Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ХАРАКТЕРИСТИКА МИТОХОНДРИОМА КАРДИОМИОЦИТОВ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА СЕРДЦА КРЫС ПРИ ГИПЕРГРАВИТАЦИИ И МОДЕЛИРОВАНИИ НЕКОТОРЫХ ЭФФЕКТОВ НЕВЕСОМОСТИ

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "ХАРАКТЕРИСТИКА МИТОХОНДРИОМА КАРДИОМИОЦИТОВ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА СЕРДЦА КРЫС ПРИ ГИПЕРГРАВИТАЦИИ И МОДЕЛИРОВАНИИ НЕКОТОРЫХ ЭФФЕКТОВ НЕВЕСОМОСТИ"



На правах рукописи

ЛИПИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

УДК 576.311.347; 612,176

ХАРАКТЕРИСТИКА МИТОХОНДРИОМА КАРДИОМИОЦИТОВ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА СЕРДЦА КРЫС ПРИ ГИПЕРГРАВИТАЦИИ И МОДЕЛИРОВАНИИ НЕКОТОРЫХ ЭФФЕКТОВ НЕВЕСОМОСТИ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003 ^

Работа выполнена на кафедре меточной биологин и гистологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Ченцов Юрий Сергеевич, кандидат биологических наук, доцент Шорникова Маргарита Васильевна,

доктор биологических наук Озернюк Николай Дмитриевич кандидат биологических наук, Большакова Галина Борисовна

Московская медицинская академия им. И.М, Сеченова.

Зашита состоится «13» декабря 2003 г. в часов минут на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете им, М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. 557 ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «__»__2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии являются одними из самых изменчивых н полиморфных органди эукариотической клетки, их размеры, форма и улътраструктура быстро меняется под влиянием различных экспериментальных факторов. В современной клеточной биологии часто изучают не отдельные митохоядрия, но всю совокупность оргаяелл в целом - митохондриом. Удобным объектом для исследования митохондриома при разных экспериментальных воздействиях являются кардномиоциты (КМЦ), постоянно ритмично сокращающиеся клетки, в которых энсргопродуцирующнй аппарат занимает около трети общего объема (Непомнящих, 1991; Barth eta!., 1992).

Около двадцати лет назад было показано, что КМЦ млекопитающих обладают особой системой организации митохондрий - митохондриальиым ретнкулумом, в котором практически все митохондрии объединены структурно и энергетически с помощью мсжмитохонд-риальиых контактов (ММК) (Бакеева н др., 1982; Амченкова и др., 1986; Бакеева, Ченцов, 1989), осуществляющих передачу энергии в форме электрического потенциала по мембранам объединенных митохондрий, образующих таким образом эквипотенциальную поверхность. Это позволяет рассматривать митохондрии, соединенные ММК, как мембранный внутриклеточный кабель, благодаря которому возможно быстрое распространение энергии в объеме клетке (Скуяачев, 1989). Сравнительно недавно показано, что ММК являются универсальными по ультраструктуре и необходимыми для формирования митохондриома КМЦ структурами как позвоночных, так и беспозвоночных животных (Шорпикова, 2000).

На основании целого ряда работ (Абдулла и др., 1991; Пауков, Проиенко, 1996; Агафонова и др., 1997) установлена прямая связь между функциональной активностью КМЦ и числом ММК в них. Так, при увеличении нагрузки на сердце, обусловленной стенозом аорты, развивается гипертрофия КМЦ, сопровождающаяся ростом числа ММК (Пауков, Проиенко, 1996). Напротив, при снижении нагрузки иа сердце в условиях гипокинезии отмечено снижение числа ММК (Агафонова и др., 1997; Колесникова и др., 1998). Таким образом, изменение степени ассоциирования митохондрий является одной из универсальных приспособительных реакций КМЦ при различных изменениях условий функционирования миокарда.

Как вариант изменения нагрузки на сердце можно рассматривать воздействие иа организм гипергравитации 2G, а таюке вывешивание животных в антиортостати чес ком положении, моделирующем основные эффекты невесомости (Morey-Holton, Globus, 2002). Оба фактора оказывают значительное влияние на организм млекопитающих в космическом полете. Работы, посвященные описанию ультраструктуры КМЦ и их митохондрий желудочка мле-

копитающих в таких условиях, не многочисленны (Frey et al„ 1997Гры1яп*^ ai 1<ю> Ллй.

stein et aJ., 1998). В этик работах отсутствует анализ поведения митохондриома как системы митохондрий и ММК в КМЦ, что определяет актуальность данной работы. Также х настоящему времени остаются не изученными изменения митохондриома КМЦ в период после снятия пшергравитационкого воздействия и адтиортостатического вывешивания. Анализ изменений & других системах органов крыс показал, что при повторе 2Q воздействия реакции организма могут отличаться от обнаруженных при первом воздействии (Краснов и др., 1998; Краснов и др., 2000). Однако вопрос об отличиях реакции митохондриома КМЦ на однократное и повторное воздействие гипергравнтацин н антиортостатическое вывешивание абсолютно не освещен в литературе, чем также обусловлена актуальность данного исследования.

