применении новейших молекулярно-генетических технологи! Разработка методов ДНК-диагностики СПВ и СЭ стала возможной благодар новым сведениям о молекулярной организации критического район хромосомы 15, полученным при изучении геномного импринтинга у человек; В основу диагностического теста для СПВ и СЭ положена информация о особенностях аллельного метилирования в некоторых локусах критическог района и его изменениях при этих заболеваниях. Разработка методологии диагностического протокола для этих заболеваний позволит предложить новь: подходы к медико-генетическому консультированию пациентов и их семе) Применение таких подходов является важной задачей, учитывая тяжель неврологические проявления этих наследственных заболеваний, особенно пр СЭ.

Разработка молекулярных методов диагностики позволят разделить «следственные и спорадические случаи этих тяжелых заболеваний и федложить пренатальную ДНК-диагностику в семьях, имеющих повышенный шск рождения детей с СПВ и СЭ.

Цель и задачи исследования Цель: изучение структуры и частоты молекулярной патологии при индромах Прадера-Вилли и Энжельмена и разработка ДНК - диагностического [ротокола для этих заболеваний.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Выявить структурные и функциональные нарушения критического района 15qll-qlЗ, приводящие к развитию синдрома Прадера-Вилли в исследуемой выборке больных.

2. Выявить структурные и функциональные нарушения критического района приводящие к развитию синдрома Энжельмена в исследуемой выборке больных.

3. Исследовать мутации в гене 11ВЕЗА у пациентов с синдромом Энжельмена, у которых не выявлена патология импринтинга, и оценить их частоту.

4. Разработать оптимальные подходы для молекулярно-генетической диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена.

5. Разработать ДНК - диагностический протокол для пациентов с синдромами Прадера-Вилли и Энжельмена.

Научная новизна полученных результатов

Впервые предложен комплексный подход в молекулярно-генетической 1 агностике наследственных заболеваний, связанных с нарушением -тринтинга в критическом районе который включает тест на

¡следование аномального метилирования промоторной области гена SNRPN, 1кросателлитный анализ локусов для дифференцировки делеции и (нородительской дисомии, а также определение мутаций в гене-кандидате

иВЕЗА для СЭ. В результате применения такого подхода к диагностике впервые появилась возможность определить весь спектр молекулярной патологии, включающий структурные и функциональные повреждения критического района 15ц11-я13, приводящий к развитию СПВ и СЭ. Впервые в России проведен поиск мутаций в гене иВЕЗА у пациентов с клиническим диагнозом синдрома Энжельмена без нарушения аллельного метилирования импринтированных генов. Выявлено пять мутаций (1У84-22с1е18, р.Суз21Туг, р.А^482Х, р.А^506Суз, с.2568_2571с!е14) и один полиморфный вариант (р.А1а178ТЬг) в разных экзонах гена [/ВЕЗА, одна мутация описана впервые. На основе полученных результатов впервые был предложен алгоритм исследования пациентов для выявления всех молекулярных нарушений, приводящих к развитию СПВ и СЭ.

Практическая значимость результатов исследования

В результате выполненной работы предложены эффективные методы молекулярно-генетической диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена, которые могут быть использованы в медико-генетических центрах и клинических лабораториях в России. Применение этих методов позволяет определить все причины, приводящие к возникновению этих заболеваний у пациентов для разделения спорадических и наследственных случаев. Выявление мутаций в гене ЦВЕЗА, делеций/мутаций ЦИ или робертсоновских транслокаций (15; 15) имеет исключительно важное значение для медико-генетического консультирования семьи и планирования рождения здорового потомства, поскольку именно эти генетические причины обуславливают максимальный риск повторного рождения ребенка с СПВ или СЭ. В представленной работе впервые проведено исследование спектра и частоты мутаций в гене иВЕЗА на выборке российских пациентов с СЭ. Впервые в России предложен полный и эффективный молекулярно-генетический протокол для диагностики СПВ и СЭ.

Положения, выносимые на защиту

1. В структуре молекулярной патологии критического района 15я11 -ц 13, связанного с геномным импринтингом, делении и однородительские дисомии являются наиболее частыми причинами, приводящими к развитию СПВ и СЭ.

2. В диагностике СПВ и СЭ необходимо использовать комплекс молекулярно-генетических методов для выявления нарушений импринтинга в критическом районе 15ql 1 -ц 13, который включает: тест на исследование аномального метилирования промоторной области гена БМЯРН, микросателлитный анализ локусо.в для дифференцировки делении и однородительской дисомии, и определение точковых мутаций в гене иВЕЗА для пациентов с СЭ без нарушения метилирования импринтированных генов.

3. Исследование спектра и частоты мутаций в гене ШЕЗА является необходимым для диагностики пациентов с СЭ при нормальном статусе метилирования импринтированных генов критического района.

4. Разработка ДНК - диагностического протокола для СПВ и СЭ позволит выявить пациентов с различными формами молекулярной патологии и повысить эффективность диагностики и медико-генетического консультирования семей имеющих повышенный риск рождения детей с СПВ и СЭ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на расширенном заседании кафедры медицинской генетики РМАПО (Москва, 2009), представлены в материалах конференции молодых ученых, посвященной 80-летию РМАПО (Москва, 2010) и в материалах VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании ученого совета МГНЦ РАМН 20 апреля 2010 года.

Личный вклад автора в проведение исследования. Автор лично принимал участие в анализе отечественной и зарубежной литературы по теме

диссертации, планировании экспериментов и получении основной части результатов. Автор самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из крови пациентов, проводил тесты для определения нарушения метилирования критического района 15qll-ql3, микросателлитный анализ для дифференцировки делеций и однородительских дисомий в семьях пациентов с СПВ и СЭ. Также автор самостоятельно разработал протокол секвенирования и провел анализ мутаций в гене UBE3A у больных СЭ без нарушения импринтинга в критическом районе 15qll-ql3. Принимал непосредственное участие в разработке диагностических протоколов для СПВ и СЭ. Автор сформулировал выводы и опубликовал статьи, отражающие основные результаты диссертационной работы.

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 4 печатных работах. Из них 2 статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ и 2 тезисов.

Внедрение результатов работы. Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в работу МГНЦ РАМН.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (155 наименований). Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 20 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В группу исследования были отобраны пациенты с клиническим) признаками СПВ и СЭ. Пациенты направлялись из КПО МГНЦ РАМН, ДКБ Jd 13 им. Н.Ф. Филатова, Московского Научно-исследовательского институт педиатрии и детской хирургии (МНИИ).

Геномную ДНК из лимфоцитов периферической крови необходимо степени чистоты и достаточного молекулярного веса выделяли стандартным методом (Sambrook et. al., 1989).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого многоканального амплификатора ДНК «Терцин» фирмы ДНК-Технология с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы «ИнтерЛабсервис» г. Москва. В работе была использована метилспецифическая ПЦР (МС-ПЦР), микросателлитный анализ, SSCP-анализ и прямое секвенирование ДНК.

Для проведения скрининга мутаций в гене UBE3A были сконструированы олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие кодирующие экзоны гена и прилегающие интронные области. Праймеры были подобраны с помощью программы Oligo 4.0 и отработаны оптимальные условия для проведения ПЦР. Для поиска точковых мутаций и полиморфных вариантов в транслируемых экзонах гена UBE3A использовали метод анализа SSCP (single strand conformation polymorphism) с температурной денатурацией и последующим разделением фрагментов в 8-10%-ном полиакриламидном геле. Визуализация результатов электрофореза проводилась с помощью стандартного метода окраски нитратом серебра.

При выявлении аномальных фрагментов ДНК проводили прямое секвенирование определенного участка экзона гена согласно протоколу ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits ("Applied Biosystems", США). Результаты ;еквенирования анализировали при помощи программы Chromas и геномных >аз данных NCBI и UCSC. Оценку влияния определенного структурного ирушения на вероятность возникновения/потери сайта сплайсинга проводили фи помощи программы SpliceView (WebGene).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ аллельного метилирования промоторной области гена

NRPN

Для диагностики СПВ и СЭ на первом этапе использовали анализ ялельного метилирования промоторной области гена SNRPN методом етилспецифической полимеразной цепной реакции (МС-ПЦР). Анализ был

проведен у 100 пациентов с предварительным диагнозом СПВ и 50 пациентов с предварительным диагнозом СЭ. В результате проведенного исследования у 63 из 100 пациентов с клиническими проявлениями СПВ, был выявлен фрагмент длиной 131 п.н., соответствующий метилированному материнскому аллелю, при отсутствии отцовского неметилированного аллеля, длиной 164 п.н., утраченного вследствие делеции или однородительской дисомии. У 18 из 50 пациентов с СЭ наблюдался фрагмент длиной 164 п.н., соответствующий отцовскому неметилированному аллелю. Второй метилированный аллель утрачен в результате структурного или функционального нарушения в районе 15я11ч[13 (рис. 1). Таким образом, молекулярный анализ выявил у этих пациентов молекулярно-генегические нарушения критического района, что подтверждает клинический диагноз у 63% пациентов с СПВ и у 36% пациентов с СЭ из исследуемой нами выборки (табл. 1).

f tMMrf toNMt ЬшШ I«.' MMWf MMf

164 п н 131 n ii

Рис. 1. Анализ аллельного метилирования промоторной области гена SNRPN методом метилспецифической ПЦР с двумя парами праймеров «Met» и «Unmet»

М ~ маркер длины фрагментов ДНК Pucl9/HpaII

1,2,9,10 - фрагмент 131 п.н., соответствующий ПЦР-продукту, полученному с материнской хромосомы, метилированная форма. Подтверждает синдром Прадера-Вилли у пациентов.