Целью исследование явилась морфо-функциоиальная характеристика митохондриома как системы митохондрий, объединенных между собой ММК, в КМЦ левого желудочка сердца крыс при двух экспериментальных воздействиях, изменяющих уровень нагрузки на миокард: при действии гипергравитации 20 и в условиях антиортостатического вывешивания животных; а также после снятия данных воздействий, и при их повторном действии.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) для определения общего состояния миокарда, выяснения фона, на котором развиваются изменения митохондриома КМЦ, исследовать ряд морфо-функциональных параметров КМЦ и кро&еносных капилляров:

а) шющадь поперечного сечения КМЦ и их ядер, б) относительный объем миофиб-рнлл в КМЦ, в) относительное число и диаметр капилляров;

2) дать подробную ультраструктурную морфометрнчсскую характеристику митохондриома КМЦ по следующим параметрам:

а) относительный объем митохондрий; б) численная плотность митохондрий;

в) размеры митохондрий; г) юс ультраструктура; д) число крист в митохондриях;

е) число ММК.

Научная новизна работы. Впервые в КМЦ левого желудочка крыс, подвергнутых однократной и повторной гипергравитащщ 2G, проанализированы морфофункциональные изменения митохондриома как системы митохондрий, объединенных ММК. Показано, что рост числа ММК в разных зонах локализации митохондрий в КМЦ происходит неодинаково, что является первичной реакцией митохондриома при гипергравитации, н опережает развитие гипертрофии КМЦ, что несомненно связано с динамичностью и высокой чувствительностью ММК к 2G условиям. После окончания действия гнпергравитации указанные изменения числа ММК сохраняются. Установлено, что выраженность изменений в числе ММК при по-

вторном действии зависит от длительности первого воздействия и последующего перерыва перед вторым воздействием.

Впервые исследован митохоаариом КМЦ левого желудочка крыс при вывешивании их в антиортостатическом положении. При этом выявлено, что рост числа ММК происходит в уменьшающихся по размерам (гипотрофированньи) КМЦ. Описана замедленная нормализация изменений в митохондриоме КМЦ после снятия данного воздействия. Показано, что при повторном вывешивании крыс рост числа ММК в КМЦ более выражен по сравнению с первым вывешиванием.

Практическое значение работы. Выполненная работа представляет не только теоретический, ко н практический интерес в области космической биологин и медицины. Данные, полученные в настоящей работе, об изменениях КМЦ при гипергравитации важны для разработки методов использования перегрузок в борьбе с нежелательными последствиями действия невесомости на организм. Данные о влиянии однократных и повторных воздействий искусственной невесомости на КМЦ могут способствовать разработке оптимальных временных режимов пребывания человека в условиях космических полетов.

Дпрободая работы. Основные результаты работы были изложены на 4-ом междисциплинарном симпозиуме ИНТ АС по физическим и химическим методам в биологии, медицине и окружающей среде (Москва, 2001), на всероссийском симпозиуме "Онтогенетические, эволюционные и экологические аспекты биоэнергетики" {Москва, 2001), на XII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2002), на 23-ем ежегодном международном съезде по гравитационной физиологии (Стокгольм, 2002), на 1-ом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003) и на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Описание экспериментальных моделей. Работу проводили на сердце крыс самцов линии Вистар массой 310±20 г. Исследовали КМЦ левого желудочка в норме и в условиях двух экспериментальных воздействий: гипергравитации 2й и вывешивания в антиортостатическом положении, что позволяет моделировать в земных условиях некоторые физиологические эффекты невесомости. Описана динамика изменений КМЦ при каждом воздействии, обраггимость изменений после снятия действия данного фактора, а также проведено сравнение изменений при однократном и повторном экспериментальном воздействии. После окончания экспериментов крыс декапитировали с помощью гильотины. Постановка эксперимен-

тов осуществлялась на базе Государственного научного центра РФ - Института меди ко-биологических проблем РАН (директор - акад. А.И. Григорьев) под руководством ведущего научного сотрудника к.м.н. Краснова И.Б.; автор выражает ему искреннюю благодарность за предоставленную возможность в получении экспериментального материала. Гипергравитация 20 в наземном эксперименте создавалась с помощью круглосуточного вращения крыс (по 6 в клетке) на центрифуге с радиусом З.б м и скоростью вращения 22 об/мин. При вращении животные в клетка* находились в нефиксированном состоянии. Проведено два эксперимента. отличающихся по срокам Ю действия и перерыву между первым и вторым воздействиями. В эксперименте I изучены четыре группы опытных животных (схема 1): 1) - 19 суток вращения на центрифуге; 2)- 30 суток пребывания в условиях земной гравитации (Ш) после окончания 19-суточного вращения; 3) - повторное 5-суточное вращение (после 19-суточного вращения и последующего 30-суточного перерыва); 4) - 5 суток однократного вращения, одновременно с таким же повторным для 3 группы.

Схема!. Эксперимент! по действию гипергравитацни 2G.

tj 1 2G ■' -.''V

& 2 2G 1G

3 с 1 А J 1-.ШШЖ-',; 1G 2<;

4 1С 1G 2G

О (контроль) 19 49 54 Суг.

В эксперименте II изучены также четыре группы опытных крыс (аналогично схеме эксперимента I): 1) - 33 суток врашенкя; 2) - 39 суток пребывания при IG после 33-суточного вращения; 3) - повторное 5-суточное вращение (после 33-суточного вращения и последующего 39-суточного перерыва); 4) - 5 суток однократного вращения, одновременно с таким же повторным для 3 группы. Контролем служили интактные крысы, содержащиеся в помещении с центрифугой при её вращении и в виварии при реадаптации опытных крыс к земной силе тяжести.

Круглосуточное вывешивание животных в антнортостатическом положении осуществляли стандартным методом (Morey-Holton, Wronski, 1981; Morey-Holton, Globus, 2002), угол вывешивания подбирался таким, чтобы животное, максимально вытянувшись, не доставало задними конечностями пола клетки, при этом онн могли перемещаться по клетке на передних конечностях. Забой проводили тотчас после снятия крыс, не допуская их касания задними конечностями пола клетки или иных поверхностей. Изучены четыре группы опытных животных (схема 2): 1) - 30 суток вывешивания; 2) - 30 суток пребывания в нормальном положений после окончания 30-суточного вывешивания («отдых»); 3) - повторное 14-суточное

вывешивание (после 30 суток вывешивания н последующего 30-суточного перерыва); 4) - 14 суток однократного вывешивания.

Схема 2. Вывешивание животных в антиортостаггнческом положении.

£ & 1 'вывешивание ,!у;. 1

2 *л; нвывешивание - "отдых"

й С 3 вывешив» ни е -¿0-' "отдых" выест. ;.

4 вывеш.

О (контроль) 30 60 74 Сут.

Для изучения на светоогггнческом уровне кусочки миокарда левого желудочка фиксировали 4% Глухаревым альдегидом на 0,1 М фосфатном буфере, затем обезвоживали по стандартное методике и заливали в парафин. Полученные поперечные срезы окрашивали железным гематоксилином. Для светооптического анализа использовали также поперечные полутонкие эпоновые срезы, полученные на пирамитоме и окрашенные метнленовым синим. Для электронномикроскопнческого анализа отдельные волоконца миокарда левого желудочка в области верхушки сердца фиксировали 4% глутаровым альдегидом на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2-7.4), дофиксировалн 1%-ным раствором ОаО^. Материал обезвоживали н заключали в Эпон 812 по общепринятой методике. Продольно ориентированные на пирамитоме КМЦ резали на ультратоме 1КВ III. Ультратонкие срезы дополнительно контрастировали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу, и просматривали в электронном микроскопе .1ЕМ-1О0С,

Морфометрический анализ. На светооптическом уровне на парафиновых или полутонких эпоновых срезах с помощью компьютерной программы Кагео-3 (Россия) определяли плошали поперечных сечений КМЦ и их ядер (проанализировано не менее 100 клеток от каждого животного), что позволило установить наличие илн отсутствие гипертрофии/гипотрофии клеток при изучаемом воздействии; а также диаметр кровеносных капилляров (не менее 50 капилляров от каждого животного). По этим же срезам определяли относительное число кровеносных капилляров (в расчете на один КМЦ).

На эяектронномикроскопическом уровне по полученным негативам с помошью хорошо разработанного метода квадратной тестовой системы коротки* отрезков (Непомнящих н др., 1941) определяли относительные объемы миофибрилл и митохондрий в саркоплазме КМЦ. По тем же негативам отдельно в каждой зоне локализации митохондрий в КМЦ - околоядерной, межфибрнллярной, субсарколеммальной околососудистой (что связано с морфологической н функциональной гетерогенностью митохондрий КМЦ) оценивали следующие параметры митохондриома:

s

численную плотность профилей митохондрий (использовано не менее 10 наложений морфометрической сетки в каждой зоне для каждого животного);

соотношение числа профилей митохондрий разной длины, при этом профили митохондрий были разделены на три группы: мелкие (< 1 мкм), средние (от 1 до 3 мкм) и длинные (> 3 мкм), просчитано не менее 100 митохондрий каждой зоны для каждого животного;

число крнст, приходящееся на сечение одной митохондрии средней длины (просчитано не менее 50 митохондрий в каждой зоне для каждого животного);

число ММК, приходящееся на сто митохондрий в расчете в среднем на КМЦ и отдельно по зонам (просчитано не менее 100 митохондрий каждой зоны для каждого животного).

Статистический анализ данных проводили с помощью Microsoft Excel 98, STATISTICA 5.0. с использованием t-критерия Стъюдента и непараметрического критерия Манна-Уитии. Различия признавались достоверными при р < 0,05. На графиках приведены усредненные данные не менее, чем по 3 животным на каждый срок опытов.

Результаты исследования и их обсуждение.

При анализе контрольного материала были получены результаты, согласующиеся с имеющимися в литературе данными о рабочих КМЦ крыс в норме (Проценко, 1996; Агафонова и др., 1997; Шорникова, 2000). Так, отмечено, что митохондрии расположены неравномерно и можно выделить три популяции этих органеля, расположенные в разных зонах клетки и различающиеся по анализируемым параметрам: 1) околоядерную, 2) межфибриллярную и 3) околососудистую субсарколеммальную (где скопления митохондрий получили название «почек»). В частности, число ММК в разных зонах неодинаково, наибольшее число этих структур приходите« на субсарколеммальную околососудистую зону (рис. I б,т; рис. 26).

Гипергравитация 2G. Эксперимент 1.