3,4 - фрагмент 164 п.н., соответствующий ПЦР-продукту, полученному с отцовской хромосомы, неметилированная форма. Подтверждает синдром Энжельмена у пациентов.

5,6,7,8,11,12,13,14 - ПЦР-продукты 131 п.н. и 164 п.н., характерные для нормы.

Таблица 1

Результаты анализа аллельного метилирования промоторной области гена SNRPN

Клинические признаки синдромов

Общее число пациентов

Количество положительных результатов

Количество отрицательных результатов

Прадера-Вилли

100(100%)

63 (63%)

37 (37%)

Энжельмена

50 (100%)

18(36%)

32 (64%)

Анализ аллельного метилирования с большой надежностью позволяет подтвердить или исключить диагноз у пациентов с СПВ и СЭ, но не дает представления об истинной молекулярной причине заболевания.

2. Анализ микросателлитного полиморфизма локусов критического района 15qll-ql3

! С целью выявления делеций и однородительских дисомий был применен микросателлитный анализ локусов критического района. Локусы D15S11 и D15S113 характеризуются большим количеством аллелей и высокой гетерозиготностью. Локус D15S11 входит в наименьшую область перекрывания всех делеций при СПВ, локус D15S113 расположен внутри области перекрывания всех делеций при СЭ. Делеции стандартной ~ 6 м.п.н. протяженности обычно затрагивают оба локуса.

Микросателлитный анализ был применен для всех пациентов и членов их семей с подтвержденным диагнозом СПВ и СЭ (рис. 2). Делеции отцовского происхождения при СПВ, обнаружены у 47 из 63 пациентов (75%), для 16 из 63 пациентов при СПВ (25%) была установлена материнская однородительская дисомия. У 17 из 18 пациентов (94%) с СЭ в результате проведенного анализа была выявлена делеция материнского аллеля. Отцовская однородительская дисомия на основании присутствия только отцовских аллелей, при отсутствии материнских, была установлена для 1 из 18 пациентов (6%) с СЭ (табл. 2).

Рцс19/ del del ОРД

Hpall в СПВ $ S СЭ $ в СПВ $

Рис. 2. Анализ микросателлитного полиморфизма локуса D15S11 у пациентов с СПВ и СЭ и их родителей

СПВ - ДНК пациента с синдром Прадера-Вилли; СЭ - ДНК пациента с синдром Энжельмена; с? - отец, 5 - мать; del - делеция; ОРД -однородительская дисомия.

ШЩ.

Таблица 2

Результаты анализа микросателлитного полиморфизма локусов 015811 и Р15Э113 у пациентов с СПВ и СЭ__

Пациенты с подтвержденным диагнозом синдромов Общее число пациентов Делеция, (%) Однородительская дисомия, (%)

СП В 63 (100%) 47 (75%) 16(25%)

СЭ 18(100%) 17(94%) 1 (6%)

3. Анализ точковых мутаций в гене-кандидате иВЕЗА

В настоящей работе у 32 пациентов с клиническими признаками СЭ, но без нарушения аллельного метилирования критического района, был проведен поиск мутаций в девяти кодирующих экзонах (с 5 по 13) и фланкирующих интронных областях гена иВЕЗА методом ЗБСР-анализа с последующим секвенированием.

В результате проведенных исследований у пациентов с клиническими признаками СЭ и нормальным статусом метилирования отцовской и материнской хромосомы 15, обнаружено пять различных мутаций (1У84-22ёе18, р.Суз21Туг, р.А^482Х, р.А^506Суэ, с.2568_257Ые!4) и один полиморфный вариант (р.А1а178ТЬг) (табл. 3).

Таблица 3

Мутации и полиморфный вариант, обнаруженные в гене ШЕЗА у пациентов с СЭ

№ п/л Код исслед. Локализация в гене Изменение в нуклеотидной последовательности Изменение в аминокислотной последовательности Тип мутации Авторы

1 Р23 нитрон 4 1У54-22ёе18 - сплайсинг Описана впервые

2 С9 экзон 5 с.1230>А р.Суз21Туг миссенс Рап§ е1 а1 1999

3 К27 экзон 6 с.1505С>Т р.А^482Х нонсенс Рлкэо е! а1„ 2000

4 012 экзон 6 С.15770Т р.А^506Суз миссенс СашргиЫ е! а1., 200

5 Ш экзон 13 с.2568_257Ые14 - сдвиг рамки [.ОБвк ее а!., 2001

6 г\б экзон 6 с.593 в>А р.А1а178ТЬг полиморфизм Ларакко ег а1., 200

У пациента Р23 обнаружена мутация сайта сплайсинга четвертого интрона (1У84-22ёе18) (рис. 3). Подобного изменения не выявлено у родителей

больного, мутация описана впервые и произошла de novo. При использовании программы SpliceView (WebGene) удалось подтвердить, что эта мутация приводит к нарушению сайта сплайсинга пятого экзона гена UBE3A. Миссенс мутация в экзоне 5 (p.Cys21Tyr) определена у больного С9, описана ранее и наследуется от матери. У больного К27 выявлена нонсенс мутация в экзоне 6 (p.Arg482X), описана ранее и встречается, как в семейных, так и в спорадических случаях СЭ. Миссенс мутация (p.Arg506Cys) в 6 экзоне обнаружена у больного D12, данная мутация описана ранее и встречается в семейных случаях. У больного U5 выявлена мутация со сдвигом рамки считывания (c.2568_2571de!4) в экзоне 13, ранее описана другими авторами, в нашем случае является мутацией de novo. По данным литературы, это наиболее часто встречающаяся мутация среди больных с СЭ (Camprubi С. et al., 2009). Кроме выявленных патогенных мутаций, приводящих к развитию заболевания, у одного больного Z16 обнаружена нуклеотидная замена (p.Alal78Thr) не вызывающая патологии. Данная замена описана несколькими авторами как полиморфный вариант, может наследоваться от отца, и с малой частотой | встречается в контрольной группе, что позволяет судить о ней, не как о мутации, а как о нейтральном полиморфизме (Rapakko К. et ah, 2004).

'ис. 3. Электрофореграмма ПЦР-продуктов экзона 5 гена UBE3A у пациента Р23

: лс. 4. Результат секвенирования участка экзона 5 гена UBE3A у пациента Р23

В результате обследования родителей пациентов с СЭ, имеющих мутацию в гене UBE3A, было выявлено два случая из пяти передачи мутации от матери (пациенты D12 и С9). Оба пациента (D12 и С9) с СЭ были гетерозиготами по той же самой мутации, что и их фенотипически нормальные матери. В других трех семьях матери пациентов с СЭ не имели мутантных аллелей или признаков мозаицизма. Это означает, что мутация возникла de novo у пациента и привела к развитию заболевания.

При исследовании пациентов с СЭ зарубежными авторами, точковые мутации были обнаружены во всех кодирующих экзонах в гене UBE3A с преимущественной локализацией в экзоне бив экзоне 13 (Kishino et. al., 1998; Lossie et. al., 2001; Camprubi et. al., 2009). Преобладают мутации со сдвигом рамки считывания и нонсенс мутации, которые приводят к полной потере белка или образованию белка, не способного нормально функционировать.

По литературным данным, точковые мутации в гене UBE3A, чаще обнаруживают в семейных случаях (75-80%), чем в спорадических (14 - 44%), среди пациентов с нормальным метилированием критического района (Malzac et. al., 1998; Fang et. al., 1999; Lossie et. al., 2001). В некоторых случаях, точковые мутации в гене UBE3A возникают de novo, непосредственно в материнской гамете и наследуются от матери. Предполагается, что соотношение мутаций, возникающих в женских и мужских гаметах примерно равное. Существует мнение, что замены одного нуклеотида, более вероятно, будут происходить в сперматогенезе, в результате увеличения числа клеточных делений в процессе мужского гаметогенеза, в то время как делеции или инсерции могут быть связаны с событиями, происходящими в предмейотической или мейотической стадиях в женском гаметогенезе (Camprubi et. al., 2009).

В остальных случаях молчащие мутации передаются от отца к сыну, не имея фенотипического проявления, потому что ген UBE3A имеет моноаллельную материнскую экспрессию. Мутация не проявится, если она будет передана от отца-носителя к дочери, в этом случае девочка будет здорова.

Фенотипическое проявление возникнет при передаче данной мутации от дочери к ее детям, т.е. через поколение. При формировании половых клеток у такой женщины должна произойти переустановка импринта - эпигенетической маркировки, приводящей к различиям в экспрессии родительских аллелей, которая приведет к активации материнского аллеля, в результате чего мутация проявится.