Чере? 5 суток обнаружено, что площади поперечного сечения КМЦ (ряс. 1а) и число капилляров не изменены, но увеличен на 21% диаметр капилляров (здесь и далее сравнения приведены относительно контроля, если не указано иначе). Возможно, эта реакция миокарда связана с нарушениями скорости циркуляции крови и лимфы, их необычным перераспределением - комплексом изменений, описанных как первичные в условиях гипергравитации (Куприянов, Петрухин, 1971; Котовская, Вартбаронов, 1997). Относительные объемы мио-фибрилл и митохондрий на этом и последующих этапах значимо не изменяются (рис. 1а). Ультраструктура большинства митохондрий и других компонентов клеток остается нормальной как на данном, так и на остальных этапах опыта. В межфибриллярной области в S раз чаще встречаются длинные органеллы (более 3 мкм). Число ММК возрастает как в среднем по клетке на 32 %, так и во всех зонах КМЦ, что особенно выражено в околоааерной зо-

не - на 33 %, и в субсарколеммальной околососуднстой - на 43 % {рис. 16). Следовательно, рост числа ММК опережает проявление гипертрофии КМЦ (которая обнаруживается только через 19 суток). Динамичность и лабильность системы ММК, опережающей по срокам развитие ответной реакции со стороны других параметров клетки, подчеркивалась также в работах на других экспериментальных моделях гипертрофии сердца (Пауков, Проценко, 1996; Шорннкова, 2000). Увеличение числа ММК в 2G условиях хорошо согласуется с экспериментально подтвержденным положением о том, что число этих структур в митохондриоме КМЦ прямо связано с уровнем функциональной нагрузки на миокард (Абдулла, 1992; Пауков, Проценко, 1996; Шорникова, 2ÖOO), Причем наблюдаемое увеличение числа ММК не сопровождается повышением плотности взаиморасположения самих митохондрий (то есть их численной плотности), что также подтверждает положение о том, что число ММК отражает именно степень ассоциативности органелл, зависящую от функциональной нагрузки на клетку, но не плотность расположения митохондрий. Ультраструктура ММК (их протяженность, электронная плотность) визуально не изменяется на протяжении всего эксперимента.

Через 19 с>ток обнаружена гипертрофия КМЦ: площадь их поперечного сечения, а также их ядер возрастает соответственно на 41% и 17 % (рис. 1а). Развитие гипертрофии КМЦ обусловлено, по-видимому, общими изменениями в организме животных в 2G условиях - повышением газообмена, свидетельствующем о возросших энергетических потребностях (Oyama. Chan, 1973; Котовская и др., 1996), повышением артериального давления (Вохмя-нин, 1963; Richardson, Knapp, 1977), скорости и амплитуды сердечных сокращений (Краснов, Носова, 1987). Гипертрофия клеток как адаптивная реакция сердечной мышцы на гипергравитацию также описывалось при двухнедельном 2G действии на крыс (Goldstein et al., 1998). Число капилляров увеличено на 10%, их диаметр на 23% выше, чем в контроле. Такие изменения в микрососудистом, русле миокарда пря гилергравитацин ожидаемы, так как увеличение капилляризацин сердца отмечали при повышении на него нагрузки (Меерсон,1978; Ме-ерсои, ПшенииковЕц 1988), что происходит н в условиях 2G (Котовская и др., 1985; Краснов, Носова, 1987). В 10 раз чаше, чем в контроле встречаются длинные межфибриллярные митохондрии. Количество ММК выше контроля как в среднем по клетке, так и по зонам (рис. 1 б).

Через 30 суток после снятия 19-суточного 2G воздействия площади поперечного сечения КМЦ и их ядер значительно повышены - соответственно на 33% и 36% от нормы (рис. 1а). Чисто капилляров выше на 18 %, а их диаметр на 13 % по сравнению с контролем. Сохраняются в относительно большом количестве длинные межфибриллярные митохондрии.

Эксперимент 1. Эдр100 ад Число

■■80

--60

--40

--20

04-

Контроль 5еут. )9с)т. 19с)т,+ повтор 30 суг. 5суг.

Срок 20 воздействия 1(5

Контроль 5 сут. ¡9 суг- " СУТ.+ повтор

30 сут, 5сут. Срок 20 воздействия 10

Эксперимент Ц.

Контроль 5 суг. 33 сут. 33 сут,+ повтор Контроль 5 сут. 13 сут. 33 (ут.+ повтор

39 сут. Зсуг. 39 сут. 5суг.

Срок 2С воздействия 10 Срок 2й воздействия

Рис, 1. Морфометрнческая характеристика КМЦ и нх митохондриома при шпергравнта-цни. а, в - изменения плошадей поперечного сечения КМЦ и их ядер (левая ось ординат соответственно столбики 1) и 2) и относительных объемов миофибрнлл н митохондрий (правая ось, кривые 3 и 4); б, г - динамика изменения числа ММК на 100 митохондрий в околоядерной (а), межфибриллярней (б) и околососуднстой субсарколемм альной (в) зонах. Значении площадей КМЦ и их ядер контроля различны на рис. 1а) и в), так как анализ проводили по парафиновым (а) и слоновым (в) срогп^, т\> есть при разной степени сжатии материала.