В настоящем исследовании точковые мутации в гене были выявлены у 5 из 32 (16%) больных, у которых исключены нарушения метилирования критического района.

По данным литературы, мутации в гене 11ВЕЗА рбнаруживают примерно в 20% случаев у пациентов с синдромом Энжельмена. Однако в разных работах частота выявления мутаций в гене 1/ВЕЗА имеет значительный разброс, и варьирует от 8% до 35% для разных выборок пациентов. Такая частота мутаций у пациентов может иметь несколько объяснений. Во-первых, вероятно наличие дефектов в других, пока не установленных локусах, расположенных либо в критическом районе хромосомы ^11^13, либо за его пределами на других хромосомах. Известно, что в критическом районе локализован ген 4ТР10С, расположенный приблизительно в 200 т.п.н. дистальнее гена 1/ВЕЗА, и имеющий материнскую экспрессию. Существует предположение, что этот ген гоже играет роль в формировании фенотипических проявлений СЭ. Кроме того, существуют другие гены, повреждения в которых вызывают клинический фенотип, сходный с фенотипом СЭ. Например, ген МЕСР2, нарушения в котором приводят к развитию синдрома Ретга. Поскольку, эти клинические синдромы имеют похожий фенотип, необходимо проводить цифференциальную диагностику СЭ и синдрома Ретга (,1ес1е1е с1. а1., 2007). Также необходимо дифференцировать СЭ от синдромов Х-сцепленной альфа-талассемии/синдрома умственной отсталости (АТЫ-Х) и делеции 22ц 13 (Уап Buggenhout е1. а1., 2009). Во-вторых, метод ЗБСР-анализа имеет некоторые ограничения чувствительности, и позволяет выявлять только 80 - 90% точковых мутаций. В-третьих, значительные различия в частоте мутаций можно

объяснить недостаточно четкими критериями клинического отбора больных для лабораторной диагностики.

4. Исследование структуры и частоты молекулярной патологии, приводящей к развитию СПВ и СЭ

В результате работы получены данные о молекулярных причинах,

приводящих к развитию СПВ и СЭ, на исследуемой выборке пациентов.

>

ф - пациенты с нарушением метилирования

0 - пациенты без нарушения метилирования

(§) - пациенты с делецией района отцовской хромосомы 15д11- д13

© - пациенты с материнской ОРД

Рис. 5. Структура выявленной молекулярной патологии в исследуемой группе пациентов с СПВ

у) - пациенты с нарушением метилирования

@ - пациенты с делецией района материнской хромосомы 15ч11- qlЗ ф - пациенты с отцовской ОРД ^ - пациенты без нарушения метилирования (2) - пациенты с мутациями в гене 1/ВЕЗА - пациенты без выявленных мутаций

Рис. 6. Структура выявленной молекулярной патологии в исследуемой группе пациентов с СЭ

Среди пациентов с СПВ и нарушением метилирования критического района, делеция района отцовской хромосомы 15qll-ql3 обнаружена в 75% случаев, а однородительская материнская дисомия в 25% случаев. У пациентов с СЭ и нарушением метилирования критического района, делеция района материнской хромосомы 15qll-ql3 выявлена в 94% случаев, что несколько превышает частоту делеций, установленных в исследованиях других авторов, которая составляет 70-75% (Van Buggenhout et. al., 2009). Частота однородительской отцовской дисомии, обнаруженная у больных с СЭ в настоящем исследовании, составляет 6%. Мутации в гене UBE3A у пациентов СЭ с нормальным статусом метилирования критического района обнаружены в 16% случаев. Частота молекулярной патологии, делеций, однородительских дисомий и мутаций в гене UBE3A, сходна с частотой определяемой в других исследованиях для СПВ и СЭ. К сожалению, нам не удалось обнаружить пациентов с нарушением центра импринтинга, однако, предложенные методы исследования молекулярно-генетических причин, приводящих к СПВ и СЭ, позволяют выявить таких больных.

Полученные результаты согласуются с данными литературы, где наиболее частой причиной возникновения СПВ и СЭ становится интерстициальная делеция критического района 15qll-ql3, а также однородительская дисомия. Около 20% случаев, причиной, приводящей к развитию СЭ, становятся мутации в гене UBE3A (Sartori et al., 2008).

5. Разработка ДНК - диагностического протокола для СПВ

Практическая целесообразность молекулярной диагностики СПВ и СЭ с привлечением молекулярно-генетических методов объясняется, во-первых, вариабельностью фенотипических проявлений и трудностями дифференциальной диагностики с другими наследственными патологиями; во-вторых, необходимостью профилактики в связи с исключительной тяжестью неврологических расстройств (особенно при СЭ); в-третьих, довольно высокой распространенностью в популяции и, наконец, особой необходимостью своевременного выявления наследуемых форм СПВ и СЭ, когда медико-

генетическое консультирование и пренатальная диагностика могу» способствовать рождению здорового потомства.

Для наиболее полного обследования пациентов с клиническим диагнозов СПВ и членов их семей предложены следующие диагностические подходы для выявления структурных и функциональных нарушений критического район; хромосомы 15ql l-ql3 (рис. 7).

1) Цитогенетическое исследование кариотипа пациентов с СПВ с цельк исключения хромосомных перестроек, представленных инвертированным! дупликациями, инверсиями, сбалансированными и несбалансированным! транслокациями хромосомы 15qll-ql3, а также для исключения други; хромосомных перестроек, приводящих к развитию сходной клиническо! картины. При выявлении хромосомной аномалии у пациентов с СП! необходимо обследование родителей для исключения носительств; сбалансированных хромосомных перестроек.

2) Проведение теста на исследование аномального метилировани промоторной области гена SNRPN с целью подтверждения или исключени молекулярно-генетических нарушений в кластере импринтированных гено! расположенных в критическом районе хромосомы 15 q 11 -q 13.

3) При нормальном статусе метилирования целесообразно применят молекулярно-цитогенетические методы флуоресцентной гибридизации in sit (FISH) для исключения мозаицизма по делеции 15qll-ql3. Необходим отметить, что для СПВ на сегодняшний день нет генов-кандидатов, в которы могут быть обнаружены мутации, поэтому при отсутствии мозаицизма п делеции и нормальном статусе метилирования необходимо проводит дифференциальную диагностику с другими генетическими синдромами.

4) При выявлении аномального метилирования необходимо использован!-микросателлитного анализа локусов критического района для более детально! определения молекулярной причины заболевания. В случае подтвержден! делеции или ОРД, причина считается установленной. Но если nj использовании микросателлитного анализа наблюдается наличие нормально]

этцовского и материнского аллелей, то необходимо проводить исследование дефектов в центре импринтинга (ЦИ). Такие дефекты в ЦИ приводят к невозможности переключения эпигенотипа и установления нормального дифференциального метилирования на материнской или отцовской хромосоме { пробандов. Обнаружение дефектов в ЦИ является показанием для )бследования ближайших родственников пациента с СПВ.

6. Разработка ДНК - диагностического протокола для СЭ

При обследовании пациентов с клиническим диагнозом СЭ и членов их ;емей предложена следующая тактика проведения цитогенетических и голекулярно-генетических методов диагностики (рис: 8).

1) Проведение высокоразрешающего метода хромосомного анализа у [ациентов с СЭ с целью исключения транслокаций, инверсий, дупликаций и [ругих хромосомных перестроек с вовлечением критического района ромосомы 15qll-ql3, а также для исключения других хромосомных [ерестроек, приводящих к развитию сходной клинической картины. При ыявлении хромосомной аномалии критического района у пациентов с СЭ еобходимо обследование родителей для исключения сбалансированных ромосомных перестроек.

2) Проведение теста на аномальное метилирование промоторной области гна SNRPN с целью исключения или подтверждения молекулярно-гнетических нарушений критического района хромосомы 15ql l-ql3.

3) При нормальном статусе метилирования у пациентов с клиническим иагнозом СЭ необходимо исключить мозаицизм по делеции молекулярно-итогенетическими методами флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). При сключении мозаичной делеции у пациентов с СЭ необходимо проводить оиск мутаций в гене-кандидате UBE3A.

4) При выявлении аномального метилирования необходимо проведение икросателлитного анализа локусов критического района для определения олекулярной причины заболевания. В случае подтверждения делеции или РД, причина считается установленной. Но если при микросателлитном

исследовании наблюдается наличие отцовского и материнского аллелей, то в этом случае, при отсутствии других причин можно предположить наличие дефектов в центре импринтинга (ЦИ). Такие дефекты в ЦИ приводят к невозможности переключения эпигенотипа и установления нормального дифференциального метилирования на материнской или отцовской хромосоме у пробандов. Следует отметить, что риск рождения ребенка с СЭ, имеющего делецию в центре импринтинга у фенотипически нормальной матери с такой же делецией в центре импринтинга, составляет 50%.

5) Скрининг точковых мутаций в гене-кандидате ЦВЕЗА с помощью анализа однонитевого конформационного полиморфизма (ЗБСР) и прямого секвенирования. При обнаружении мутации у пациента с СЭ необходимо проводить обследование матери для исключения носительства данной мутации. При нормальном статусе метилирования и отсутствии мутаций в гене-кандидате ЦВЕЗА необходимо проводить дифференциальную диагностику на другие синдромы.

Рис. 7. Схема проведения цитогенетического и молекулярно-генетического обследования пациентов с СПВ

Рис. 8. Схема проведения цитогенетического и молекулярно-генетического обследования пациентов с СЭ

23

ВЫВОДЫ

1. Определены молекулярные причины, приводящие к развитию синдрома Прадера-Вилли у 63 из 100 (63%) пациентов. Из 63 пациентов с нарушением метилирования критического района ^114113, делеция отцовского происхождения выявлена у 47 (75%) пациентов, а ОРД - у 16 (25%) пациентов.

2. Определены молекулярные причины, приводящие к развитию синдрома Энжельмена у 23 из 50 (46%) пациентов. Нарушение метилирования критического района ^11ч}13 выявлено у 18 пациентов, из которых в 17 (94%) случаях установлена делеция материнского происхождения, а в 1 (6%) - отцовская ОРД, в 5 случаях определены мутации в гене иВЕЗА.

3. При исследовании пациентов с синдромом Энжельмена без нарушения метилирования критического района выявлено 5/32 (16%) патогенных мутаций (1У84-20с1е18, р.Суз21Туг, р.А^482Х, р.Аге506Суз, 2568_257Ме14) и 1 полиморфный вариант (р.А1а178ТЬт).

4. Предложен комплексный подход в молекулярно-генетической диагностике синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена, который включает исследование аномального метилирования критического района ^11ч}13, определение делеции и однородительской дисомии, а также выявление мутаций в гене-кандидате ИВЕЗА для СЭ.

5. Разработан ДНК - диагностический протокол для синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Землякова, В.В. Молекулярная диагностика синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена I В.В. Землякова, М.А. Ермакова, Д.В. Залетаев, М.В. Немцова // Медицинская генетика. - Москва. - 2009. - Т.8. № 9(87). - С. 16-20.

2. Ермакова, М.А. Анализ мутаций в гене 11ВЕЗА при синдроме Энжельмена / М.А. Ермакова, О.В. Бабенко, Д.В. Залетаев, М.В.

Немцова // Медицинская генетика. - Москва. - 2010. - Т.9. № 5. - С. 22-26.

3. Ермакова, М.А. Молекулярно-генетическая диагностика синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена / М.А. Ермакова // Тезисы конференции молодых ученых, посвященной 80-летию РМАПО. - Москва. РМАПО. -2010.-С. 47-48.

4. Ермакова, М.А. Молекулярно-генетическая диагностика синдрома Энжельмена / М.А. Ермакова, В.В. Землякова, Д.В. Залетаев, М.В. Немцова // Тезисы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. - Ростов-на-Дону. Медицинская генетика. - Москва. - 2010 Приложение. - С. 61-62.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПВ - синдром Прадера-Вилли

СЭ - синдром Энжельмена

ГИ - геномный импринтинг

UBE3A - ген (ubiquitin protein ligase ЕЗА)

ОРД - однородительская дисомия

ЦИ - центр импринтинга

del - делеция

Подписано в печать 04.05.10 Формат60*84/16 Бумага офисная «SvetoCopy»■ Тираж 100 экз. Заказ № 436 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ермакова, Марина Александровна

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клиническая характеристика синдромов

Прадера-Вилли и Энжельмена.

1.1.1. Клиническая характеристика СПВ.

1.1.2. Клиническая характеристика СЭ.

1.2. Геномный импринтинг и эмбриональное развитие.

1.2.1. Проявление импринтинга при патологии человека.

1.3. Возможные механизмы импринтинга.

1.4. Молекулярная организация района хромосомы 15ql l-ql

1.5. Генетические дефекты при СПВ и СЭ.

1.5.1. Делеция критического района хромосомы 15qll-ql3.

1.5.2. Однородительская дисомия.

1.5.3. Дефекты центра импринтинга.

1.6. Гены-кандидаты.

1.6.1. Гены-кандидаты для СПВ.

1.6.2. Гены-кандидаты для СЭ.

1.7. Мутации в генах-кандидатах.

1.7.1. Мутации в гене UBE3A при СЭ.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Клинический материал.

2.2. Забор венозной крови.

2.3. Выделение геномной ДНК.

2.4. Обработка ДНК бисульфитом натрия.

2.5. Метил специфическая ПЦР.

2.6. Микросателлитный анализ.

2.7. Метод SSCP-анализа.

2.8. Секвенирование ДНК.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Молекулярно-генетическая диагностика СПВ и СЭ.

3.1.1. Анализ аллельного метилирования промоторной области гена SNRPN.

3.1.2. Анализ микросателлитного полиморфизма локусов критического района 15qll-ql3.

3.1.3. Анализ точковых мутаций в гене-кандидате UBE3A

3.1.4. Исследование структуры и частоты молекулярной патологии, приводящей к развитию СПВ и СЭ.

3.2. Разработка ДНК - диагностических протоколов для СПВ и СЭ.

3.2.1. Разработка ДНК - диагностического протокола для СПВ.

3.2.2. Разработка ДНК - диагностического протокола для СЭ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика молекулярно-генетических причин возникновения синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена"

Синдромы Прадера-Вилли (СПВ) и Энжельмена (СЭ) относятся к наиболее распространённым генетическим заболеваниям. Частота синдромов в различных популяциях составляет 1:10000-1:20000 новорожденных (Cassidy et. al., 2009; Van Buggenhout et. al., 2009). Основными проявлениями СПВ и СЭ являются тяжелые неврологические расстройства в сочетании с умственной отсталостью, степень которой при СПВ может быть различной, а при СЭ достигает степени идиотии. Причиной СПВ и СЭ являются нарушения геномного импринтинга, в результате повреждений различного генеза в кластере импринтированных генов, расположенных на длинном плече хромосомы 15 в районе qll-ql3. Геномный импринтинг предполагает различное функционирование генов, в зависимости от происхождения хромосомы, на которой ген расположен - отцовская или материнская. Проявление геномного импринтинга обеспечивается дифференциальным метилированием цитозинов в CG-динуклеотидах, локализованных в регуляторных районах импринтированных генов.

Наличие дифференциального метилирования является эпигенетической маркировкой, которое определяет различное функционирование генов в зависимости от родительского происхождения хромосомы. Различие в дифференциальном метилировании генов на отцовском и материнском гомологе может быть использовано для молекулярно-генетической диагностики СПВ и СЭ.

Исследование хромосомного набора пациентов с применением высокоразрешающих цитогенетических методов для диагностики этих наследственных синдромов, имеет ряд недостатков. Главными из них являются высокий риск ложноотрицательных результатов в связи с трудностями визуального обнаружения микроделеций критического района 15qll-ql3, а также невозможность выявления функциональных нарушений в этой хромосомной области, которые не сопровождаются структурными перестройками хромосомы 15.

Наиболее частой причиной возникновения СПВ и СЭ становится интерстициальная делеция критического района хромосомы 15qll-ql3, которая обнаруживается у 70-75% пациентов. СПВ возникает в результате делеции критического района на отцовской хромосоме, а СЭ в случае делеции того же района на ее материнском гомологе.

Другой причиной развития этих синдромов является однородительская дисомия (ОРД). При однородительской дисомии у пациента целая хромосома или ее фрагмент имеет только отцовское или только материнское происхождение. В результате не происходит структурного повреждения хромосомы, но имеет место функциональное нарушение импринтинга. В силу функциональной неравнозначности отцовской и материнской хромосомы 15, наличие у ребенка двух структурно полноценных хромосом материнского или отцовского происхождения не обеспечивает нормального развития и, приводит к развитию СПВ или СЭ.

В 25% случаев СПВ наблюдается однородительская материнская дисомия критического района хромосомы 15qll-ql3, наличие отцовской дисомии этого района приводит к возникновению СЭ в 5% случаев.

Кроме структурных и функциональных нарушений критического района 15qll-ql3 существует ряд других причин, приводящих к развитию этих заболеваний. В 20% случаев при СЭ обнаруживаются точковые мутации в гене-кандидате UBE3A, который расположен в критическом районе хромосомы 15qll-ql3 и имеет материнскую экспрессию. Диагностика мутаций возможна только при использовании молекулярно-генетических методов - различных видов ПЦР и секвенирования. До настоящего времени в России не проводилось исследование мутаций в этом гене, и нет данных о спектре и частоте мутаций среди пациентов.

Еще одной значимой причиной развития этих наследственных синдромов являются мутации и микроделеции в регуляторном элементе, названном центром импринтинга (ЦИ), которые выявляются у 2% пациентов. Определение мутаций в гене UBE3A и делеций/мутаций в ЦИ необходимо при медико-генетическом консультировании семьи и планировании рождения здорового потомства, поскольку именно эти генетические причины обуславливают высокий риск повторного рождения ребенка с СПВ или СЭ.

Также имеются сообщения о вовлечении района ql l-ql3 хромосомы 15 в инвертированные дупликации, несбалансированные и сбалансированные транслокации и инверсии, которые могут приводить к возникновению СПВ и СЭ.