По числу ММК в КМЦ не происходит изменений но сравнению с предыдущей точкой эксперимента (рис. Î б), то есть их число повышено во всех зонах. Эти данные, указывающие на длительное сохранение гипертрофия и сопровождающих ее изменений в митохондрноме, согласуются с результатами многих исследователей, отмечавших, что обратное развитие гипертрофии миокарда, вызванной различными воздействиями, протекает медленнее, чем развитие самой гипертрофии (Регеппес, Hait, 1990; Абдулла, 1992; Проценко, 1996)

После 5 суток повторного действия гипергравитацня (после 19-сугочного первого воздействия и последующего 30-суточного перерыва) площадь поперечного сечения КМЦ остается выше контроля (на 27 %); площадь поперечного сечения их ядер снижается, но остается на 21% выше, чем в контроле (рис. 1а). Число капилляров остается на повышенном уровне, но их диаметр уменьшается до контроля. Относительный объем митохондрий достоверно уменьшается от уровня контроля (рис. 1а). В межфибриллярной зоне число длинных митохондрий гораздо выше, чем в контроле, как и на других этапах эксперимента. Число ММК снижается в среднем по клетке, оставаясь при этом выше контроля, при анализе по зонам выявлено, что впервые за весь срок эксперимента этот параметр достигает контрольного значения в околоядерной зоне; в межфибриллярной и субсарколемм альной околососудистой зонах остается на повышенном уровне (рте. 16). Таким образом, при повторе 2G нагрузки не усиливается гипертрофия КМЦ а не происходит дополнительный рост числа ММК, что, вероятно связано с сохранением в клетках изменений* полученных при первом 2G воздействии, в частности, повторному галер гравитационному воздействию были подвергнуты животные, у которых КМЦ были уже до начала воздействия гипертрофированы. Гипергравитация 2G. Эксперимент II,

Через суток площадь поперечного сечения КМЦ и их ядер возрастает соответственно на 41% и 34 % (ряс. 1в), следовательно степень увеличения площади КМЦ одинакова (на 40% от нормы) при 19- и 33-суточном воздействии. Число капилляров увеличено на 15%, их диаметр - на 12 %. Относительный объем щюфибрилл и митохондрий на протяжении данного эксперимента значимо не меняется, (рис. 1в), что указывает, учитывая вышеописанное увеличение площадей клеток, на сбалансированный рост объемов миофибрилл и митохондрий пропорционально общему увеличению гипертрофированных КМЦ. Аналогичный факт был установлен при гипертрофии КМЦ в условиях стеноза аорты (Прояенко и др., 1996). В околоядерной зоне растет доля мелких митохондрий, что указывает, возможно, на их деление, характерное именно для охолоядерной зоны (Озернкж, 1978). Это приводит к повышению суммарной поверхности митохондрий (Непомнящих, 1991), способствуя сохранению пластичности ресурсов клетки в условиях гипертрофии (Целлариуе, Ериековская, 1979), что необходимо для поддержания нормальной работы клеток. Также как при 5-ти н ! 9-ти суточ-

ном сроках, часто встречаются длинные межфибриллярные митохондрии, к тому же вытянутые и изогнутые по форме органеллы появляются и в субсарколеммальной околососудистой зоне. Длинные митохондрии протяженностью в несколько саркомеров, описаны также в КМЦ при их гипертрофии разного генеза в ряде работ (Саркисов, Втюрин, 1967; Цсллариус, Ерисковская, 1979; Тен Эйк, Бассет, 1990; Абдулда и др., 1991). Видимо, увеличение размеров отдельных митохондрий является адекватной реакций митохондриома КМЦ на усиление функционирования сердца. Повышается число крист в митохондриях: в околоядерной и субсарколеммальной околососудистой зонах - на 27%, в межфибриллярной - на 20%. Число ММК находится на высоком относительно контроля уровне (+16%) только в субсарколеммальной околососудистой зоне, однако оно не повышается дополнительно относительно более коротких сроков (рис. 1г). То есть, в динамике 20 воздействия меняется режим работы митохондриома КМЦ: на ранних этапах функционирование этой системы в 20 условиях осуществляется за счет большего объединения отдельных органелл через ММК, то есть за счет интенсификации транспорта эисргни, а на более поздних сроках преобладающим становится повышенное производство энергии за счет возросшего числа крист в митохондриях.

Через 39 суток после снятия ЗЗ-суточного воздействия 20 площади поперечного сечения КМЦ и их ядер снижаются (рис. 1в). Число и диаметр капилляров также снижаются до контрольного уровня. Таким образом, на данном этапе произошла регрессия гипертрофии КМЦ, которой не было через 30 суток после окончания 19-суточной гипергравитации. Следовательно, скорость развития обратимости изменений в миокарде значительно отличается после 19- и 33-суточной гипергравитацин, и, вероятно, зависит от продолжительности самого воздействия. Число длинных митохондрий нормализуется в межфибриллярной и субсарколеммальной околососудистой зонах. Число крист нормализуется в околоядерной зоне, в других зонах оно остается повышенным. Эти данные указывают на неполноту обратимости гипертрофии и подтверждают ранее сделанное наблюдение (Абдулла, 1992; Проыенко, 1996) о различной скорости нормализации изменений разных параметров КМЦ после снятия нагрузки. Число ММК сохраняется во всех зонах на уровне, наблюдаемом через 33 суток гипергравитации (рис. 1г). Таким образом, этот параметр не нормализуется после снятия как 19-суточной, так и 33-суточной гипергравитации, то есть при выбранных условиях изменения в числе ММК необратимы вне зависимости от длительности воздействия, и вне зависимости от отсутствия или наличия регрессии гипертрофии КМЦ.