Многообразие молекулярных форм патологии, приводящих к развитию этих заболеваний, ставит вопрос о разработке адекватных методов диагностики, основанных на применении новейших молекулярно-генетических технологий. Разработка методов ДНК-диагностики СПВ и СЭ стала возможной благодаря сведениям о молекулярной организации критического района хромосомы 15, полученным в связи с изучением явления геномного импринтинга у человека. В основу диагностического теста для СПВ и СЭ положена информация об особенностях аллельного метилирования в некоторых локусах критического района и его изменениях при этих заболеваниях. Разработка методологии и диагностического протокола для этих заболеваний позволит предложить новые подходы к медико-генетическому консультированию пациентов и их семей. Применение таких подходов является важной задачей, учитывая тяжелые неврологические проявления этих наследственных заболеваний, особенно при СЭ.

Разработка молекулярных методов диагностики позволят разделить наследственные и спорадические случаи этих тяжелых наследственных заболеваний и предложить пренатальную ДНК-диагностику в семьях, имеющих повышенный риск рождения детей с СПВ и СЭ.

Цель и задачи исследования Цель: изучение структуры и частоты молекулярной патологии при синдромах Прадера-Вилли и Энжельмена и разработка ДНК диагностического протокола для этих заболеваний.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Выявить структурные и функциональные нарушения критического района 15qll-ql3, приводящие к развитию синдрома Прадера-Вилли в исследуемой выборке больных.

2. Выявить структурные и функциональные нарушения критического района 15qll-ql3, приводящие к развитию синдрома Энжельмена в исследуемой выборке больных.

3. Исследовать мутации в гене UBE3A у пациентов с синдромом Энжельмена, у которых не выявлена патология импринтинга, и оценить их частоту.

4. Разработать оптимальные подходы для молекулярно-генетической диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена.

5. Разработать ДНК - диагностический протокол для пациентов с синдромами Прадера-Вилли и Энжельмена.

Научная новизна полученных результатов

Впервые предложен комплексный подход в молекулярно-генетической диагностике наследственных заболеваний, связанных с нарушением импринтинга в критическом районе 15qll-ql3, который включает тест на исследование аномального метилирования промоторной области гена SNRPN, микросателлитный анализ локусов для дифференцировки делеции и однородительской дисомии, а также определение мутаций в гене-кандидате UBE3A для СЭ. В результате применения такого подхода к диагностике впервые появилась возможность определить весь спектр молекулярной патологии, включающий структурные и функциональные повреждения критического района 15ql l-ql3, приводящий к развитию СПВ и СЭ.

Впервые в России проведен поиск мутаций в гене UBE3A у пациентов с клиническим диагнозом синдрома Энжельмена без нарушения аллельного метилирования импринтированных генов. Выявлено пять мутаций (IVS4-22del8, p.Cys21Tyr, p.Arg482X, p.Arg506Cys, c.25682571del4) и один полиморфный вариант (p.Alal78Thr) в разных экзонах гена UBE3A, одна мутация описана впервые. На основе полученных результатов впервые был предложен алгоритм исследования пациентов для выявления всех молекулярных нарушений, приводящих к развитию СПВ и СЭ.

Практическая значимость результатов исследования

В результате выполненной работы предложены эффективные методы молекулярно-генетической диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена, которые могут быть использованы в медико-генетических центрах и клинических лабораториях в России. Применение этих методов позволяет определить основные причины, приводящие к возникновению этих заболеваний у пациентов для разделения спорадических и наследственных случаев. Выявление мутаций в гене UBE3A, делеций/мутаций ЦИ или робертсоновских транслокаций (15; 15) имеет исключительно важное значение для медико-генетического консультирования семьи и планирования рождения здорового потомства, поскольку именно эти генетические причины обуславливают максимальный риск повторного рождения ребенка с СПВ или СЭ. В представленной работе впервые проведено исследование спектра и частоты мутаций в гене UBE3A на выборке российских пациентов с СЭ. Впервые в России предложен полный и эффективный молекулярно-генетический протокол для диагностики СПВ и СЭ.

Положения, выносимые на защиту

1. В структуре молекулярной патологии критического района 15qll-ql3, связанного с геномным импринтингом, делеции и однородительские дисомии являются наиболее частыми причинами, приводящими к развитию СПВ и СЭ.

2. В диагностике СПВ и СЭ необходимо использовать комплекс молекулярно-генетических методов для выявления нарушений импринтинга в критическом районе 15qll-ql3, который включает: тест на исследование аномального метилирования промоторной области гена SNRPN, микросателлитный анализ локусов для дифференцировки делеции и однородительской дисомии, а при исключении - исследование на наличие дефектов в центре импринтинга (ЦИ) и определение точковых мутаций в гене UBE3A для пациентов с СЭ без нарушения метилирования импринтированных генов.

3. Исследование спектра и частоты мутаций в гене UBE3A является необходимым для диагностики пациентов с СЭ при нормальном статусе метилирования импринтированных генов критического района 15qll-ql3.

4. Разработка ДНК - диагностического протокола для СПВ и СЭ позволит выявить пациентов с различными формами молекулярной патологии и повысить эффективность диагностики и медико-генетического консультирования семей имеющих повышенный риск рождения детей с СПВ и СЭ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ермакова, Марина Александровна

выводы

1. Определены молекулярные причины, приводящие к развитию синдрома Прадера-Вилли у 63 из 100 (63%) пациентов. Из 63 пациентов с нарушением метилирования критического района 15qll-ql3, делеция отцовского происхождения выявлена у 47 (75%) пациентов, а ОРД - у 16 (25%) пациентов.

2. Определены молекулярные причины, приводящие к развитию синдрома Энжельмена у 23 из 50 (46%) пациентов. Нарушение метилирования критического района 15qll-ql3 выявлено у 18 пациентов, из которых в 17 (94%) случаях установлена делеция материнского происхождения, а в 1 (6%) — отцовская ОРД, в 5 случаях определены мутации в гене UBE3A.

3. При исследовании пациентов с синдромом Энжельмена без нарушения метилирования критического района выявлено 5/32 (16%) патогенных мутаций (IVS4-20del8, p.Cys21Tyr, p.Arg482X, p.Arg506Cys, 25682571del4) и 1 полиморфный вариант (p.Alal78Thr).

4. Предложен комплексный подход в молекулярно-генетической диагностике синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена, который включает исследование аномального метилирования критического района 15qll-ql3, определение делеции и однородительской дисомии, а также выявление мутаций в гене-кандидате UBE3A для СЭ.

5. Разработан ДНК — диагностический протокол для синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синдромы Прадера-Вилли (СПВ) и Энжельмена (СЭ) относятся к наиболее распространённым наследственным патологиям человека. Это инвалидизирующие заболевания, основными проявлениями которых являются тяжелые неврологические расстройства и умственная отсталость. Исходя из высокой частоты синдромов в популяции и тяжести клинических проявлений, разработка надежных методов ранней ДНК-диагностики СПВ и СЭ является задачей большой социальной значимости.

Поскольку молекулярные причины, приводящие к нарушению импринтинга в критическом районе 15qll-ql3 достаточно разнообразны, становится необходимым проведение комплекса молекулярно-генетических методов диагностики этих заболеваний.

Практическая целесообразность молекулярной диагностики СПВ и СЭ с привлечением методов ДНК-анализа объясняется, во-первых, довольно высокой распространенностью в популяции, во-вторых, вариабельностью фенотипических проявлений и трудностями дифференциальной диагностики с другими наследственными патологиями; в-третьих, необходимостью профилактики при семейных случаях, в связи с исключительной тяжестью неврологических расстройств, особенно при СЭ.

В настоящей работе разработаны оптимальные подходы для молекулярно-генетической диагностики СПВ и СЭ, позволяющие определить весь спектр причин, приводящих к возникновению этих заболеваний: делецию критического района 15qll-ql3, однородительскую дисомию, а также мутации в гене UBE3A у больных с СЭ без нарушения метилирования. С этой целью проведено молекулярно-генетическое исследование 100 пациентов с клиническими признаками СПВ и 50 пациентов с клиническими признаками СЭ. Представленное в работе комплексное исследование молекулярной патологии критического райорш 15qll-ql3 позволило выявить как структурные, так и функциональные нарушения, приводящие к развитию СПВ и СЭ.

Среди пациентов с СПВ и нарушением метилирования критического района, делеция района отцовской хромосомы 15qll-ql3 обнаружена в 75% случаев, а однородительская материнская дисомия в 25% случаев. У пациентов с СЭ и нарушением метилирования критического района, делеция района материнской хромосомы 15qll-ql3 выявлена в 94% случаев, что несколько превышает частоту делеций, установленных в исследованиях других авторов, которая составляет 70-75% (Van Buggenhout et. al., 2009). Частота однородительской отцовской дисомии, обнаруженная у больных с СЭ в настоящем исследовании, составляет 6%. Мутации в гене UBE3A у пациентов СЭ с нормальным статусом метилирования критического района обнаружены в 16% случаев. Частота молекулярной патологии, делеций, однородительских дисомий и мутаций в гене UBE3A, сходна с частотой определяемой в других исследованиях для СПВ и СЭ (Sartori et al., 2008). К сожалению, нам не удалось обнаружить пациентов с нарушением центра импринтинга, однако, предложенные методы исследования молекулярно-генетических причин, приводящих к СПВ и СЭ, позволяют выявить таких больных.

Впервые проведено исследование мутаций в гене UBE3A на выборке российских пациентов с СЭ, и описано 5 точковых мутаций, одна из которых впервые, и 1 полиморфный вариант.

Исследование мутаций является необходимым этапом в диагностике СЭ, который позволяет определить наследственную форму заболевания и поставить правильный диагноз пациентам без структурных и функциональных нарушений импринтированного района 15qll-ql3. Выявленные мутации дают возможность контролировать семейные случаи с «молчащими» мутациями и проводить пренатальную диагностику СЭ в семьях, имеющих высокий риск повторного рождения больных СЭ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ермакова, Марина Александровна, Москва

1. Angelman, H. "Puppet" children: a report on three cases / H. Angelman // Develop. Med. Child. Neurol. 1965. - Vol. 7. - P. 681-688.

2. Arima, T. The human HYMAI/PLAGL1 differentially methylated region acts as an imprint control region in mice / T. Arima, K. Yamasaki, R.M. John, K. Kato, K. Sakumi, Y. Nakabeppu, N. Wake, T. Kono // Genomics. 2006. -Vol. 88.-P. 650-658.

3. Barlow, D.P. Competition—a common motif for the imprinting mechanism? / D.P. Barlow // EMBO J. 1997. - Vol. 16. - P. 6899-905.

4. Baumer, A. Screening for UBE3A gene mutations in a group of Angelman syndrome patients selected according to non-stringent clinical criteria / A. Baumer, D. Balmer, A. Schinzel // Hum Genet. 1999. - Vol. 105. - P. 598602.

5. Bestor, T. Structure of mammalian DNA methyltransferase as deduced from the inferred amino acid sequence and direct studies of the protein / T. Bestor // Biochem Soc Trans. 1988. - Vol. 16. - P. 944-947.

6. Brandeis, M. The ontogeny of allele-specific methylation associated with imprinted genes in the mouse / M. Brandeis, T. Kafri, M. Ariel, J.R. Chaillet,

7. J. McCarrey, A. Razin, H. Cedar // EMBO J. 1993. - Vol. 12. - P. 36693677.

8. Brannan, C.I. Mechanisms of genomic imprinting / C.I. Brannan, M.S. Bartolomei // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. - Vol. 9. - P. 164-170.

9. Burger, J. Different mechanisms and recurrence risks of imprinting defects in Angelman syndrome / J. Burger, K. Buiting, B. Dittrich, S. Gross, C. Lich, K. Sperling, B. Horsthemke, A. Reis // Am. J. Hum. Genet. 1997. - Vol. 61. -P. 88-93.

10. Calounova, G. Prader-Willi syndrome due to uniparental disomy in a patient with a balanced chromosomal translocation / G. Calounova, D. Novotna, M.

11. Simandlova, M. Havlovicova, A. Zumrova, E. Kocarek, Z. Sedlacek // Neuro Endocrinol Lett. 2006. - Vol. 27. - P. 579-585.

12. Cassidy, S.B. Prader-Willi syndrome / S.B. Cassidy, D.J. Driscoll // Eur. J. Hum. Genet. 2009. - Vol. 17. - P. 3-13.

13. Chaddha, V. Low level of mosaicism in atypical Prader Willi syndrome: detection using fluorescent in situ hybridization / V. Chaddha, S. Agarwal, S.R. Phadke, A. Haider // Indian Pediatr. 2003. - Vol. 40(2). - P. 166-168.

14. Constancia, M. Imprinting mechanisms / M. Constancia, B. Pickard, G. Kelsey, W. Reik // Genome Res. 1998. - Vol. 8. - P. 881-900.

15. De Molfetta, G.A. A further case of a Prader-Willi syndrome phenotype in a patient with Angelman syndrome molecular defect / G.A. De Molfetta, T.M.

16. Felix, M. Riegel, V.E. Ferraz, J.M. de Pina Neto // Arq Neuropsiquiatr. -2002.-Vol. 60. P. 1011-1014.

17. De-Groot, N. Gene imprinting during placental and embryonic development / N. De-Groot, A. Hochberg // Mol. Reprod. Dev. 1993. - Vol. 36. - P. 390406.

18. Engel, E. A new genetic concept: uniparental disomy and its potential effect, isodisomy / E. Engel // Am. J. Med. Genet. 1980. - Vol. 6. - P. 137-143.

19. Feil, R. Genomic imprinting: a chromatin connection / R. Feil, G. Kelsey // Am. J. Hum. Genet. 1997.-Vol. 61(6).-P. 1213-1219.

20. Flamant, S. Characterization of a putative type IV aminophospholipid transporter P-type ATPase / Flamant S, Pescher P, Lemercier B, Clement-Ziza M, Kepes F, Fellous M, Milon G, Marchal G, Besmond С // Mamm Genome. -2003.-Vol. 14.-P. 21-30.

21. Fu, Y.H. Identification of a novel protein, DMAP, which interacts with the myotonic dystrophy protein kinase and shows strong homology to D1 snRNP / Fu Y.H. // Genetica. 1996. - Vol. 97(1). - P. 117-125.

22. Giardina, E. A multiplex molecular assay for the detection of uniparental disomy for human chromosome 15 / Giardina E, Peconi C, Cascella R, Sinibaldi C, Nardone AM, Novelli G // Electrophoresis. 2008. - Vol. 29. -P. 4775-4779.

23. Gibbons, R.J. Molecular-clinical spectrum of the ATR-X syndrome / Gibbons RJ, Higgs DR. // Am. J. Med. Genet. 2000. - Vol. 97. - P. 204-212.

24. Glenn, C.C. Modification of 15ql l-ql3 DNA methylation imprints in unique Angelman and Prader-Willi patients / Glenn CC, Nicholls RD, Robinson WP,

25. Saitoh S, Niikawa N, Schinzel A, Horsthemke B, Driscoll DJ // Hum. Mol. Genet. 1993.-Vol. 2.-P. 1377-1382.

26. Glenn, C.C. Gene structure, DNA methylation, and imprinted expression of the human SNRPN gene / Glenn CC, Saitoh S, Jong MT, Filbrandt MM, Surti U, Driscoll DJ, Nicholls RD // Am. J. Hum. Genet. 1996. - Vol. 58. - P. 335-346.

27. Goldstone, AP. Prader-Willi syndrome: advances in genetics, pathophysiology and treatment. / Goldstone AP // Trends Endocrin. Metab. — 2004.-Vol. 15.-P. 12-20.

28. Gray, ТА. An imprinted, mammalian bicistronic transcript encodes two independent proteins / Gray ТА, Saitoh S, Nicholls RD // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. Vol. 96. - P. 5616-5621.

29. Hayashi, Y. Arrest of cell growth by necdin, a nuclear protein expressed in postmitotic neurons / Hayashi Y, Matsuyama K, Takagi K, Sugiura H, Yoshikawa К // Biochem Biophys Res Commun. 1995. - Vol. 213. — P. 317-324.

30. Hershko, A. The ubiquitin system / Hershko A, Ciechanover A // Annu Rev Biochem. 1998. - Vol. 67. - P. 425-479.

31. Herzing, LB. The human aminophospholipid-transporting ATPase gene ATP 10C maps adjacent to UBE3A and exhibits similar imprinted expression / Herzing LB, Kim SJ, Cook EH Jr, Ledbetter DH // Am. J. Hum. Genet. -2001.-Vol. 68.-P. 1501-1505.

32. Hogart, A. Gender influences monoallelic expression of ATP 1 OA in human brain / Hogart A, Patzel KA, LaSalle JM // Hum Genet. 2008. - Vol. 124. -P. 235-242.

33. Holmquist, GP. Role of replication time in the control of tissue-specific gene expression / Holmquist GP // Am. J. Hum. Genet. 1987. - Vol. 40. - P. 151173.

34. Horsthemke, B. Imprinting defects on human chromosome 15 / Horsthemke B, Buiting К // Cytogenet Genome Res. 2006. Vol. 113(1-4). - P. 292-299.

35. Horsthemke, B. Mechanisms of imprinting of the Prader-Willi/Angelman region / Horsthemke B, Wagstaff J // Am. J. Med. Genet A. 2008. - Vol. 146A(16). - P. 2041-2052.

36. Hosoki, K. Germline mosaicism of a novel UBE3A mutation in Angelman syndrome / Hosoki К, Takano K, Sudo A, Tanaka S, Saitoh S // Am. J. Med. Genet A. 2005. - Vol. 138A(2). - P. 187-189.

37. Hosoki, K. Maternal uniparental disomy 14 syndrome demonstrates prader-willi syndrome-like phenotype / Hosoki K, Kagami M, Tanaka T, Kubota M, Kurosawa K, Kato M, Uetake K, Tohyama J, Ogata T, Saitoh S // J. Pediatr. -2009. Vol. 155. - P. 900-903.

38. Huibregtse, JM. A family of proteins structurally and functionally related to the E6-AP ubiquitin-protein ligase / Huibregtse JM, Scheffner M, Beaudenon S, Howley PM // Proc Natl Acad Sci USA.- 1995. Vol. 92. - P. 5249.