После 5 суток повторного действия гипергравитации 2<3 (после 33-суточного первого воздействия и последующего 39-суточного перерыва) площади поперечного сечения КМЦ увеличены на 20% по сравнению с предыдущим сроком эксперимента и на 12 % по сравнению с нормой, то есть обнаружена нх повторная гипертрофия (рис. 1 вХ Через 5 суток перво-

го действия 2G гипертрофия еще не была отмечена, следовательно, повторный ответ КМЦ проявляется быстрее. При этом площадь ядер КМЦ, как и число и диаметр капилляров находятся в пределах нормы. Число крист в околоядерной зоне соответствует норме, в межфибриллярной зоне отмечено снижение их числа относительно предыдущей точки опыта до уровня контроля; в субсарколеммальной околососудистой нет изменений по сравнению со значением на предыдущем этане, то есть число крист остается выше нормы. Число ММК поднимается в среднем по клетке на 23 %, при анализе по зонам: выше контроля впервые на всем протяжении этого эксперимента в околоядерной и межфибриллярной зонах (на 24 и 22% соответственно), сохраняясь на высоком уровне (+24% от контроля) в субсарколеммальной околососудистой зоне (рис. 1г). Такой рост числа ММК согласуется с ростом площади КМЦ, то есть повторным развитием гипертрофии на данном этапе.

Обобщая результаты двух экспериментов по воздействию гипергравиташпг, можно отметить, что повышенное число ММК проявляется уже через 5 суток и сохраняется на более длительных сроках; действие 2G ведет к гипертрофии КМЦ в одинаковой степени за 19 и 33 суток, через 33 суток возрастает еще и число крист в митохондриях. При повторном действии 2G на необратимо гипертрофированные КМЦ не отмечено их дополнительной гипертрофии и роста числа ММК, но при аналогичном повторном действии на КМЦ, нормализовавшиеся после первого воздействия, вновь обнаружена их гипертрофия и рост числа ММК.

Вывешивание в антиортостатическом положении.

Через 14 суток площади поперечного сечения КМЦ снижены на 7%, площади поперечного сечения их ядер также снижены (рис. 2а). Уменьшение площади КМЦ наблюдали также в сосочковых мышц желудочка крыс при 14-суточном пребывании в условиях невесомости в космосе (Goldstein et ah, 1992). При этом обнаружено увеличение на 10% числа капилляров. Относительный объем миофибршш и митохондрий в КМЦ находится в пределах нормы (рис. 2а), что подтверждает данные литературы (Goldstein et al., 1992). Ультраструктура митохондрий не подвергается изменениям по сравнению с контролем. Число ММК соответствует контролю во всех зовах (рис. 26), их ультраструкгура тоже сохраняется без изменений, как на этом, так и на последующих этапах эксперимента по вывешиванию.

Через 30 суток обнаружено уменьшение на 16,5 % площадей поперечного сечения КМЦ - нх частичная гипотрофия, площади поперечного сечения ядер снижаются более выражено - на 30 % от контроля (рис. 2а). Гипотрофия КМЦ обусловлена, по-видимому, снижением нагрузки на левый отдел сердца у вывешенных животных, что связано с их гипокинезией и атрофией скелетной мускулатуры задних конечностей при вывешивании (Ильин, Капланский, 1998; Wu et at., 2002), и, следовательно, с меньшими потребностями в ее кровоснабжении. Число капилляров увеличено на 11%. Но относительные объемы как миофиб-

и

рилл, так н митохондрий клеток не изменяются, указывая на пропорциональное снижение обьемов этих компонентов в КМЦ при уменьшении площадей клеток. При этом нарушалась ультраструктура некоторых митохондрий - матрикс локально просветлялся, происходила локальная деструкция крист. Митохондрии с такими нарушениями чаще наблюдались в околоядерной и субсартолеммальной околососудистой зонах, они сохранились и на последующих этапах опыта (на «отдыхе» и при повторном вывешивании). Однако большинство митохондрий, а также мнофибриллы имели нормальное строение. Вероятно, обнаруженные нарушения ультраструктуры митохондрий отражают процессы элиминации некоторого числа митохондрий, ставших липшими, избыточными в сниженном при гипотрофии объеме клетки, Число ММК возрастает в среднем на клетку на 10 %, но при анализе этого параметра по зонам видно, что только в околоядерной зоне он повышен достоверно (на 27 %) (рис, 26), П околоядерной зоне, где происходит деление митохондрий (Озернюк, 1978; Быков, 1985), наряду с ростом числа ММК увеличена доля мелких митохондрий, а также нередко наблюдались митохондрии с нарушенной ультраструктурой. Объединяя эти факты, можно предполагать, что в данных условиях в этой зоне идет процесс репаративмото восстановлен™ числа митохондрий для поддержания целостности их пула. Увеличенное число ММК в околоядерной зоне, вероятно, связано с дополнительным энергообеспечением этих процессов. Как правило (Щорникова, 2000), в разных экспериментальных условиях число ММК возрастает при увеличении нагрузки на миокард, что сопровождается гипертрофией КМЦ. В данной работе рост числа ММК наблюдался в частично гнпотрофировашой (уменьшенной в размере) клетке, Вероятно, рост числа ММК при вывешивания обусловлен затруднением работы левого желудочка в связи с необходимостью проталкивать больший ударный объем крови вверх, против силы тяжести. Также возможно, что при вывешивании ММК реагируют на увеличение растяжения КМЦ при диастоле (ТЬотазоп е! а1„ 1996), что может приводить к изменению условий сокращения клеток, тем самым, требовать их иное, возможно повышенное, энергообеспечение.