39. Jedele, KB. The overlapping spectrum of rett and angelman syndromes: a clinical review / Jedele KB // Semin. Pediatr. Neurol. 2007. - Vol. 14. - P. 108-117.

40. Jeppesen, P. Histone acetylation: a possible mechanism for the inheritance of cell memory at mitosis / Jeppesen P // Bioessays. — 1997. — Vol. 19. P. 6774.

41. Rinchik EM, Horsthemke B, Stubbs L, Nicholls RD // Hum. Mol. Genet. -1999.-Vol. 8.-P. 533-542.

42. Jiang, Y. Genetics of Angelman syndrome / Jiang Y, Lev-Lehman E, Bressler J, Tsai TF, Beaudet AL // Am. J. Hum. Genet. 1999. - Vol. 65(1). - P. 1-6.

43. Johnson, PR. SUMO-1: Ubiquitin gains weight / Johnson PR, Hochstrasser M // Trends Cell Biol. 1997. - Vol. 7. - P. 408-413.

44. Kimura, Y. Factors affecting meiotic and developmental competence of primary spermatocyte nuclei injected into mouse oocytes / Kimura Y, Tateno H, Handel MA, Yanagimachi R // Biol. Reprod. 1998. - Vol. 59. - P. 871877.

45. Kishino, T. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome / Kishino T, Lalande M, Wagstaff J // Nat. Genet. 1997. - Vol. 15. - P. 70-73.

46. Kishino, T. Genomic organization of the UBE3A/E6-AP gene and related pseudogenes / Kishino T, Wagstaff J // Genomics. 1998. - Vol. 47. - P. 101107.

47. Koerner, MV. The function of non-coding RNAs in genomic imprinting / Koerner MV, Pauler FM, Huang R, Barlow DP // Development. 2009. -Vol. 136.-P. 1771-1783.

48. Kono, T. Epigenetic modifications during oocyte growth correlates with extended parthenogenetic development in the mouse / Kono T, Obata Y,

49. Yoshimzu T, Nakahara T, Carroll J // Nat. Genet. 1996. - Vol. 13. - P. 9194.

50. Kosaki, K. Prader-Willi and Angelman syndromes: diagnosis with a bisulfite-treated methylation-specific PCR method / Kosaki K, McGinniss MJ, Veraksa AN, McGinnis WJ, Jones KL // Am. J. Med. Genet. 1997. - Vol. 73. - P. 308-313.

51. Kuslich, CD. Prader-Willi syndrome is caused by disruption of the SNRPN gene / Kuslich CD, Kobori JA, Mohapatra G, Gregorio-King C, Donlon ТА // Am. J. Hum. Genet. 1999. - Vol. 64. - P. 70-76.

52. LaSalle, JM. Domain organization of allele-specific replication within the GABRB3 gene cluster requires a biparental 15ql 1-13 contribution // LaSalle JM, Lalande M //Nat. Genet. 1995. - Vol. 9. - P. 386-394.

53. Lawson-Yuen, A. Atypical cases of Angelman syndrome / Lawson-Yuen A, Wu BL, Lip V, Sahoo T, Kimonis V // Am. J. Med. Genet A. 2006. - Vol. 140.-P. 2361-2364.

54. Leighton, PA. Disruption of imprinting caused by deletion of the H19 gene region in mice / Leighton PA, Ingram RS, Eggenschwiler J, Efstratiadis A, Tilghman SM // Nature. 1995. - Vol. 375. - P. 34-39.

55. Li, E. Role for DNA methylation in genomic imprinting / Li E, Beard C, JaenischR//Nature. 1993.-Vol. 366.-P. 362-365.

56. Ltihrmann, R. Structure of spliceosomal snRNPs and their role in pre-mRNA splicing / Liihrmann R, Kastner B, Bach M // Biochim Biophys Acta. 1990. -Vol. 1087.-P. 265-292.

57. Lyko, F. An imprinting element from the mouse H19 locus functions as a silencer in Drosophila / Lyko F, Brenton JD, Surani MA, Paro R // Nat. Genet.- 1997. Vol. 16. - P. 171-173.

58. Lyko, F. Identification of a silencing element in the human 15qll-ql3 imprinting center by using transgenic Drosophila / Lyko F, Buiting K, Horsthemke B, Paro R // Proc. Natl. Acad Sci USA.- 1998. Vol. 95. - P. 1698-1702.

59. Malzac, P. Mutation analysis of UBE3A in Angelman syndrome patients / Malzac P, Webber H, Moncla A, Graham JM, Kukolich M, Williams C, Pagon RA, Ramsdell LA, Kishino T, Wagstaff J // Am. J. Hum. Genet.1998. Vol. 62. - P. 1353-1360.

60. Mann, MR. Towards a molecular understanding of Prader-Willi and Angelman syndromes / Mann MR, Bartolomei MS // Hum. Mol. Genet.1999.-Vol. 8.-P. 1867-1873.

61. Matsuura, T. De novo truncating mutations in E6-AP ubiquitin-protein ligase gene (UBE3A) in Angelman syndrome / Matsuura T, Sutcliffe JS, Fang P, Galjaard RJ, Jiang YH, Benton CS, Rommens JM, Beaudet AL // Nat. Genet.- 1997.-Vol. 15.-P. 74-77.

62. McArthur, M. A preference of histone HI for methylated DNA / McArthur M, Thomas JO // EMBO J. 1996. - Vol. 15. - P. 1705-1714.

63. McGrath, J. Nuclear transplantation in mouse embryos / McGrath J, Solter D // J. Exp. Zool. 1983. Vol. 228. - P. 355-362.

64. Mercer, RE. Loss of magel2, a candidate gene for features of Prader-Willi syndrome, impairs reproductive function in mice / Mercer RE, Wevrick R // PLoS One. 2009. - Vol. 4. - P. 4291.

65. Mertineit, С. Sex-specific exons control DNA methyltransferase in mammalian germ cells / Mertineit C, Yoder JA, Taketo T, Laird DW, Trasler JM, Bestor TH // Development. 1998. - Vol. 125. - P. 889-897.

66. Monk, M. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development / Monk M, Boubelik M, Lehnert S // Development. 1987. -Vol. 99.-P. 371-382.

67. Nakada, Y. The human chromosomal gene for necdin, a neuronal growth suppressor, in the Prader-Willi syndrome deletion region / Nakada Y, Taniura H, Uetsuki T, Inazawa J, Yoshikawa К // Gene. 1998. - Vol. 213. - P. 6572.

68. Nakanishi, H. Loss of imprinting of PEG1/MEST in lung cancer cell lines / Nakanishi H, Suda T, Katoh M, Watanabe A, Igishi T, Kodani M, Matsumoto S, Nakamoto M, Shigeoka Y, Okabe T, Oshimura M, Shimizu E // Oncol. Rep.-2004.-Vol. 12.-P. 1273-1278.

69. Nan, X. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin / Nan X, Campoy FJ, Bird A // Cell. 1997. - Vol. 88. -P. 471-481.

70. Nasrin, N. DNA-binding properties of the product of the testis-determining gene and a related protein / Nasrin N, Buggs C, Kong XF, Carnazza J, Goebl M, Alexander-Bridges M//Nature.- 1991.-Vol. 354.-P. 317-320.

71. Nawaz, Z. The Angelman syndrome-associated protein, E6-AP, is a coactivator for the nuclear hormone receptor superfamily / Nawaz Z, Lonard DM, Smith CL, Lev-Lehman E, Tsai SY, Tsai MJ, O'Malley BW // Mol. Cell. Biol. 1999.-Vol. 19.-P. 1182-1189.

72. Nicholls, RD. Imprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes / Nicholls RD, Saitoh S, Horsthemke В // Trends Genet. 1998. - Vol. 14. - P. 194-200.

73. Nicholls, RD. Genome organization, function, and imprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes / Nicholls RD, Knepper JL // Annu Rev. Genomics Hum. Genet. 2001. - Vol. 2. - P. 153-175.

74. Ogura, A. Development of normal mice from metaphase I oocytes fertilized with primary spermatocytes / Ogura A, Suzuki O, Tanemura K, Mochida K, Kobayashi Y, Matsuda J // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. Vol. 95. - P. 5611-5615.

75. Perez, E. Chromosome 22qll.2 deletion syndrome (DiGeorge and velocardiofacial syndromes) / Perez E, Sullivan KE // Curr. Opin. Pediatr. -2002. Vol. 14. - P. 678-683.

76. Phelan, MC. Deletion 22ql3.3 syndrome / MC Phelan // Orphanet. J. Rare. Dis.-2008.-Vol. 27.-P. 14.

77. Poyatos, D. Prader Willi syndrome patients: study of 77 patients / Poyatos D, Camprubl C, Gabau E, Nosas R, Villatoro S, Coll MD, Guitart M // Med. Clin. (Bare). 2009. - Vol. 133. - P. 649-656.

78. Prader, A. Ein syndrom von Adipositas, kleinwuchs, kryptochismus und ologophrenie nach myotonieartigem zustand in neugeborenalter / Prader A, Labhart A, Willi H // Schweiz. Med. Wochenschr. 1956. - Vol. 86. - P. 1260-1261.