Через 30 сутрк после окодчатшя 30-суточного антиорто^татическ^го вывешивания ("«отдых»'! площади поперечного сечеиня КМЦ и их ядер увеличены по сравнению с аналогичными показателями на предыдущем этапе соответственно на И % и 25 %, но оба параметра остаются ниже контрольного уровня соответственно на 7 % и 13 % (рис. 2а). Вероятно, замедленные темпы увеличения КМЦ при нормализации после воздействия связаны с необходимостью синтеза новых структурных элементов (миофиламентов и др.) для наращивания объемов саркоплазмы и ее компонентов до исходного уровня. В тоже время число капилляров не изменено по сравнению с предыдущим этапом. Относительный объем миофябрилл и митохондрий находится в пределах нормы (рис. 2а).

и

1ШЭ1

"О т Мкм3 г—п?

-4

Число

300 -250 -■ 200 • 150 100 ■ 50 -О

-г 1 ОСг 80 -I

--80

№ ы

Ж

I

¡2

--60

ММ

Л .(¡Л |

Г Л 2

-¡Я

Ша Вб 13в

60-

40 -

--40

- - 20

^ О

У

20-

Л» ^

Срок вывешивания "Р V

в антиортостатнческом положении

Рис2. Морфометрическая характеристика КМЦ и их митохондрлома при вывешиваний крыс

в антнортостатическом положении. Обозначения как на рис. 1.

а - изменения площадей поперечного сечения КМЦ, их едер и относительных объемов мио-фибрилл и митохондрий, б - динамика изменения числа ММК на 100 митохондрий.

Число ММК снижено по сравнению со значением через 30 суток вывешивания как в целом на клетку, так и при расчете отдельно по зонам: в околоядерной зоне - до контрольного уровня; в субсарколеммальной окопососуднстой зоне - даже ниже контрольного уровня (рис, 26). Таким образом, после окончания антиортостатического вывешивания для нормализации изменений в КМЦ и их митохондриоме требуется более длинный период, чем для развития самих изменений при вывешивании.

Через 14 суток повторного вывешивания (после первого 30-суточного вывешивания и последующего 30-суточного перерыва) площадь поперечного сечения КМЦ и их ядер совпадает с контрольным значением (рис. 2а). Число капилляров не изменено после предыдущего срока. Такая реакция КМЦ отличается от реакции на первое вывешивание равной длительности, так как гипотрофии клеток лри повторном вывешивании не наблюдается даже в слабой степени, тогда как при первом воздействии она была отмечена, что обсуждалось ранее. Относительные объемы миофибрилл и митохондрий на этом этапе по-прежнему значимо не

изменяются относительно контроля (рис. 2а), Число ММК увеличивается в большей степени, чем на предыдущих этапах. В целом на клетку число этих структур возрастает на 20 % от контроля и на 29 % от предыдущего этапа, при анализе по зонам: в околоадерной и субсар-колеммадьной околососудистой зонах число ММК растет на 30 % и 16% соответственно от контроля, и на 22 % и 44 % от предыдущего этапа (рис, 26). В межфибрилляриой зоне увеличение числа ММК по сравнению с контролем недостоверно. То есть, реакция митохондрио-ма, как и изменения площадей КМЦ, на повторное вывешивание резко отличается от реакции на первое вывешивание. Вероятно, отмеченные различия связаны с неполной нормализацией измененных параметров за период «отдыха» между первым н вторым вывешиваниями (в частности, в миокарде сохраняются в повышенном числе капилляры; в клетках - нарушенная ультраструктура ряда митохондрий). То есть, повторное вывешивание действует на миокард с новыми морфо-функциональными характеристиками, чем в норме, и, следовательно, ответная реакция измененного миокарда оказывается другой, нежели интактного.

Таким образом, 14-суточное антиортостатичесхое вывешивание крыс приводит к незначительному снижению площади поперечного сечения КМЦ {к частичной их гипотрофии), тогда как число ММК в КМЦ не изменяется. При 30-суточном вывешивании уменьшение площади КМЦ становится более выраженным, отмечены нарушения ультраструктуры отдельных митохондрий и рост числа ММК. Через 30 суток после окончания 30-суточного вывешивания не происходит полной нормализации изменений площадей КМЦ и числа ММК, Повторное вывешивание ведет к более выраженному росту числа ММК в КМЦ, чем первое, но уменьшения размеров КМЦ, как при первом воздействии, при этом не обнаружено.

ВЫВОДЫ

1. Гипергравитация 20 в течение 19 и 33 суток ведет к гипертрофии кардиомиоцнтов (КМЦ). При этом в разной степени изменяются основные параметры митохоцдриома этих клеток - число, размер митохондрий, число крист в них и число ММК. Число ММК повышается уже через 5 суток, когда отсутствует гипертрофия клеток, и остается повышенным на более длительных сроках гипергравитации.

2. Длительность действия 20 влияет на скорость нормализации анализируемых параметров после окончания гипергравитации. при этом повышенное число ММК сохраняется.

3. Реакция КМЦ и их митохондриома на повторное 5-суточное действие гипергравитации зависит от того, на какие клетки (гипертрофированные или нормализовавшиеся после первого воздействия) оно накладывается - ответ гипертрофированных КМЦ на повторное воздействие менее выражен.

4. )4-суточное ангиортостатнческое вывешивание крыс ведет к незначительной гипотрофии их КМЦ, при этом большинство параметров митохондриома не изменяются. Удлинение срока вывешивания до 30 суток приводит к более выраженной гипотрофии КМЦ, что сопровождается нарушением ультраструктуры отдельных митохондрий и ростом числа ММК в околоядерной зоне КМЦ.

5. Через 30 суток после окончания 30-суточного вывешивания не происходит полной нормализации всех анализируемых параметров.

6. При повторном 14-суточном вывешивании не обнаружено гипотрофии КМЦ и выявлен более выраженный рост числа ММК, по сравнению с первым вывешиванием; как и па предыдущих этапах встречаются митохондрии с нарушенной ультраструкгурой,

7. Установлены общие закономерности изменения числа ММК в митохондриоме гн-пер- и гкпотрофированных КМЦ; а) изменения в числе ММК в разных зонах КМЦ и на разных сроках в одной зоне не одинаковы; б) после окончания воздействий число ММК возвращается к норме медленнее, чем оно изменяется при самом воздействии; в) при неполной нормализации КМЦ число ММК в них после повторных воздействий изменяется иначе, чем при первом воздействии; г) изменение числа ММК - это чувствительный и универсальный механизм адаптивной реакции КМЦ как на действие гипергравитации, так и на вывешивание.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Chentsov Yu.S., Shornikova M.V., Pogodina L.S., Frolov V.N., Lipina T.V. "Responses f cardiac muscle in rats exposed to prolonged and repeated head-down tilts and +Gz-centrifugation" //3rd INTAS Interdisciplinaiy Symposium on general biochemistry, biotechnology, and environment (Moscow December 14-17,2000), pp. 70-71.

2. Chentsov Yu.S,, Shornikova M.V., Pogodina L.S., Frolov V.N., Lipina T.V. "Mitochondrion! of cardiomyocytes in rats exposed lo prolonged and repeated 2g-hypergravitaiion" /М1" INTAS Interdisciplinary Symposium on physical and chemical methods in biology, medicine and environment (Moscow, May 30-June 3,2001), pp. 39-40.

3. Липина T.B., Ченцов Ю.С., Шорникова M.B., Фролов В.Н, "Реакция хардио.чиоцитов левого желудочка крыс на действие гипергравитации" it Тезисы всероссийского симпозиума "Онтогенетические, эволюционные и экологические аспекты биоэнергетики" (Москва, 5-6 ноября, 2001), с. 44-45.

4. Липина Т.В., Шорникова М.В., Ченцов Ю.С. "Реакция кардиомноцитов и кровеносных капилляров левого желудочка сердца крыс на действие гипергравитации" И Доклады АН, 2002, т. 384, № 4, с. 547-549.

IS

5, Липина T.B., Шорникова М.В., Фролов B.fL, Краснов И.Б., Ченцов Ю.С. "Реакция кардном ноцитов левого желудочка сердца крыс на воздействие гипергравнтацни 2G" // Тезисы ХП конференции по космической биологии и авиакосмической медицины (Москва, 10-14 июня, 2002 г.), с. 210-211.

6, Lipina T.V., Shomikova M.V., Frolov V.N„ Rrasnov I.В., Chentsov Yu.S. "Responses of tat left ventricle cardiomyocytes to constant 2g-hypergravity" It J. Grav. Physio!. 2002. vol. 9(1). p.I09-l 10.

7, Липниа T.B, "Изучение митохондрий кардиомиоцитов левого желудочка крыс в условиях 20-гипергравитации н после снятия данного воздействия" Н Материалы IX международной научной конференции студентов, аспирантов п молодых ученых "Ломоносов" (Москва, апрель 2002 г.), с. 36.

8, Липина Т.В., Шорникова М.В., Ченцов Ю.С, «Морфометрическая и ультраструктурная характеристика митохондриома кардиомиоцитов левого желудочка крыс в условиях ги-иерфавитации»//Известия АН, серия биол., 2003, №5, с. 1-10.

9, Липина Т.В. "Митохондряом кардиомиоцитов левого желудочка крыс при вывешиваний в антиортостатическом положении" // Материалы X международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, апр. 2003 г.), с, 29,

10, Липина Т.В,, Шорникова М.В., Ченцов Ю.С, "Морфометрический анализ кардиомиоцитов левого желудочка крыс при моделировании эффектов невесомости" // Доклады АН, 2003, т, 392,№2, с. 271-273.

11, Липина Т.В., Шорникова М.В., Ченцов Ю.С, «Мнтохондриом кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс при гипергравитшшн и моделировании эффектов невесомости» // Цитология, т. 45, № 9, с. 896-897. (Тезисы 1-ого съезда Общества клеточной биологии. С-Петербург, 14-16 октября 2003 г.).

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12,99 г. Подписано к печати 29.10.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,0, Тираж 100 экз. Заказ 849. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские торы, МГУ им. М.В Ломоносова.

»21042