79. Preece, MA. Genomic imprinting, uniparental disomy and foetal growth / Preece MA, Moore GE // Trends Endocrinol Metab. 2000.- Vol. 11. - P. 270-275.

80. Rapakko, K. UBE3A gene mutations in Finnish Angelman syndrome patients detected by conformation sensitive gel electrophoresis / Rapakko K, Kokkonen H, Leisti J // Am. J. Med. Genet A. 2004. - Vol. 126A. - P. 248252.

81. Reik, W. Imprinting mechanisms in mammals / Reik W, Walter J // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. - Vol. 8. - P. 154-164.

82. Reik, W. Genomic imprinting: parental influence on the genome / Reik W, Walter J // Nat. Rev. Genet. 2001. - Vol. 2. - P. 21-32.

83. Rodriguez-Jato, S. Characterization of cis- and trans-acting elements in the imprinted human SNURF-SNRPN locus / Rodriguez-Jato S, Nicholls RD, Driscoll DJ, Yang TP I I Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33. - P. 47404753.

84. Ronan, A. Atypical Angelman syndrome with macrocephaly due to a familial imprinting center deletion / Ronan A, Buiting K, Dudding T // Am. J. Med. Genet A. 2008. - Vol. 146A. - P. 78-82.

85. Rossant, J. Immortal germ cells? / J Rossant // Curr Biol. 1993. - Vol. 3. -P. 47-49.

86. Rougeulle, C. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain / Rougeulle C, Glatt H, Lalande M // Nat. Genet. 1997. -Vol. 17.-P. 14-15.

87. Rougeulle, C. An imprinted antisense RNA overlaps UBE3A and a second maternally expressed transcript / Rougeulle C, Cardoso C, Fontes M, Colleaux L, Lalande M//Nat. Genet. 1998. - Vol. 19.-P. 15-16.

88. Runte, M. Exclusion of the C/D box snoRNA gene cluster HBII-52 from a major role in Prader-Willi syndrome / Runte M, Varon R, Horn D, Horsthemke B, Buiting К // Hum. Genet. 2005. - Vol. 116. - P. 228-230.

89. Russo, S. Novel mutations of ubiquitin protein ligase ЗА gene in Italian patients with Angelman syndrome / Russo S, Cogliati F, Viri M, Cavalleri F, Selicorni A, Turolla L, Belli S, Romeo A, Larizza L // Hum. Mutat. 2000. -Vol. 15.-P. 387.

90. Sachs, RK. A random-walk/giant-loop model for interphase chromosomes / Sachs RK, van den Engh G, Trask B, Yokota H, Hearst JE // Proc Natl Acad Sci USA.- 1995. Vol. 92. - P. 2710-2714.

91. Saitoh, S. Minimal definition of the imprinting center and fixation of chromosome 15qll-ql3 epigenotype by imprinting mutations / Saitoh S, Buiting K, Rogan PK, Buxton JL, Driscoll DJ, Arnemann J, Konig R,

92. Malcolm S, Horsthemke B, Nicholls RD // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. -Vol. 93.-P. 7811-7815.

93. Sanford, JP. Differences in DNA methylation during oogenesis and spermatogenesis and their persistence during early embryogenesis in the mouse / Sanford JP, Clark HJ, Chapman VM, Rossant J // Genes Dev. 1987. -Vol. l.-P. 1039-1046.

94. Sapienza, C. Genetic Imprinting in Human Disease / Sapienza C, Hall JG // The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 1995. - Vol. 1. -P. 437-458.

95. Sartori, S. Angelman syndrome due to a novel splicing mutation of the JJBE3A gene / Sartori S, Anesi L, Polli R, Toldo I, Casarin A, Drigo P, Murgia A // J Child Neurol. 2008. - Vol. 23. - P. 912-915.

96. Schulze, A. Exclusion of SNRPN as a major determinant of Prader-Willi syndrome by a translocation breakpoint / Schulze A, Hansen C, Skakkebaek NE, Bmndum-Nielsen K, Ledbeter DH, Tommerup N // Nat Genet. 1996. -Vol. 12. - P. 452-454.

97. Schumacher, A. Methylation analysis of the PWS/AS region does not support an enhancer-competition model / Schumacher A, Buiting K, Zeschnigk M, Doerfler W, Horsthemke В // Nat Genet. 1998. - Vol. 19. - P. 324-325.

98. Shemer, R. Structure of the imprinted mouse Snrpn gene and establishment of its parental-specific methylation pattern / Shemer R, Birger Y, Riggs AD, Razin A // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. Vol. 94. - P. 10267-72.

99. Siomi, H. RNA-binding proteins as regulators of gene expression / Siomi H, Dreyfiiss G // Curr Opin Genet Dev.- 1997. Vol. 7. - P. 345-353.

100. Stoger, R. Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Ig/2r locus identifies the expressed locus as carrying the imprinting signal / Stoger R, Kubicka P, Liu CG, Kafri T, Razin A, Cedar H, Barlow DP // Cell. 1993. -Vol. 73.-P. 61-71.

101. Surani, MA. Development of gynogenetic eggs in the mouse: implications for parthenogenetic embryos / Surani MA, Barton SC // Science 1983. - Vol. 222.-P. 1034- 1036.

102. Surani MA. Imprinting and the initiation of gene silencing in the germ line. Cell. 1998 May 1;93(3):309-12.

103. Szabo, PE. Allele-specific expression of imprinted genes in mouse migratory primordial germ cells / Szabo PE, Hiibner K, Scholer H, Mann JR // Mech Dev. 2002. - Vol. 115. - P. 157-160.

104. Tajima, S. Regulation and function of DNA methylation in vertebrates / Tajima S, Suetake I // J Biochem. 1998. - Vol. 123. - P. 993-999.

105. Taniura, H. Necdin, a postmitotic neuron-specific growth suppressor, interacts with viral transforming proteins and cellular transcription factor E2F1 / Taniura H, Taniguchi N, Нага M, Yoshikawa К // J Biol Chem. 1998. - Vol. 273.-P. 720-728.

106. Tate, PH. Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression / Tate PH, Bird AP // Curr Opin Genet Dev. 1993. - Vol. 3. - P. 226-231.

107. Temple, IK. Imprinting in human disease with special reference to transient neonatal diabetes and Beckwith-Wiedemann syndrome / IK Temple // Endocr Dev. 2007. - Vol. 12. - P. 113-123.

108. Tilghman, SM. Parental imprinting of the H19 and Igf2 genes in the mouse / Tilghman SM, Bartolomei MS, Webber AL, Brunkow ME, Saam J, Leighton PA, Pfeifer K, Zemel S // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1993. - Vol. 58.-P. 287-295.

109. Tilghman, SM. Competitive edge at the imprinted Prader-Willi/Angelman region? / Tilghman SM, Caspary T, Ingram RS // Nat Genet. 1998. - Vol. 18.-P. 206-208.

110. Tremblay, KD. A paternal-specific methylation imprint marks the alleles of the mouse H19 gene / Tremblay KD, Saam JR, Ingram RS, Tilghman SM, Bartolomei MS //Nat Genet. 1995. - Vol. 9. - P. 407-413.

111. Uetsuki, T. Structure and expression of the mouse necdin gene. Identification of a postmitotic neuron-restrictive core promoter / Uetsuki T, Takagi K, Sugiura H, Yoshikawa К // J Biol Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 918-924.

112. Voelkel-Meiman, K. Recombination-stimulating sequences in yeast ribosomal DNA correspond to sequences regulating transcription by RNA polymerase I /Voelkel-Meiman K, Keil RL, Roeder GS //Cell. 1987.-Vol. 48. - P. 1071-9.

113. Wandstrat, AE. Isolation and molecular analysis of inv dup(15) and construction of a physical map of a common breakpoint in order to elucidate their mechanism of formation / Wandstrat AE, Schwartz S // Chromosoma. -2000. Vol. 109. - P. 498-505.

114. Wutz, A. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island / Wutz A, Smrzka OW, Schweifer N, Schellander K, Wagner EF, Barlow DP //Nature. 1997. - Vol. 389. - P. 745-749.

115. Yamamoto, Y. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing / Yamamoto Y, Huibregtse JM, Howley PM // Genomics. 1997. - Vol. 41. - P. 263-266.

116. Yamasaki, K. The novel gene, gamma2-COP (COPG2), in the 7q32 imprinted domain escapes genomic imprinting / Yamasaki K, Hayashida S, Miura K, Masuzaki H, Ishimaru T, Niikawa N, Kishino T // Genomics. 2000. - Vol. 68.-P. 330-335.

117. Yang, T. A mouse model for Prader-Willi syndrome imprinting-centre mutations / Yang T, Adamson ТЕ, Resnick JL, Leff S, Wevrick R, Francke U, Jenkins NA, Copeland NG, Brannan CI // Nat Genet. 1998. - Vol. 19. - P. 25-31.

118. Yoder, JA. DNA (cytosine-5)-methyltransferases in mouse cells and tissues. Studies with a mechanism-based probe / Yoder JA, Soman NS, Verdine GL, Bestor TH // J Mol Biol. 1997. - Vol. 270. - P. 385-395.